方法文章

一种用于神经突生长测量的新型半自动软件的标准化

DOI：

10.3791/67163

⸱

2024年8月9日

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1Neuroscience Institute Cavalieri Ottolenghi, University of Turin, 2Department of Neuroscience Rita Levi-Montalcini, University of Turin, 3University School for Advanced Studies IUSS Pavia

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

神经突生长实验可提供有关神经元再生过程的定量数据。该半自动软件的优势在于，通过创建掩膜将细胞体和神经突分别进行分割，并测量多种参数，如神经突长度、分支点数量、细胞体簇面积以及细胞簇数量。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

有效的活体成像技术对于评估神经元形态、实时测量神经突生长至关重要。多年来，神经科学研究领域一直面临准确测量神经突生长的挑战。该参数是众多 体外 实验装置涵盖从离解培养、器官型培养到细胞系等多种体系。通过量化神经突长度，可判断特定处理是否有效，或不同实验组中轴突再生是否增强。本研究旨在展示 Incucyte Neurotrack 神经突生长分析软件的稳健性与准确性。该半自动软件集成于延时显微成像系统，相较于传统方法在相位对比图像中量化神经突长度具有多项优势。该算法对每幅图像中的多个参数进行掩膜与量化，输出包括神经突长度、分支点、胞体簇及胞体簇面积在内的神经元细胞参数。首先，我们通过将软件所得数据与手动分析工具 NeuronJ（Fiji 插件）的结果进行相关性分析，验证了其稳健性与准确性。其次，我们应用该算法对相位对比图像和免疫细胞化学图像均进行了处理。利用特异性神经元标记物，我们验证了基于荧光信号的神经突生长分析在感觉神经元中的可行性。 体外 培养物。此外，该软件可测量不同接种条件下神经突的长度，范围涵盖单个细胞至复杂的神经元网络。综上所述，该软件为神经突 outgrowth 检测提供了一个创新且高效的平台，为更快速、更可靠的定量分析开辟了新途径。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在坐骨神经中，可以测量轴突再生1此外， 体外 研究表明，监测轴突生长是可行的2,3 以理解其在健康与受损神经元中的各个阶段，从轴突发芽到轴突变性。通过追踪这些过程，可以测量轴突极性、起始、稳定性及分支等参数。其中，分支参数对于理解神经性疼痛感知至关重要。4,5,6同样，轴突变性过程可以被监测 在体内7 或 体外8,9在神经突生长过程中，肌动蛋白和微管细胞骨架网络会根据细胞的需求进行稳定或改变10微丝细胞骨架发生重组，以促进轴突生长锥的形成，同时微管重新排列成束，以稳定生长中的神经突11为了研究中枢和外周神经元的神经突生长 体外，通常量化三个常见参数：总轴突长度、最大距离和分支点数量。这些参数用于研究神经元在治疗干预（如神经营养因子、化合物、抑制剂、视黄酸、siRNA、shRNA）下或在基因修饰动物中的轴突发芽反应12,13,14为了评估神经元是否具有更长的神经突和/或更多的分支，这三个参数可用于评估神经元的形态。在多项研究中，神经突长度测量是最受关注的参数 体外 实验装置。从背根神经节主要进行两种类型的培养：解离培养 体外 背根神经节全组织块培养或类器官培养。无论哪种情况，神经突长度都是评估实验结果的关键指标。在类运动神经元细胞系（NSC-34）中，通过维甲酸诱导分化后，测量轴突的外延生长和分支情况。15,16事实上，通过测量神经突的生长情况，可以确定某种特定处理是否有效。17，生长速率18或损伤操作后的再生能力19.

多年来，如何正确评估神经突生长一直在研究领域中带来诸多挑战。然而，神经突长度的测量尚未实现标准化。目前使用最广泛的一些方法包括 体外 例如，Fiji 上的手动 NeuronJ 插件可用于细胞培养18,20 或 MetaMorph21,23 以及半自动Neurolucida23,24除了手动方法外，还有一些自动化方法，例如 Fiji 上的 NeuriteTracer 插件。25，HCA Vision 软件26,27，或 WIS-NeuroMath2,28其他准确性较低的方法依赖于测量神经元的整体尺寸，包括测量从胞体到最长轴突末端的矢量距离。29 或Sholl分析30然而，这些测量方法仅适用于极低密度的培养物或单个神经元。此外，所有这些方法主要应用于经染色的神经元或表达基因编码荧光蛋白（如GFP、Venus、mCherry）的神经元。神经元类型和细胞培养密度会显著影响测量方法的选择。例如，对形态极为复杂精细的神经元（如背根神经节神经元）进行手动分割，可能很快变得无法完成。如果结构迂曲的神经元已经难以实现准确分割，那么由于神经网络具有高度复杂的组织结构，其手动分割则完全不可行。

一方面，手动分割非常精确，因为它由人眼和人类智能完成；但另一方面，这种方法确实耗时。手动方法所需时间较长是其主要缺点。因此，仅能获取少量神经元用于分析，导致分析结果准确性较低，且耗时成本较高。而自动或半自动方法则在一定程度上减少了时间消耗。然而，这些方法也存在一些缺点。自动方法需要经过训练才能正常工作，如果软件与用户的交互性不足，分割结果可能会出错。

除了神经突生长长度的测量外，分支点的数量也是重要的信息。通过手动分割可以计算分支点的数量，而使用矢量距离法则无法实现。对于自动分析方法，通常可直接提供分支点数量；而在使用Sholl分析时，则需通过数学公式进行计算。

在本方法学论文中，我们旨在描述该半自动软件在测量总轴突长度及其他参数方面的功能与有效性。该仪器可自动在预设时间点获取图像，或用于开展长期研究（数天、数周乃至数月），同时为活细胞维持生理环境。采用相差显微时程成像技术测量神经突生长具有优势，可实现对神经突动力学及生长过程的连续监测。此外，还可通过在培养基中添加特异性染料标记死亡细胞，以同步监测细胞死亡情况31,32,33。尽管该软件自2012年已发布，但我们是首次以可重复且无偏倚的方式对该方法进行标准化，以实现对神经突生长的精确定量。然而需注意，该软件并非随仪器购买附带。尽管需额外支出费用，但其在测量总轴突长度及其他参数方面具有显著优势，因而对神经科学领域的研究具有重要贡献。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 在仪器上扫描容器

注意：检测由内置的 Basler Ace 1920-155 µm 相机完成。

  1. 单击以打开程序 连接到设备 并选择 时间表 - 获取然后点击 + 信号
  2. 选择相应选项，指定容器将被重复扫描还是仅扫描一次 定时扫描 或 扫描一次，立即完成分别。
  3. 选择 新方法 创建一个全新的容器进行扫描。如果未添加新容器，则使用以下选项之一创建新的扫描。
    1. 选择 复制当前 通过从当前时间表复制一个容器来创建新容器。选择 复制上一步 通过复制先前扫描的血管来创建新血管。
    2. 选择 添加扫描 用于恢复先前已扫描的血管以进行额外扫描。
  4. 根据实验和应用选择扫描类型。进行分析时，选择 标准.
  5. 指定扫描参数。选择一种逐细胞扫描模式，即“无”、“贴壁细胞逐细胞”或“非贴壁细胞逐细胞”，并根据所使用的荧光分子设定相应的成像通道。选择 无 成年与胚胎感觉神经元培养的可选方案。对于细胞系，选择 无或贴壁细胞逐个分离 选项
  6. 选择显微镜物镜（4倍、10倍、20倍）。在原代培养中使用较高放大倍数（20倍）进行成像，而在细胞系中，10倍物镜已足够。
  7. 从提供的选项中选择要扫描的容器类型。通过在抽屉的虚拟地图上选择其位置，标明容器在抽屉中的具体位置。
  8. 通过选择要扫描的孔来指定图像采集的扫描模式。选择每个孔所需的图像数量。扫描持续时间的估算值将显示出来。
  9. 通过输入名称提供容器信息，并通过点击指定板图 + 信号
  10. 点击 下一步选择分析类型，然后单击 下一步所选选项的摘要页面将会出现。如果无误，请点击 立即扫描 扫描将开始。

2. 相差图像分析的设置

注意：Neurotrack 分析只能对机器先前获取的图像进行。

  1. 选择要分析的已扫描血管。选择启动分析。选择创建新分析定义。
  2. 选择Neurotrack。选择图像通道。选择一组代表性图像以执行分析。为训练算法，请选择每个孔中的所有图像。
  3. 通过调整以下参数来优化分析定义设置。
    注意：默认情况下，神经突以品红色分割，而细胞体以黄色分割。可根据需要修改颜色。
    1. 针对细胞体簇分割，请按以下说明调整参数。
      1. 分割模式：图像分割用于区分细胞体与背景及神经突。可在亮度和纹理之间选择。对于原代培养和细胞系，选择亮度模式。
      2. 分割调整：使用滑块调节分割对背景或细胞的敏感度。范围从0（背景）到2（细胞）。该设置会增大或减小黄色掩膜的大小。将滑块向0（背景）方向移动，黄色掩膜将逐渐缩小，为品红色掩膜留出空间；反之，若将滑块向2（细胞）方向移动，则会产生相反效果。
    2. 针对清理操作，请按以下说明调整参数。
      1. 填充孔洞（µm2）：调整此参数可移除小于用户指定面积的细胞体掩膜中的任何孔洞。
      2. 调整大小（像素）：按指定像素数增加（正值）或缩小（负值）黄色掩膜。范围为-10至+10。通过此设置可对高对比度对象（如死细胞和细胞碎片）上的黄色分割进行添加或去除。
      3. 最小细胞宽度（µm）：选择一个值以定义被视为神经突的细胞体尺寸。
    3. 针对细胞体簇筛选条件，请按以下说明调整参数。
      1. 面积（µm2）：设定细胞体面积的最小值和最大值。超出或低于设定值的对象将不被视为细胞体。
    4. 针对神经突参数，请按以下说明调整参数。
      1. 过滤：用于减少对微小血管缺陷和碎片的掩膜。可在无、较好和最佳选项之间选择。仅在培养物和容器非常洁净时选择无。选择较好可加快处理速度，但会损失对极细神经突的检测能力；对于具有较粗或高对比度神经突的细胞可能已足够，也可用于存在较多缺陷或碎片的容器。选择最佳将延长处理时间，但这是最敏感的滤波设置，可确保检测到极细的神经突。
      2. 神经突敏感度：用于调整检测灵敏度。提高灵敏度可检测更细的神经突。范围从0.25（较低）到0.75（较高）。
        注意：该设置会增加或降低软件识别神经突的敏感性。若将滑块移向0.25（较低），软件对神经突的识别将更严格；反之，若将滑块移向0.75（较高），软件的识别将更宽松，因此更多瑕疵（如细胞碎片、污物）将被识别为神经突。
      3. 神经突宽度（µm）：用于根据神经元的大小调节检测参数。可选值为1、2或4。增大该值将忽略更细的神经突。对于原代成年感觉神经元培养，设为1；对于细胞系和胚胎感觉神经元培养，设为2。
  4. 点击预览当前以查看分割后的图像。每张图像将提供以下测量结果：神经突长度（mm/mm2）、神经突分支点数（每mm2）、细胞体簇数量（每mm2）以及细胞体簇面积（mm2/mm2）。
  5. 对所有选定图像重复步骤2.3和2.4。点击下一步。
  6. 选择要分析的扫描时间和孔。指定一个定义名称，如有需要，添加分析备注。点击下一步 > 完成。

3. 免疫细胞化学（ICC）图像分析的设置

  1. 按照 2.1 至 2.4 中所示的相同步骤操作。选择用于神经突和细胞核的图像通道。选择图像集；为每个孔选择所有图像以训练算法。
  2. 通过调整以下参数来优化分析定义设置，具体如下所述。
    注意：默认情况下，神经突以蓝色分割，而细胞体为紫色。然而，颜色可根据需要进行修改。
    1. 细胞体聚类分割：用于将图像分割为感兴趣的物体。估算图像中每个像素的背景亮度。在找到背景后，执行以下选项之一。
      1. 无背景扣除：用于在不修改原始图像的情况下进行分割。可在自适应阈值或固定阈值之间选择。自适应：使用背景来寻找物体，但不显式扣除背景；使用此选项时，可设置阈值调整（GCU）。固定阈值：在原始图像中检测亮度高于该阈值的物体；使用此选项时，可设置阈值（GCU）。
      2. 背景扣除：使用此选项通过Top-Hat变换从图像中扣除背景，然后应用阈值。使用此选项时，需设置半径和阈值。半径：使用具有此半径的圆盘；该圆盘应足够大，使其无法完全容纳于图像中的任何物体内部。阈值：在扣除背景后的图像中检测亮度高于该阈值的物体。
    2. 清理：使用以下选项执行此操作。
      1. 填充孔洞（µm2）：用于移除细胞体掩膜中面积小于指定值的任何孔洞。
      2. 调整大小（像素）：用于按指定像素数增加（若为正值）或缩小（若为负值）紫色掩膜。范围为 -10 至 +10。可在高对比度物体（如死细胞和细胞碎片）上添加或去除紫色。
      3. 最小细胞宽度（µm）：用于定义将细胞体视为神经突的尺寸。
    3. 细胞体聚类滤波器：使用以下选项应用滤波器。
      1. 面积（µm2）：设置细胞体面积的最小值和最大值。超出或低于设定值的物体将不被视为细胞体。
    4. 神经突参数：使用以下选项进行设置。
      1. 神经突粗调灵敏度：用于调整神经突亮度。若神经突荧光强度较低，应提高灵敏度。范围为 0（较低）至 10（较高）。该参数可提高或降低软件对较暗神经突的识别灵敏度。最佳值范围为 7 至 10；需注意，若设置为 10，则背景很可能也被计入神经突测量中。
      2. 神经突细调灵敏度：用于调整检测灵敏度。应提高灵敏度以检测更细的神经突。范围为 0.25（较低）至 0.75（较高）。该参数可提高或降低软件对细小且较暗神经突的识别灵敏度。若滑块移向 0.25（较低），软件将忽略微弱的神经突；若滑块移向 0.75（较高），软件将检测到非常微弱（几乎与背景相近）的神经突。
      3. 神经突宽度（µm）：用于根据神经元的大小调整检测参数。可选值为 1、2 或 4。增大该值后，较细的神经突将不被考虑。对于原代成年感觉神经元培养，应设为 1；对于细胞系和胚胎感觉神经元培养，应设为 2。

4. 数据导出

  1. 打开分析。点击 Graph Metrics。
  2. 选择感兴趣的 指标、时间点 和 孔板孔位。
  3. 在“全部”、“无”、“列”、“行”和“孔板图重复”之间选择分组选项。
  4. 点击 导出数据，选择目标文件夹及所需其他选项。系统将生成一个 .txt 文件。
    注意：仪器将为每个孔提供所选指标的单一平均值。在分析过程中需手动标注，以获取单张图像的数值。

5. 图像导出

  1. 打开容器。点击 导出图像 和 视频.
  2. 选择图像的导出类型。
    1. 选择 如所示 导出为显示的图像。点击 下一步 并选择 感兴趣的图像 用于出口。点击 下一步.
      1. 选择 序列类型 在单个视频或一系列图像与感兴趣的时间点之间进行选择。点击 下一步.
      2. 根据需要调整导出选项，然后单击 下一步设置输出文件夹、文件格式和文件名，然后单击 导出.
    2. 选择 如储存状态 以原始格式导出图像。选择 图像类型.
      1. 选择 时间点 和 目标孔. 点击 下一步设置输出文件夹、文件格式和文件名，然后单击 导出.
  3. 带分割掩膜的图像导出
    1. 打开分析。点击 图像图层的图标. 选择 期望的通道掩膜 （相位神经突和相位胞体簇）。执行步骤5.2。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

神经突生长测量算法能够稳健地检测神经网络和单个神经元中的神经突。该算法生成一个黄色掩膜，用于分割高对比度的物体，例如细胞体、细胞碎片、死亡细胞、组织外植体和阴影。此外，不同厚度的神经突上会出现品红色掩膜。神经突长度值以 mm/mm2 表示，说明轴突长度已被除以图像面积（0.282739 mm2），该面积在所有扫描条件下保持恒定。因此，为了获得以 mm 为单位的神经突长度绝对值，需将软件提供的数值乘以图像面积。

半自动方法与手动方法的比较
所使用的软件是一种用于测量总轴突长度的半自动方法。为了评估该软件的准确性，我们同时使用 NeuronJ 插件通过手动方法对相同神经元进行了测量。如图1所示，两种方法在神经元上的分割掩膜高度相似（图1A）。

此外，我们对获得的数值进行了统计学分析以检验其相关性。Spearman 相关性分析得到较高的相关系数 r 值为 0.8526，因此为该算法的准确性和精确性提供了有力证据（图 1B）。自动测量对培养物的质量有较高要求，主要基于其清洁度、密度和纯度。半自动分割所获得的结果具有可重复性，且不受个体判断的影响。而手动方法则存在无偏性与可重复性的问题。

有时，由于各种原因，半自动分割可能会出现错误。在相差图像中，培养物中的杂质可能被半自动分割误识别为神经突。此外，不同细胞类型的存在也可能干扰分割过程。这类问题在手动分割中不会出现，因为手动分割依赖人眼判断。尽管如此，若出现上述问题，可通过使用免疫细胞化学图像作为对照来克服。

神经突的分割
对于成年动物背根神经节（DRG）神经元的原代培养，进行可靠相位分析的最佳起始条件是神经元在孔板中均匀铺板且培养环境洁净。如果在接种过程中出现错误，导致细胞聚集在某一区域（如图2A-B所示），则测量结果将更多地表现为估算值，而非对实际情况的准确反映。在这种情况下，黄色掩模会覆盖细胞之间大部分的神经突（图2A-B），从而导致神经突长度的丢失。此外，软件在识别神经突时会出现显著偏差，极有可能在非神经突结构上出现品红色掩模（图2D）。在理想图像中，20倍放大下应包含不超过15个神经元。

当神经元接种得当且培养环境洁净时（如图3A-B所示），建议将分割滑块向背景方向调整（0.5 - 0.7；图3C）。这有助于减少图像中高对比度结构上出现的黄色成分，例如本应呈现品红色的分支点。此外，如果神经突较粗，将神经突敏感度设置在0.4至0.5之间通常足以覆盖大多数神经突（图3C-D）。

另一种常见的情况是培养物受到污染，含有大量细胞碎片和死亡细胞，如图4A-B所示。在这种情况下，会存在许多高对比度的物体。因此，建议通过将分割滑块向细胞方向调节，或增大调整大小参数（+1、+2等；图4C），来增加黄色掩膜的尺寸。然而，也建议略微降低神经突的敏感度，以防止软件将非神经突结构错误识别为神经突（图4C-D）。

有时，神经突会显得非常细且颜色浅淡，如图5A-B所示，这会给软件准确分割带来困难（图5D）。此时，建议将神经突敏感度至少提高至0.6（图5C）。但需注意，敏感度越高，软件越有可能将非神经突结构错误地识别为神经突（图5D）。为防止敏感度偏差过大，可采取一些预防措施，例如将分割滑块向细胞方向调整。然而，若神经突过细以致软件无法检测，则无论采取何种措施，神经突长度的测量值都将存在偏差。

对于免疫细胞化学图像，主要问题在于背景信号。除了上述规则适用的铺板条件外，荧光信号本身是偏差的主要来源。软件能够有效识别非常明亮的神经突，而较细且荧光强度较低的神经突则容易被遗漏（图6A-B）。为避免神经突长度的丢失，可将神经突精细敏感度提高至0.75（图6C）。然而，强烈建议将神经突粗略敏感度至少降低至8-9，以避免将背景中的信号误判为神经突，从而导致过度检测的偏差（图6C-D）。若不降低该参数，则整个背景都将被分割，如图7所示。

荧光采集过程中常见的问题是光的散射。免疫细胞化学图像中经常出现光晕现象，这会显著影响分析的质量和精确性（图8A-B）。在这种情况下，很难有效改善分析结果，所得数值更接近于估算。光散射会干扰神经突的识别，导致只有非常明亮的神经突才能被检测到（图8C-D）。免疫细胞化学图像中的另一个问题是染色本身的质量。由于人为操作误差，轴突常常出现断裂（图9A），细胞体也可能在洗涤过程中被冲走（图9B）。这些错误会造成严重问题，使神经突长度的测量值失去精确性和准确性，进而影响生物学数据的解读，导致错误的结论。

对于胚胎培养物，情况有所不同。在此类培养中，胶质细胞占主导地位。因此，由于软件还会检测到胶质细胞的边缘，误差会显著增加（图10A-B）。为尽量减少这一问题，应将分割滑块向“细胞”方向调整，通常设置在1.7–2左右（图10C-D）。该方法可确保大部分胶质细胞被黄色掩膜覆盖，从而在测量 neurite 长度时不将其纳入分析。另一个实用建议是将 neurite 宽度保持为2，因为培养中的胚胎神经元通常呈现双极或单极形态，且 neurite 较粗（图10C-D）。这一设置有助于滤除通常非常细的胶质细胞边缘。最后，需注意不要将 neurite 敏感度调得过高；否则，原本由 neurite 宽度参数滤除的结构将再次被计入 neurite 长度的测量中。

对于胶质细胞成分占主导地位的胚胎培养，免疫细胞化学可能是更佳的选择。通过特异性标记神经元，可避免对胶质细胞进行分割的问题，因为胶质细胞不会被染色，从而使分析更加简便且准确（图11）。

最后，该软件还可用于评估细胞系和/或诱导多能干细胞（iPSCs）的分化程序，以判断其生长状态。因此，类似参数和注意事项可适用于不同目的。

关于分化过程，该软件在NSC-34细胞系（由小鼠神经母细胞瘤细胞与源自小鼠胚胎脊髓的运动神经元融合而成的杂交细胞系）向类运动神经元成熟的过程中已证实具有良好的稳健性。对于背根神经节（DRG）原代培养，获得理想分析结果的关键在于细胞接种的均匀性。未分化和经视黄酸处理后分化的细胞，可通过整个培养期间的连续成像进行追踪，或如图12所示，在培养的最后一个时间点进行观察。

事实上，除了神经突长度外，该算法还提供分支点参数。然而需要注意的是，分支点参数并不代表分支点的精确数量；它表示的是图像中分支的密度，单位为 mm/mm2。该测量值显著受到培养物中碎片和接种浓度的影响。因此，图像中神经元的密度以及培养物的洁净程度是获得可靠数据的关键因素。如果培养物中存在大量未被黄色掩膜过滤掉的细胞碎片，这些碎片将被计入神经突长度以及分支点的测量结果中。

因此，建议根据细胞数量对这些数值进行归一化处理，因为图像中神经元的数量会影响神经突长度和分支点的测量结果。

细胞体的分割
系统提供的所有参数中包含细胞体簇和细胞体簇面积。然而，这两个参数并不可靠，不能用于细胞计数。如图4所示，软件会在黄色掩膜中标记高对比度的物体，其中包括由于孔板内培养基流动造成的阴影。此外，软件还会将死亡细胞和细胞碎片进行分割（图4）。为了获得生长中神经元的可靠细胞计数，可采用手动方法，例如 Fiji 中的细胞计数器工具（图13）。

针对相位图像和免疫细胞化学图像，按培养类型分类的建议分析参数汇总分别见表1和表2。此外，针对特定问题的建议分析参数汇总见表3。

神经元生长分析对比、显微图像及相关性图、数据指标可视化。
图1：手动与半自动轴突分割方法之间的相关性分析。（A） 左侧为使用Fiji软件中NeuronJ插件进行分割的神经元代表性相差图像；右侧为使用半自动软件分割的神经元代表性相差图像。（B） 对20个神经元分别采用手动和半自动方法进行简单线性回归分析。Spearman相关系数r = 0.8526，p**** < 0.0001。图像在接种后48小时采集。放大倍数为20倍。比例尺为50 µm。该图使用BioRender绘制。请点击此处查看该图的放大版本。

细胞分割；相差图像和Neurotrack分割示意图；神经突分析设置；显微镜图像。
图2：成年感觉神经元培养中的接种误差。（A） 接种误差的代表性相差图像。（B） 代表性自动分割图像。黄色掩模用于分割胞体，洋红色掩模用于分割神经突。（C） 神经突生长分析定义参数示意图。（D） 上图：由于胞体聚集导致的胞体分割误差（黄色掩模）的放大图。下图：由于细胞碎片导致的神经突分割误差（洋红色掩模）的放大图。图像为接种后48小时采集。放大倍数20倍。比例尺，50 µm。该图使用BioRender绘制。请点击此处查看此图的放大版本。

神经突分析过程；显微镜下的分割图像、相位神经突及调整设置。
图3：用于神经突生长分析的理想成年感觉神经元培养。（A）适用于神经突生长分析的代表性理想接种条件的相位图像。（B）代表性自动分割图像。黄色掩模用于分割细胞体，洋红色掩模用于分割神经突。（C）神经突生长分析定义参数示意图。（D）细胞体分割（黄色掩模）和神经突分割（洋红色掩模）的放大图。图像于接种后48小时采集。放大倍数20倍。比例尺为50 µm。该图使用BioRender绘制。请点击此处查看此图的放大版本。

神经突生长分析，经 NeuroTrack 分割的图像，突出显示细胞簇及参数
图 4：成年感觉神经元培养中神经突生长分析的干扰因素。（A） 培养基流动引起的细胞碎片和阴影的代表性相差图像。（B） 代表性自动分割图像。黄色掩膜分割细胞体，洋红色掩膜分割神经突。（C） 神经突生长分析参数的示意图。（D） 由于细胞碎片及培养基流动产生的阴影，导致细胞体分割（黄色掩膜）和神经突分割（洋红色掩膜）出现误差的局部放大图。图像于接种后 48 小时采集。放大倍数 20×。比例尺，50 µm。该图使用 BioRender 制作。请点击此处查看此图的放大版本。

具有分割、相位图像、参数和神经突追踪结果的神经突分析示意图。
图 5：成年感觉神经元培养中神经突生长分析中的细神经突。(A) 具有极细神经突的神经元的代表性相位图像。(B) 代表性自动分割图像。黄色掩膜分割胞体，品红色掩膜分割神经突。(C) 神经突生长分析定义参数示意图。(D) 上图：因神经突分割检测限（品红色掩膜）导致神经突长度丢失的局部放大图。下图：神经突分割（品红色掩膜）在异物上的误差局部放大图。图像于接种后 48 小时采集。放大倍数 20×。比例尺，50 µm。该图使用 BioRender 制作。请点击此处查看该图的放大版本。

使用免疫细胞化学、分割图像、软件参数、细胞网络和Tuj1标记物进行神经突分析的示意图。
图6：成年感觉神经元培养中神经突生长分析的神经突亮度。（A） 免疫细胞化学代表性图像（神经元标记物Tuj1），显示具有非常明亮且粗壮神经突的神经元。（B） 代表性自动分割图像。紫色掩模用于分割胞体，蓝色掩模用于分割神经突。（C） 神经突生长分析参数定义示意图。（D） 上图：由于神经突较粗导致胞体分割错误（紫色掩模）的局部放大图；下图：由于粗大神经突荧光信号过强而导致神经突长度丢失的局部放大图。图像于接种后48小时采集。放大倍数20倍。比例尺为50 µm。该图使用BioRender绘制。请点击此处查看此图的放大版本。

轴突分析示意图、分段ICC图像、Tuj1标记、胞体滤波器、轴突参数。
图7：成年感觉神经元培养中轴突发芽分析的背景荧光问题。（A） 免疫细胞化学图像（神经元标记物Tuj1）的代表性示例，显示较高的背景荧光噪声。（B） 代表性自动分割图像。紫色掩模用于分割细胞体，蓝色掩模用于分割轴突。（C） 轴突发芽分析参数定义示意图。（D） 由于背景荧光干扰导致轴突分割错误（蓝色掩模）的局部放大图。图像采集于接种后48小时。放大倍数20倍。比例尺为50 µm。该图使用BioRender绘制。请点击此处查看此图的放大版本。

使用Tuj1标记物进行神经突分析；神经网络识别的免疫细胞化学图像及分割方法。
图8：成年感觉神经元培养物中神经突生长分析的光散射现象。（A） 光散射现象的代表性免疫细胞化学图像（神经元标记物 Tuj1）。（B） 代表性自动分割图像。紫色掩膜用于分割细胞体，蓝色掩膜用于分割神经突。（C） 神经突生长分析参数的示意图。（D） 上图：聚焦于因光散射干扰导致的神经突长度丢失；下图：聚焦于细胞体分割错误（紫色掩膜）。图像于接种后48小时采集。放大倍数为20倍。比例尺为50 µm。该图使用BioRender绘制。请点击此处查看此图的放大版本。

神经元细胞相差图像和免疫细胞化学图像，显示48小时时的细胞结构和蛋白质表达。
图9：影响染色过程质量的错误，干扰成年感觉神经元培养中神经突生长的分析。（A）左侧为成年感觉神经元的代表性相差图像；右侧为染色过程中因洗涤导致神经突断裂的代表性免疫细胞化学图像（神经元标志物Tuj1）。（B）左侧为成年感觉神经元的代表性相差图像；右侧为染色过程中因洗涤导致细胞体脱落的代表性免疫细胞化学图像（神经元标志物Tuj1）。图像于接种后48小时采集。放大倍数为20倍。比例尺为50 µm。该图使用BioRender绘制。请点击此处查看此图的放大版本。

使用 Neurotrack 进行神经突追踪与分析；分割成像，相差显微镜结果。
图 10：用于神经突生长分析的理想胚胎期（E13.5）感觉神经元培养。（A） 胚胎期感觉神经元培养中用于神经突生长分析的理想接种条件的代表性相差图像。（B） 代表性自动分割图像。黄色掩模用于分割细胞体，洋红色掩模用于分割神经突。（C） 神经突生长分析定义参数示意图。（D） 细胞体分割（黄色掩模）和神经突分割（洋红色掩模）的局部放大图。图像在接种后 24 小时采集。放大倍数 20×。比例尺，50 µm。该图使用 BioRender 制作。请点击此处查看该图的放大版本。

神经突网络分析；图像分割；免疫细胞化学，Neurotrack；荧光显微镜；细胞定量。
图11：用于神经突生长分析的理想胚胎期（E13.5）感觉神经元培养。（A） 用于神经突生长分析的理想胚胎期感觉神经元培养的代表性免疫细胞化学图像（神经元标志物 Tuj1）。（B） 代表性自动分割图像。紫色掩膜用于分割细胞体，蓝色掩膜用于分割神经突。（C） 神经突生长分析参数的示意图。（D） 细胞体分割（紫色掩膜）与神经突分割（蓝色掩膜）的局部放大图。图像于接种后24小时采集。放大倍数20倍。比例尺，50 µm。该图使用BioRender绘制。请点击此处查看此图的高清版本。

NSC-34 细胞分化 96 小时，带颜色分析的显微镜图像，未分化与已分化细胞对比。
图 12：与未分化的对照细胞相比，已分化的 NSC-34 细胞具有更多的神经突起和分支。 NSC-34 细胞的代表性图像。上图：未分化的 NSC-34 细胞（对照）。下图：经维甲酸处理 96 小时后的已分化 NSC-34 细胞。两个图的左侧为相差显微图像，右侧为自动分割图像（胞体为黄色，神经突起为品红色）。图像在接种后 96 小时采集。放大倍数为 10×。比例尺为 50 µm。该图使用 BioRender 制作。请点击此处查看此图的放大版本。

使用ImageJ软件进行显微镜下的细胞计数、类型分类和数据分析。
图13：Fiji中的Cell Counter工具。在适合神经突生长分析的理想接种条件下，对相差图像进行手动细胞计数。放大倍数为20倍。该图使用BioRender绘制。请点击此处查看此图的放大版本。

培养类型成年DRG培养（相差）胚胎DRG培养（相差）NSC-34（相差）
放大倍数20x20x10x
分割模式亮度亮度亮度
分割调整0.5 - 0.71.7 - 21
调整大小（像素）0, +1, +20, +10
滤波最佳最佳最佳
神经突敏感度0.4 - 0.50.25 - 0.40.3 - 0.5
神经突宽度122

表1：成年感觉神经元培养、胚胎期（E13.5）感觉神经元培养以及NSC-34细胞培养在相差图像中建议的分析定义参数汇总。

培养类型成年DRG培养（ICC）胚胎DRG培养（ICC）
放大倍数20x20x
分割模式亮度亮度
分割调整0.5 - 0.71.7 - 2
调整大小（像素）0, +1, +20, +1
滤波最佳最佳
神经突粗略灵敏度8 - 98 - 9
神经突精细灵敏度最高0.750.5 - 0.75
神经突宽度12

表2：成年感觉神经元培养、胚胎期（E13.5）感觉神经元培养以及NSC-34细胞培养在免疫细胞化学图像中建议的分析定义参数汇总。

问题建议
培养物污染将分割滑块向细胞方向调整
增加调整大小参数（+1，+2…）
略微降低神经突敏感度
神经突颜色浅/纤细提高神经突敏感度（至少0.6）
将分割滑块向细胞方向调整
免疫细胞化学中神经突纤细提高细神经突敏感度（最高至0.75）
降低神经突粗略敏感度（至少降至8-9）
胶质细胞干扰将分割滑块向细胞方向调整（1.7-2）
神经突宽度设为2

表3：针对不同类型培养物中特定问题的建议分析定义参数汇总。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

准确测量神经元在健康、损伤和疾病状态下的生长情况，是神经科学领域许多实验设计中的关键参数。无论是在使用完整的背根神经节（DRG）组织块进行的器官型培养，还是在解离培养中，过去20年来，如何正确测量轴突生长一直是一个重大挑战。若无法对神经突起的生长进行可靠且准确的定量分析，就无法判断特定处理是否有效，例如对NSC-34细胞施加维甲酸（持续4天）34，或对胚胎期DRG神经元施加神经营养因子（持续1-2天）14,35。神经元在健康状态下通常表现出持续生长；然而，在受到损伤后，其轴突生长速率会增加12,13。测量轴突生长时，时间点的选择至关重要；因此，在正式开展实验前，必须先进行预实验，根据细胞生长速率的平台期曲线确定最佳的固定时间点。

方法的选择，无论是手动还是自动，标志着在时间消耗和准确性方面的分水岭。一些最常见的手动方法包括 NeuronJ18,20 和 Metamorph（Visitron）2,22,28。手动方法要求用户手动追踪神经突，这一过程极为耗时，且需要单细胞图像。由于神经突的手动分割，对神经网络的分析完全无法实现。通常，这些方法仅测量最长的轴突，或采用矢量距离测量，从而丢失了诸如分支点数量 和总轴突长度等重要信息。Sholl 分析30在一定程度上有所改进，但仍然局限于单细胞条件。单细胞分析面临诸多挑战，首先是从细胞接种开始。神经元必须以非常低的浓度接种，而这可能并不适合所有细胞类型的最优生长条件。另一个问题来自图像采集。通常使用共聚焦显微镜进行成像，这需要经过培训的操作人员以及荧光标记的神经元，且在时间和成本上均不高效。虽然共聚焦显微镜可获得高分辨率图像，但每次实验仅能成像极少数神经元。这构成了一项限制，因为需要更多的生物学重复才能获得足够数量的神经元。

一些自动化方法（如 NeuroMath2,28 ）解决了耗时的神经突分割问题，该过程以自动化方式完成。

然而，由于时间限制，在延时显微镜设备上获取图像时，该神经突起生长测量模块能够更快地提供结果。该模块与本软件结合使用，可显著提高学生和课题负责人的实验时间与成本效率。

成像设备能够基于孔径大小获取数量可变的图像，从而生成相当完整的孔内图像图谱。这一特性具有显著优势，可同时对多个神经元进行成像。然而，仅需达到20倍放大倍数即可满足使用软件分析图像的需求。该软件的核心功能在于其能够基于一组图像进行训练，并实现轴突总长度的半自动测量。此外，该软件既可用于单个神经元，也可用于神经元网络的分析。软件能够使用两种不同的掩膜分别对神经突和细胞体进行分割：黄色掩膜用于分割图像中所有高对比度的物体，例如细胞体、细胞碎片和阴影；而品红色掩膜则用于分割神经突。通过将该软件与NeuronJ分别对相同神经元进行分割的结果进行比较，验证了该软件的精确性与准确性。从统计分析的角度来看，神经突长度的测量值之间呈现出高度的Spearman相关系数，相关性良好。

在评估了该方法的可靠性后，我们转向对各种测试条件的分析。为了获得最佳分析结果，需要采取一些预防措施。首先，必须将神经元均匀地接种在孔板中，避免出现细胞浓度过高的区域。神经元的聚集会导致软件在检测神经突时失去精度。另一个影响分析准确性和精确性的变量是培养物的清洁程度。理想的培养环境应较为洁净，细胞碎片和死亡细胞较少。然而，软件可以通过调节神经突敏感度和细胞体分割掩膜来补偿此类问题。如前所述，黄色掩膜用于分割高对比度的物体，其中也包括培养基在孔中流动所产生的阴影。这些阴影可能覆盖神经突，从而导致神经突长度的丢失。但这一问题可通过在成像前让培养基充分静置而轻松解决。

该算法能够对相差图像和免疫细胞化学图像进行神经突长度的定量分析。当涉及荧光时，必须采取其他预防措施以获得可靠的分析结果。首先，染色质量会极大地影响分析结果。如果在洗涤过程中神经突断裂或被分割，以及细胞体被冲走，分析的强度和可靠性将受到影响。此外，荧光本身可能对分析造成干扰。由于焦距由仪器自动确定，物镜会优先对非常明亮的物体（如伪影、细胞体或较粗的神经突）进行对焦，导致较细且荧光较弱的神经突无法清晰成像，从而使用户难以准确测量其长度。

因此，相较于免疫细胞化学图像的分析，对相差图像的分析可能更具依据。该软件能够处理多种不同的神经元形态，无论其结构是极为复杂精细还是极为简单，均可对单个细胞或神经元网络进行分析。因此，该软件可广泛应用于多个研究领域，包括来自中枢或外周神经系统不同发育阶段的原代神经元培养物、诱导多能干细胞（iPSC）来源的神经元以及NSC-34等细胞系。

尽管该软件具有显著的潜力，但仍存在一些局限性。首先，细胞体分割的精度不够理想。因此，细胞体簇和细胞体簇面积等参数无法可靠地用于细胞计数。其次，除了需要采取必要的措施以实现最佳的神经突分割外，过细的轴突可能在神经突长度测量中被排除，从而导致数据丢失。

分支点参数在两种类型的分割中均会遇到问题。培养物中局部存在的阴影、死亡细胞或碎片 在分支点处，由于被细胞体的分割所覆盖，它们变得难以辨识。此外，对于较细的神经突而言，分支点参数的可靠性同样会受到严重影响。

此外，图像采集过程中的自动聚焦有时可能不够理想。该设备的最大 放大倍数仅限于20倍，可能不足以观察神经突等细长结构中的精细细节或荧光信号。另外，该设备在均质塑料基底上的表现最佳。如果在孔中插入了玻璃盖玻片，则对玻璃的聚焦可能会失败，导致图像部分模糊。然而，该软件不仅适用于神经元研究，还可应用于其他截然不同的研究领域，例如真菌生长36。

综上所述，我们认为该神经突生长测量模块是一种快速、无偏且高效测量神经突的可靠工具。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明，本研究的开展不存在任何可能产生利益冲突的商业或财务关系。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们感谢Alessandro Vercelli提出的宝贵意见，以及Sartorius的技术支持所提供的帮助。本课题的研究工作得到了意大利大学与研究部（MIUR）2021年Rita Levi Montalcini基金的慷慨资助。本研究由意大利大学与研究部（MIUR）“卓越系所项目”（Dipartimenti di Eccellenza 2023-2027）资助，授予神经科学系Rita Levi Montalcini。D.M.R.的研究工作是在意大利国家大学间可持续发展与气候变化博士课程（链接：www.phd-sdc.it）期间开展，并在其支持下完成的。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
胶原酶AMerck / Roche10103586001
分散酶II（中性蛋白酶，II型级）Merck / Roche4942078001
杜尔贝科改良伊格尔培养基Merck / SigmaD5796
胎牛血清 Merck / SigmaF7524
Ham's F-12营养混合物（1X）ThermoFisher Scientific21765029
含L-谷氨酰胺的Ham's F12EurocloneECM0135L
Hanks平衡盐溶液EurocloneECM0507L
HBSS（10X），无钙、无镁、无酚红ThermoFisher Scientific14185045
HyClone表征胎牛血清（美国来源）CytivaSH30071.03
Incucyte神经示踪分析软件 Sartorius9600-0010
L-15培养基（Leibovitz）Millipore/SigmaL5520
小鼠层粘连蛋白，天然蛋白ThermoFisher Scientific23017015
L-半胱氨酸Merck / SigmaC7352
不含L-谷氨酰胺的Leibovitz's L-15培养基EurocloneECB0020L
小鼠NGF 2.5S（>95%）Alomone LabsN-100
Neurobasal培养基（不含谷氨酰胺）ThermoFisher Scientific21103049
NSC-34CELLutions Biosystems Inc (Ontario, Canada)CLU140
木瓜蛋白酶（来自木瓜乳胶）SigmaP4762
青霉素-链霉素溶液（5,000 U/mL）ThermoFisher Scientific15070063
Percoll（密度1.130 g/mL）Cytiva17089101
聚-D-赖氨酸溶液（1mg/mL）EMD Millipore/MerckA-003-E
聚-L-赖氨酸溶液（0-01%）SigmaP4832
重组人神经营养因子-3（NT-3）PeproTech450-03
维甲酸Merck / SigmaR2625
胰蛋白酶-EDTA溶液SigmaT3924
β-微管蛋白III（Tuj1）抗体Merck / SigmaT8660

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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