以下方案介绍了一种基于剪切的挤出方法，用于制备具有纳米级图案化纤维的胶原蛋白水凝胶，该方法可广泛应用于多种组织工程领域。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
再生生物材料旨在促进细胞与材料之间的相互作用，以引导受损组织和器官的修复。这些材料被设计用于模拟天然组织的生物物理特性，为细胞提供表型和形态学上的指导，从而有助于再生组织微环境的恢复。胶原蛋白是一种常见的细胞外基质蛋白，因其良好的生物相容性及其他有利特性，常被用作此类再生生物材料的组分。本研究介绍了一种新颖且简便的方法，用于制备具有定向纤维排列结构的工程化纳米纤维胶原。通过调控剪切应力、温度和pH值，可精确控制胶原纤维的形成与取向，且无需使用特殊设备。该方法能够制备出模拟具有各向异性或各向同性特征的天然组织结构的纳米纤维胶原生物材料。胶原纳米纤维排列方式的灵活性不仅有助于研究纳米级图案对细胞行为的影响，也为图案化组织工程的应用提供了广泛的可能性。
引言
再生医学的目标是通过应用工程化治疗手段来增强组织再生和修复。其中一种方法是构建能够紧密模拟天然组织成分和结构的生物材料。在设计这些构建物时，一个关键考虑因素是天然的细胞外基质（ECM），它为细胞增殖、迁移和分化提供指导性信号，最终促进组织再生1,2。天然ECM主要由纤维状胶原蛋白组成3,4。在骨骼肌和肌腱等高度有序的组织中，这些ECM呈现出定向排列的结构，这对于支持组织内的力传递以及运动功能至关重要5,6。
胶原蛋白作为一种组织工程应用的生物材料，其用途不仅限于在天然组织中的广泛存在，还因其具有良好的生物相容性、可生物降解性以及细胞亲和性7,8,9近年来，基于胶原蛋白的生物材料研发进展主要集中于优化其生物物理特性，以更有效地调控对特定组织再生至关重要的力学和生化信号。构建具有纤维结构的胶原蛋白生物材料 体外 相对地 ....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 透析胶原蛋白的制备（ 图1）
- 将透析管剪成约3英寸长。使用具有以下规格的透析管：32 mm扁平宽度、20 mm膨胀直径、4.8 nm孔径。
- 用超纯水重新水化透析管。
- 用透析管夹夹住透析管的一端。
- 使用配备18 G针头的10 mL注射器，将5–6 mL大鼠尾部I型胶原（浓度：9–10 mg/mL，溶于0.02 N乙酸中）转移至透析管内。 夹住另一端以封闭透析管。
- 在玻璃培养皿底部铺上一层0.5–1 cm厚的聚乙二醇（PEG）碎片，然后将装有胶原的透析管置于PEG层之上。
注意：一个13英寸×9英寸×2英寸的玻璃培养皿通常可容纳4–5根胶原填充管排成一行。可根据所需胶原体积调整培养皿尺寸。 - 添加更多PEG碎片以完全覆盖透析管，并将托盘放入4 °C冰箱中。
- 每10–15分钟，从透析管表面移除湿润的PEG碎片，并用一层新的干燥PEG重新覆盖。将培养皿放回4 °C冰箱。
- 重复步骤1.7两次，30–35分钟后，用自来水冲洗掉湿润的PEG碎片。
- 再用超纯水冲洗透析管一次，并用纸巾轻轻吸干管壁。
- 打开透析管一端，将透析后的胶原（最终浓度：约30 mg/mL）转移至微量离心管中。使用小型离心机....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
本方案描述了一种基于剪切力的简单挤出技术，用于制备由取向排列（图2）或随机分布（图3）纳米纤维组成的胶原蛋白水凝胶。纳米纤维的图案化依赖于对剪切力的精确控制，这通过调节注射器移动速度与胶原蛋白挤出速率的协同作用来实现。先前研究已确定诱导纤维取向排列的最佳参数为：注射器速度340 mm/s，胶原蛋白挤出速率为3.2 mL/min28,29。该比例关系不仅对形成取向排列的纳米纤维至关重要，也影响水凝胶在宏观尺度上的功能表现。若该比例失调，则可能产生不符合预期图案的水凝胶，或生成直径过小（<0.5 mm）、过大（>1.5 mm）或呈波浪状而不适用于后续实验的胶原条带。例如，注射器移动过快而挤出速率过慢会导致条带过细；相反的比例则会导致条带过厚或呈波浪形（图4A-D），具体形态取决于比.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
该方案的关键步骤可归纳为三个主要部分：1）胶原蛋白纤维形成，2）水凝胶固定，3）洗涤。胶原蛋白纤维形成过程在中性条件下可自发进行，依赖于单个胶原分子自组装为更大且稳定的纤维结构。10,11通过使用如10倍浓度磷酸盐缓冲液（10x PBS）等中和性缓冲液，并将其预热至37 °C，可实现这一过程，这对于调控静电相互作用、确保胶原完全发育成原纤维至关重要。纳米级原纤维的取向排列是通过在原纤维形成的同时施加剪切力来实现的。剪切力的有无以及剪切速率的大小将决定原纤维的排列模式。其次，水凝胶固定是增强材料稳定性的关键步骤，其作用是在干燥过程中为材料提供物理锚定点，此过程伴随胶原的收缩与脱水。如果材料的预期用途是用于 体外 细胞接种，因为它将胶原固定在刚性基底上，防止不受控的收缩。随机型与取向型图案化水凝胶的固定过程略有不同。为确保随机型水凝胶的牢固附着，需在纤维形成之前，在固定表面（通常为玻璃）边缘额外沉积胶原，以将其牢固固定于表面。而取向型图案化水凝胶则通过将其包裹在固定表面边缘实现相同的锚定作用。对于取向型水凝.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
不存在任何利益冲突需要声明。
致谢
本研究部分得到了再生康复研究联盟资助项目的资助 & 培训，MTF Biologics，俄勒冈健康 & 科学大学基金会以及柯林斯医学信托基金。K.M.H. 获得美国国家科学基金会研究生研究奖学金（DGE-1937961）和俄勒冈学生学习与体验研究（OSLER）奖学金（5TL1TR2371-8）的支持。K.H.N. 获得美国国立卫生研究院/国家心脏、肺和血液研究所（NIH/NHLBI，R00HL136701）和美国国立卫生研究院/国家关节炎、肌肉骨骼和皮肤病研究所（NIH/NIAMS，R01AR080150）资助项目的资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 高浓度 I 型胶原蛋白，大鼠尾部来源 | Corning | CB354249 | |
| Eclipse TE-2000-U 显微镜 | Nikon | TE-2000-U | 倒置显微镜 |
| 超厚显微镜载玻片 | Fisher Scientific | 22-267-005 | 适用于胶原蛋白挤出表面 |
| FEI Helios G3 NanoLab DualBeam | Thermo Fisher Scientific | N/A | 扫描电子显微镜 |
| 玻璃切割工具套装 2 mm–20 mm 铅笔式油供碳化钨尖头 | Amazon/MOARMOR | B07Y1D243H | 可选玻璃切割工具 |
| Hamilton Kel-F Hub 钝头针（鲁尔锁，22 G） | Fisher Scientific | 14-815-574 | 用于胶原蛋白挤出的针头 |
| Nexterion Slide H 3-D | Schott | NC0782819 | 疏水性载玻片 |
| PBS 片剂 | Thermo Fisher Scientific | 18912014 | |
| 聚乙二醇 8000 | Fisher BioReagents | BP233-1 | |
| 无缝纤维素透析管 | Fisher Scientific | S25645G | |
| SnakeSkin 透析夹 | Thermo Fisher Scientific | PI68011 | |
| Synthware 玻璃切割器 | Synthware | 31-501-927 | 可选玻璃切割工具 |
参考文献
- Padhi, A., Nain, A. S. ECM in differentiation: A review of matrix structure, composition and mechanical properties. Ann Biomed Eng. 48 (3), 1071-1089 (2020).
- Schlie-Wolter, S., Ngezahayo, A., Chichkov, B. N. T....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
