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N-甲基-N-亚硝基脲诱导大鼠视网膜损伤的取样及病理变化多指标评价

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DOI：

10.3791/67159

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2024年9月13日

 ,  ,  ,  , 
1School of Nursing, School of Pharmacy, Key Laboratory of Hui Ethnic Medicine Modernization, Ministry of Education, Ningxia Medical University, 2Department of Critical Care Medicine, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

通讯作者： Jun Chen <drchenjun@qq.com>, Qipeng Zhao <zhqp623@126.com>

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案描述了一种大鼠视网膜取样方法，并利用苏木精-伊红染色、TUNEL检测和蛋白质印迹法，检测腹腔注射N-甲基-N-亚硝基脲后视网膜的病理变化和细胞凋亡情况。

摘要

视网膜病变可见于大多数眼病以及糖尿病的晚期并发症中。特异性的视网膜色素上皮细胞和视细胞损伤与退变是视网膜病变的主要特征。许多 传统药物在治疗视网膜病变方面已显示出显著的临床疗效。如何快速而完整地获取视网膜组织，是传统药物治疗视网膜病变研究中的关键步骤。本研究旨在提供一种标准化且可操作的取材方法，用于N-甲基-N-亚硝基脲（MNU）诱导的大鼠视网膜损伤模型的视网膜样本采集，并对病理变化进行多指标评价。通过一次性腹腔注射60 mg/kg的MNU诱导大鼠视网膜损伤，并在给药7天后获取视网膜样本。此外，我们采用苏木精-伊红染色评估视网膜病理 变化。 通过TUNEL法和Western blot检测细胞凋亡率及凋亡相关蛋白表达。这些标准化的视网膜取材与病理变化评估方案，有助于推动视网膜病变发病机制的研究以及新型有效传统草药的发现。

引言

视网膜色素变性（RP）是一种遗传性致盲性视网膜疾病1。RP 的发病率在 1/3500 至 1/5000 之间，全球约有 250 万人的视觉功能受到影响。它是导致人类视力障碍最为人熟知的疾病之一，给整个社会带来沉重负担2。该病的特征是视网膜色素上皮细胞功能逐渐丧失以及光感受器细胞进行性凋亡。在疾病早期，患者会出现夜盲，表现为周边视野缺损，最终导致中心视力丧失3。因此，抑制视网膜光感受器细胞凋亡是预防和治疗 RP 的关键切入点。

视网膜细胞凋亡是人类视网膜色素变性（RP）及动物模型中的常见特征4。在大鼠中连续7天腹腔注射60 mg/kg的N-甲基-N-亚硝基脲（MNU），可诱导视网膜感光细胞的凋亡与丢失，是目前常用的RP动物模型5,6。分析模型动物视网膜组织的病理结构变化、特定细胞的凋亡情况以及凋亡相关蛋白的表达水平，可为研究人类RP的发病机制及药物筛选提供有效的实验数据和理论依据7,8。因此，视网膜样本的质量直接决定了实验数据的可靠性。然而，由于眼部组织的特殊性，关于如何获取大鼠视网膜的报道极为少见9。

本文提供了一种简单、快速、标准化且可操作的大鼠视网膜取材方法，以克服上述不足。采用苏木精-伊红染色（HE）、末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸地高辛标记缺口末端标记法（TUNEL）染色以及蛋白质印迹法（Western blot）分析大鼠视网膜组织损伤及细胞凋亡的病理变化。所有方法均源自本研究团队在具体操作流程中的实践经验。

方案

所有实验方案和手术操作均经宁夏医科大学伦理委员会批准（伦理编号：NO. 2020-Q066）。7-8周龄、体重200-220 g的SPF级雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠购自宁夏医科大学，动物生产许可证号为SCXK（宁）2020-0001。所有动物均饲养于宁夏医科大学实验动物中心，环境温度与湿度适宜，维持正常的昼夜光照周期，饮食和饮水自由且充足。

1. 术前准备

  1. 材料准备
    1. 准备大鼠切片、吸入麻醉装置、包埋盒、冻存管、一次性外科手套和口罩、广口瓶、4%多聚甲醛、冰袋、眼科剪、眼科镊、手术刀片及刀柄、1.5 mL 微量离心管，并提前进行灭菌处理（参见 材料表）。
  2. 动物准备
    1. 将20只雄性SD大鼠随机分为模型组（n=10）和对照组（n=10）。对模型组大鼠腹腔注射60 mg/kg MNU，对照组大鼠腹腔注射等体积生理盐水。
    2. 注射后第7天，于取样前夜禁食，自由饮水。
    3. 次日，将大鼠仰卧位固定于手术台上，使用面罩以4%异氟烷和2 L/min氧气进行麻醉。通过轻捏足底中央观察大鼠反应，以判断麻醉深度。

2. 视网膜取样用于蛋白质因子检测

  1. 用左手固定大鼠的眼眶，右手使用眼科弯镊适度用力摘除眼球。将眼球置于冷玻璃皿中，呈矢状位。
  2. 左手持眼科直镊固定眼球，右手持手术刀，在晶状体附近做一条长约2 mm的纵向切口。
  3. 沿切口用眼科剪剪除角膜，轻轻剥离晶状体和玻璃体，暴露眼杯。
  4. 将眼杯底部置于1.5 mL微量离心管管口，翻转眼杯使其朝向管内，暴露视网膜（视网膜呈淡黄色）。
  5. 用眼科弯镊沿眼球巩膜壁完整剥离视网膜，随后将其放入冻存管中，储存于液氮罐中以备后续使用（图1）。

3. 视网膜取样用于病理学检查及特定细胞染色

  1. 用左手使用眼科镊子提起大鼠眼睛的角膜边缘，右手持手术刀沿大鼠眼角切开一个4 mm的开口。
  2. 用左手持眼科镊子夹住眼球切口边缘，同时使用眼科剪沿眼球边缘剪除周围组织，并注意清理眼球周围的残留组织。
  3. 用眼科镊子分离眼球后极部视神经周围的组织，切断视神经并注意保留视神经，随后取出眼球。
  4. 将取出的眼球用生理盐水冲洗以去除残留血液，再在滤纸上轻轻滚动以吸去多余水分，然后置于冰冷的锡箔纸上。
  5. 用眼科镊子固定眼球，使用手术刀沿角膜与巩膜交界处做一条4 mm的纵向切口。
  6. 用眼科剪剪除角膜，沿切口做环形剪切，轻柔地取出晶状体和玻璃体。
  7. 将剩余带视神经的眼杯放入包埋盒中，并用4%多聚甲醛固定。
  8. 将多聚甲醛固定的样品进行石蜡包埋，切成4 µm厚的切片，用于HE染色和TUNEL染色7。

4. 大鼠视网膜的苏木精-伊红染色

  1. 脱蜡与水化：将切片放入二甲苯中10分钟，重复一次10分钟；随后放入无水乙醇中5分钟，再重复乙醇处理5分钟；接着依次放入95%乙醇中5分钟、85%乙醇中5分钟，最后放入75%乙醇中5分钟。
  2. 苏木精染色：用去离子水冲洗切片5分钟。加入100 µL苏木精染色液，染色5分钟，用去离子水冲洗5–10秒。加入100 µL 1%盐酸乙醇溶液，分化30秒，用去离子水冲洗20分钟，再加入100 µL 0.2%氨水溶液1分钟。最后用去离子水冲洗5分钟。
  3. 伊红染色：加入100 µL伊红染色液，染色5分钟，用去离子水冲洗30秒。
  4. 脱水与封片：将切片依次浸入70%乙醇中5分钟、85%乙醇中5分钟、90%乙醇中5分钟，再放入无水乙醇中5分钟，并重复无水乙醇处理一次5分钟；随后浸入二甲苯中5分钟，再重复一次5分钟。最后在切片表面滴加约100 µL中性树胶，盖上盖玻片封片。
  5. 切片成像：将染色后的切片置于显微镜下，调节显微镜焦距至图像清晰，设定放大倍数为400倍，采集图像。
  6. 测量总视网膜厚度与外层视网膜厚度：测量总视网膜厚度及外层视网膜厚度（外核层与光感受器层的厚度），并计算外层视网膜厚度百分比
    外层视网膜厚度（%）=（外层视网膜厚度 / 总视网膜厚度）× 100。

5. 采用TUNEL法测定视网膜感光细胞的凋亡率

  1. 脱蜡与水化：将切片放入二甲苯中10分钟，重复一次，每次10分钟；然后放入无水乙醇中5分钟，重复此步骤一次，每次5分钟。依次在95%乙醇中放置5分钟、90%乙醇中5分钟、80%乙醇中5分钟、70%乙醇中5分钟进行水化，最后用去离子水冲洗5分钟。
  2. 用0.85%氯化钠溶液冲洗5分钟，再用PBS冲洗5分钟。使用4%多聚甲醛固定15分钟，随后用PBS冲洗5分钟，重复一次。
  3. 孵育与平衡7：加入20 µg/mL蛋白酶K溶液，消化孵育15分钟；用平衡缓冲液平衡10分钟；再加入重组末端脱氧核苷酸转移酶（rTdT）缓冲液，在37 °C孵育60分钟。
  4. 终止反应：加入100 µL标准柠檬酸盐溶液（2×SSC溶液），作用15分钟。用PBS冲洗5分钟，重复一次。
  5. 核染色：加入100 µL 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）试剂，染色5分钟。用去离子水洗涤5分钟，重复一次。
  6. 封片：擦去切片周围多余的二甲苯，取约100 µL中性树脂滴加于切片表面，盖上盖玻片进行封片。
  7. 显微镜观察：将染色后的切片置于显微镜下，调节焦距以获得清晰图像，设定放大倍数为400×，采集图像。使用标准荧光滤光片在520 ± 20 nm处观察绿色荧光，在460 nm处观察蓝色DAPI荧光。
  8. 计算凋亡率：测定视网膜外核层的绿色荧光值和蓝色荧光值。按以下公式计算细胞凋亡率：
    凋亡细胞率 = 绿色荧光值 / 蓝色荧光值 × 100。

6. 蛋白质印迹分析 10

  1. 裂解缓冲液处理：取一个冷冻的视网膜组织，用50 µL预冷的裂解缓冲液（每1 mL裂解缓冲液中含5 µL磷酸酶抑制剂、1 µL蛋白酶抑制剂和5 µL 100 mM PMSF）进行剪碎并匀浆。
  2. 将样品置于冰浴中，以28 kHz超声处理5秒，重复3次。在4 °C、10,000 × g 条件下离心5分钟，去除细胞碎片，保留上清液。
  3. em>6.3 蛋白定量：使用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。
  4. em>6.4 电泳：上样50 µg蛋白样品，采用12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行分离。
  5. 转膜：使用电泳转膜系统将蛋白电转移至PVDF膜上。
  6. 膜分割：将膜分割，从同一次转膜中分别检测目标蛋白、β-actin和GAPDH。
  7. 封闭：在室温下用含5%脱脂奶粉的TBST溶液封闭膜1小时。
  8. 一抗孵育：在4 °C条件下，与裂解型caspase-9（1:200稀释）、裂解型caspase-3（1:200稀释）、裂解型caspase-7（1:200稀释）以及β-actin（1:1000稀释）的一抗孵育过夜。用TBST洗涤膜5分钟，重复3次。
  9. 二抗孵育：室温下与辣根过氧化物酶标记的二抗（1:2000稀释）孵育2小时。用TBST洗涤膜5分钟，重复3次。
  10. 显影：使用Western blot底物显色，并在自动曝光模式下对膜进行曝光以观察蛋白条带。
  11. 通过测定蛋白条带密度计算蛋白含量7。

7. 统计学分析

  1. 使用 SPSS 19.0 软件分析数据，并以均值 ± 标准差表示。采用单因素方差分析对观测值进行统计学分析。以 p< 0.05 为差异具有统计学意义。

结果

HE染色后，对照组大鼠视网膜各层组织结构清晰，细胞排列整齐，染色均匀；而模型组大鼠视网膜结构明显受损，外层视网膜变薄，外核层几乎完全与内核层融合，层内细胞排列极度紊乱，细胞层数显著减少，感光细胞层及外核层厚度明显变薄。对照组与模型组外层视网膜厚度分别为48%和23%（p < 0.01；图2）。

TUNEL 法显示，对照组中未检测到凋亡细胞，而模型组大鼠的外核层中可见一些凋亡细胞（p < 0.01），TUNEL 阳性细胞比例为 9.6%（图 3）。

Caspase 蛋白家族是执行细胞凋亡的主要蛋白家族之一。其中，cleaved caspase 3、cleaved caspase 7 和 cleaved caspase 9 是评估细胞凋亡的经典指标7。Western blot 结果显示，与对照组相比，模型组视网膜中 cleaved caspase 3、cleaved caspase 7 和 cleaved caspase 9 的表达显著升高（p<0.01；图4）。这表明 MNU 可明显引起视网膜细胞凋亡。

大鼠视网膜MNU注射实验；包括眼球解剖、多聚甲醛固定、HE染色。
图1：实验流程图。大鼠经腹腔注射MNU后7天（7d），取麻醉大鼠的视网膜进行HE染色和TUNEL染色。缩写：MNU = N-methyl-N-nitrosourea；HE = hematoxylin-eosin；TUNEL = terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyuridine triphosphate-digoxigenin nick-end labeling。请点击此处查看该图的放大版本。

视网膜结构比较，MNU组与对照组；组织学图像与柱状图；神经元层分析。
图2：MNU注射后第7天的代表性组织病理学HE染色图像。（A）MNU给药后7天（7d）的HE染色结果。（B）外层视网膜比例。数据以均值±标准差表示（n=6）。采用单因素方差分析对观测值进行统计学分析。** p < 0.01，与对照组比较。缩写：GCL = 神经节细胞层；IPL = 内丛状层；INL = 核层；OPL = 外丛状层；ONL = 外核层；PRL = 光感受器层；MNU = N-甲基-N-亚硝基脲；HE = 苏木精-伊红。n = 6。请点击此处查看该图的放大版本。

TUNEL 检测视网膜层的荧光显微镜图像，显示凋亡比较的柱状图。
图 3：TUNEL 检测显示 MNU 诱导大鼠感光细胞发生凋亡。（A）MNU 注射后 7 天（7d），在 MNU 处理组大鼠的外核层（ONL）中可见 TUNEL 阳性细胞（绿色）。（B）TUNEL 阳性细胞比例。数据以均值 ± 标准差表示（n=6）。采用单因素方差分析对观测值进行统计学分析。** p < 0.01，与对照组比较。缩写：GCL = 神经节细胞层；IPL = 内丛状层；INL = 内核层；OPL = 外丛状层；ONL = 外核层；PRL = 感光细胞层；MNU = N-甲基-N-亚硝基脲；TUNEL = 末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸-地高辛缺口末端标记法。n = 6。 请点击此处查看该图的放大版本。

Western blot 显示剪切型 caspase 3、7、9 的表达水平；柱状图显示 caspase/β-actin 比值的比较。
图 4：MNU 注射后第 7 天大鼠视网膜中剪切型 caspase 3、剪切型 caspase 7 和剪切型 caspase 9 的表达情况。 （A）剪切型 caspase 表达的代表性数据。（B）剪切型 caspase 3/β-actin 比值。（C）剪切型 caspase 7/β-actin 比值。（D）剪切型 caspase 9/β-actin 比值。数据以均值 ± 标准差表示（n=6）。采用单因素方差分析对观测值进行统计学分析。** p < 0.01，与对照组比较。 请点击此处查看该图的高清版本。

讨论

视网膜色素变性（RP）是临床上常见的视网膜疾病。RP的发病、严重程度及进展与基因和遗传模式相关，并受环境因素影响8,11。RP包括家族性RP和散发性RP，其中家族性RP约占患者总数的60%。通过追溯家族遗传史，目前已鉴定出83个与RP相关的基因；而散发性RP约占40%，这类患者缺乏家族史，遗传模式不规则2。尽管视网膜感光细胞凋亡导致RP患者视觉功能丧失已被广泛认可，但RP中感光细胞死亡的具体机制仍不明确12,13,14。由于人类视网膜组织获取受限，主要来源于玻璃体切除术中取得的样本，因此从模式动物中提取视网膜组织仍是RP基础研究中的常用方法14,15。

视网膜是位于眼球壁内层的一层透明膜，内侧邻接玻璃体腔，外侧紧贴脉络膜。视网膜前端起自锯齿缘，后端止于视盘，是视觉形成的起始部位16。模式动物的视网膜样本主要用于视网膜PCR分析、Western blot检测、病理组织结构观察、免疫组织化学染色、免疫荧光检测、微血管密度评估、细胞分离与培养等17,18。针对不同检测指标，视网膜取样的要求也各不相同。用于模式动物蛋白因子检测的视网膜取样以及用于石蜡包埋切片的视网膜取样，是筛选视网膜色素变性（RP）治疗药物的常用实验技术8。然而，由于模式动物眼球结构极为精细且复杂，在取样过程中去除眼内干扰组织并获取完整的视网膜标本操作难度较大。取样过程中可能出现视网膜组织丢失、污染、蛋白质降解或视网膜脱离等情况。这些因素将影响视网膜蛋白提取的得率与质量，以及切片染色效果和实验指标的检测结果。因此，需要建立一种 合适的视网膜取样操作流程。

为了改进模式动物视网膜采集技术，关键在于化繁为简，抓住采集中最核心的环节。在模式大鼠用于蛋白因子检测的视网膜取材中，快速暴露视网膜并尽可能完整地剥离视网膜是关键步骤。本研究在麻醉后直接摘取眼球，以节省取材时间。一种有效暴露视网膜的技巧是将眼杯倒扣在1.5 mL离心管上，该方法经济实用，可将视网膜完全从巩膜壁上剥离。该操作流程简便、快速、节约成本，且便于实验人员操作实践，可在5分钟内完成。在用于病理学检查和特定细胞染色的视网膜取材过程中，保持视网膜的新鲜度和结构完整性是获得高质量染色结果的关键步骤。经左心室灌注甲醛后再取视网膜是研究人员常用的方法之一，但该方法耗时较长，且甲醛气味刺鼻，会给操作者带来不适19.。本研究在麻醉后将眼球周围组织环形分离，以保持其完整性。在视神经切断并保留后，于眼球后极分离其周围组织，随后取出眼球。利用视神经准确定位眼球的不同部位。最后，在眼内容物的支撑下进行切口，环形切除角膜，剥离晶状体和玻璃体，获得连接视神经的眼杯（视网膜位于眼杯内侧巩膜壁上）。此过程中操作应轻柔，以维持视网膜的完整性。该操作流程不仅显著提高了材料采集速度，还能保持眼球完整正常的结构与形态，并在取出眼球后准确对应眼球各部位。经过熟练操作，整个过程可在8分钟内完成。通过采用上述视网膜取材方法，本研究团队获得了较为理想的蛋白因子检测结果、HE染色结果以及TUNEL染色结果。

尽管目前的视网膜取样方法具有一些优势，但仍需进一步改进。在进行蛋白因子检测的视网膜取样过程中，暴露视网膜后，由于弯头镊子的支撑点有限，使用其夹取视网膜时存在视网膜分离不完全或组织丢失的风险。因此，有必要改进视网膜分离工具。另一方面，在用于病理学检查和特定细胞染色的视网膜提取过程中，眼球摘除后，在剥离晶状体和玻璃体时，由于失去眼球内部支撑，眼球壁容易塌陷，进而导致视网膜剥离。因此，操作必须迅速、轻柔且力度适中，操作者需要经过反复练习。综上所述，为了更深入地推动中医药对视网膜色素变性（RP）保护作用及其机制的研究，我们的视网膜取样流程仍有待进一步优化。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到宁夏高等教育部门科学研究项目（NYG2022029）的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Amersham 成像仪GE680
过硫酸铵 Boster Biological Technology Co.,LtdA8090
分析天平Mettler ToledoME104E
BCA 蛋白定量试剂盒 Ken Gen Biotech. Co. LtdKGP902
cleaved caspase-3 抗体Cell Signaling Technology#9664
cleaved caspase-7 抗体Cell Signaling Technology#8438
cleaved caspase-9 抗体Cell Signaling Technology#9507
DeadEnd 荧光 TUNEL 检测试剂盒PromegaG3250
甘氨酸 Boster Biological Technology Co.,LtdAR1200
山羊抗兔 IgG H&L (HRP)Bioss Antibodiesbs-80295G-HRP
山羊血清BiosharpBL210A
高速 匀浆器Thermo Fisher ScientificAG22331
Immobilon-P SQ 转膜滤膜Merck Millipore. LtdISEQ00010
异氟烷RWD Life ScienceR510-22-10
甲醇成都科龙化工试剂有限公司20230108
酶标仪Thermo Fisher Scientific1510
显微镜OlympusIX73
显微镜载玻片江苏启东市其昌医疗器械有限公司7105P-G
Mini-PROTEAN Tetra 电泳仪BIO-RAD1658001
N-甲基-N-亚硝基脲sigma-AldrichN4766–100G
烘箱上海跃进医疗器械有限公司DHG-8145
聚丙烯酰胺预混液 (30% )双螺旋生物科技有限公司L3202A
PageRuler 预染蛋白 MarkerThermo Fisher Scientific26617
PBS 缓冲液BiosharpG4202
SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液 (5×)碧云天生物技术P0015
脱脂奶粉BioFroxx1172GR500
Sprague Dawley 大鼠宁夏医科大学SCXK (宁) 2020-0001
TEMED Boster Biological Technology Co.,LtdAR1165
总蛋白提取试剂盒 Ken Gen Biotech. Co. LtdKGP2100
Trans-Blot 转膜模块BIO-RAD1703935
Tris 碱 Boster Biological Technology Co.,LtdAR1162
镊子 常德百康美安生物科技有限公司130302027
β-actinCell Signaling Technology#4970

参考文献

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