本文介绍了一种评估植入物表面免疫调节潜力的详细实验方案 体外旨在提高现有实验方案的可靠性和可重复性，并推动进一步研究。通过使用人外周血单核细胞来源的巨噬细胞，检测其在钛材料表面培养时的分泌性细胞因子谱、mRNA表达及细胞表面标志物，以研究巨噬细胞的极化状态。
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本文内容
摘要
摘要
异物反应（FBR）是一种由免疫介导的复杂愈合过程，在植入物与机体整合中起着关键作用。巨噬细胞作为免疫系统与植入物表面相互作用的第一道防线，在调控炎症与再生平衡中发挥双向作用。为了深入理解并评估植入材料与免疫反应之间的相互作用，需要可靠的 体外 方法与方案至关重要。在不同 体外 模型、原代单核细胞来源的巨噬细胞（MDMs）是研究巨噬细胞-植入物相互作用的优良模型。我们建立了一种实验方案，用于评估在植入物表面将MDMs极化为M1（经典活化）和M2（替代活化）巨噬细胞。我们从健康供体分离外周血单核细胞，并使用巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）将其分化为巨噬细胞。将已分化的巨噬细胞接种于植入物表面，并进一步诱导其向M1和M2亚型极化。M1极化通过添加干扰素（IFN）-γ和脂多糖（LPS）实现，而M2极化则在含有白细胞介素（IL）-4和IL-13的培养基中进行。我们采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）评估巨噬细胞表型 酶联免疫吸附试验（ELISA）、共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）以及基于分泌性细胞因子、细胞表面标志物和表达基因的定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）。提取的RNA被逆转录为互补DNA（cDNA），并采用qRT-PCR对与M1和M2型巨噬细胞相关的mRNA进行定量。结果显示，与M2型巨噬细胞相比，M1型巨噬细胞表现出更高的促炎性肿瘤坏死因子（TNF-α）细胞因子和CCR7表面标志物的表达水平 巨噬细胞表现出更高水平的CD209和CCL13。因此，通过免疫染色并结合共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察，CD209和CCR7被鉴定为M1和M2型巨噬细胞亚型的特异且可靠的标志物。进一步通过ELISA检测证实，M1型细胞中TNF-ɑ水平升高，M2型细胞中CCL13水平增加。所提出的标志物及实验体系可有效用于评估植入物的免疫调节潜力。
引言
可植入生物材料已成为治疗多种人类疾病的常规解决方案，并在生物医学研究中发挥着重要作用，包括组织工程、药物递送系统和植入物1,4。目前有多种由不同材料制成、具有不同结构和功能的植入物，例如髋关节假体、支架、网片、心脏瓣膜或牙科植入物。植入后，组织与植入物的接触会引发免疫反应，随后经历消退、组织重塑和稳态建立过程。这些过程受到所用生物材料的物理、化学和生物活性特性的显著影响。这些特性可能影响促炎和抗炎反应的强度与范围、纤维囊形成、组织降解以及愈合阶段3,4。为了支持并优化愈合过程及植入物的长期整合，当前研究的一个新兴方向是探究并调控植入物表面与免疫细胞之间的相互作用。
在多种免疫细胞中，巨噬细胞遍布全身，是炎症反应、抗病原体防御以及组织修复过程和维持组织稳态中的关键参与者5,6。根据其可塑性以及局部组织微环境的刺激信号，巨噬细胞能够极化为不同功能表型，这些表型在细胞代谢、细胞功能和细胞因子分泌谱方面表现出显著差异。经典活化的M1表型以分泌促炎性细胞因子（如IL-1β、IL-6和TNF-α）为特征，参与创伤和外来生物材料引起的初始及慢....
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方案
人外周血来自健康献血者，采集过程遵循图宾根大学医学院伦理委员会批准的方案（伦理批准号：286/2021 BO）。人外周血单个核细胞（PBMC）采用密度梯度离心法分离，方法如前所述16。以下方案适用于从 24 mL 血液中分离 PBMC。该方案的示意图见图 1。
注意：应根据所用 M0 巨噬细胞的数量调整血容量。
从24 mL血液中获得总计35.46 ± 9.1百万个PBMCs，最终得到1.97 ± 0.46百万个M0巨噬细胞（n = 5）。所有试剂、耗材和设备均列于材料表中。缓冲液列于表1中。
1. 人血液单核细胞向巨噬细胞的分化
- 将分离的外周血单个核细胞（PBMCs）重悬于15 mL预热的单核细胞贴壁培养基中，并转移至一个T75细胞培养瓶中。
- 在37 °C、5% CO2条件下孵育90分钟，以促进细胞贴壁。
- 弃去上清液，用预热的完全培养基轻轻倾斜洗涤细胞一次，以去除未贴壁或贴壁不牢的细胞。
注意：贴壁的细胞为单核细胞，约占最初加入培养瓶的总PBMCs的10%。<....
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结果
本研究结果表明，在钛表面上成功实现了单核源巨噬细胞（MDM）的分化与极化，并对M1或M2极化的巨噬细胞进行了表征。第一步中，我们采用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）对极化的MDM进行表征。根据我们的前期研究，CD209和CCR7被用作特异性标志物，以区分M1与M2极化的MDM。如图2A、B所示，MDM成功极化为M1和M2型巨噬细胞。在钛表面上，M1极化巨噬细胞中CCR7的表达强于M2极化巨噬细胞中特异性表达的CD209。此外，通过量化相对荧光强度，可将标志物明确归类至M1或M2亚型（图2C）。
图3展示了在钛片和盖玻片表面培养的MDM的代表性qRT-PCR分析结果。结果显示，在两种表面上的MDM均成功实现了极化，表现为M1型极化标志物（CCR7和TNF-ɑ）和M2型极化标志物（CD209和CCL13）的高表达。这一结果在蛋白水平上进一步得到验证：M1极化细胞中可检测到高水.......
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讨论
深入了解巨噬细胞的行为对于理解可植入材料的免疫调节特性至关重要。已有多个研究报道了巨噬细胞极化在体外（in vitro）表征中的异质性标志物、多种细胞模型及实验方案17,18,19,20。为了提高实验结果的可重复性、可靠性和可比性，必须采用标准化且经过验证的实验流程，并结合合适的细胞模型和共识性的表征标志物。因此，准确模拟植入材料的免疫调节特性，首先需要一个恰当的细胞模型。不同研究使用了多种多样的细胞模型，包括从组织中分离的巨噬细胞、由外周血单核细胞分化而来的巨噬细胞，以及永生化的单核细胞系。尽管从组织中分离的巨噬细胞可能更接近体内（in vivo）的真实状态，但其在技术操作和伦理方面均存在挑战21,22。巨噬细胞也常通过已建立的永.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
这些圆盘由德国巴特诺因阿尔-阿赫魏勒的Medentis Medical公司慷慨提供。作者感谢图宾根大学医院口腔与颌面外科部门的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 24孔板，未处理 | Corning Incorporated (Kennebunk, USA) | 144530 | |
| 吸光度读数仪 Infinite F50 | TECAN Austria GmbH (Grödig, Austria) | TCAT91000001 | |
| 含0.5 mM EDTA的DPBS中的Accutase | EMD Millipore Corp. (Burlington, USA) | SCR005 | |
| 抗荧光淬灭荧光封片剂—水性，Fluoroshield | abcam (Cambridge, UK) | ab104135 | |
| Bio-Rad MJ Research PTC-200 Peltier梯度PCR仪 | Bio-Rad / MJ Research | 7212 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | VWR International bvba (Leuven, Belgium) | 422361V | |
| Centrifuge 5804 R 离心机 | Eppendorf SE (Hamburg, Germany) | 5804 R | |
| DC-SIGN (D7F5C) XP 兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 13193 | |
| 二甲基亚砜 | Sigma Aldrich Co. (St.Louis, MO, USA) | D2438-5X10ML | |
| DRAQ5 染色液 | Milteny Biotec (Bergisch Gladbach, Germany) | 130-117-344 | |
| 分子生物学级乙醇 ≥99.8% | Carl Roth GmbH + CO. KG (Karlsruhe, Germany) | 1HPH.1 | |
| 山羊抗小鼠IgG (H&L) 高度交叉吸附 二抗，Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723TR | |
| 山羊抗兔IgG (H+L) 交叉吸附二抗，Cyanine3 | Invitrogen | A10520 | |
| GraphPad Prism | GraphPad | 版本 9.4.1 | |
| 人CCR7抗体 | R&D Systems | MAB197 | |
| 人IFN-γ重组蛋白 | Invitrogen (Rockford, USA) | RIFNG100 | |
| 人IL-13 | Milteny Biotec (Bergisch Gladbach, Germany) | 5230901032 | |
| 人IL-4 | Milteny Biotec (Bergisch Gladbach, Germany) | 130-095-373 | |
| 人M-CSF | Peprotech (Cranbury, USA) | 300-25 | |
| Leica TCS SP5 | Leica Microsystems CMS GmbH (Mannheim, Germany) | https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp5/ | |
| 大肠杆菌来源的脂多糖 | Sigma Aldrich Co. (Missouri, USA) | L4391-1MG | |
| Luna通用qPCR预混液 | New England Biolabs | NEB #M3003 | |
| LunaScript RT 超混试剂盒 | New England Biolabs | E3010L | |
| 淋巴细胞分离液 1077 | PromoCell (Heidelberg, Germany) | C-44010 | |
| MCP-4/CCL13 人ELISA试剂盒 | Invitrogen | EHCCL13 | |
| MicroAmp快速96孔反应板（0.1 mL） | Applied Biosystems (Waltham, USA) | 4346907 | |
| MicroAmp光学粘性封膜 | Life Technologies Corporation (Carlsbad, USA) | 4311971 | |
| MicroAmp防溅96孔底座 | Applied Biosystems (Waltham, USA) | 4312063 | |
| 微量离心机 CD-3124R | Phoenix Instrument (Germany) | 9013111121 | |
| 显微镜盖玻片，10 mm | Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany | 4HX4.1 | |
| 单核细胞贴壁培养基 | PromoCell (Heidelberg, Germany) | C-28051 | |
| Multiply-Pro 管 Gefäß 0.5 mL，聚丙烯材质 | Sarstedt AG & CO (Nümbrecht, Germany) | 7,27,35,100 | |
| Nanodrop One | Thermo Scientific (USA) | ND-ONE-W | |
| QuantStudio 3 系统 | Life Technologies GmbH (St. Leon-Rot, Germany) | A28567 | |
| RNeasy 微量试剂盒 | Qiagen | 74007 | |
| RPMI 1640，1×，含L-谷氨酰胺 | Mediatech, Inc. (Manassas, USA) | 10-040-CV | |
| 无菌操作台，LaminarAir HB 2472 | Heraeus instruments (Hanau, Germany) | 51012197 | |
| 组织培养用盖玻片 13 mm（塑料） | Sarstedt Inc. (Newton, USA) | 83,18,40,002 | |
| 钛合金加工圆盘 12 cm | Medentis Medical (Bad-Neuenahr-Ahrweiler, Germany) | N/A | |
| TNF-α人ELISA试剂盒 | Invitrogen | KHC3011 | |
| 0.4% 台盼蓝溶液 | Carl Roth GmbH + Co. KG (Karlsruhe, Germany) | 1680.1 |
参考文献
- Othman, Z., Pastor, B. C., van Rijt, S., Habibovic, P. Understanding interactions between biomaterials and biological systems using proteomics. Biomaterials. 167, 191-204 (2018).
- Ikada, Y. Challenges in tissue engineering. J R Soc Interface. 3 (10), 589-601 (2006....
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