改良四血管阻塞法诱导的脑缺血昏迷模型

摘要

本方案描述了采用改良的四血管阻塞法诱导脑缺血性昏迷模型的过程。

摘要

由脑缺血引起的昏迷是脑缺血最严重的并发症。四血管阻塞法可用于建立脑缺血性昏迷模型，服务于疾病研究和药物开发。然而，传统的四血管阻塞方法主要通过将电凝笔插入颈部后方第一颈椎两侧的翼状孔，对椎动脉进行电凝。该操作存在电凝不完全、出血以及损伤脑干和脊髓的风险。术后24小时，需对大鼠再次麻醉，并在颈部前方进行颈动脉结扎。两次手术使大鼠感染风险升高，且延长了实验周期。本研究中，在一次手术过程中采用颈前入路，定位椎动脉穿入第一颈椎的关键部位，在直视下对双侧椎动脉进行电灼，并分离双侧颈总动脉以预先置入松结。当大鼠四肢开始抽搐时，迅速结扎双侧颈总动脉，从而诱导缺血性昏迷。该方法可避免因两次手术带来的感染风险，操作简便且成功率高，为相关研究人员提供了有价值的参考。

引言

缺血性脑损伤是临床实践中最常见的脑损伤，约占脑血管疾病病例的75%。缺血可导致严重的继发性脑损伤和疾病^1,2，而昏迷是缺血缺氧性脑损伤引起的最严重症状，也是多种危重病症的最终通路³。昏迷是临床实践中一种危重且难以处理的严重病症⁴。昏迷持续时间越长，潜在危险越大。及时促醒是防止病情恶化和进展的首要目标。尽管纳洛酮注射液在促醒方面具有广泛的临床应用，但仍存在一些副作用⁵。因此，开发安全有效的促醒药物是一个亟待解决的重要问题。建立一种简便易行的脑缺血性昏迷模型，对于阐明缺血性昏迷的发病机制以及新药研发至关重要^6,7,8。

本研究旨在介绍一种通过电凝双侧椎动脉（VA）和暂时性结扎双侧颈总动脉（CCA）来诱导全脑缺血性昏迷的模型，该模型操作简便，适合初学者使用。先前的方案涉及在第一次手术中暴露第一颈椎后方的双侧翼孔，并通过电灼翼孔以阻断双侧椎动脉；24小时后进行第二次手术，通过结扎双侧颈总动脉诱导完全性缺血性昏迷^9,10,11,12。然而，由于解剖结构不可见，存在电凝不完全、出血、脑干及脊髓损伤的风险，且实验周期较长。因此，有必要解决上述问题。

本文介绍了一种改进的缺血性昏迷建模方法。主要操作步骤包括：在颈部前正中线做切口，在直视条件下进行双侧椎动脉的电凝切除，并在单次手术中短暂结扎双侧颈总动脉，以阻断全脑血供，导致脑电图（EEG）迅速抑制，从而诱发昏迷。该方法在再灌注后还可诱导短暂的持续性昏迷。该手术操作简便，易于掌握，对初学者友好，且可降低实验动物继发性创伤感染的风险，从而缩短实验周期。

该方案适用于研究由心脏骤停引起的全脑缺血性昏迷。同时，它也非常适合用于缺血性痴呆的研究，主要因为海马脑区对缺血极为敏感；因此，短暂性脑缺血可导致海马神经元的损伤甚至丢失¹³，进而引发认知功能障碍。因此，本方案可为从事脑缺血、缺血性昏迷及缺血性痴呆研究的科研人员提供参考。

方案

实验方案严格遵循佛山科学技术学院实验动物使用与管理伦理委员会的要求（记录编号：2023-643656）。本研究选用雄性Sprague Dawley（SD）大鼠（体重200 g ± 20 g，6-8周龄）。所有动物实验数据均按照ARRIVE（动物研究：活体实验报告）指南撰写。研究中所用试剂与设备的详细信息见《材料表》。

1. 脑电图电极的植入

1. 在麻醉前15分钟，皮下注射0.05 mg/kg的阿托品，以预防分泌物引起的呼吸道阻塞和窒息。通过肌肉注射给予20 mg/kg的唑拉西泮和5 mg/kg的赛拉嗪以麻醉大鼠¹⁴。使用镊子夹住大鼠脚趾以确认深度麻醉状态。
2. 使用剃毛器去除大鼠头部的毛发。使用非穿透性耳杆将大鼠头部固定于脑立体定位仪上。用无菌棉球以乙醇和聚维酮碘对术区皮肤进行三次消毒。
3. 使用手术刀沿矢状缝切开大鼠头部皮肤。剥离覆盖颅骨的肌肉组织，充分暴露颅骨。在整个过程中使用无菌棉签控制出血。
4. 使用洗耳球吹干颅骨表面，以利于牙科水泥牢固粘附。用黑色记号笔标记颅钉（直径1.2 mm，长度3 mm）的安装位置（图1，步骤1），具体位置包括前囟点及另外四个位点。
5. 使用10 mL注射器针头依次旋转钻孔四个区域，并依次将四枚颅钉植入颅骨，确保其与大脑皮层接触（图1，步骤2-3）。
   注意：若出现出血，使用无菌棉签吸除血液，以防骨钉生锈。
6. 将脑电图电极的银丝缠绕在颅钉上。将肌电图电极植入肌肉组织中，并用6-0缝线固定。
7. 将义齿基托树脂与自凝义齿粉混合，将电极固定于颅骨上。使用洗耳球向牙科水泥表面吹气，以加速固化。
8. 注射10,000单位青霉素以预防感染。将每只大鼠单独饲养，防止相互撕咬导致电极损坏。连续三天每日皮下注射0.2 mg/kg美洛昔康，以缓解术后疼痛。给予3天恢复期，使大鼠伤口愈合并确保电极稳固固定（图1，步骤4）。

2. 脑缺血昏迷模型的手术过程

1. 三天后，重新麻醉大鼠并使其仰卧。使用无菌棉球 通过碘伏重复消毒手术部位三次，随后进行酒精消毒 酒精冲洗/擦拭。用手术刀从胸骨上缘沿颈部中线纵向切开约2-3厘米长的切口（图1，步骤5）。
2. 钝性分离皮下组织和胸骨舌骨肌，充分暴露气管以及气管两侧的颈长肌¹⁵.
   注意：在整个操作过程中应避免刺激气管。
3. 钝性分离甲状腺水平以下的颈长肌，暴露第一和第二颈椎。使用大鼠组织扩张器扩大颈部区域，充分暴露手术部位。
4. 使用精细镊子仔细分离颈椎椎间隙中可见的肌肉和组织，暴露椎动脉进入第一颈椎的特征性位置。可观察到椎动脉穿过第一颈椎（图1，步骤6）。
   注意：在颈部下方放置一支1 mL注射器可提供更清晰的手术操作空间。
5. 预热电凝笔，插入目标区域3-5秒，确保椎动脉被电凝并切断。沿胸锁乳突肌内侧缘分离肌肉和筋膜，暴露并游离双侧颈总动脉，打松结备用。
   注意：电凝笔必须预先加热，否则无法快速凝固椎动脉，导致出血。需对两侧椎动脉进行电凝，并在颈总动脉（CCA）周围打松结。
6. 当大鼠恢复意识并出现肢体抽搐，且脑电图检测器检测到活跃的脑电图和肌电图信号时，迅速扎紧第一个松结以阻断颈总动脉（CCA）血流。大鼠将挣扎数秒，随后逐渐失去意识。图1，步骤7）。
7. 固定解除后，观察到大鼠四肢僵硬，翻正反射消失，但呼吸仍维持。此时肌电图（EMG）呈直线，脑电图（EEG）迅速受到抑制，表明4-VO诱导的脑缺血模型建立成功。¹⁶.
   注意：部分大鼠在双侧颈总动脉结扎期间会出现呼吸抑制。快速机械刺激可使部分大鼠恢复自主呼吸。
8. 根据 "针控结扎法¹⁶," 用6-0尼龙线在颈总动脉（CCA）分叉处（即颈内动脉ICA和颈外动脉ECA分叉点）约1.5 cm处，以直径0.5 mm的注射器针头为模具结扎CCA。小心抽出针头；此第二结将导致颈总动脉狭窄。图1，步骤8）。
   注意：用于颈总动脉狭窄的结扎线必须由稳定的尼龙材料制成。尼龙线不受血液影响，不会发生肿胀；否则可能导致大鼠颈总动脉严重狭窄，并增加死亡率。
9. 缺血30分钟后，松开第一个结扎线，颈总动脉（CCA）将恢复灌注，但第二个结扎线将导致CCA狭窄，从而诱导持续性昏迷（图1，步骤9）。使用可吸收单丝缝线缝合皮下组织，使用不可吸收单丝缝线缝合皮肤。

3. 动物恢复

1. 将大鼠置于绝缘垫上，并注射 10,000 单位青霉素以预防感染。 皮下注射 0.2 mg/kg 梅洛昔康，连续三天，以缓解术后疼痛。
2. 再灌注 60 分钟后，确保大鼠逐渐恢复。

结果

由于电极植入引起的炎症及其他刺激，脑电图（EEG）可能不稳定，因此大鼠需要恢复3天。3天后脑电图和肌电图（EMG）正常的大鼠方可用于昏迷模型的制备。麻醉状态下，大鼠的脑电图和肌电图活动轻度受抑，但仍保持平稳。双侧椎动脉电凝阻断后，脑电图和肌电图活动无明显变化。约30分钟后，药物代谢完毕，大鼠逐渐恢复意识，脑电图和肌电图活动增强。当大鼠出现肢体抽动，且脑电图与肌电图信号活跃、不再呈直线时，迅速结扎颈总动脉（CCA）。此时，负责脑部供血的四条血管均被阻断，导致全脑缺血。脑电图和肌电图活动迅速受到抑制，几乎呈直线，大鼠不再挣扎，眼球呈现灰白色（图2A）。若大鼠无法进入昏迷状态，则表明模型制备失败。

30分钟后，释放颈总动脉（CCAs）的第一根结扎线以恢复灌注，但保留在颈总动脉前方的第二根结扎线仍维持较低的灌注水平，从而使大鼠持续处于昏迷状态约60分钟。随着机体逐渐代偿和血液灌注的恢复，大鼠逐渐苏醒（图2B）。大鼠苏醒后，脑电图（EEG）和肌电图（EMG）几乎完全恢复正常...

讨论

四血管阻塞可诱导全脑缺血和缺氧性脑损伤，能够模拟临床上由脑缺血引起的急性昏迷、心脏骤停、窒息、休克、严重心律失常等危重临床状况。同时，四血管阻塞主要导致海马区损伤^17,18，而海马是负责认知记忆功能的主要脑区^19,20,21。因此，四血管阻塞也可用于模拟血管性痴呆模型^22,23。综上所述，四血管阻塞诱导的全脑缺血模型已被广泛用于模拟上述临床疾病。

1979年，Pulsinelli等人¹⁰通过阻断双侧颈总动脉和双侧椎动脉，实现了全脑缺血与再灌注。自此以后，该模型逐渐成为国际公认的全脑缺血模型的经典制备方法

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
16通道微纤维光电极阵列	Jiangsu Yige Biotechnology Co., Ltd	2605
4-0外科缝合线	Nantong Holycon Medical Devices Co.,Ltd.	B-104
6-0外科缝合线	Ningbo MEDICAL Needle Co., Ltd.	JM1216-742417
脑电图电极	Kedou Brain machine Technology Co., LTD	KD-EEGEMG
电凝笔	CONPUVON Company	465
Lunion Stage自动睡眠分期系统	上海 lulian 智能科技有限公司	1336
微型手持式颅骨钻	Rayward Life Technology Co., Ltd	87001
青霉素钠	成都科龙化工有限公司	17121709-2
SD大鼠	SPF (北京) 生物技术有限公司	180-220g
颅骨钉	GLOBALEBIO,LTD	/
立体定位仪	Rayward Life Technology Co., Ltd	68801
Zoletil 50	Vic Trading (Shanghai) Co., LTD	BN 88SHA