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用于组织工程的纳米纤维图案化胶原蛋白的制备

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DOI：

10.3791/67165

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2024年9月20日

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Oregon Health & Science University, 2Department of Orthopaedics and Rehabilitation, Oregon Health & Science University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

以下方案介绍了一种基于剪切的挤出方法，用于制备具有纳米级图案化纤维的胶原蛋白水凝胶，该方法可广泛应用于多种组织工程领域。

摘要

再生生物材料旨在促进细胞与材料之间的相互作用，以引导受损组织和器官的修复。这些材料被设计用于模拟天然组织的生物物理特性，为细胞提供表型和形态学上的指导，从而有助于再生组织微环境的恢复。胶原蛋白是一种常见的细胞外基质蛋白，因其良好的生物相容性及其他有利特性，常被用作此类再生生物材料的组分。本研究介绍了一种新颖且简便的方法，用于制备具有定向纤维排列结构的工程化纳米纤维胶原。通过调控剪切应力、温度和pH值，可精确控制胶原纤维的形成与取向，且无需使用特殊设备。该方法能够制备出模拟具有各向异性或各向同性特征的天然组织结构的纳米纤维胶原生物材料。胶原纳米纤维排列方式的灵活性不仅有助于研究纳米级图案对细胞行为的影响，也为图案化组织工程的应用提供了广泛的可能性。

引言

再生医学的目标是通过应用工程化治疗手段来增强组织再生和修复。其中一种方法是构建能够紧密模拟天然组织成分和结构的生物材料。在设计这些构建物时，一个关键考虑因素是天然的细胞外基质（ECM），它为细胞增殖、迁移和分化提供指导性信号，最终促进组织再生1,2。天然ECM主要由纤维状胶原蛋白组成3,4。在骨骼肌和肌腱等高度有序的组织中，这些ECM呈现出定向排列的结构，这对于支持组织内的力传递以及运动功能至关重要5,6。

胶原蛋白作为一种组织工程应用的生物材料，其用途不仅限于在天然组织中的广泛存在，还因其具有良好的生物相容性、可生物降解性以及细胞亲和性7,8,9近年来，基于胶原蛋白的生物材料研发进展主要集中于优化其生物物理特性，以更有效地调控对特定组织再生至关重要的力学和生化信号。构建具有纤维结构的胶原蛋白生物材料 体外 相对地 简单，因为酸溶性胶原分子在温暖温度和中性pH条件下能够自组装形成纳米原纤维10,11然而，若无引导性操控，这些纤维会形成随机网络结构，因而不适用于各向异性组织工程应用。能够制备取向纤维的技术包括静电纺丝、湿法纺丝以及其他溶液挤出技术。12,13，冷冻干燥14电化学或磁性制备15,16剪切流沉积17流动诱导结晶18，凝胶挤出19应变诱导排列20，以及通过调控流体流动实现的力引导式对齐21,22然而，这些方法中的许多要么与胶原蛋白的相容性不高，要么只能在微米尺度上实现取向而无法达到纳米尺度，要么需要额外的后处理步骤来诱导取向和增强稳定性，要么依赖高度专业化的设备和试剂，因而难以被广泛采用。

本研究介绍一种简便的基于剪切力的方法，用于制备具有定向排列或随机取向纤维结构的纳米纤维胶原，无需使用注射泵或电纺丝仪等特殊设备。该技术利用了胶原纤维形成过程对pH值的依赖性。在中和缓冲液中对酸性单体胶原施加剪切力，可促使胶原沿剪切方向有序地形成纤维。类似地，在无剪切力条件下也可诱导胶原发生纤维化，从而产生随机排列的纤维结构。所获得的三维胶原条带，由定向排列或随机分布的纳米纤维胶原构成，可作为研究纳米级结构模式对细胞行为影响的工具。此外，它们还为各向异性与各向同性的组织工程应用提供了广泛的可能性23,24,25,26,27。该结构模式可根据目标天然组织的结构进行定制。胶原条带还可组合成不同尺寸的束状结构，用作适用于各种大小和形状损伤部位的移植型工程化治疗材料。

方案

1. 透析胶原蛋白的制备（ 图1）

  1. 将透析管剪成约3英寸长。使用具有以下规格的透析管：32 mm扁平宽度、20 mm膨胀直径、4.8 nm孔径。
  2. 用超纯水重新水化透析管。
  3. 用透析管夹夹住透析管的一端。
  4. 使用配备18 G针头的10 mL注射器，将5–6 mL大鼠尾部I型胶原（浓度：9–10 mg/mL，溶于0.02 N乙酸中）转移至透析管内。 夹住另一端以封闭透析管。
  5. 在玻璃培养皿底部铺上一层0.5–1 cm厚的聚乙二醇（PEG）碎片，然后将装有胶原的透析管置于PEG层之上。
    注意：一个13英寸×9英寸×2英寸的玻璃培养皿通常可容纳4–5根胶原填充管排成一行。可根据所需胶原体积调整培养皿尺寸。
  6. 添加更多PEG碎片以完全覆盖透析管，并将托盘放入4 °C冰箱中。
  7. 每10–15分钟，从透析管表面移除湿润的PEG碎片，并用一层新的干燥PEG重新覆盖。将培养皿放回4 °C冰箱。
  8. 重复步骤1.7两次，30–35分钟后，用自来水冲洗掉湿润的PEG碎片。
  9. 再用超纯水冲洗透析管一次，并用纸巾轻轻吸干管壁。
  10. 打开透析管一端，将透析后的胶原（最终浓度：约30 mg/mL）转移至微量离心管中。使用小型离心机短暂离心去除胶原中的气泡（2,000 × g，≤30秒，室温[RT]），随后于4 °C保存以备后续使用。
  11. 使用前一天，将胶原装入注射器中。
    1. 使用16号针头，将约1 mL透析后的胶原吸入1 mL注射器中。
      注意：胶原为黏稠物质。在吸入更多胶原前，可能需要预先在针头部分填充少量胶原。必要时可取下针头并排出较大的气泡。
    2. 取下针头，并用封口膜包裹注射器头部。
    3. 将装有胶原的注射器直立存放于4 °C冰箱中过夜，使微小气泡自然破裂。

2. 玻璃芯片的制备（ 图1）

注意：进行本实验步骤时需使用眼部防护装备。

注意：细胞培养实验需使用特殊涂层的疏水性玻璃载片。操作时必须手持载片边缘，以防止表面涂层被去除。应在合适的切割表面上进行玻璃切割操作。

  1. 使用永久性记号笔测量并标出玻璃芯片所需的尺寸
    1. 若制备8条状支架，沿载玻片长边以约1 cm的间隔做标记。根据所需支架尺寸，必要时调整间距。
  2. 使用直边工具（例如6孔板边缘），沿第一条标记线将玻璃切割刀滑动以划痕玻璃表面。
  3. 载玻片将沿划痕线自行断裂，或将其翻转放置于纸巾上（疏水面向下），手动对划痕区域施加压力使其断裂。
  4. 使用乙醇标记笔在疏水性玻璃载玻片的涂层面上做标记。
  5. 用超纯水冲洗玻璃芯片，以去除残留的玻璃粉尘。
  6. 使用台式气流喷嘴吹干玻璃芯片，或将其倾斜叠放于通风橱中干燥。
  7. 根据所需芯片数量重复上述步骤。将芯片储存于室温条件下。为获得最佳细胞培养效果，建议在制备后7天内使用。

3. 10倍磷酸盐缓冲液（PBS）的制备

  1. 用一个玻璃瓶装入 500 mL 超纯水。
  2. 向瓶中加入 10 片 PBS 片剂。
    注意：本方案假设 1x PBS 的片剂比例为每 500 mL 水使用 1 片。若使用不同规格或品牌的片剂，请根据需要调整片剂数量。
  3. 向瓶中加入一个搅拌子，并将瓶子置于搅拌器上，持续搅拌至片剂完全溶解。
  4. 在制备水凝胶当天，将所需体积的 10x PBS 转移至 50 mL 锥形管中。
  5. 在胶原蛋白制备前，将装有 PBS 的离心管置于 37 °C 水浴中至少 15 分钟。

4. 制备取向排列的胶原纳米原纤维（图2）

  1. 从冰箱中取出一支胶原蛋白溶液，并连接一根钝头的22 G针头。
  2. 将一块载玻片放入4孔板的盖子中。
  3. 用预热至37 °C的10x PBS覆盖载玻片，用量足以浸没载玻片（30–50 mL）。
  4. 将注射器保持在约30–45°角，以约340 mm/s的速度和约3.2 mL/min的流速，手动将胶原蛋白挤出成细条状，沉积在玻璃芯片上。
    注意：在加入预热PBS后30–60秒内完成胶原蛋白挤出，以确保PBS不会过度冷却。
  5. 静置1–2分钟，使胶原蛋白完成纤维形成过程，或直至胶原蛋白变为不透明的白色。
  6. 使用镊子将胶原蛋白条切割至合适长度，确保条带足够长，以便在芯片两端各有3–5 mm向下折叠。
  7. 逐条将胶原蛋白条沿长度方向（与刻痕区域平行）轻轻覆盖在已准备好的玻璃芯片上，并将边缘部分塞入芯片下方。
  8. 继续放置胶原蛋白条，直至达到所需尺寸。
  9. 将新形成的胶原蛋白水凝胶横跨放置在12孔板的两个孔上。这有助于干燥过程中空气流通，并防止胶原蛋白末端粘附到非目标表面。
  10. 将水凝胶置于实验台面上干燥1–3小时，或直至PBS盐结晶覆盖水凝胶表面的50%–90%。
    注意：干燥时间会因水凝胶尺寸和残留液体量而异。
  11. 将每块水凝胶浸入1x PBS中约30–60秒，或直至盐结晶完全溶解。
  12. 用纸巾轻轻吸去多余的PBS。
  13. 将水凝胶重新放回孔板中，并在通风橱中过夜干燥。
  14. 将干燥后的水凝胶在室温下保存约1周。

5. 随机胶原纳米原纤维的制备（图3）

  1. 从冰箱中取出一支胶原蛋白溶液，并连接一个钝头的22 G针头。
  2. 以约3.2 mL/min的速度将胶原蛋白挤出至干燥的玻璃载片上。挤出足够量的胶原蛋白，使其尺寸与取向排列的胶原水凝胶相近。必要时防止气泡积聚。
  3. 额外挤出一些胶原蛋白，使其包裹玻璃载片的边缘，以降低意外脱落的风险。
  4. 使用镊子将挤出的胶原蛋白浸入装有预热10倍浓度PBS的50 mL离心管中。
  5. 静置45–60秒，使胶原蛋白完成纤维形成过程，或直至胶原蛋白变为不透明的白色。
  6. 用纸巾轻轻吸去多余的PBS。
  7. 完成步骤4.9–4.14，以清洗并干燥水凝胶。

6. 灭菌与重悬

注意：所有以下步骤均须在生物安全柜中进行

  1. 将胶原蛋白水凝胶及周围孔板在70%乙醇中灭菌15分钟。
    1. 灭菌进行至一半时，用镊子短暂地将水凝胶抬起，确保玻璃芯片的底面和水凝胶均与乙醇接触。
  2. 去除乙醇，让水凝胶在空气中干燥10分钟。
  3. 用无菌1×PBS洗涤水凝胶3次，每次10分钟，以去除残留的乙醇并重新水合水凝胶。此时水凝胶已可使用（用于细胞培养等）。若暂不立即使用，可在最后一次洗涤后短暂保留在PBS中。

结果

本方案描述了一种基于剪切力的简单挤出技术，用于制备由取向排列（图2）或随机分布（图3）纳米纤维组成的胶原蛋白水凝胶。纳米纤维的图案化依赖于对剪切力的精确控制，这通过调节注射器移动速度与胶原蛋白挤出速率的协同作用来实现。先前研究已确定诱导纤维取向排列的最佳参数为：注射器速度340 mm/s，胶原蛋白挤出速率为3.2 mL/min28,29。该比例关系不仅对形成取向排列的纳米纤维至关重要，也影响水凝胶在宏观尺度上的功能表现。若该比例失调，则可能产生不符合预期图案的水凝胶，或生成直径过小（<0.5 mm）、过大（>1.5 mm）或呈波浪状而不适用于后续实验的胶原条带。例如，注射器移动过快而挤出速率过慢会导致条带过细；相反的比例则会导致条带过厚或呈波浪形（图4A-D），具体形态取决于比例失衡的程度。这些宏观特性的差异可能导致条带间变异程度显著，从而影响细胞沉积和局部黏附行为。

在胶原蛋白挤出和组装完成后，水凝胶的制备需经过初始干燥阶段（通常为1至3小时），随后在1×PBS中进行洗涤步骤（图2 和 图3）。获得最佳形貌结果依赖于洗涤步骤的时间与强度之间的精细平衡。洗涤不足或延迟会导致纤维形貌紊乱，表现为PBS盐晶体在原纤维上留下的印迹。相反，在胶原蛋白制备后过度或过早洗涤，则会导致一层溶解的胶原蛋白覆盖在形貌特征之上（图4E、F）。

扫描电子显微镜（SEM）证实了胶原水凝胶中存在有序排列或随机分布的纳米原纤维结构。在有序排列和随机分布的水凝胶中，纳米原纤维的直径均介于30–50 nm之间29。从定性角度来看，有序水凝胶中包含单轴取向的纳米原纤维（图5）。此前已通过二维快速傅里叶变换分析对这种取向性进行了定量表征：有序水凝胶的取向图显示两个相距180°的显著峰，而随机取向的水凝胶仅表现出低频峰28。

明场成像显示，小鼠原代骨骼肌成肌细胞在胶原纤维各向异性纳米拓扑引导下呈现明显的细胞取向排列（图6）。这些具有纳米图案的胶原蛋白水凝胶已被证明不仅可诱导成肌细胞的细胞排列26 但也在其他细胞类型中，例如内皮细胞23,24.

透析袋、聚乙二醇制备超高密度胶原及胶原储存；玻片制备步骤，划痕、断裂、冲洗。示意图。
图1超高密度胶原蛋白及切割玻璃载片制备示意图 (A-F胶原蛋白透析过程：（A) 将透析袋剪成3英寸长的条状，并夹上第一枚夹子，(B) 将高密度胶原蛋白储备液装入管中，并固定第二个夹子，(C用聚乙二醇（PEG）碎片包裹已加样透析管，（D) 去除饱和的 PEG 碎片，(E) 用水冲洗掉 PEG 碎片，以及（F) 将超高密度胶原蛋白储存于微量离心管中。G-L) 玻璃载玻片切割过程：(G) 获取用于研究的载玻片，(H,I用金刚石尖玻璃切割刀对玻片进行划痕处理，（J) 从未划痕侧折断载玻片，(K) 用水冲洗切割后的玻璃，以及（L) 玻璃载玻片的干燥。使用 BioRender 制作。 请点击此处以查看此图的放大版本。

胶原蛋白挤出过程示意图；纤维形成、纤维束排列、水凝胶干燥阶段。
图 2：取向胶原蛋白水凝胶的制备过程。 步骤 1：在剪切力作用下将胶原蛋白挤入预热的 10x PBS 缓冲液中，并诱导纤维形成；步骤 2：将挤出的胶原蛋白固定在切割好的玻璃片上；步骤 3：叠加更多挤出的胶原蛋白以增加水凝胶的尺寸；以及 步骤 4：胶原蛋白水凝胶的干燥。使用 BioRender 制作。请点击此处查看该图的放大版本。

水凝胶形成过程示意图：单链到多链、纤维形成、干燥结果。
图 3：随机胶原蛋白水凝胶制备过程。步骤 1：将胶原蛋白挤出至切割的玻片上（单条带）；步骤 2：继续挤出胶原蛋白以增大尺寸（多条带）；步骤 3：将挤出的胶原蛋白浸入 10X PBS 缓冲液中以启动纤维形成；以及步骤 4：水凝胶的干燥。使用 BioRender 制作。请点击此处查看该图的放大版本。

涂层厚度比较；SEM结果；最佳/过厚/过薄的涂层；表面分析
图4：胶原水凝胶制备过程中可能的误差步骤。 (A-F) 示例（A）厚度适宜的胶原条，（B）过厚的胶原条，（C）胶原条厚度不足，（D）弯曲的胶原条带，以及（E,F过度清洗的胶原表面，通过扫描电子显微镜显示。比例尺 = 1 µm. 请点击此处查看此图的放大版本。

扫描电镜图像，取向性与随机纳米纤维的材料结构对比。
图5：取向性与随机胶原水凝胶的扫描电子显微镜图像。 图像使用电子显微镜拍摄，束流条件设置为2 keV，电流范围为25–100 pA，工作距离为4–5 mm。图像均以6144 × 4096像素的分辨率保存，停留时间为1 µs。比例尺 = 1 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

在100μm尺度下比较有序排列与随机排列纤维取向的显微图像，用于组织分析。
图6：在有序排列与随机排列的胶原水凝胶上培养的小鼠原代成肌细胞。 成肌细胞在成像前于水凝胶上培养3天。使用倒置显微镜在10倍放大倍数下拍摄明场图像。箭头指示有序排列的纳米原纤维取向。比例尺 = 100 µm。 请点击此处查看该图的高清版本。

讨论

该方案的关键步骤可归纳为三个主要部分：1）胶原蛋白纤维形成，2）水凝胶固定，3）洗涤。胶原蛋白纤维形成过程在中性条件下可自发进行，依赖于单个胶原分子自组装为更大且稳定的纤维结构。10,11通过使用如10倍浓度磷酸盐缓冲液（10x PBS）等中和性缓冲液，并将其预热至37 °C，可实现这一过程，这对于调控静电相互作用、确保胶原完全发育成原纤维至关重要。纳米级原纤维的取向排列是通过在原纤维形成的同时施加剪切力来实现的。剪切力的有无以及剪切速率的大小将决定原纤维的排列模式。其次，水凝胶固定是增强材料稳定性的关键步骤，其作用是在干燥过程中为材料提供物理锚定点，此过程伴随胶原的收缩与脱水。如果材料的预期用途是用于 体外 细胞接种，因为它将胶原固定在刚性基底上，防止不受控的收缩。随机型与取向型图案化水凝胶的固定过程略有不同。为确保随机型水凝胶的牢固附着，需在纤维形成之前，在固定表面（通常为玻璃）边缘额外沉积胶原，以将其牢固固定于表面。而取向型图案化水凝胶则通过将其包裹在固定表面边缘实现相同的锚定作用。对于取向型水凝胶，一个重要的附加考虑因素是胶原条的初始放置位置将决定水凝胶的形状和均匀性。后续胶原条的放置需借助已沉积胶原的表面张力进行引导，并在放置后避免触碰水凝胶。最后，固定后水凝胶的充分干燥与清洗至关重要，以维持其表面拓扑结构。若干燥不充分，随后用1×PBS或水清洗可能导致胶原溶解或形成类似蛋糕状的层状结构。为避免此问题，必须确保水凝胶完全干燥，可通过观察PBS结晶的形成及胶原透明度增加来直观确认。

胶原蛋白水凝胶已被用于两者 体外 研究与再生工程应用 体内23,24,25,26,27需要注意的是，水凝胶是在非无菌条件下制备的，因此在用于任何细胞培养或移植之前必须进行灭菌。推荐的灭菌方法为70%乙醇，因为其他灭菌方式（如紫外线照射）会通过交联和降解胶原分子而破坏纳米纤维的结构排列。30然而，通过蒸发和洗涤步骤去除乙醇对于最大限度减少残留乙醇至关重要，因为残留乙醇可能对细胞相容性产生不利影响。原料胶原蛋白批次间的差异可能导致透析后高浓度胶原蛋白工作浓度的波动，进而影响原纤维形成过程。根据具体应用需求，可能更倾向于选择随机各向同性排列而非定向各向异性排列；因此，在本实验方案中，我们同时包含了这两种方法以调控胶原原纤维的组织结构。

本方案中所述基于剪切力的挤出方法存在一个局限性，即该过程高度依赖人工操作和操作者个体差异。需要经过大量培训和实践，才能使每位操作者达到可重复的结果。这意味着为确保精确性，通量可能较低且耗时较长。其中部分局限性可通过高度自动化的机器制造方法来解决，例如3D打印、静电纺丝以及软光刻和表面光刻技术。然而，与其他这些方法不同，这种完全手动的纳米原纤维制备方法无需专用设备，具有良好的可及性和经济性。随着3D打印技术在方法学上的进步及其成本效益的持续提升，未来有望将本方案与3D打印技术相结合。尽管目前尚无法实现这种整合，但一旦成功，将有望显著提高本方案的一致性和通量。

制备两种不同拓扑结构的水凝胶为深入研究胶原原纤维纳米拓扑结构对细胞形态、行为及组织再生的引导作用提供了独特的机会。通过观察细胞对不同原纤维拓扑结构的响应，我们可以了解基底纳米级图案如何影响细胞表型。例如，先前的研究表明，当内皮细胞在取向排列的纳米原纤维上呈现伸长形态时，会表现出抗炎表型，并对紊乱的血流条件具有更强的耐受性24。这些发现不仅加深了我们对动脉粥样硬化病变发生机制的理解，也为未来抗动脉粥样硬化旁路移植物的设计带来了希望。这些胶原水凝胶可用于组织工程应用，并可在植入前负载生长因子或细胞以增强治疗效果25,26,27。比较分析显示，与无规拓扑结构的水凝胶相比，具有取向排列拓扑结构的水凝胶在肌肉再生和血管化方面表现更优26，并且若负载成肌生长因子，这些水凝胶还可作为无细胞的"即用型"材料，在小鼠损伤模型中促进组织再生27。尽管目前的研究重点是将这些水凝胶作为肌肉损伤的潜在治疗手段，但其应用可拓展至广泛的再生医学和组织工程领域。

披露

不存在任何利益冲突需要声明。

致谢

本研究部分得到了再生康复研究联盟资助项目的资助 & 培训，MTF Biologics，俄勒冈健康 & 科学大学基金会以及柯林斯医学信托基金。K.M.H. 获得美国国家科学基金会研究生研究奖学金（DGE-1937961）和俄勒冈学生学习与体验研究（OSLER）奖学金（5TL1TR2371-8）的支持。K.H.N. 获得美国国立卫生研究院/国家心脏、肺和血液研究所（NIH/NHLBI，R00HL136701）和美国国立卫生研究院/国家关节炎、肌肉骨骼和皮肤病研究所（NIH/NIAMS，R01AR080150）资助项目的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
高浓度 I 型胶原蛋白，大鼠尾部来源CorningCB354249
Eclipse TE-2000-U 显微镜NikonTE-2000-U 倒置显微镜
超厚显微镜载玻片Fisher Scientific22-267-005适用于胶原蛋白挤出表面
FEI Helios G3 NanoLab DualBeamThermo Fisher ScientificN/A扫描电子显微镜
玻璃切割工具套装 2 mm–20 mm 铅笔式油供碳化钨尖头Amazon/MOARMORB07Y1D243H可选玻璃切割工具
Hamilton Kel-F Hub 钝头针（鲁尔锁，22 G）Fisher Scientific14-815-574用于胶原蛋白挤出的针头
Nexterion Slide H 3-DSchottNC0782819疏水性载玻片
PBS 片剂Thermo Fisher Scientific18912014
聚乙二醇 8000Fisher BioReagentsBP233-1
无缝纤维素透析管 Fisher ScientificS25645G
SnakeSkin 透析夹Thermo Fisher ScientificPI68011
Synthware 玻璃切割器Synthware31-501-927可选玻璃切割工具

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