酵母完整细胞中的线粒体呼吸是细胞生物能量学的一个重要指标。本文介绍了一种可适用于多种酵母物种的表型定量实验方案。
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摘要
摘要
代谢主要由细胞能量供应状况和环境条件协调调控。了解细胞如何适应不同营养和环境条件下的能量代谢的检测方法，可为阐明分子机制提供重要信息。氧化磷酸化是大多数细胞中ATP的主要来源，而线粒体呼吸活性是氧化磷酸化的一个关键组分，可维持线粒体膜电位以进行ATP合成。线粒体呼吸通常在分离的线粒体中进行研究，但此类体系缺乏完整的细胞环境。本文介绍一种在酵母完整细胞中定量线粒体呼吸的方法。该方法适用于任何酵母物种，尽管目前主要应用于Saccharomyces cerevisiae细胞。首先，在特定条件下培养酵母。然后将细胞洗涤并以1:1（w/v）的比例重悬于去离子水中。接着将细胞置于氧电极室中，在持续搅拌条件下，使用克拉克电极定量氧气消耗量。根据对电子传递链或ATP合成的影响，依次向反应室中加入若干特定分子。首先加入AT酶抑制剂寡霉素，以测定与ATP合成相偶联的呼吸作用。随后使用解偶联剂，以测定最大呼吸能力。最后加入电子传递链抑制剂混合物，以排除与线粒体呼吸无关的氧气消耗。通过线性回归分析数据，获得代表氧气消耗速率的斜率。该方法的优势在于特异性针对酵母线粒体呼吸，并保留了细胞环境。需要特别指出的是，用于线粒体呼吸定量的抑制剂在不同酵母物种之间可能存在差异。
引言
线粒体在细胞生物能量学中起着基础性作用，因为它是大多数细胞中三磷酸腺苷（ATP）的主要来源，多种代谢通路在此汇聚并依赖于线粒体通路的活性1。氧化磷酸化是合成ATP所必需的过程，该过程通过电子传递链传递电子以还原氧气，并利用电子流动产生的线粒体膜电位驱动F1F0-ATP酶活性来合成ATP2。因此，线粒体呼吸是氧化磷酸化的一部分3。
线粒体呼吸链由四个复合物组成，而在某些情况下（例如缺乏复合物I的酵母，如Saccharomyces cerevisiae），则由三个复合物和三种脱氢酶蛋白组成4。呼吸复合物定位于线粒体内膜；一些酵母具有经典的电子传递链，包括复合物I（NADH脱氢酶）或三种NADH脱氢酶、泛醌（Co Q）、复合物II（琥珀酸-泛醌氧化还原酶）、复合物III（泛醌-细胞色素氧化还原酶）、细胞色素c（Cyt c）以及复合物IV（细胞色素c氧化酶）5,6。电子在这些复合物之间的传递促使质子从线粒体基质泵至膜间隙，从而形成线粒体膜电位7。位于膜间隙的质子随后通过F1F0-ATP酶逆向泵回线粒体基质，每转运四个质子可合成一个ATP分子8。
线粒体呼吸作用的测量可为线粒体完整性、细胞生物能量学及线粒体呼吸能力提供有价值的见解9。线粒体呼吸功能可通过多种技术在体外（in vitro）或原位（in situ）进行分析。然而，使用完整细胞进行线粒体呼吸分析具有一系列优势，因为它涵盖了整个细胞的代谢过程，且在使用完整细胞时能够同时考虑细胞与其环境的相互作用以及细胞内代谢10。此外，使用完整细胞可方便地评估多种实验条件，并检测在分离的线粒体中难以观察到的微小变化10,11。在完整细胞中定量线粒体呼吸的另一优势在于，线粒体增殖和定位的影响得以保留12。
关于完整哺乳动物细胞中线粒体呼吸作用的研究已有详尽描述12，但其他真核生物（如酵母）的相关研究则相对较少。本文提出一种基于哺乳动物实验方案改进而来的、用于定量检测酵母线粒体呼吸作用的技术。该技术借鉴了哺乳动物线粒体呼吸定量研究中的相关概念。例如，本技术同样分为多个阶段，类似于哺乳动物实验方案：1）基础呼吸（底物依赖性呼吸），2）ATP偶联呼吸（通过抑制ATP合酶实现），3）最大呼吸能力（使用解偶联剂，使质子能够穿过线粒体内膜），4）线粒体呼吸抑制（利用呼吸链抑制剂混合物，排除非线粒体呼吸来源的耗氧量）11,13。因此，本文旨在提供一种用于定量检测酵母线粒体呼吸作用的实验方案。
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方案
1. 培养基与接种物制备
- 通过在95 mL蒸馏水中加入1 g酵母提取物、2 g酪蛋白胨和2 g葡萄糖，配制100 mL酵母提取物-胨-葡萄糖培养基（YPD）。将3 mL培养基分装至10 mL玻璃试管中，在121 °C、1.5 psi条件下灭菌15分钟。
注意：该培养基可在4 - 8 °C保存最多1个月。 - 用250 µL保存于-20 °C的甘油菌种接种一支含有3 mL YPD培养基的10 mL玻璃试管。在30 °C、200 rpm持续振荡条件下过夜培养。
注意：某些酵母菌种的培养温度可能有所不同（例如，Kluyveromyces marxianus 的最适生长温度为37 °C）。 - 将无菌2% YPD琼脂培养基（将10 g酵母提取物、20 g酪蛋白胨、20 g葡萄糖和20 g细菌学琼脂加入950 mL蒸馏水中）倒入一个培养皿（60 × 15 mm2）中，并用无菌接种环将来自10 mL玻璃试管中培养的酵母菌液在培养皿表面划线接种。在30 °C培养至出现单菌落。
- 从培养皿中挑取两到三个酵母单菌落，接种于一支含有3 mL YPD培养基（含2%葡萄糖）的无菌10 mL玻璃试管中，制备预接种培养物。在30 °C、持续振荡条件下过夜培养。
2. 生长条件与实验设计
- 在500 mL锥形瓶中加入100 mL无菌合成完全培养基（SC培养基；含0.18 g不含氨基酸的酵母氮源基础培养基、0.5 g硫酸铵、0.2 g磷酸氢二钾、1 g酵母合成缺陷补充剂，以及根据实验设计添加的葡萄糖，溶于98.02 mL蒸馏水中），并以初始OD值接种酵母菌液600 约 0.1，即过夜预接种物约 3 mL（OD600 ~ 3). 设置待测的环境条件或添加用于线粒体呼吸检测的化学处理因素（例如，加入 100 µM 白藜芦醇）。为化学处理因素设置单独的溶剂对照组。每组至少进行三个生物学重复实验。
注意：建议使用最小培养基以消除检测中的营养干扰，此处推荐的最小培养基用于 S. cerevisiae 并且可能因其他酵母物种而异。最后，培养基中添加的葡萄糖浓度至关重要，需避免引起葡萄糖阻遏或克雷布特效应（Crabtree effect），这些效应会抑制线粒体呼吸；低于0.5%（w/v）的葡萄糖浓度可获得良好的线粒体呼吸响应，同时伴随较高的生长速率 S. cerevisiae在Crabtree阴性酵母中，高浓度葡萄糖不影响线粒体呼吸（例如， K. marxianus). - 称取一个空的50 mL锥形管的重量，并用其收集处于对数中期（OD600 ~ 0.5）通过4000 × g离心 g 5 分钟。
注意：建议在对数中期进行线粒体呼吸测定，因为此生长期的能量代谢最为活跃。 - 弃去上清液，用25 mL去离子水重悬沉淀，洗涤3次。称量含有沉淀细胞的锥形管重量（湿重），减去锥形管自身重量，得到细胞湿重。
- 将沉淀重悬于2 mL去离子水中。
- 通过将湿重除以2来计算细胞浓度，得到细胞的毫克数/毫升（mg cells/mL）。该数值对于确定检测中所需加入的细胞体积（以达到50 mg细胞量）至关重要。
3. 耗氧量测定（极谱法）
- 使用连接至 YSI5300A 监测仪和计算机以采集数据的克拉克型氧电极。
- 在极谱仪样品室中加入5 mL用三乙醇胺调节至pH 6的吗啉乙磺酸缓冲液（MES-TEA缓冲液；10 mM）和50 mg细胞（湿重）。轻轻放入电极，注意避免产生气泡。
- 打开 YSI5300A 监测仪、用于数据采集的计算机以及搅拌室。通过选择设置 YSI5300A 监测仪 通道1设置旋钮 在空气中。将通道1调节至 100% 使用通道1的校准旋钮，将信号在100%条件下稳定5分钟。
- 在计算机中开始记录数据，并使用秒表测量时间。
注意：YSI5300A 监测仪没有配备数据采集计算机或程序；用户可自行 externally 实现。 - 使用氧电极室中的侧通道依次加入可氧化底物、寡霉素、解偶联剂以及呼吸链抑制剂混合物。
- 使用色谱注射器将可氧化底物（葡萄糖、甘油、L-乳酸或根据实验设计选择的其他碳源）加入至终浓度为 10 mM。始终保持 chamber 处于封闭状态并持续搅拌。记录 2–3 分钟内的氧气百分比消耗量，以确定基础呼吸速率。
注意：葡萄糖、甘油和L-乳酸用于分析呼吸链不同位点的电子传递链：葡萄糖代谢可还原NAD+ 生成NADH，用于分析整个呼吸链；甘油将电子传递给泛醌，用于评估从泛醌开始的呼吸链；最后，L-乳酸将其电子传递给细胞色素 c 并用于确定细胞色素的作用效果 c14. 这些底物可能因酵母菌种的酶活性能力不同而有所差异。 - 使用色谱注射器向测氧室中加入寡霉素，使其终浓度为 0.01 mM，以评估ATP偶联呼吸，并记录2-3分钟内的氧气消耗百分比。
- 向氧电极室中加入解偶联剂3-氯苯腙羰基氰化物（CCCP），使用色谱注射器使其终浓度为0.015 mM，以测定最大呼吸能力，并记录2–3分钟内的氧气消耗百分比。
- 使用色谱注射器加入电子传递链抑制剂：先加入2-噻吩甲酰三氟丙酮（TTFA），终浓度为1 mM，测量2-3分钟；然后加入抗霉素A（AA），终浓度为1 mg/mL，再测量2-3分钟。
注意：不同酵母物种的电子传递链抑制剂可能有所不同；在该步骤中应考虑这一因素。 - 分别筛选每种碳源（即葡萄糖、甘油或L-乳酸）。对每种碳源重复步骤3.3至3.5。每次使用后，用70%乙醇清洗腔室3次，再用去离子水清洗3次。
4. 数据处理
- 利用耗氧量曲线（绘制空气百分比随时间变化的曲线）计算可氧化底物（基础呼吸）、寡霉素（ATP偶联呼吸）、CCCP（最大呼吸）、抗霉素A（AA）和TTFA（非线粒体呼吸；图1）的斜率。使用以下所述的线性回归方法，分别计算每种添加化合物的斜率。
- 在统计分析软件中创建一个新的项目文件。在“创建”部分选择XY。在“数据表”部分选择将数据输入或导入新表格。
- 在“选项”部分的X子部分中选择数值。在Y子部分中点击在并列的子列中输入3个重复值。
注：表格格式包含一个X列和多个Y列，每个Y列包含3个子列，命名为A: Y1和A: Y2。 - 在X列中输入时间数据（例如，0、2、4、6、8秒或0、1、2、3分钟）。在Y列中填写空气百分比数值。
- 进行线性回归拟合。点击菜单栏中的分析。在“分析”选项中，选择“XY分析”下的简单线性回归，然后点击确定。
- 从屏幕左侧“数据表”中的“结果”部分获取斜率值。
- 将斜率值记录在数据表中，并从可氧化底物、寡霉素和CCCP所得的斜率中减去呼吸抑制剂混合物（AA和TTFA）所得的斜率，以排除非线粒体呼吸来源的耗氧量。
- 将所得数值乘以237 µM的O2。该数值代表在25 °C条件下，空气（20.9% O2）平衡的缓冲线粒体介质中O2的溶解度；该值会随温度、海拔和所用缓冲液的不同而变化。
- 转换为每分钟单位；所得数值为单位时间内的O2 µM值，根据时间绘制方式的不同，最终获得O2 µM/min。
- 除以50，即所用细胞的毫克数；细胞用量可根据实验设计而变化。最终，耗氧量表示为O2 µM/mg细胞 × min。
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结果
该线粒体呼吸技术也可用于除S. cerevisiae以外的其他酵母物种，例如Scheffersomyces stipitis15和K. marxianus16。然而，为具有代表性起见，本文仅展示来自S. cerevisiae的结果。众所周知，S. cerevisiae在低葡萄糖浓度（低于0.8 mM）下主要表现为呼吸代谢17,18。因此，为验证S. cerevisiae的呼吸表型，本研究将其培养于两种葡萄糖浓度条件下，以分别促进（0.5%葡萄糖）和限制（5%葡萄糖）线粒体呼吸18,19。正如预期，基础呼吸（可氧化底物）、ATP偶联呼吸（寡霉素处理）和最大呼吸能力（CCCP处理）的实验结果均支持S....
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讨论
线粒体呼吸磷酸化在多个依赖线粒体膜电位并通过氧化磷酸化维持ATP水平的通路中发挥着基础性作用。了解环境和营养条件如何影响酵母的线粒体呼吸，可作为阐明其分子机制的工具。
为了从该方法获得可靠的结果，必须考虑以下关键步骤。在呼吸生长条件下，振荡速度必须高于>200 rpm，这是获得足够生物量以检测线粒体呼吸的关键；低于200 rpm的振荡条件会导致生长不良和生物量积累不足，延长达到对数中期生长阶段所需时间，并可能影响耗氧速率，因为细胞处于较低氧含量的环境中生存。培养基中的葡萄糖浓度应根据酵母表型（Crabtree阳性或阴性）设定；对于Crabtree阳性酵母尤其关键，因为高浓度葡萄糖会抑制线粒体呼吸，可能导致数据分析出现偏差。例如，在S. cerevisiae中，高浓度葡萄糖会引起分解代谢阻遏，从而抑制线粒体呼吸21,22。基于这一证据，与在低葡萄糖浓度（0.5%）下培养的酵母细胞相比，在高葡萄糖浓度（5%）下培养的细胞其基础呼吸、ATP偶联呼...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由墨西哥国立理工学院（资助号：20026.24-PD）授予 LAMP。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-噻吩甲酰三氟丙酮（TTFA） | Merck | T27006 | 复合体 II 抑制剂 |
| 3-氯苯腙羰基氰（CCCP） | Merck | C2759 | 线粒体呼吸解偶联剂 |
| 无水乙醇 | Merck | 107017 | 用于溶解槲皮素 |
| 琼脂 | Merck | A1296 | YPD 琼脂制备 |
| 硫酸铵颗粒（(NH4)2SO4） | J.T. Baker | 0792-05 | SC 肉汤制备 |
| 抗霉素 A（AA） | Merck | A8674 | 复合体 III 抑制剂 |
| aYSI5300A | ---- | ---- | 监测仪 |
| 离心机 | Hermle | Z 206 A | 用于细胞离心 |
| 克拉克型氧 | ---- | ---- | 电极 |
| 计算机 | ---- | ---- | 用于数据采集 |
| 磷酸氢二钾（K2HPO4） | J.T. Baker | 3252-05 | SC 肉汤制备 |
| 葡萄糖 | Merck | G7021 | YPD 肉汤制备 |
| 甘油 | Merck | G5516 | 底物培养基补充物 |
| 乳酸 | Merck | L1250 | 底物培养基补充物 |
| 来自Streptomyces diastatochromogenes的寡霉素 | Merck | O4876 | 抑制线粒体ATP合酶 |
| 轨道摇床 | Thermo Fisher | SHKE6000 | 接种物孵育用玻璃管和烧瓶 |
| 酪蛋白蛋白胨，酶解产物 | Merck | 82303 | YPD 肉汤制备 |
| 槲皮素 | Merck | 337951 | 用于降低线粒体呼吸 |
| 尿嘧啶 | Merck | U0750 | SC 肉汤制备 |
| 酵母提取物 | Merck | Y1625 | YPD 肉汤制备 |
| 不含氨基酸和硫酸铵的酵母氮源基础 | Merck | Y1251 | SC 肉汤制备 |
| 不含尿嘧啶的酵母合成缺陷型培养基补充剂 | Merck | Y1501 | SC 肉汤制备 |
参考文献
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