使用定量不可逆栓系测定法进行共价片段筛选

Summary

定量不可逆栓系 （qIT） 测定是一种基于荧光的方法，用于识别选择性地与靶蛋白结合的共价片段。这里概述了描述 qIT 检测的详细方案，并包括示例结果。

Abstract

与特定靶蛋白形成共价键的化合物作为化学探针和治疗剂具有多种优势。最常见的是，温和反应性的亲电小分子用于与特定蛋白质中的选定半胱氨酸侧链形成共价键。亲电优先的配体发现方法，即针对蛋白质靶标筛选亲电小分子库，已经变得很流行，因为它们避免了耗时的亲电弹头下游安装。然而，这种筛选很复杂，因为亲电配体可以与半胱氨酸表现出各种不同速率的自发反应。定量-不可逆栓系 （qIT） 提供了一种基于荧光的苗头化合物识别和开发方法，可对这些内在化合物反应性差异的数据进行标准化。确定单个化合物与目标蛋白的反应速率，并将其与化合物与非结构化三肽谷胱甘肽的反应性（这是自发化合物反应的代理）进行比较，从而能够鉴定优先与目标蛋白质反应的化合物。该方法已成功应用于鉴定针对多种药物靶标的选择性共价片段，包括 SARS-CoV-2 主要蛋白酶、细胞周期蛋白依赖性激酶 2 和 RAP27A。在这里，我们展示了 qIT 在靶蛋白上的应用，以生成定量和稳健的数据集，从而为未来的开发确定苗头化合物配体的优先级。

Introduction

近几十年来，半胱氨酸反应性靶向共价配体（通过与特定蛋白质上的选定半胱氨酸残基反应来发挥生物效应的分子）作为化学工具和治疗方法越来越受欢迎¹。这些通常由附着在对蛋白质靶标具有高亲和力的配体部分的温和反应性亲电试剂（如丙烯酰胺、氯乙酰胺或乙烯基砜）组成²。理想情况下，配体-蛋白质相互作用通过两步机制进行，包括初始非共价配体结合，然后在目标半胱氨酸和亲电试剂之间形成不可逆的共价键³。

几种早期靶向共价配体，包括 Bruton 酪氨酸激酶抑制剂依鲁替尼，是通过为先前鉴定的可逆配体提供亲电手柄来开发的⁴。然而，这种方法并不总是成功的，其他尝试发现亲电试剂的安装需要显著的优化⁵。相反，亲电优先的方法，特别是使用亲电片段的方法，近年来变得越来越流行。这些通常包括将亲电试剂库与蛋白质一起孵育，然后选择对半胱氨酸反应速率增强的化合物，假设半胱氨酸反应速率增强，这被认为是由配体和结合口袋之间的有效非共价相互作用诱导^{的 6}。值得注意的是，这些方法在 KRAS （G12C） 抑制剂 Sotorasib¹ 的开发过程中成功应用。

与传统的非共价配体筛选相比，亲电试剂优先筛选带来了一些独特的挑战，主要是由于弹头类别内和弹头类别之间的反应性高度可变⁷。随着时间的推移，大多数半胱氨酸反应性亲电试剂会与所有溶剂暴露的半胱氨酸残基反应，而不管对目标蛋白的任何选择性相互作用。因此，几乎所有亲电试剂的配体占有率都会随着时间的推移而增加，并且在不控制反应性的情况下，苗头化合物的选择通常会偏向于反应性更强的片段，这些片段能更快地与靶标结合⁸。

此外，亲电优先筛选方法通常使用质谱法来检测蛋白质-配体加合物的形成，这在通量上是有限的⁹。需要在较长的时间段（数小时到数天）内定期进行反应采样，以正确表征具有不同亲电性的化合物库的反应动力学¹⁰。因此，在 10 个时间点采样的 300 个片段的筛选将需要执行 3000 张质谱图，这超出了大多数蛋白质质谱系统的通量。因此，需要高通量方法来监测蛋白质-配体加合物的形成。

此处概述的方法，即定量不可逆栓系 （qIT） 测定，是一种亲电优先筛选方法，可控制内在反应性并利用简单的荧光读数⁷。将蛋白质或谷胱甘肽（一种非结构化的、含硫醇的三肽，用作内在反应性的对照）与亲电片段库一起孵育，并取常规样品淬灭成 CPM（7-二乙氨基-3-（4'-马来酰亚胺基苯基）-4-甲基香豆素，一种荧光硫醇定量剂）溶液。半胱氨酸和亲电片段之间形成的加合物减少了可与 CPM 反应的巯基量，从而减少了淬灭时产生的荧光。因此，CPM 荧光充当未反应巯基的代理，从而可以确定巯基反应与每个亲电子片段的动力学。选择蛋白质反应性显著优于谷胱甘肽的亲电片段作为命中，并优先进行进一步开发（图 1）。

图 1:qIT 示意图。 qIT 检测的示意图概述。（使用 BioRender 创建）。 请单击此处查看此图的较大版本。

使用 REF 值的苗头化合物选择可控制内在反应性，并确保仅当片段与蛋白质靶标形成有效的非共价相互作用时，它们才会被选为苗头化合物。简单的荧光读数还意味着 qIT 分析具有高度可扩展性，不需要基于质谱的反应监测方法。

这里概述了 qIT 检测的综合程序，并包括示例结果以说明检测性能和苗头化合物选择。

Protocol

1. 片段库构建

1. 设计一个亲电片段库，然后合成或购买它们。亲电片段库通常由附着在各种化学支架上的温和反应性亲电试剂（如丙烯酰胺、氯乙酰胺和乙烯基磺酰胺）组成。亲电片段库可从商业供应商处广泛获得，有关其设计和构建的更多细节将在其他地方回顾 ^5,11。
2. 将每种化合物溶于 DMSO 中至浓度为 50 mM，然后将不同的化合物分配到 384 孔储液槽板的第 3 至 22 列的每个孔中，称为片段文库板。
   1. 将 DMSO 分配到第 1、2、23 和 24 列的每个孔中，用于阳性和阴性对照。板布局可以根据筛选的化合物数量而变化（图 2）。添加到文库板中的体积将取决于要执行的筛选数量，考虑到每个 qIT 筛选每个孔大约需要 1.8 μL。提前准备该片段文库板并将其储存在 4 °C。

图 2:板布局。 qIT 检测 384 孔板布局概述。 请单击此处查看此图的较大版本。

2. 检测设置（图 3）

1. 制备以下溶液:重组蛋白溶液（任何缓冲液中的靶蛋白）、qIT 检测缓冲液（150 mM NaCl、25 mM Hepes （pH 8））、qIT 检测淬灭缓冲液（150 mM NaCl、25 mM Hepes （pH 7.5））和化合物储备液（DMSO 中的亲电片段 （50 mM））。
   注:反应缓冲液中的 pH 值为 8 以加速目标半胱氨酸残基和片段之间的反应，即使对于反应性极弱的片段，也可以测量反应速率。淬灭缓冲液中使用的 pH 值略低，为 7.5，因为在 CPM 的马来酰亚胺和半胱氨酸硫醇之间形成的硫醚键在更碱性的 pH 值下容易水解（例如，以前的工作发现半胱氨酸-马来酰亚胺偶联物在 pH 7.3 下比在 pH 8 下稳定得多¹²）。
2. 从储存中取出 DMSO 片段储备溶液，并在室温下放置至少 2 小时，以使化合物储备液解冻。
3. 通过用氩气鼓泡约 30 分钟来脱气 qIT 检测缓冲液。
4. 将目标蛋白溶液彻底置换到脱气的 qIT 检测缓冲液中。至关重要的是，必须彻底去除 DTT 和 TCEP 等还原剂<浓度为 100 nM，因为它们会干扰巯基定量。此步骤可以通过一系列重复的缓冲液更换来执行，如下所述。
   1. 在旋转过滤装置中稀释过量脱气的 qIT 测定缓冲液的蛋白质溶液，使用离心浓缩（4000 x g ，4 °C，15 分钟）并重复。通常，需要 4 轮 1/15 稀释液才能从 1 mL 重组蛋白储备液中充分去除 DTT （1 mM），尽管此步骤可以根据原始重组蛋白溶液中的还原剂浓度进行调整。
      注:或者，用大量过量的脱气 qIT 检测缓冲液透析目标蛋白溶液可以获得相同的结果。
5. 在脱气的 qIT 检测缓冲液中将目标蛋白溶液（在步骤 2.1 中产生）稀释至 15 μM 的蛋白浓度。大约需要 9 mL 靶蛋白溶液才能填充具有足够死体积的 384 孔板。
6. 在脱气的 qIT 测定缓冲液中制备 1.5% （v/v） 的 TCEP-琼脂糖悬浮液。每个筛选板大约需要 9 mL 的 TCEP-琼脂糖悬浮液。
7. 将 20 μL TCEP-琼脂糖溶液分配到两个 384 孔板的每个孔中。
8. 在脱气的 qIT 测定缓冲液中制备 15 μM 谷胱甘肽原液。这应该在电镀前立即制备，因为谷胱甘肽会在溶液中迅速氧化，而无需还原剂。
9. 将 20 μL qIT 检测缓冲液分配到两个 384 孔板的第 1 列和第 2 列中。
10. 将 20 μL 的 15 μM 蛋白质或谷胱甘肽溶液（根据预期的板）分配到 384 孔板的第 3-24 列中。这些被称为蛋白质反应板和谷胱甘肽反应板。在 RT 下减少 1 小时。
11. 将 58.2 μL 脱气的 qIT 检测缓冲液分配到 384 孔板的每个孔中，然后从片段文库板的每个相应孔中转移 1.8 μL，以制备化合物稀释板，其中每种化合物在 qIT 检测缓冲液中稀释至 1.5 mM 的浓度加 3% DMSO。
    注:使用 384 移液站可以更轻松地完成此步骤，该移液站允许在一次作中为每个孔转移化合物储备液。
12. 将蛋白质和谷胱甘肽与 TCEP 琼脂糖孵育 1 小时后，将 20 μL 化合物溶液从化合物稀释板的每个孔中转移到蛋白质和谷胱甘肽反应板中以开始测定。使用 384 移液站也使这一步骤变得更加容易。检测步骤总结于 图 3 中。
    注:片段浓度可根据需要变化，如果需要，可以对较低浓度的命中重复 qIT 分析，以确认蛋白质亲和力不是高片段浓度的伪影。相对较高的片段浓度用于提高 k_pro 和 k_GSH，以确保可确定轻度反应性化合物的准确速率（在测定条件下，其> 24 小时可以显示 t_1/2（GSH））。此外，尽管 500 μM 的片段浓度很高，但在片段筛选中使用了高 μM 至低 mM 浓度，例如¹³。
13. 启动计时器 - 分析已开始，应根据以下部分在固定时间点进行淬灭。

图 3:qIT 检测总结。 总结了 qIT 分析反应孔设置的关键步骤。（使用 BioRender 创建）。 请单击此处查看此图的较大版本。

3. CPM 淬火

注:进行 CPM 淬灭以量化蛋白质和谷胱甘肽反应板中残留的未反应硫醇的量。这些应在离散的时间点进行（例如，通常使用以下时间点:7、15、30、60、120、240、360、1220 和 1440 分钟），以便监测反应动力学。

1. 在 DMSO 中制备 CPM 储备溶液 （500 μM），将它们分配到微量离心管中的 111.2 μL 等分试样中，并储存在 -20 °C。 这些 CPM 储备液可以提前制备，每个淬灭时间点需要 1 等分试样。
2. 通过解冻冷冻的 CPM 储备液 （500 μM） 并将其添加到 40 mL qIT 测定淬灭缓冲液中来制备 CPM 淬灭溶液 （1.4 μM）。
3. 将 27 μL CPM 淬灭溶液分配到两个 384 孔板的每个孔中 - 淬灭蛋白质和谷胱甘肽反应板需要两个。这些被称为 CPM 淬火板，使用前最多 30 分钟准备它们。
4. 将蛋白质反应板以 200 x g 离心 3 分钟，以确保 TCEP 琼脂糖沉淀。
5. 在预定的时间点，将 3 μL 样品从蛋白质反应板的每个孔中转移到预装的 CPM 淬灭板中。使用 384 移液站也简化了此步骤。
6. 通过吸取和分配 3 x 25 μL 来混合 CPM 淬火板。重要的是从孔的顶部取出样品，以避免从底部吸出 TCEP-琼脂糖，这会干扰 CPM 淬灭。
7. 使用谷胱甘肽反应板重复步骤 3.4-3.6。
8. 在室温下孵育 CPM 淬火板（在 3.4-3.6 中制备）1 小时。
9. 测量 CPM 淬灭板的荧光强度（384 nm 激发和 470 nm 发射）。

4. 数据分析和命中选择

1. 对于每次淬灭，计算 Z' 作为测定质量的量度。任何 Z' < 0.5 的 CPM 淬灭都应该被忽略。
   Z' = 1 - （（3σ_阳性对照 + 3σ_阴性对照） / （μ_阳性对照 - μ_阴性对照））
   其中 σ = 荧光强度标准差，μ = 荧光强度平均值
2. 计算阴性和阳性对照孔（分别为第 1 列和第 2 列，第 23 列和第 24 列）的平均荧光值。
3. 将每个反应很好地标准化为阳性和阴性对照的平均荧光值:
   修饰% = 100 x（化合物孔荧光 - 阴性对照荧光）/（阳性对照荧光 - 阴性对照荧光）
4. 分别绘制与谷胱甘肽和目标蛋白反应的每种化合物的修饰百分比与时间的关系。
5. 使用以下公式将标准化的 % 修饰与时间数据拟合到与蛋白质和谷胱甘肽反应的单相指数衰减模型:
   修改百分比 = ae ^{- kt + c}
   其中 a = % 修饰值的范围，k = 反应速率，t = 时间，c = 无限大时的 % 修饰值。曲线拟合和参数确定可以使用商业软件（如 Graphpad）进行。
6. 使用片段与蛋白质 （k_pro） 和谷胱甘肽 （k_GSH） 的反应速率计算每个片段的速率增强因子 （REF） 值:
   参考 = k_pro / k_GSH
7. 使用 REF 值选择点击片段。这可以通过设置 REF 阈值（例如，REF > 3）、任意命中率（例如，前 2%）或通过选择 REF 3 标准差大于几何平均值的片段来实现。

Results

qIT 检测试剂盒用于鉴定未命名的单个半胱氨酸蛋白的共价片段命中。将 MgCl₂ （10 mM） 添加到反应缓冲液中，因为已知靶蛋白与 Mg²⁺ 离子结合。筛选一式三份进行，并确定每个片段与靶蛋白 （k_pro） 和谷胱甘肽 （k_GSH） 反应的速率。所有淬灭板的 Z' 值均大于 0.5，蛋白质淬灭的平均值为 0.75，谷胱甘肽淬灭的平均值为 0.79，表明分析性能优异。然后计算每个片段的 REF 值，并选择 REF > 3 的命中。

代表性结果（图 4）提供了使用 qIT 检测进行苗头化合物选择的实例。化合物 1 与靶蛋白上半胱氨酸残基的反应速率是与谷胱甘肽反应的 6.0 倍，并且使用 REF > 3 的标准，被选为苗头化合物（图 4B）。这种速率加速表明存在模板效应，其中非共价相互作用将 1 位位于目标蛋白上的半胱氨酸与氯乙酰胺弹头反应的正确方向。相比之下， 2 是非命中片段的一个例子，因为 2 与目标半胱氨酸残基之间的反应相对于 2 与谷胱甘肽之间的反应没有加速。缺乏速率加速表明没有有效的非共价相互作用将 2 定位在正确的方向上以与目标半胱氨酸残基反应。

图 4:代表性结果。 结果显示，qIT 对 （A） 高内在反应性、可能的假阳性命中片段和 （B） 命中片段的蛋白质和谷胱甘肽反应进行了监测。 请单击此处查看此图的较大版本。

Discussion

qIT 检测试剂盒为筛选针对靶蛋白的半胱氨酸反应性亲电片段提供了一个有效且方便的平台。然而，如果考虑不充分，有一些关键因素可能会妨碍检测性能。最值得注意的是，靶蛋白必须仅包含一个表面暴露的半胱氨酸才适合 qIT 筛选，因为其他半胱氨酸残基会与 CPM 反应并干扰荧光测量。在先前包含多个表面暴露的半胱氨酸的靶蛋白（例如 SARS-CoV-2 主蛋白酶、小 GTP 酶 RAP27A 和细胞周期蛋白依赖性激酶 2）的情况下，去除干扰残基的筛选构建体以前已成功使用。然而，这种策略的有效性会因蛋白质 10,14,15 而异。

此外，由于 qIT 检测测量的是可与 CPM 反应的巯基随时间推移而减少的情况，因此任何降低可用巯基比例的因素（例如巯基氧化或蛋白质聚集）都可能妨碍检测性能。缓冲液脱气和使用固定化还原剂（TCEP-琼脂糖）可确保巯基氧化缓慢，并且应通过将荧光测量值标准化为阳性对照孔的荧光测量值来减轻任何剩余的氧化。然而，当 TCEP-琼脂糖在孔之间的分布不均匀导致巯基氧化不均匀时，就会出现问题。因此，一致的 TCEP-琼脂糖铺板对于检测性能至关重要，由于 TCEP-琼脂糖颗粒在移液储液槽中沉没，因此这可能具有挑战性。

蛋白质聚集也可能是一个问题，因为检测条件（室温孵育 24 小时）相对苛刻。故障排除策略（例如将靶蛋白融合到溶解标签、改变反应缓冲液或在较低温度下进行检测）可以减少聚集并可能解决蛋白质稳定性问题。某些片段也可能诱导蛋白质聚集，这再次降低了可与 CPM 反应的巯基比例，并产生假阳性命中。使用完整蛋白质谱法进行正交苗头验证是检测这些情况的有效方法，因为当与靶蛋白一起孵育时，假阳性命中会产生少量或不存在的标记物种群。

当这些因素得到控制时，qIT 检测比其他共价片段筛选方法具有一些明显的优势。使用 REF 的苗头化合物选择可确保仅当苗头化合物与靶蛋白形成有效的非共价相互作用时，才会被选中。碎片亲电性在大范围内变化，包括不同弹头之间和弹头类别内;例如，以前的工作发现丙烯酰胺之间的谷胱甘肽反应率存在数百倍的变化¹⁰。由于模板效应，这种广泛的亲电性使得区分具有高 k_pro 值的片段与那些简单的高反应性片段变得具有挑战性，这可能导致高反应性片段被选为假阳性命中。例如，2 与目标半胱氨酸残基的反应速度比 1 快，并且在不考虑内在反应性的情况下，可以被选为苗头化合物。然而，2 与目标半胱氨酸残基的反应速率并不比与谷胱甘肽反应更大，这表明 2 相对于 1 的 k_pro 更大，这是由于片段内在反应性更大，而不是模板效应。

qIT 分析用于定量剩余巯基的简单荧光读数也非常有利。其他共价片段筛选方法使用完整蛋白质谱法来确定片段与目标蛋白反应的速率，并使用 LC-MS 来确定谷胱甘肽与片段反应的速率 - 这两种方法都需要专门的设备并且通量不足 ^8,16。方便的荧光读数使 qIT 检测具有高度可扩展性，并且只需要常用的实验室设备。

这些创新相结合，创造了一种稳健且可扩展的共价片段筛选方法，无需质谱设备。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
氩气	BOC	I1149
康宁 384 孔、低法兰、平底分析板	康宁	3575
CPM	Invitrogen	D346
DMSO	Sigma-Aldrich	D8418
固定化 TCEP 琼脂糖	Pierce	77712
微孔板检测仪	CLARIOstar
PCR 板密封	BioRad	MSA5001
还原 L-谷胱甘肽	Sigma-Aldrich	G4251
氯化钠	Sigma-Aldrich	S9888
Hepes 钠	Sigma-Aldrich	RES6007H-A7