需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

用于组织工程的纳米纤维图案化胶原蛋白的制备

1.5K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/67165

⸱

2024年9月20日

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Oregon Health & Science University, 2Department of Orthopaedics and Rehabilitation, Oregon Health & Science University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

以下方案介绍了一种基于剪切的挤出方法，用于制备具有纳米级图案化纤维的胶原蛋白水凝胶，该方法可广泛应用于多种组织工程领域。

摘要

再生生物材料旨在促进细胞与材料之间的相互作用，以引导受损组织和器官的修复。这些材料被设计用于模拟天然组织的生物物理特性，为细胞提供表型和形态学上的指导，从而有助于再生组织微环境的恢复。胶原蛋白是一种常见的细胞外基质蛋白，因其良好的生物相容性及其他有利特性，常被用作此类再生生物材料的组分。本研究介绍了一种新颖且简便的方法，用于制备具有定向纤维排列结构的工程化纳米纤维胶原。通过调控剪切应力、温度和pH值，可精确控制胶原纤维的形成与取向，且无需使用特殊设备。该方法能够制备出模拟具有各向异性或各向同性特征的天然组织结构的纳米纤维胶原生物材料。胶原纳米纤维排列方式的灵活性不仅有助于研究纳米级图案对细胞行为的影响，也为图案化组织工程的应用提供了广泛的可能性。

引言

再生医学的目标是通过应用工程化治疗手段来增强组织再生和修复。其中一种方法是构建能够紧密模拟天然组织成分和结构的生物材料。在设计这些构建物时，一个关键考虑因素是天然的细胞外基质（ECM），它为细胞增殖、迁移和分化提供指导性信号，最终促进组织再生1,2。天然ECM主要由纤维状胶原蛋白组成3,4。在骨骼肌和肌腱等高度有序的组织中，这些ECM呈现出定向排列的结构，这对于支持组织内的力传递以及运动功能至关重要5,6。

胶原蛋白作为一种组织工程应用的生物材料，其用途不仅限于在天然组织中的广泛存在，还因其具有良好的生物相容性、可生物降解性以及细胞亲和性7,8,9近年来，基于胶原蛋白的生物材料研发进展主要集中于优化其生物物理特性，以更有效地调控对特定组织再生至关重要的力学和生化信号。构建具有纤维结构的胶原蛋白生物材料 体外 相对地 简单，因为酸溶性胶原分子在温暖温度和中性pH条件下能够自组装形成纳米原纤维10,11然而，若无引导性操控，这些纤维会形成随机网络结构，因而不适用于各向异性组织工程应用。能够制备取向纤维的技术包括静电纺丝、湿法纺丝以及其他溶液挤出技术。12,13，冷冻干燥14电化学或磁性制备15,16剪切流沉积17流动诱导结晶18，凝胶挤出19应变诱导排列20，以及通过调控流体流动实现的力引导式对齐21,22然而，这些方法中的许多要么与胶原蛋白的相容性不高，要么只能在微米尺度上实现取向而无法达到纳米尺度，要么需要额外的后处理步骤来诱导取向和增强稳定性，要么依赖高度专业化的设备和试剂，因而难以被广泛采用。

本研究介绍一种简便的基于剪切力的方法，用于制备具有定向排列或随机取向纤维结构的纳米纤维胶原，无需使用注射泵或电纺丝仪等特殊设备。该技术利用了胶原纤维形成过程对pH值的依赖性。在中和缓冲液中对酸性单体胶原施加剪切力，可促使胶原沿剪切方向有序地形成纤维。类似地，在无剪切力条件下也可诱导胶原发生纤维化，从而产生随机排列的纤维结构。所获得的三维胶原条带，由定向排列或随机分布的纳米纤维胶原构成，可作为研究纳米级结构模式对细胞行为影响的工具。此外，它们还为各向异性与各向同性的组织工程应用提供了广泛的可能性23,24,25,26,27。该结构模式可根据目标天然组织的结构进行定制。胶原条带还可组合成不同尺寸的束状结构，用作适用于各种大小和形状损伤部位的移植型工程化治疗材料。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. 透析胶原蛋白的制备（ 图1）

  1. 将透析管剪成约3英寸长。使用具有以下规格的透析管：32 mm扁平宽度、20 mm膨胀直径、4.8 nm孔径。
  2. 用超纯水重新水化透析管。
  3. 用透析管夹夹住透析管的一端。
  4. 使用配备18 G针头的10 mL注射器，将5–6 mL大鼠尾部I型胶原（浓度：9–10 mg/mL，溶于0.02 N乙酸中）转移至透析管内。 夹住另一端以封闭透析管。
  5. 在玻璃培养皿底部铺上一层0.5–1 cm厚的聚乙二醇（PEG）碎片，然后将装有胶原的透析管置于PEG层之上。
    注意：一个13英寸×9英寸×2英寸的玻璃培养皿通常可容纳4–5根胶原填充管排成一行。可根据所需胶原体积调整培养皿尺寸。
  6. 添加更多PEG碎片以完全覆盖透析管，并将托盘放入4 °C冰箱中。
  7. 每10–15分钟，从透析管表面移除湿润的PEG碎片，并用一层新的干燥PEG重新覆盖。将培养皿放回4 °C冰箱。
  8. 重复步骤1.7两次，30–35分钟后，用自来水冲洗掉湿润的PEG碎片。
  9. 再用超纯水冲洗透析管一次，并用纸巾轻轻吸干管壁。
  10. 打开透析管一端，将透析后的胶原（最终浓度：约30 mg/mL）转移至微量离心管中。使用小型离心机短暂离心去除胶原中的气泡（2,000 × g，≤30秒，室温[RT]），随后于4 °C保存以备后续使用。
  11. 使用前一天，将胶原装入注射器中。
    1. 使用16号针头，将约1 mL透析后的胶原吸入1 mL注射器中。
      注意：胶原为黏稠物质。在吸入更多胶原前，可能需要预先在针头部分填充少量胶原。必要时可取下针头并排出较大的气泡。
    2. 取下针头，并用封口膜包裹注射器头部。
    3. 将装有胶原的注射器直立存放于4 °C冰箱中过夜，使微小气泡自然破裂。

2. 玻璃芯片的制备（ 图1）

注意：进行本实验步骤时需使用眼部防护装备。

注意：细胞培养实验需使用特殊涂层的疏水性玻璃载片。操作时必须手持载片边缘，以防止表面涂层被去除。应在合适的切割表面上进行玻璃切割操作。

  1. 使用永久性记号笔测量并标出玻璃芯片所需的尺寸
    1. 若制备8条状支架，沿载玻片长边以约1 cm的间隔做标记。根据所需支架尺寸，必要时调整间距。
  2. 使用直边工具（例如6孔板边缘），沿第一条标记线将玻璃切割刀滑动以划痕玻璃表面。
  3. 载玻片将沿划痕线自行断裂，或将其翻转放置于纸巾上（疏水面向下），手动对划痕区域施加压力使其断裂。
  4. 使用乙醇标记笔在疏水性玻璃载玻片的涂层面上做标记。
  5. 用超纯水冲洗玻璃芯片，以去除残留的玻璃粉尘。
  6. 使用台式气流喷嘴吹干玻璃芯片，或将其倾斜叠放于通风橱中干燥。
  7. 根据所需芯片数量重复上述步骤。将芯片储存于室温条件下。为获得最佳细胞培养效果，建议在制备后7天内使用。

3. 10倍磷酸盐缓冲液（PBS）的制备

  1. 用一个玻璃瓶装入 500 mL 超纯水。
  2. 向瓶中加入 10 片 PBS 片剂。
    注意：本方案假设 1x PBS 的片剂比例为每 500 mL 水使用 1 片。若使用不同规格或品牌的片剂，请根据需要调整片剂数量。
  3. 向瓶中加入一个搅拌子，并将瓶子置于搅拌器上，持续搅拌至片剂完全溶解。
  4. 在制备水凝胶当天，将所需体积的 10x PBS 转移至 50 mL 锥形管中。
  5. 在胶原蛋白制备前，将装有 PBS 的离心管置于 37 °C 水浴中至少 15 分钟。

4. 制备取向排列的胶原纳米原纤维（图2）

  1. 从冰箱中取出一支胶原蛋白溶液，并连接一根钝头的22 G针头。
  2. 将一块载玻片放入4孔板的盖子中。
  3. 用预热至37 °C的10x PBS覆盖载玻片，用量足以浸没载玻片（30–50 mL）。
  4. 将注射器保持在约30–45°角，以约340 mm/s的速度和约3.2 mL/min的流速，手动将胶原蛋白挤出成细条状，沉积在玻璃芯片上。
    注意：在加入预热PBS后30–60秒内完成胶原蛋白挤出，以确保PBS不会过度冷却。
  5. 静置1–2分钟，使胶原蛋白完成纤维形成过程，或直至胶原蛋白变为不透明的白色。
  6. 使用镊子将胶原蛋白条切割至合适长度，确保条带足够长，以便在芯片两端各有3–5 mm向下折叠。
  7. 逐条将胶原蛋白条沿长度方向（与刻痕区域平行）轻轻覆盖在已准备好的玻璃芯片上，并将边缘部分塞入芯片下方。
  8. 继续放置胶原蛋白条，直至达到所需尺寸。
  9. 将新形成的胶原蛋白水凝胶横跨放置在12孔板的两个孔上。这有助于干燥过程中空气流通，并防止胶原蛋白末端粘附到非目标表面。
  10. 将水凝胶置于实验台面上干燥1–3小时，或直至PBS盐结晶覆盖水凝胶表面的50%–90%。
    注意：干燥时间会因水凝胶尺寸和残留液体量而异。
  11. 将每块水凝胶浸入1x PBS中约30–60秒，或直至盐结晶完全溶解。
  12. 用纸巾轻轻吸去多余的PBS。
  13. 将水凝胶重新放回孔板中，并在通风橱中过夜干燥。
  14. 将干燥后的水凝胶在室温下保存约1周。

5. 随机胶原纳米原纤维的制备（图3）

  1. 从冰箱中取出一支胶原蛋白溶液，并连接一个钝头的22 G针头。
  2. 以约3.2 mL/min的速度将胶原蛋白挤出至干燥的玻璃载片上。挤出足够量的胶原蛋白，使其尺寸与取向排列的胶原水凝胶相近。必要时防止气泡积聚。
  3. 额外挤出一些胶原蛋白，使其包裹玻璃载片的边缘，以降低意外脱落的风险。
  4. 使用镊子将挤出的胶原蛋白浸入装有预热10倍浓度PBS的50 mL离心管中。
  5. 静置45–60秒，使胶原蛋白完成纤维形成过程，或直至胶原蛋白变为不透明的白色。
  6. 用纸巾轻轻吸去多余的PBS。
  7. 完成步骤4.9–4.14，以清洗并干燥水凝胶。

6. 灭菌与重悬

注意：所有以下步骤均须在生物安全柜中进行

  1. 将胶原蛋白水凝胶及周围孔板在70%乙醇中灭菌15分钟。
    1. 灭菌进行至一半时，用镊子短暂地将水凝胶抬起，确保玻璃芯片的底面和水凝胶均与乙醇接触。
  2. 去除乙醇，让水凝胶在空气中干燥10分钟。
  3. 用无菌1×PBS洗涤水凝胶3次，每次10分钟，以去除残留的乙醇并重新水合水凝胶。此时水凝胶已可使用（用于细胞培养等）。若暂不立即使用，可在最后一次洗涤后短暂保留在PBS中。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

本方案描述了一种基于剪切力的简单挤出技术，用于制备由取向排列（图2）或随机分布（图3）纳米纤维组成的胶原蛋白水凝胶。纳米纤维的图案化依赖于对剪切力的精确控制，这通过调节注射器移动速度与胶原蛋白挤出速率的协同作用来实现。先前研究已确定诱导纤维取向排列的最佳参数为：注射器速度340 mm/s，胶原蛋白挤出速率为3.2 mL/min28,29。该比例关系不仅对形成取向排列的纳米纤维至关重要，也影响水凝胶在宏观尺度上的功能表现。若该比例失调，则可能产生不符合预期图案的水凝胶，或生成直径过小（<0.5 mm）、过大（>1.5 mm）或呈波浪状而不适用于后续实验的胶原条带。例如，注射器移动过快而挤出速率过慢会导致条带过细；相反的比例则会导致条带过厚或呈波浪形（图4A-D），具体形态取决于比...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

该方案的关键步骤可归纳为三个主要部分：1）胶原蛋白纤维形成，2）水凝胶固定，3）洗涤。胶原蛋白纤维形成过程在中性条件下可自发进行，依赖于单个胶原分子自组装为更大且稳定的纤维结构。10,11通过使用如10倍浓度磷酸盐缓冲液（10x PBS）等中和性缓冲液，并将其预热至37 °C，可实现这一过程，这对于调控静电相互作用、确保胶原完全发育成原纤维至关重要。纳米级原纤维的取向排列是通过在原纤维形成的同时施加剪切力来实现的。剪切力的有无以及剪切速率的大小将决定原纤维的排列模式。其次，水凝胶固定是增强材料稳定性的关键步骤，其作用是在干燥过程中为材料提供物理锚定点，此过程伴随胶原的收缩与脱水。如果材料的预期用途是用于 体外 细胞接种，因为它将胶原固定在刚性基底上，防止不受控的收缩。随机型与取向型图案化水凝胶的固定过程略有不同。为确保随机型水凝胶的牢固附着，需在纤维形成之前，在固定表面（通常为玻璃）边缘额外沉积胶原，以将其牢固固定于表面。而取向型图案化水凝胶则通过将其包裹在固定表面边缘实现相同的锚定作用。对于取向型水凝...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

不存在任何利益冲突需要声明。

致谢

本研究部分得到了再生康复研究联盟资助项目的资助 & 培训，MTF Biologics，俄勒冈健康 & 科学大学基金会以及柯林斯医学信托基金。K.M.H. 获得美国国家科学基金会研究生研究奖学金（DGE-1937961）和俄勒冈学生学习与体验研究（OSLER）奖学金（5TL1TR2371-8）的支持。K.H.N. 获得美国国立卫生研究院/国家心脏、肺和血液研究所（NIH/NHLBI，R00HL136701）和美国国立卫生研究院/国家关节炎、肌肉骨骼和皮肤病研究所（NIH/NIAMS，R01AR080150）资助项目的资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
高浓度 I 型胶原蛋白，大鼠尾部来源CorningCB354249
Eclipse TE-2000-U 显微镜NikonTE-2000-U 倒置显微镜
超厚显微镜载玻片Fisher Scientific22-267-005适用于胶原蛋白挤出表面
FEI Helios G3 NanoLab DualBeamThermo Fisher ScientificN/A扫描电子显微镜
玻璃切割工具套装 2 mm–20 mm 铅笔式油供碳化钨尖头Amazon/MOARMORB07Y1D243H可选玻璃切割工具
Hamilton Kel-F Hub 钝头针（鲁尔锁，22 G）Fisher Scientific14-815-574用于胶原蛋白挤出的针头
Nexterion Slide H 3-DSchottNC0782819疏水性载玻片
PBS 片剂Thermo Fisher Scientific18912014
聚乙二醇 8000Fisher BioReagentsBP233-1
无缝纤维素透析管 Fisher ScientificS25645G
SnakeSkin 透析夹Thermo Fisher ScientificPI68011
Synthware 玻璃切割器Synthware31-501-927可选玻璃切割工具

参考文献

  1. Padhi, A., Nain, A. S. ECM in differentiation: A review of matrix structure, composition and mechanical properties. Ann Biomed Eng. 48 (3), 1071-1089 (2020).
  2. Schlie-Wolter, S., Ngezahayo, A., Chichkov, B. N. The selective role of ECM components on cell adhesion, morphology, proliferation and communication in vitro. Exp Cell Res. 319 (10), 1553-1561 (2013).
  3. Ricard-Blum, S. The collagen family. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a004978(2011).
  4. Shoulders, M. D., Raines, R. T. Collagen structure and stability. Annu Rev Biochem. 78, 929-958 (2009).
  5. Gillies, A. R., Lieber, R. L. Structure and function of the skeletal muscle extracellular matrix. Muscle Nerve. 44 (3), 318-331 (2011).
  6. Silver, F. H., Freeman, J. W., Seehra, G. P. Collagen self-assembly and the development of tendon mechanical properties. J Biomech. 36 (10), 1529-1553 (2003).
  7. Friess, W. Collagen-biomaterial for drug delivery. Eur J Pharm Biopharm. 45 (2), 113-136 (1998).
  8. Lee, C. H., Singla, A., Lee, Y. Biomedical applications of collagen. Int J Pharm. 221 (1-2), 1-22 (2001).
  9. Liu, X., Zheng, C., Luo, X., Wang, X., Jiang, H. Recent advances of collagen-based biomaterials: Multi-hierarchical structure, modification and biomedical applications. Mater Sci Eng C. 99, 1509-1522 (2019).
  10. Harris, J. R., Reiber, A. Influence of saline and pH on collagen type I fibrillogenesis in vitro: Fibril polymorphism and colloidal gold labelling. Micron. 38 (5), 513-521 (2007).
  11. Williams, B. R., Gelman, R. A., Poppke, D. C., Piez, K. A. Collagen fibril formation. Optimal in vitro conditions and preliminary kinetic results. J Biol Chem. 253 (18), 6578-6585 (1978).
  12. Zhong, S., et al. An aligned nanofibrous collagen scaffold by electrospinning and its effects on in vitro fibroblast culture. J Biomed Mater Res A. 79A (3), 456-463 (2006).
  13. Malladi, S., et al. Continuous formation of ultrathin, strong collagen sheets with tunable anisotropy and compaction. ACS Biomater Sci Eng. 6 (7), 4236-4246 (2020).
  14. Lowe, C. J., Reucroft, I. M., Grota, M. C., Shreiber, D. I. Production of highly aligned collagen scaffolds by freeze-drying of self-assembled, fibrillar collagen gels. ACS Biomater Sci Eng. 2 (4), 643-651 (2016).
  15. Torbet, J., Ronzière, M. C. Magnetic alignment of collagen during self-assembly. Biochem J. 219 (3), 1057-1059 (1984).
  16. Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Inman, D. R., Keely, P. J. Engineering three-dimensional collagen matrices to provide contact guidance during 3d cell migration. Curr Protoc Cell Biol. Chpater 10 (Unit 10.17), (2010).
  17. Saeidi, N., Sander, E. A., Zareian, R., Ruberti, J. W. Production of highly aligned collagen lamellae by combining shear force and thin film confinement. Acta Biomater. 7 (6), 2437-2447 (2011).
  18. Paten, J. A., et al. Flow-induced crystallization of collagen: A potentially critical mechanism in early tissue formation. ACS Nano. 10 (5), 5027-5040 (2016).
  19. Yunoki, S., Hatayama, H., Ebisawa, M., Kondo, E., Yasuda, K. A novel method for continuous formation of cord-like collagen gels to fabricate durable fibers in which collagen fibrils are longitudinally aligned. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 107 (4), 1011-1023 (2019).
  20. Vader, D., Kabla, A., Weitz, D., Mahadevan, L. Strain-induced alignment in collagen gels. PLoS One. 4 (6), e5902(2009).
  21. Ahmed, A., et al. Local extensional flows promote long-range fiber alignment in 3d collagen hydrogels. Biofabrication. 14 (3), (2022).
  22. Su, C. Y., et al. Engineering a 3D collective cancer invasion model with control over collagen fiber alignment. Biomaterials. 275, 120922(2021).
  23. Nakayama, K. H., et al. Bilayered vascular graft derived from human induced pluripotent stem cells with biomimetic structure and function. Regen Med. 10 (6), 745-755 (2015).
  24. Nakayama, K. H., et al. Nanoscale patterning of extracellular matrix alters endothelial function under shear stress. Nano Lett. 16 (1), 410-419 (2016).
  25. Nakayama, K. H., et al. Rehabilitative exercise and spatially patterned nanofibrillar scaffolds enhance vascularization and innervation following volumetric muscle loss. NPJ Regen Med. 3, 16(2018).
  26. Nakayama, K. H., et al. Treatment of volumetric muscle loss in mice using nanofibrillar scaffolds enhances vascular organization and integration. Commun Biol. 2 (1), 170(2019).
  27. Alcazar, C. A., Hu, C., Rando, T. A., Huang, N. F., Nakayama, K. H. Transplantation of insulin-like growth factor-1 laden scaffolds combined with exercise promotes neuroregeneration and angiogenesis in a preclinical muscle injury model. Biomater Sci. 8 (19), 5376-5389 (2020).
  28. Lai, E. S., Huang, N. F., Cooke, J. P., Fuller, G. G. Aligned nanofibrillar collagen regulates endothelial organization and migration. Regen Med. 7 (5), 649-661 (2012).
  29. Huang, N. F., et al. Spatial patterning of endothelium modulates cell morphology, adhesiveness and transcriptional signature. Biomaterials. 34 (12), 2928-2937 (2013).
  30. Weadock, K. S., Miller, E. J., Bellincampi, L. D., Zawadsky, J. P., Dunn, M. G. Physical crosslinking of collagen fibers: Comparison of ultraviolet irradiation and dehydrothermal treatment. J Biomed Mater Res. 29 (11), 1373-1379 (1995).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

探索更多文章

纳米纤维胶原胶原图案化胶原原纤维形成细胞外基质透析管剪切应力胶原水凝胶细胞取向再生生物材料
用于组织工程的纳米纤维图案化胶原蛋白的制备
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。