定量不可逆锚定（qIT）检测是一种基于荧光的方法，用于鉴定选择性结合靶蛋白的共价片段。本文概述了一项详细的实验方案，以描述qIT检测，并包含了示例结果。
本文内容
摘要
摘要
能够与特定靶蛋白形成共价键的化合物作为化学探针和治疗剂具有多种优势 。通常使用轻度反应性的亲电小分子与特定蛋白质中的特定半胱氨酸侧链形成共价键。在配体发现的“亲电基团优先”策略中，通过筛选包含多种亲电小分子的化合物库来作用于靶蛋白，该方法日益流行，因为它避免了后续耗时地引入亲电弹头的步骤。然而，此类筛选较为复杂，因为亲电配体与半胱氨酸发生自发反应的速率可能差异很大。定量不可逆锚定技术（qIT）提供了一种基于荧光的方法，用于筛选命中化合物并进行优化，该方法可对化合物本征反应活性的差异进行数据归一化处理。通过测定各个化合物与靶蛋白的反应速率，并将其与化合物同无固定结构的三肽谷胱甘肽的反应活性进行比较（后者作为化合物自发反应的替代指标），从而识别出优先与目标蛋白反应的化合物。该方法已成功应用于多个药物靶点的选择性共价片段筛选，包括严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）主蛋白酶、细胞周期蛋白依赖性激酶2（cyclin-dependent kinase 2）以及RAP27A。本文中，我们展示了将qIT技术应用于一个靶蛋白，以生成定量且稳健的数据集，从而为后续开发优先筛选出有潜力的命中配体。
引言
近年来，针对半胱氨酸的共价配体（通过与特定蛋白质上的特定半胱氨酸残基发生反应从而产生生物学效应的分子）作为化学工具和治疗剂的应用日益广泛1。这类分子通常由一个轻度反应性的亲电基团（如丙烯酰胺、氯乙酰胺或乙烯基砜）与一个对靶标蛋白具有高亲和力的配体部分连接而成2。理想情况下，配体与蛋白的相互作用通过两步机制进行：首先发生非共价结合，随后靶标半胱氨酸与亲电基团之间形成不可逆的共价键3。
一些早期的靶向共价配体，包括布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂伊布替尼（Ibrutinib），是通过在先前已确定的可逆配体上引入亲电基团而开发的4。然而，这种方法并不总是成功，其他研究发现引入亲电基团往往需要大量优化5。近年来，亲电基团优先的策略，特别是使用亲电片段的方法，变得越来越流行。这些方法通常涉及将一组亲电片段与靶蛋白共同孵育，然后筛选出对半胱氨酸具有更快反应速率的化合物，该速率的提升被认为是由配体与结合口袋之间有利的非共价相互作用所诱导的6。值得注意的是，这些方法在KRAS (G12C) 抑制剂索托拉西布（Sotorasib）的开发过程中得到了成功应用1。
与传统的非共价配体筛选相比，亲电体优先筛选面临若干独特的挑战，主要原因是不同弹头类别内部及类别之间的反应性存在高度变异性7。大多数与半胱氨酸反应的亲电体会随着时间推移与所有溶剂可及的半胱氨酸残基发生反应，而不论其是否对靶标蛋白具有选择性结合。因此，几乎所有亲电体的配体占据率都会随时间增加；若不控制反应性，筛选命中物往往偏向于那些与靶标结合更快、反应性更高的片段8。
此外，亲电试剂优先筛选方法通常采用质谱法检测蛋白质-配体加合物的形成，但该方法的通量有限9。为了充分表征具有不同亲电性的化合物库的反应动力学，需要在较长时间内（数小时至数天）进行常规反应取样10。因此，对300个片段在10个时间点进行筛选，将需要完成3000次质谱分析，超出了大多数蛋白质质谱系统的通量能力。因此，亟需更高通量的蛋白质-配体加合物形成监测方法。
本文所述方法为定量不可逆锚定（qIT）检测，是一种以亲电片段优先的筛选方法，可控制固有反应性，并利用简单的荧光读数进行检测7。将蛋白质或谷胱甘肽（一种无结构的含巯基三肽，用于作为固有反应性的对照）与一系列亲电片段文库共同孵育，并定期取样，淬灭至CPM溶液（7-二乙氨基-3-(4'-马来酰亚胺基苯基)-4-甲基香豆素，一种荧光生成型巯基定量试剂）中。半胱氨酸与亲电片段之间的加合物形成会减少可用于与CPM反应的巯基数量，从而降低淬灭后的荧光信号。因此，CPM荧光强度可作为未反应巯基的替代指标，用于确定每个亲电片段与巯基反应的动力学。相较于谷胱甘肽，对蛋白质反应性显著增强的亲电片段被选为阳性命中化合物，并优先用于后续开发（图1）。
图1：qIT 示意图。 qIT 检测的示意图概述。（使用 BioRender 创建）。请点击此处查看此图的放大版本。
利用REF值进行命中筛选可控制内在反应性，确保只有当片段与蛋白质靶标形成有效的非共价相互作用时，才被选为命中化合物。简单的荧光检测读数也意味着qIT实验具有高度可扩展性，且无需依赖基于质谱的反应监测方法。
本文概述了qIT检测的完整操作流程，并提供了示例结果，以说明检测性能及阳性结果的筛选方法。
方案
1. 片段文库构建
- 设计一个亲电性片段库，并对这些片段进行合成或采购。亲电性片段库通常包含反应活性较温和的亲电基团（例如丙烯酰胺、氯乙酰胺和乙烯基磺酰胺），并连接在多种多样的化学骨架上。市面上已有多个供应商提供此类亲电性片段库，其设计与构建的更多细节可参见其他综述文献5,11。
- 将每种化合物溶解于DMSO中，配制成50 mM的浓度，然后将不同的化合物分别加入384孔储液板的第3至第22列的各个孔中，该板称为片段库板。
- 在第1、2、23和24列的每个孔中加入DMSO，作为阳性和阴性对照。板的布局可根据待筛选化合物的数量进行调整（图2）。加入片段库板的体积取决于计划进行的筛选次数，每次qIT筛选每个孔约需1.8 μL。该片段库板应提前配制，并在4 °C下保存。
图2：孔板布局。qIT实验384孔板布局的总体示意图。请点击此处查看该图的放大版本。
2. 实验设置（图3）
- 配制以下溶液：重组蛋白溶液（目标蛋白溶于任意缓冲液中）、qIT检测缓冲液（150 mM NaCl，25 mM Hepes（pH 8））、qIT检测淬灭缓冲液（150 mM NaCl，25 mM Hepes（pH 7.5））以及化合物储备溶液（50 mM 亲电性片段溶于DMSO中）。
注意：反应缓冲液的 pH 值设为 8，以加速目标半胱氨酸残基与片段之间的反应，从而即使对于反应活性极弱的片段，也能测量其反应速率。淬灭缓冲液采用略低的 pH 值（7.5），因为 CPM 的马来酰亚胺与半胱氨酸巯基形成的硫醚键在更偏碱性的 pH 条件下容易发生水解（例如，先前的研究发现，半胱氨酸-马来酰亚胺偶联物在 pH 7.3 时比在 pH 8 时稳定得多）12). - 从储存处取出DMSO片段储备溶液，在室温下放置至少2小时，使化合物储备液充分解冻。
- 用氩气鼓泡处理qIT测定缓冲液约30分钟以去除溶解氧。
- 将目标蛋白溶液彻底置换到脱气的 qIT 检测缓冲液中。关键的是，必须将二硫苏糖醇（DTT）和三(2-羧乙基)膦（TCEP）等还原剂彻底去除至极低浓度 < 100 nM，因为它们会干扰巯基的定量。此步骤可通过重复进行缓冲液置换来完成，如下所述。
- 在超滤离心管中，用过量的脱气qIT测定缓冲液稀释蛋白质溶液，通过离心（4000 × g）进行浓缩， 4 °C，15 分钟），然后重复此步骤。通常需要进行 4 轮 1:15 稀释，才能充分去除 1 mL 重组蛋白储备液中的 DTT（1 mM）；但该步骤可根据原始重组蛋白溶液中还原剂的浓度进行调整。
注意：或者，将目标蛋白溶液对大量脱气的qIT检测缓冲液进行透析，也可达到相同效果。
- 在超滤离心管中，用过量的脱气qIT测定缓冲液稀释蛋白质溶液，通过离心（4000 × g）进行浓缩， 4 °C，15 分钟），然后重复此步骤。通常需要进行 4 轮 1:15 稀释，才能充分去除 1 mL 重组蛋白储备液中的 DTT（1 mM）；但该步骤可根据原始重组蛋白溶液中还原剂的浓度进行调整。
- 将目标蛋白溶液（步骤 2.1 中制备）稀释至蛋白浓度为 15 μM 在脱气的qIT测定缓冲液中。填充384孔板并保留足够死体积约需9 mL靶蛋白溶液。
- 在脱气的qIT检测缓冲液中制备1.5%（v/v）的TCEP-琼脂糖悬浮液。每块筛选板约需9 mL TCEP-琼脂糖悬浮液。
- 分配 20 μL 将TCEP-琼脂糖溶液加入两个384孔板的每个孔中。
- 制备一种 15 μM 在脱气的qIT检测缓冲液中配制谷胱甘肽储备液。该储备液应在铺板前立即配制，因为谷胱甘肽在无还原剂的溶液中会迅速氧化。
- 分配 20 μL 将qIT测定缓冲液加入两个384孔板的第1和第2列。
- 分配 20 μL 的 15 μM 将蛋白或谷胱甘肽溶液（根据目标板的类型）加入384孔板的第3至24列。这些板分别称为蛋白反应板和谷胱甘肽反应板。室温下孵育1小时以进行还原反应。
- 分配 58.2 μL 将脱气的qIT测定缓冲液加入384孔板的每孔中，然后转移 1.8 μL 从片段文库板的每个相应孔中转移至化合物稀释板，使每种化合物在qIT检测缓冲液中稀释至1.5 mM浓度，并含有3% DMSO。
注意：使用384道移液工作站可简化此步骤，该设备可在一次操作中将化合物母液转移至所有孔中。 - 蛋白与谷胱甘肽在TCEP-agarose中孵育1小时后，转移 20 μL 将化合物稀释板中每个孔的化合物溶液分别加入蛋白反应板和谷胱甘肽反应板，以启动检测。使用384通道移液工作站可使该步骤操作更为简便。检测步骤总结如下 图3.
注意：可根据需要调整片段浓度，如有必要，可对命中化合物在较低浓度下重复进行qIT检测，以确认蛋白质亲和力并非高片段浓度所致的人为假象。使用相对较高的片段浓度是为了提高kpro 和 kGSH 以确保能够准确测定弱反应性化合物（可能表现出 t 的反应速率1/2(GSH) > 24 h 在检测条件下）。此外，尽管片段浓度为 500 µM 高，高 µM 例如，在片段筛选中已使用低毫摩尔浓度13. - 启动计时器——检测正式开始，应按照下述部分的要求在规定时间点进行淬灭反应。
图3：qIT实验流程概要。 本图概括展示了qIT实验反应孔设置的关键步骤。（使用BioRender绘制）请点击此处查看该图的放大版本。
3. CPM 淬灭
注意：进行 CPM 淬灭以定量蛋白质和谷胱甘肽反应板中剩余的未反应巯基含量。应在不同的时间点（例如，通常使用以下时间点：7、15、30、60、120、240、360、1220 和 1440 分钟）进行该操作，以便监测反应动力学。
- 用DMSO配制CPM储备液（500 μM），分装至微量离心管中，每管111.2 µL，于-20 °C保存。这些CPM储备液可预先配制，每个淬灭时间点需使用1份分装液。
- 将冷冻的CPM储备液（500 μM）解冻后加入40 mL qIT检测淬灭缓冲液中，配制CPM淬灭溶液（1.4 μM）。
- 将27 µL CPM淬灭溶液加入两块384孔板的每孔中——淬灭蛋白质反应板和谷胱甘肽反应板各需一块。这些板称为CPM-淬灭板，应在使用前最多30分钟内制备。
- 将蛋白质反应板在200 x g 条件下离心3分钟，确保TCEP-琼脂糖沉淀至管底。
- 在预设的时间点，从蛋白质反应板的每孔中转移3 µL样品至预装有CPM淬灭液的孔板中。此步骤可使用384通道移液工作站简化操作。
- 通过反复吸液和排液3次（每次25 µL）混匀CPM淬灭板。注意应从孔的上层吸取样品，避免吸入底部的TCEP-琼脂糖，以免干扰CPM的淬灭反应。
- 对谷胱甘肽反应板重复步骤3.4–3.6。
- 将CPM淬灭板（按步骤3.4–3.6制备）在室温下孵育1小时。
- 测定CPM淬灭板的荧光强度（激发波长384 nm，发射波长470 nm）。
4. 数据分析与阳性结果筛选
- 对于每次淬灭，计算Z'值以评估检测质量。任何CPM淬灭若其Z'值低于0.5，则应被排除。 < 0.5 应予以忽略。
Z' = 1 - ((3σ阳性对照 + 3σ阴性对照) / (µ阳性对照 - µ阴性对照))
其中，σ = 荧光强度标准差， µ = 荧光强度均值 - 计算阴性对照孔（第1列和第2列）和阳性对照孔（第23列和第24列）的平均荧光值。
- 将每个反应孔的荧光值相对于阳性和阴性对照的平均荧光值进行归一化处理：
% 修饰率 = 100 ×（化合物孔荧光值 - 阴性对照荧光值）/（阳性对照荧光值 - 阴性对照荧光值） - 分别绘制每种化合物与谷胱甘肽反应以及与靶蛋白反应的修饰百分比随时间变化的曲线。
- 将蛋白质反应和谷胱甘肽反应的归一化修饰百分比随时间变化的数据，分别用以下公式拟合为单相指数衰减模型：
% 修改 = ae - kt + c
其中，a 表示修饰百分比值的范围，k 表示反应速率，t 表示时间，c 表示无限时间时的修饰百分比值。曲线拟合及参数确定可使用商业软件（如 Graphpad）完成。 - 使用片段与蛋白质反应的速率kpro）和谷胱甘肽（kGSH) 用于计算每个片段的速率增强因子（REF）值：
REF = kpro / kGSH - 使用 REF 值筛选命中片段。可通过设定 REF 阈值（例如，REF > 3），任意的命中率（例如，前 2%），或通过选择 REF 值比几何均值高 3 个标准差的片段。
结果
本研究采用qIT实验鉴定针对一种未命名的单半胱氨酸蛋白的共价片段命中物。由于目标蛋白已知可结合Mg2+离子，因此在反应缓冲液中添加了MgCl2（10 mM）。筛选实验重复进行三次，测定各片段与目标蛋白（kpro）及谷胱甘肽（kGSH）的反应速率。所有淬灭板的Z'值均大于0.5，其中蛋白淬灭的平均Z'值为0.75，谷胱甘肽淬灭的平均Z'值为0.79，表明该实验具有优异的性能。随后计算每个片段的REF值，并选择REF > 3的片段作为命中物。
代表性结果（图4），提供使用qIT检测进行命中化合物筛选的示例。化合物 1 与谷胱甘肽相比，与靶蛋白上的半胱氨酸残基反应速率快6.0倍，并采用REF作为判断标准 > 3 被选为命中结果（图 4B。这种速率加快表明存在模板效应，即通过非共价相互作用使反应组分定向排列 1 靶蛋白上的半胱氨酸与氯乙酰胺弹头发生反应时，应保持正确的取向。相比之下， 2 是一个非命中片段的例子，因为其反应在 2 且目标半胱氨酸残基的反应速率并未比以下反应加快 2 和谷胱甘肽。缺乏速率加速表明不存在能够有效定位的非共价相互作用 2 以正确的取向与目标半胱氨酸残基发生反应。
图4代表性结果。 结果表明，通过qIT对蛋白质和谷胱甘肽反应进行监测，以（A) 高固有反应性，可能为假阳性命中片段，以及 (B) 命中片段。 请点击此处以查看此图的放大版本。
讨论
qIT 检测为筛选针对靶蛋白的半胱氨酸反应性亲电片段提供了一个高效且便捷的平台。然而，若未充分考虑某些关键因素，可能会影响检测的性能。尤其需要注意的是，靶蛋白必须仅含有一个暴露于表面的半胱氨酸，才适用于 qIT 筛选，因为其他半胱氨酸残基会与 CPM 发生反应，干扰荧光测定。在以往的研究中，对于含有多个表面暴露半胱氨酸的靶蛋白（例如 SARS-CoV-2 主蛋白酶、小 GTP 酶 RAP27A 和周期蛋白依赖性激酶 2），已成功使用去除了干扰残基的筛选构建体。然而，该策略的有效性会因蛋白不同而有所差异10,14,15。
此外，由于qIT检测法是通过测量随时间推移可与CPM反应的巯基减少量来实现检测，因此任何会降低可利用巯基比例的因素（例如巯基氧化或蛋白质聚集）都可能影响检测性能。缓冲液脱气以及使用固定化还原剂（TCEP-agarose）可确保巯基氧化速率较慢，任何残留的氧化效应应通过将荧光测量值归一化至阳性对照孔的数值来消除。然而，当TCEP-agarose在各孔之间分布不均时，可能导致巯基氧化程度不一致，从而引发问题。因此，TCEP-agarose加样的一致性对于检测性能至关重要；但由于TCEP-agarose颗粒在移液储液槽中容易沉降，实现均匀加样可能具有挑战性。
蛋白质聚集也可能成为一个问题，因为实验条件（室温孵育24小时）相对较为严苛。可通过一些故障排除策略来减少聚集，例如将目标蛋白与可溶性标签融合、改变反应缓冲液或在较低温度下进行实验，这些方法可能有助于解决蛋白质稳定性问题。某些片段还可能诱导蛋白质聚集，从而再次降低可用于与CPM反应的巯基比例，并导致假阳性结果。采用完整蛋白质质谱法进行正交验证是检测此类情况的有效方法，因为假阳性命中物在与目标蛋白孵育后，只会产生少量或几乎不存在的标记物种群体。
当这些因素得到控制时，qIT 检测法相较于其他共价片段筛选方法具有一些明显优势。使用 REF 进行命中化合物的选择可确保仅当片段与靶标蛋白形成有效的非共价相互作用时才会被选中。片段亲电性在不同弹头之间以及同一类弹头内部均存在很大差异；例如，先前的研究发现丙烯酰胺类化合物与谷胱甘肽反应速率的差异可达数百倍10。这种广泛的亲电性差异使得区分高 kpro 值是源于模板效应还是仅仅由于片段本身高度反应性变得困难，从而可能导致高反应性片段被误判为阳性命中。例如，2 与靶标半胱氨酸残基的反应速度比 1 更快，若不考虑其本征反应性，可能会被选为命中化合物。然而，2 与靶标半胱氨酸残基的反应速率并不高于其与谷胱甘肽的反应速率，表明 2 相较于 1 更高的 kpro 值是由于其更高的片段本征反应性，而非模板效应所致。
qIT检测通过简单的荧光信号读数来定量残留的巯基，这一方法也具有显著优势。其他共价片段筛选方法通常采用完整蛋白质质谱法来确定片段与靶标蛋白反应的速率，并采用液相色谱-质谱联用（LC-MS）来测定谷胱甘肽与片段反应的速率——这两种方法均需要专用设备，且通量较低8,16。而qIT检测所采用的便捷荧光读数方式使其具有高度可扩展性，且仅需常规实验室设备即可完成。
这些创新技术相结合，建立了一种稳健且可扩展的共价片段筛选方法，无需使用质谱设备。
披露
A.A. 和 D.J.M. 是一项涵盖 qIT 检测技术的专利（PCT/GB2017/052456）的共同发明人。
致谢
本工作获得了英国工程与物理科学研究委员会资助（博士生奖学金：EP/S023518/1）。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 氩气 | BOC | I1149 | |
| Corning 384 孔低边平底检测板 | Corning | 3575 | |
| CPM | Invitrogen | D346 | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| 固定化 TCEP-琼脂糖 | Pierce | 77712 | |
| 微孔板读板仪 | CLARIOstar | ||
| PCR 板封膜 | BioRad | MSA5001 | |
| 还原型 L-谷胱甘肽 | Sigma-Aldrich | G4251 | |
| 氯化钠 | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| HEPES 钠盐 | Sigma-Aldrich | RES6007H-A7 |
参考文献
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