一种由机械转导驱动的类人增生性瘢痕的小鼠模型

摘要

本方案将介绍如何建立一种增生性瘢痕小鼠模型，通过增强机械转导信号来模拟人类瘢痕的形成。该方法包括在小鼠愈合的切口处增加机械张力，并使用一种专用装置产生可重复的过度瘢痕组织，以进行详细的组织学和生物信息学分析。

摘要

增生性瘢痕（HTS）是一种异常的伤口愈合过程，会导致过度的瘢痕组织形成。在过去十年中，我们已证明机械转导——即机械刺激转化为细胞反应的过程——是驱动过度纤维化瘢痕愈合的关键因素。建立一种可评估类人增生性瘢痕的小鼠模型，对于研究各种治疗方法减少瘢痕形成及改善愈合效果的能力至关重要。具体而言，我们的实验室开发了一种小鼠伤口模型，通过增加机械应变来促进类人HTS的形成。 该方案使用生物力学加载装置，该装置由改良的13 mm腭部扩张器制成，其臂部置于切口两侧，并逐步向外牵开，从而在愈合过程中对伤口床施加持续张力。近二十年的应用中，该模型已得到显著改进，以提高其有效性与可重复性。利用该小鼠HTS模型，可诱导产生在组织学上与人类增生性瘢痕相当的显著真皮纤维化瘢痕。该小鼠模型为开发用于治疗HTS及与机械转导相关疾病（如异物反应）的生物制剂提供了重要研究平台。

引言

伤口愈合是机体试图修复受损组织并重建皮肤屏障的过程，若其止血、炎症、增殖和重塑等阶段出现异常，则可能导致异常愈合¹。增生性瘢痕（HTS）即为一种异常伤口愈合，其特征是在损伤部位过度沉积细胞外基质和结缔组织，从而形成增大的瘢痕组织区域^1,2,3。身体上经常受到反复机械牵张刺激的部位，如关节周围或面部，更容易发生HTS和纤维化^{4,5,6,7,8,9,10}。我们及其他研究者已证实，伤口床所受的机械牵张可通过激活机械转导通路——即将机械刺激转化为细胞反应的过程——促进HTS的形成^9,11。

增生性瘢痕（HTS）不仅涉及复杂的生物学过程，还给患者带来显著的社会、医疗和经济挑战。当瘢痕位于面部和手部等显眼部位时，患者可能会出现自尊心下降和抑郁等问题^1,9,10,12。科学综述文章指出，在美国，增生性瘢痕的发生率介于32%至72%之间^10,13。面部区域严重烧伤病例中对外观改善需求的增加，突出反映了这些美学问题的严重性，这一点也体现在越来越多的全脸移植手术案例中¹⁰。这些瘢痕还可能因限制活动而导致功能障碍^6,14，通常需要通过外科手术切除瘢痕以恢复活动能力¹⁰。HTS的治疗费用可能非常高昂，包括手术、治疗、物理治疗甚至长期护理的支出^1,10。仅在美国，每年用于治疗HTS的费用就超过40亿美元¹⁰。

考虑到 普遍性 尽管采取了高通量筛选（HTS）以及针对其并发症的极端措施，传统疗法（如手术切除、皮质类固醇注射和激光治疗）的效果仍然存在高度变异性^1,2,15,16,17尽管这些治疗方法在某些情况下可以缓解症状，但由于瘢痕病理机制的复杂性，其疗效可能有限。个体间的遗传差异以及对增生性瘢痕（HTS）发生机制的认识尚不充分，导致现有的治疗策略在临床上仍不尽如人意。^18,19,20HTS治疗的未来似乎在于靶向HTS细胞力学驱动机制（如机械转导）的新型创新方法^11,21，我们已充分证实其可导致过度的纤维化瘢痕愈合^{5,6,7,8,11,21,22,23,24,25}具体而言，我们先前已开发出一种小鼠模型，可通过增加伤口的机械应变以促进形成类似人类的增生性瘢痕⁹然而，经过近二十年的应用，该模型已得到显著改进，以提高其有效性和可重复性。本方案将帮助研究人员充分利用更新和优化的HTS小鼠模型，探究过度瘢痕形成背后的细胞群体及其驱动因素。该方法的总体目标是为研究人员提供一种可诱导小鼠产生类似人类增生性瘢痕的标准化操作流程。

方案

所有实验均获得亚利桑那大学机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准（批准编号：2021-0828）。本方案使用15周龄的C57BL/6J雄性小鼠，但也可适用于其他年龄和品系^9,26。

1. 创建高通量筛选生物力学加载装置

注意：在实验开始前的任何时间点，均可将腭部扩张器改装为 HTS 装置。

1. 取未修改的腭扩张器，并根据图1A、B中的规格将其送至创客空间核心或制造核心。
   注意：若无可用的创客空间或制造核心，请继续执行以下步骤。
2. 使用微型通用弯丝工具（Mini Universal Bender, MUB）对腭扩张器进行调整，使其符合图1A、B所示的规格。
3. 将装置如图1A1所示平放在平面上。
4. 当装置平放时，使用MUB工具将上臂向上弯曲90°，下臂向下弯曲90°，如图1A2所示。参见图1A3，此时装置平放于表面，其臂部与装置主体完全平行。
5. 沿虚线所示轴线，将每个臂向纸面后方弯曲90°，如图1A4所示。弯曲后的装置形态见图1A5。

2. 术后第0天（POD 0）的脱毛与初始切口操作

注意：手术前需清洁并高压灭菌多套外科器械（例如，解剖剪、手术刀、Adson 镊子、持针器）。准备已灭菌的 5-0 缝合线，并备好外科标记笔。

1. 使用70%乙醇喷雾清洁操作区域。
2. 在术前准备台上放置一个设定温度为35 °C的加热垫。用胶带将一块吸水垫固定在加热垫上。在前一块吸水垫上再放置另一块吸水垫（用于收集剃下的毛发）。将麻醉面罩（或多个面罩）用胶带固定在吸水垫上。
   注意：[可选] 如果有台式烟雾抽吸装置，可将面罩置于工作区附近并开启抽吸功能。
3. 将小鼠放入麻醉诱导舱中，使用1–3%异氟烷和2 L/min的氧气流速，直至小鼠呼吸平稳（2–3分钟）。
4. 将每只小鼠的鼻子插入鼻罩开口中，使其吸入由1–3%异氟烷和2 L/min氧气组成的麻醉气体。通过脚趾夹捏无反应来确认麻醉充分。向小鼠眼睛涂抹眼科润滑软膏。
5. 使用电动剃刀剃除背部图示区域（见图1C）的毛发。
6. 戴上手套后用手指或棉签将脱毛膏涂抹于皮肤上，覆盖已剃毛区域。45秒后，先用纱布擦去脱毛膏，再用酒精棉签擦拭。再用另一根酒精棉签擦拭背部，彻底清除残留脱毛膏，形成无毛区域（见图1C）。
   注意：必须使用适量脱毛膏，及时清除脱毛膏，并在清除后擦拭小鼠皮肤，以防止脱毛膏造成皮肤灼伤。小鼠皮肤较薄，易发生快速化学灼伤，可能对小鼠健康和实验质量产生不利影响。
7. 为小鼠佩戴耳标以进行个体识别。
8. 去除毛发后，将小鼠放回笼中，以避免过度暴露于异氟烷。持续监测小鼠状态。
9. 移除覆盖毛发的上层吸水垫，以获得清洁的术前准备操作表面。
10. 设置独立的手术操作区域。在手术台上放置一个设定温度为35 °C的加热垫。用胶带将一块吸水垫固定在加热垫上。将麻醉面罩（或多个面罩）用胶带固定在吸水垫上。
11. 将小鼠放入麻醉诱导舱中，使用2–4%异氟烷和2 L/min氧气流速，直至小鼠呼吸平稳（2–3分钟）。
12. 将小鼠从诱导舱中取出并放置于操作台面上。将每只小鼠的鼻子插入鼻罩开口中，使其吸入由1–3%异氟烷和2 L/min氧气组成的麻醉气体。通过脚趾夹捏无反应来确认麻醉充分。向小鼠眼睛涂抹眼科润滑软膏。
13. 使用21 G针头，在肩部皮下注射0.05 mg/kg缓释型布托啡诺，用于术后镇痛治疗。
14. 使用碘伏/氯己定消毒液与 酒精棉签交替擦拭三遍，对小鼠背部进行消毒。使用外科标记笔和直尺，在背部正中线标记一条2 cm长的直线，作为全层切口的位置（见图1D）。
15. 使用手术刀或解剖剪刀（根据手术偏好选择），沿标记区域做背部正中线全层切口。
    注意：注意不要切到深层组织（如肌肉），如图1D所示。
16. 使用5-0缝线，采用单纯间断缝合法，从切口中央开始缝合，如图1D所示。至少使用5个等距分布的缝合点。
17. 将Telfa纱布剪成3 cm × 1 cm大小。将其置于泡沫粘性敷料中央，并将该敷料贴于小鼠背部，使纱布覆盖切口（见图1D）。将另一块对半切开的敷料贴于腹部，并环绕包扎，直至与背部敷料相接。
18. 完成包扎后，将小鼠放入单独的无菌笼中，并持续监测，直至其完全从麻醉中恢复。
19. 对所有小鼠重复上述操作，无论其所属实验组别。在下一步操作前，让切口自然愈合4天。

3. HTS 生物力学加载装置（POD 4）的放置

注意：手术前请清洁并高压灭菌高通量筛选装置以及多套外科手术器械（例如解剖剪、手术刀、Adson 镊子、持针器、皮肤缝合器、皮肤缝合钉）。准备已灭菌的 5-0 缝合线以供使用。[可选] 若有台式烟雾抽吸装置，可将吸气罩置于工作区附近并开启抽吸功能。

1. 按照步骤 2.1 和 2.2 所述准备手术区域。
2. 对小鼠进行麻醉，并按照步骤 2.11–2.13 提供镇痛处理。
3. 使用镊子或持针器在小鼠腹部腹侧来回操作，将敷料与皮肤分离。将工具置于敷料与皮肤之间以抬高敷料，然后使用剪刀剪除敷料。
   注意：操作时需小心，避免剪伤小鼠皮肤、撕裂敷料或干扰正在愈合的切口。
4. 用酒精棉片清洁背部。检查切口是否存在伤口裂开或感染迹象。
5. 确保 HTS 装置未伸展/扩张，处于最小收缩状态，如图 1B所示。将医用胶水轻轻涂抹在装置的臂部。
6. 一只手将小鼠背部皮肤横向轻度拉紧，另一只手将 HTS 装置放置于小鼠背部，使切口到装置两侧臂的距离相等，从而将装置居中覆盖在切口上方。确保装置两臂之间的皮肤均匀绷紧。保持装置位置固定直至胶水干燥（约 30 秒），如图 2A所示。
   注意：保持皮肤均匀绷紧对于确保装置在切口上施加均匀张力至关重要。此过程中应保留缝线完整，因为装置安装过程会向皮肤施加机械张力，可能导致正在愈合的切口重新打开。缝线应保留至开始拉伸的第一天才拆除，以确保伤口持续闭合。
7. 如图 2B所示，在每个臂周围穿过皮肤缝合四针。缝合时，确保针从皮肤穿出时朝向切口方向。
   注意：若从装置靠近切口的一侧进针，由于穿刺皮肤所需的力量，有时可能导致切口撕裂。
8. 现在如图 2B所示，在装置臂周围穿过皮肤放置三枚皮肤缝合钉，将 HTS 装置牢固固定于皮肤上。
9. 按照步骤 2.17 和 2.18 对小鼠进行包扎。
10. 对所有小鼠重复上述操作，无论其所属实验组别。
    注意：所有小鼠接受相同的准备工作；但它们会被随机分配至各实验组（例如对照组、拉伸组），以确保实验设计中小鼠的无偏分布。具体而言，对照组和拉伸组的小鼠均会将装置固定于背部，对照组装置保持不动，而拉伸组小鼠将进行后续步骤。

4. HTS 生物力学加载装置的初始拉伸（POD 5）

注意：手术前请清洗并高压灭菌多套外科手术器械（例如解剖剪、手术刀、有齿镊、持针器）。[可选] 如果有台式烟雾抽吸装置，可将吸气罩置于工作区附近并开启抽吸功能。

1. 通过耳标将每只小鼠随机分配至目标组。对于对照组小鼠，仅需拆除切口缝线并更换伤口敷料（执行步骤1-6，然后8-9）。如需要，可在牵张时取出装置，并使用带有测量工具的照片记录瘢痕大小以作参照。
2. 准备手术区域，对小鼠进行麻醉，并执行步骤3.1-3.4以去除敷料。
   注意：小心操作，避免撕裂敷料或干扰正在愈合的切口。若HTS装置 的某个臂已从皮肤上脱落，应轻轻将其粘回原位，并根据脱落范围选择使用皮肤钉合钉或缝线固定。
3. 使用解剖剪刀或其他合适方法拆除伤口缝线。
4. 将HTS装置钥匙插入装置中并旋转，使装置扩张至皮肤绷紧但无撕裂风险的状态，如图2C所示。
   注意：由于装置两臂之间的皮肤可能较为松弛，初始牵开可能需要旋转钥匙约4-8圈。
5. 通过执行步骤2.17和2.18对小鼠进行包扎。

5. HTS生物力学加载装置的后续拉伸（POD 7、9、11、13、15、17）

注意：手术前请清洗并高压灭菌多套外科器械（例如解剖剪、手术刀、Adson 镊子、持针器）。[可选] 若有台式烟雾抽吸装置，可将吸气罩置于工作区附近并开启抽吸功能。

1. 对于对照组小鼠，仅需更换伤口敷料（步骤 1-5，然后步骤 13-14）。如需要，可在牵张时取下装置，并使用带有测量工具的标尺拍摄瘢痕照片，以追踪瘢痕大小。
2. 准备手术区域，对小鼠进行麻醉，并按照步骤 3.1-3.4 去除敷料。
   注意：若 HTS 装置的某个臂已从皮肤上脱落，请将其重新粘合固定，并根据脱落范围的大小添加皮肤钉合钉或缝线。
3. 将 HTS 装置钥匙插入装置并旋转，以扩展装置，直至皮肤绷紧但无撕裂风险。
   注意：此过程可能需要约 4 次旋转或总牵张距离约 2 mm。若装置已达到最大延伸限度且无法进一步扩展，则执行步骤 5.4-5.7，取下并重新安装新装置。否则，通过执行步骤 2.17 和 2.18 对小鼠进行包扎。
4. 若装置已达到最大延伸限度，请使用订书针拆除工具或剪刀撬开订书针的齿爪，将装置从小鼠背部移除。随后拆除缝线，并小心取下装置。
5. 使用手术刀、酒精棉片和纸巾清洁装置。将装置浸泡于 70% 乙醇中约 20 分钟以辅助清洁。然后使用钥匙将装置收缩至最薄状态。
6. 按照步骤 3.5-3.8 重新安装 HTS 装置。
7. 按照步骤 2.17 和 2.18 对小鼠进行包扎。

6. 收获 HTS 组织（术后第19天）

注意：可在实验流程的任意时间点收获组织。我们曾在仅拉伸4天后即收获组织以观察早期时间点；然而，组织通常在术后第19天（启动应变后2周）收获最为一致。手术前，清洗并高压灭菌多套外科器械（例如解剖剪、手术刀、Adson镊子）。为获得随时间变化的瘢痕图像，可在每次拉伸步骤前取下装置，拍摄瘢痕照片，然后重新安装装置并重新启动机械应变。[可选] 若有台式烟雾抽吸器，可将吸气口置于工作区附近并开启抽吸功能。当不再使用异氟烷气体时，可关闭台式烟雾抽吸器。

1. 按照步骤 3.1-3.4 准备手术区域，对小鼠进行麻醉，并移除敷料。
2. 通过颈椎脱位法处死小鼠。
   注意：操作时注意不要牵拉皮肤，以免撕裂小鼠背部皮肤。
3. 使用解剖剪或皮肤缝合钉移除器取下皮肤缝合钉，剪除缝线。小心地移除 HTS 装置，注意不要撕裂皮肤。
4. 使用手术刀或剪刀，切除围绕 HTS 瘢痕的皮肤组织。根据需要妥善保存皮肤样本，用于组织学分析。
   注意：如果皮肤将用于转录组或蛋白质分析（例如 qPCR、Western blot、单细胞分析），务必仅切除 HTS 瘢痕组织，以尽量减少周围健康组织的混入，从而确保分析结果仅反映瘢痕组织的特征。
5. 用手术刀将 HTS 装置刮净，随后将其放入盛有 70% 乙醇的烧杯中，以软化残留的粘合剂或组织。
   注意：在 70% 乙醇中浸泡后，装置可能仍需进一步擦拭、刮除和清洁，方可进行高压灭菌处理。

7. 测量平均瘢痕宽度

注意：此步骤使用图像分析软件 ImageJ 完成，并将信息记录在电子表格中。

1. 在 ImageJ 中打开图像。使用 多边形 工具描记瘢痕边缘。点击 分析 | 测量 以测量该区域。
   注意：瘢痕可通过其颜色改变及缺乏毛囊来识别。
2. 使用 线段 工具测量瘢痕从一端到另一端的长度。点击 分析 | 测量 以测量该长度。
3. 使用 线段 工具测量图像中 1 cm 或其他标准化长度单位的实际像素长度。点击 分析 | 测量 以测量该长度。
4. 在电子表格中，将 瘢痕面积（以像素计；px）除以 瘢痕长度（px 长度），所得结果即为以像素为单位的平均瘢痕宽度。
5. 将上一步结果除以 测得的标准长度单位（以像素为单位的长度），所得结果即为实验所用标准长度单位（例如 cm）表示的平均瘢痕宽度。

结果

为清晰展示高通量筛选（HTS）方案的有效应用并识别成功的“阳性”结果，建立了如图所示的模型 图 3A在代表性研究中，共设两组：无牵拉对照组（n = 6）和机械牵拉增生性瘢痕（HTS）组（n = 6），其中在切口处施加类人水平的机械应变以诱导形成增生性瘢痕（HTS），如图所示。 图3B，C. 在所提供的实验方案中 图3A- C术后第5、9、15和19天对瘢痕进行大体摄影，使用ImageJ软件描记瘢痕并分析不同时间点瘢痕的平均宽度（图3D平均瘢痕宽度随时间变化及组间比较结果以图表形式呈现 图3E在术后第5天（POD 5）施加机械应变后，拉伸组与对照组的瘢痕宽度尚无显著差异；此后拉伸组的瘢痕显著宽于对照组，并在术后第9天达到最大宽度0.99 mm（p = 0.045）。与对照组相比，拉伸组瘢痕宽度的显著差异持续至术后第15天（p = 0.043）和第19天（p = 0.045）。建议仅在需要移除HTS装置时进行大体摄影（即HTS装置已达到最大扩张程度需重新固定，或在取出装置期间），因为该装置会阻碍对瘢痕的清晰拍摄。本方案中，多个时间点的图像及瘢痕宽度分析可为读者更清晰地展示该模型的伤口进展过程。

对增生性瘢痕组织（HTS）的分析可通过多种方式进行，例如针对纤维化标志物进行免疫组化（IHC）染色，进行苏木精-伊红（H&E）染色和三色染色以观察组织学瘢痕区域，采用天狼星红染色评估瘢痕的胶原结构，以及其他用于伤口分析的方法——这些方法在本实验室以往的研究中均已使用过^{6,8,21,24,25,27,28}（图4）。图4展示了增生性瘢痕组织的组织学特征，如隆起的瘢痕组织（图4A）、附属结构和毛囊的缺失（图4B）、胶原纤维沿机械负荷方向排列（图4C）以及胶原纤维漩涡状结构（图4F）。图4还展示了小鼠增生性瘢痕组织中肥大细胞密度和血管结构的免疫组化染色结果，并与人类增生性瘢痕组织进行了比较（图4D、E、G、H）。此外，若在切除后立即采集、处理并送至生物信息学核心平台，还可对增生性瘢痕组织进行单细胞分析。

图 1：HTS 装置及小鼠背部的制备。（A） 将 13 mm 腭扩张器改装为 HTS 装置的过程：(1) 显示初始扩张器结构；(2) 当装置平放时，将上臂向上弯曲 90°，下臂向下弯曲 90°；(3) 初步弯曲后的结果，此时臂部与装置主体完全平行；(4) 进一步弯曲臂部以形成最终装置并标注尺寸；臂部应各自向页面内侧再弯曲 90°，如 (5) 所示为最终装置形态。（B） 完整组装后的 HTS 装置在不同角度下的视图，包括未伸展和伸展状态。（C） 小鼠背部准备的逐步操作：(1) 初始带毛状态，(2) 剃毛后，(3) 涂抹脱毛膏后的状态。（D） 背部切口制作步骤：(1) 使用 2 cm 参考线标记切口位置，(2) 进行切口操作，(3) 缝合伤口，(4) 覆盖 Telfa 纱布，(5) 用粘性敷料固定。（E） 大体摄影图像：(1) 切口状态，(2) 切口缝合闭合后。缩写：HTS = 增生性瘢痕。请点击此处查看该图的放大版本。

图2：HTS装置的定位与拉伸。(A) HTS装置在小鼠背部正确位置的示意图，确保与切口部位准确对齐。左侧图像为从后方观察的装置放置情况，右侧图像为从侧面观察的装置放置情况。(B) HTS装置固定的示意图：(1) 初始放置位置，(2) 缝合线位置，(3) 皮肤缝合钉位置。(C) 使用标注的HTS装置钥匙对HTS装置进行拉伸的示意图：(1) 起始状态，(2) 施加张力，(3) 最终扩张状态，旨在对愈合中的切口施加持续的机械应变以促进增生性瘢痕形成，施加的扩张量为2 mm。(D) 对HTS装置施加张力的大体摄影图像，图中已标注HTS装置钥匙。(E) 完成包扎后小鼠的大体摄影图像。缩写：HTS = 增生性瘢痕。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：施加机械应变以诱导瘢痕形成。（A）实验流程时间线，从切口建立（POD 0）开始，到施加机械应变（POD 4），并持续牵张期（POD 5 至 POD 19），最终完成组织离体（POD 19）。（B）两组示意图：无牵张对照组与机械牵张HTS组。（C）横截面示意图，显示无牵张对照组与牵张HTS组之间组织反应的差异。（D）无牵张对照组和牵张HTS组在术后第5、9、15和19天（POD）的代表性大体图像，增生性瘢痕以黄色虚线勾勒。（E）随时间变化的平均瘢痕宽度定量分析，显示无牵张组与牵张组之间瘢痕发育存在显著差异，误差线表示标准差。显著差异以星号（*）标注。统计分析采用双因素方差分析（ANOVA）。*p < 0.05 被认为具有统计学意义。缩写：HTS = 增生性瘢痕；POD = 术后天数。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：瘢痕的组织学。 在我们先前发表的研究中，该小鼠瘢痕组织病理学样本是在持续机械应力作用2周后采集的^9,26. （A） 较大的图像显示 H&E 为瘢痕横截面的组织学成像，右下角为天狼星红染色组织学成像，显示瘢痕区域隆起。 （B） 较大的图像显示 H&E 为瘢痕横切面的组织学成像，右下角为天狼星红染色组织学成像，显示瘢痕区域附属结构和毛囊的缺失。 (C) 较大的图像显示了瘢痕横切面的苦味酸-天狼星红染色成像，而右下角为瘢痕横切面的三色染色组织学成像，显示胶原纤维沿机械负荷方向排列。 （D） 较大的图像显示小鼠HTS组织中CD117免疫组化成像，右下角图像显示人组织中CD117免疫组化成像，表明肥大细胞密度与人HTS组织相当。 (E) 较大的图像显示小鼠增生性瘢痕组织中血管CD31免疫组化成像，右下角图像显示人组织中CD117免疫组化成像，表明肥大细胞密度与人增生性瘢痕组织相当。 (F) 在右下角图像中可见成熟人类增生性瘢痕中的胶原纤维漩涡结构，同样在小鼠瘢痕受力24周后，于圈出区域的 murine H 中也观察到此类结构&E成像。 (G) 对照组（切口+无牵张）、牵张对照组（无切口+牵张）和牵张性增生性瘢痕组（Stretch HTS组）的典型大体瘢痕图像。 (H) 显示免疫组织化学结果，比较对照组（切口+无牵张）与牵张性增生性瘢痕（HTS）组。通过共染纤维化标志物pEPF、α-SMA和YAP以及DAPI，可见HTS组中纤维化标志物表达增加。 A-F 已根据 Aarabi, S. 等人的研究进行改编。⁹. G，H 已根据 Mascharak, S. 等人改编。经 FASEB 许可转载²⁶. 缩写：HTS = 增生性瘢痕；H&E = 苏木精和伊红；pEPF = Engrailed阳性成纤维细胞；aSMA = α-平滑肌肌动蛋白；YAP = Yes相关蛋白；DAPI = 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

HTS 小鼠模型是一种通过机械转导诱导 HTS 并开发潜在疗法的经济高效且高度可重复的方法。尽管该模型在初期使用时存在一定的学习曲线，但经过练习，任何研究人员均可掌握该方案，无需具备外科手术培训背景。利用此模型，研究人员能够更深入地理解 HTS 的形成机制以及机械转导在伤口愈合中的作用，这可能为患者伤口护理带来切实的改善。本方案配套的视频演示有望降低研究人员的学习难度，并促进该模型在未来研究中的顺利应用。然而，该方案中仍有一些关键步骤需要进一步说明，以增强对使用者的清晰度。

按照实验方案的时间顺序进行，第一个关键步骤是在术后第0天（POD 0）关闭手术切口。必须完全闭合切口，确保皮肤各层精确对合²⁹。这是为了保证切口能够正常愈合，避免在植入装置后因切口处受张力而导致裂开。如果切口发生裂开（裂开），则该动物不应继续用于后续实验。

在术后第4天将HTS装置放置于小鼠背部时，必须确保小鼠背部各处受力均匀。正确安装装置后，整个切口所受张力将保持一致，从而降低因受力不均而导致实验结果不理想（瘢痕形成不均）的风险。若装置安装不当，切口的某些部分将无法在每隔一天的周期中均匀接受约2 mm的牵张刺激，从而影响HTS的诱导效果。装置的扩张应消除皮肤的松弛，使其绷紧。同时需注意避免过度拉伸，以防伤口裂开。若装置被用于多轮实验，用于插入钥匙以扩张和收缩装置的旋转齿轮可能会松动。一旦发生此情况，应制作新的装置，并弃用旧装置。

当在 POD 5 开始施加张力时，任何旨在预防瘢痕形成的治疗都应开始实施。当通过涂抹于切口部位来施加张力时，通常每隔一天给予外用软膏等治疗。水凝胶以类似方式置于切口部位。全身性治疗可通过尾静脉或眶后注射进入血液循环。

建议在术后第19天或拍照前，对小鼠背部瘢痕周围区域进行剃毛和/或轻柔涂抹脱毛膏。这有助于提高瘢痕大小在ImageJ中的可见度和后续分析效果。此外，使用脱毛膏时应尽量减少用量并缩短作用时间。小鼠背部皮肤过度接触脱毛膏可能导致化学灼伤，从而干扰伤口愈合过程。小鼠皮肤比人类皮肤更薄，更易发生化学灼伤³⁰。

HTS 小鼠模型本身存在固有局限性，因为它未使用人类皮肤，因此无法完全模拟人类 HTS。然而，与其他动物模型相比，该模型具有显著的诸多操作优势；若操作得当，这种小鼠 HTS 模型具有可靠性高、成本低廉且易于实施的特点。从生物学角度来看，HTS 是通过机械信号的物理性增强而诱导产生的。其他在兔类中建立 HTS 的模型则通过热损伤或化学损伤作用于耳部或背部皮肤来诱导 HTS^30,31,32。兔耳腹侧皮肤在愈合过程中几乎不涉及除皮肤细胞以外的其他细胞类型，例如软骨细胞^1,30。另一种方法是在猪皮肤上建立烧伤诱导的 HTS 模型³³，但在成本和操作上可能存在较大的后勤挑战。猪模型在模拟人类 HTS 方面可能是最接近的；然而，该方法在获取初步结果时成本较高。最后一种 HTS 模型是将切除的人类 HTS 皮肤异种移植到小鼠体内，但这种方法可能引发免疫反应，且无法研究新瘢痕的形成过程³⁴。

上述在动物模型中诱导增生性瘢痕（HTS）的方法无法充分触发机体的自然愈合反应，其形成过程与人类增生性瘢痕的自然发生方式存在差异。相比之下，基于机械转导的小鼠HTS模型通过施加机械张力来启动增生性瘢痕的形成，更贴近人类HTS的病理过程^1,9,21。该方法依赖于机械转导信号传导这一生理过程，以捕捉纤维化背后的关键组织生物力学机制及细胞群体驱动因素。该模型非常适合用于研究可抑制或甚至激活机械转导通路的生物学靶点，有望推动新型转化治疗策略的发现。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100 mL PYREX 蒲氏烧杯	密理博-西格玛	CLS1000100
Aesculap Exacta mini 修整器	Aesculap
AutoClip 系统	精细外科手术器械	12020-00
BD 品牌异丙醇擦拭巾	Fisher Scientific	13-680-63
缓释布托啡诺（0.5 mg/mL）	Buprenex，Indivior 公司	12496-0757-1
C57/BL6 雌性（6–8 周龄	杰克逊实验室	000664
Covidien 无菌纱布	Fisher Scientific	2187
Covidien Telfa™ 非粘性敷料垫	Fisher Scientific，Covidien	1961
牙科手术尺	DoWell Dental Products	S1070
脱毛膏（Nair 脱毛乳液）	教堂&安普；德怀特，CVS	339823
70% 乙醇溶液	Fisher Scientific	64-17-5
Excel	微软公司	Microsoft.com	软件程序
ImageJ	ImageJ，Wayne Rasband	imagej.net	软件程序
吸入麻醉系统	VetEquip	922130
虹膜剪 4½ 英寸 不锈钢	McKesson	43-2-104
异氟烷，USP	德克拉动物保健产品	17033-094-25
Kaka 工业 MUB-1	卡卡工业	173207	仅在无创客空间或加工车间可用时才需要
Leone 快速腭扩展器 - 13 mm	大湖牙科技术公司	125-004	该产品包装盒内将附带用于扩展和收缩装置的关键部件
75 x 90 厘米带粘性开口（6 x 9 厘米）的液体防渗手术单	Omnia S.p.A.	12.T4362
Medequip Depot 丝线黑色编织缝线 6-0 Rx	Medequip Depot D707N，Fisher Scientific	NCO835822
5英寸带齿镊子	McKesson	43-2-842
Prism 9	GraphPad Holdings, LLC	graphpad.com	软件程序
Puralube 眼科软膏	德克拉，NDC	17033-211-38
R Studio Desktop	RStudio PBC	rstudio.com	软件程序
外科皮肤标记笔	McKesson	19-1451_BX
Tegaderm，3 M	VWR	56222-191	泡沫粘性敷料
Thermo-peep 加热垫	K&安德海姆，亚马逊
组织镊 4¾ 英寸不锈钢 1 x 2 齿	Mckesson	43-2-775
Vetbond（3 M）	圣保罗，明尼苏达州	1469SB