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方法文章

小鼠糖尿病心肌病模型的建立与评估

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DOI：

10.3791/67189

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2024年11月29日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, West China Hospital, Sichuan University, 2Laboratory of Cardiac Structure and Function, Institute of Cardiovascular Diseases, West China Hospital, Sichuan University, 3Cardiac Structure and Function Research Key Laboratory of Sichuan Province, West China Hospital, Sichuan University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案概述了一种通过高脂饮食喂养联合链脲佐菌素注射诱导糖尿病心肌病的方法。该方法旨在为糖尿病心肌病的科学研究提供一个可靠的框架，并探索潜在的临床治疗应用途径。

摘要

糖尿病心肌病（DbCM）是2型糖尿病（T2DM）患者死亡的主要原因之一，但其潜在的病理生理机制仍不明确。与T2DM相关的心肌毒性被认为由脂毒性、糖毒性、氧化应激、心脏效率降低以及脂质诱导的细胞凋亡等因素所致。与大鼠相比，小鼠在动物实验中具有更高的可获得性、成本效益和更广泛的应用性。胰岛素抵抗和胰岛素分泌受损是T2DM病理生理过程中的关键因素。我们提出一种新型的非遗传性小鼠模型，通过高脂饮食（HFD）喂养联合链脲佐菌素（STZ）注射，模拟人类DbCM的进展过程。在本研究中，我们采用野生型C57BL/6J小鼠，给予HFD喂养12周，随后进行腹腔注射STZ持续12周，以诱导T2DM的典型表型。通过口服葡萄糖耐量试验和血清胰岛素浓度测定，确认胰岛素抵抗和胰岛素分泌不足的发生。采用无创经胸超声心动图严格评估心脏结构和功能。通过Masson三色染色和麦胚凝集素（WGA）染色评估病理特征，揭示与DbCM相关的组织病理学改变。因此，我们提供了一种可靠且灵活的方法，用于建立非遗传性小鼠DbCM模型。

引言

2型糖尿病（T2DM）是一种日益加剧的全球性健康问题，是患者发病和死亡的主要原因之一。T2DM的流行与肥胖症的迅速蔓延密切相关1,2。超过三分之一的T2DM患者表现出一种独特的心血管表型，称为糖尿病性心肌病（DbCM），其特征是心肌功能障碍，且该病变独立于冠状动脉疾病、高血压和瓣膜性心脏病3。新兴证据表明，约20%的糖尿病患者易发展为心力衰竭3，而这一状况与其预后密切相关4。目前提出的DbCM多种病理生理机制包括炎症反应5、心脏重构与功能障碍6、线粒体功能障碍7、氧化应激8以及代谢紊乱9。尽管已有大量研究，DbCM的完整机制谱系及其各因素的相对贡献仍未完全阐明10。因此，建立完善的临床前动物模型对于深入研究该疾病至关重要。

2型糖尿病（T2DM）的特征是胰岛素抵抗和进行性胰岛素分泌不足11，大多数患者超重或肥胖12。在本研究中，我们在既往研究基础上建立了一种稳定且改良的小鼠糖尿病心肌病（DbCM）模型，结合高脂饮食（HFD）喂养与链脲佐菌素（STZ）注射。在T2DM中，胰岛素抵抗和胰腺β细胞破坏共同参与了疾病的病理生理过程12。该模型利用了T2DM的两个主要危险因素：具体而言，喂食HFD的小鼠会发展出胰岛素抵抗，随后通过STZ注射进一步损害胰岛β细胞功能，显著促进类似T2DM病理生理过程的发展。STZ来源于Streptomyces achromogenes，早在1963年即被首次报道具有选择性破坏胰岛β细胞及致糖尿病的特性13。目前存在两种STZ处理模型： 给予相对高剂量的STZ可建立短期心肌病模型，而重复低剂量STZ注射则可诱导出自然进展为DbCM的T2DM模型。采用后一种方法，动物会出现高血糖、多饮和多尿等症状，这些均是人类T2DM的典型特征，并可自然发展为DbCM。

本研究发现，给予高脂饮食（HFD）并随后腹腔注射链脲佐菌素（STZ）（30 mg/kg）的野生型C57BL/6J小鼠，在实验结束时表现出的心脏功能、形态学及组织学特征均符合糖尿病性心肌病（DbCM）的特点。该方法为建立小鼠DbCM模型提供了一种有效手段。

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方案

所有实验程序均遵循美国国立卫生研究院（NIH出版物第85-23号，1996年修订版）《实验动物护理和使用指南》中规定的机构动物研究指南。所有动物实验均经四川大学动物护理伦理委员会和伦理委员会批准。雄性C57BL/6J小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司（中国）。实验期间，小鼠饲养在温度控制为24 °C、12小时光照/12小时黑暗循环的环境中，并可自由获取食物和水。

小鼠研究时间线示意图，ND 与 HFD/STZ，OGTT，胰岛素，柠檬酸，STZ，实验设置。
图 1：实验流程示意图。 HFD/STZ 组和 ND 组使用的小鼠年龄均约为 7–8 周。每周记录每只小鼠的体重和随机血糖水平。在喂养第 12 周和第 24 周时，通过口服葡萄糖耐量试验（OGTT）和血清胰岛素水平检测评估小鼠的代谢表型。此外，在基线期（第 0 周）、第 12 周和第 24 周进行超声心动图检查。在为期 24 周的喂养期结束后，处死小鼠。请点击此处查看该图的放大版本。

1. 高脂饮食喂养

  1. 将雄性 C57BL/6J 小鼠（7-8 周龄）分别喂饲正常饮食（ND）或高脂饮食（HFD，60% 千卡脂肪），持续 24 周以诱导肥胖。
  2. 每 4 周记录每只小鼠的体重。确保在第 12 周之前，体重增长曲线呈现相似的上升趋势，且 HFD 组表现出更陡峭的增长斜率。

2. STZ 溶液的配制与注射

注意：由于链脲佐菌素（STZ）在室温下极不稳定，需在 -20 °C 保存以防止降解。注射前 5 分钟内立即用柠檬酸缓冲液配制 STZ 溶液。

  1. 配制柠檬酸盐缓冲液。称取2.1 g柠檬酸（相对分子质量：210.14），溶于100 mL蒸馏水中，配制成溶液A；称取2.94 g柠檬酸钠（相对分子质量：294.10），溶于100 mL蒸馏水中，配制成溶液B。将溶液A与溶液B按1:1.32的比例混合，得到柠檬酸工作液。使用0.45 µm滤膜过滤去除杂质。
  2. 称取1 g STZ，溶于100 mL已配制的混合柠檬酸工作液中，充分溶解。将配制好的STZ溶液置于4 °C保存。应尽量在配制后30分钟内完成注射。
  3. 使用1 mL注射器，对HFD/STZ组小鼠每日进行一次腹腔注射，剂量为30 mg/kg STZ溶液，连续注射7天；同时，对ND组小鼠注射等体积的柠檬酸盐缓冲液（0.1 mmol/L，pH = 4.5）。
  4. 末次注射1周后检测血糖水平。将随机血糖浓度超过16.7 mmol/L的小鼠归类为T2DM小鼠。
    1. 将小鼠小心固定于固定装置上，确保其尾巴完全伸出。
    2. 采血前，使用70%酒精棉片彻底消毒尾巴采血部位，保持无菌和清洁。
    3. 使用尖头针头插入尾静脉，从尾尖向尾根方向进针约3–4 mm深度。针头固定后，轻轻挤压尾巴上部以促进血液流出。
    4. 采集约10 µL血液，小心将血液滴加至专用试纸上。血液被吸收后，血糖仪将立即显示血糖读数。

3. 口服葡萄糖耐量试验（OGTT）14

  1. 进行口服葡萄糖耐量试验（OGTT）前，每只小鼠禁食14小时，期间可自由饮水。
  2. 配制约10 mL的20%葡萄糖溶液。通过口服灌胃方式，以1 g/kg剂量向每只小鼠给予葡萄糖溶液。
  3. 在给药后多个时间点监测血糖水平：即刻（0分钟）、15分钟、30分钟、60分钟和120分钟。

4. 心脏功能的超声心动图评估

  1. 在喂食高脂饮食（HFD）或正常饮食（ND）前（0周）、12周和24周时，对每只小鼠进行超声心动图检查。
  2. 超声心动图检查前，通过麻醉机使用100%氧气输送3%异氟烷进行吸入麻醉。使用有齿镊夹捏皮肤或刺激足趾及尾部，确认小鼠无反应。在小鼠眼部涂抹兽用眼膏，防止麻醉期间角膜干燥。
  3. 将小鼠置于加热垫上以维持体温，并将其爪子固定在电极上，确保稳定的仰卧位。维持麻醉期间将异氟烷浓度调整至1%–2%，以保持目标心率约为每分钟450次。
  4. 使用脱毛膏去除小鼠胸部毛发，并涂抹超声耦合剂。超声检查完成后，用无菌生理盐水清除脱毛膏和超声耦合剂。
  5. 使用50 MHz探头评估心脏功能和结构参数。
    1. 为获得最佳左心室（LV）长轴切面，将探头置于小鼠胸部左侧。
    2. 根据个体解剖结构差异，将探头相对于左侧胸骨旁线逆时针旋转15°至45°，探头标记朝向小鼠右肩方向。在B模式下调节x轴和y轴15。
      注意：合适的左心室长轴切面应包括（i）主动脉瓣和主动脉根部；（ii）左心室腔位于视野中央；（iii）心尖至基底部的轴线应与换能器平行16。
    3. 连续按两次M模式按钮以显示测量线，将该线置于乳头肌水平。随后至少测量连续三个心动周期的数据以确保准确性。点击保存片段将动态图像序列保存至当前系列中。
    4. 以心电图T波对应时相确定收缩末期，以心电图R波对应时相确定舒张末期。
    5. 倾斜操作面板，使左上角最低，右下角最高。调整探头沿小鼠心尖方向穿透，与心脏长轴平行，以获取心尖四腔切面。
    6. 依次选择C（彩色多普勒）和PW（脉冲波多普勒）模式，将取样容积置于血流速度最高处，调整取样线方向与血流方向一致，记录二尖瓣血流动力学信息（E波和A波）16。点击保存片段将动态图像序列保存至当前系列中。
  6. 停止异氟烷吸入，使小鼠苏醒。将小鼠放回笼中，在受控环境中饲养，维持12小时光照/12小时黑暗循环，分别在0周和12周时进行。在24周超声心动图评估后，先吸入异氟烷麻醉，再通过颈椎脱臼法人道处死小鼠。
  7. 使用工作站加密狗分析射血分数（EF）、缩短分数（FS）、左心室后壁厚度（LVPW）、左心室内径（LVID）、室间隔厚度（IVS）以及E/A比值。

5. 组织学染色

  1. 完成24周时的超声心动图分析后，先吸入异氟烷，随后通过脊髓脱位法处死小鼠。
  2. 使用眼科剪刀和镊子解剖小鼠。小心剪断肋骨，以充分暴露心脏。
  3. 从心尖处用生理盐水灌注心脏，直至肝脏呈现苍白，表明灌注成功。取出心脏，并在生理盐水中彻底冲洗，以确保完全去除血液。
  4. 进行石蜡包埋17。
    1. 用4%甲醛在室温下固定心脏，时间不少于24小时。
    2. 将含有心脏的脱水盒放入脱水机中，进行梯度酒精脱水，并在65 °C下进行石蜡浸透。
  5. 制备组织切片17。
    1. 将含有乳头肌的修整后石蜡块放入切片机中，切成4 µm厚度的切片，室温保存，用于病理染色。
  6. 采用Masson三色染色法18和麦胚凝集素（WGA）19染色法进行染色。

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结果

本研究将小鼠随机分为两组：ND组和HFD/STZ组，每组6只小鼠。在喂养24周后进行最后一次超声心动图和口服葡萄糖耐量试验（OGTT）检测，随后处死小鼠以获取心脏组织，进行组织学评估。

HFD/STZ 诱导小鼠体重明显增加，在12周时达到峰值，且显著高于ND组。给予STZ后，HFD/STZ组小鼠体重出现显著下降。相比之下，ND组小鼠在随后的12周内体重持续稳定增长（图2A）。在整个饲养期间，HFD/STZ组的随机血糖水平始终显著高于ND组（图2B）。HFD/STZ组的口服葡萄糖耐量试验（OGTT）曲线显著高于ND组。两组的血糖峰值均在15分钟时达到，随后逐渐下降（图2C、D）。在研究过程中，前12周内ND组的血清胰岛素水平高于HFD组；然而，在给予STZ后，血清胰岛素水平呈现出相反的趋势（图2E、...

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讨论

鉴于糖尿病及其相关心血管并发症在全球范围内普遍存在，迫切需要揭示其潜在的分子机制，并开发针对该疾病的预防和治疗策略20。糖尿病性心肌病（DbCM）是2型糖尿病（T2DM）患者常见的心血管并发症之一，但其发病机制尚不明确，目前尚无有效的预防和治疗方法21。由于缺乏能够准确模拟人类心脏病理生理过程的可靠临床前模型，因此建立一种稳定且有效的特异性模型以深入研究DbCM的机制显得尤为重要。

本文介绍的实验方案概述了一种成熟且稳定的构建DbCM小鼠模型的方法，该模型是研究2型糖尿病（T2DM）相关心肌功能障碍的有力工具。通过高脂饮食（HFD）喂养以诱导胰岛素抵抗，通常被认为是一种模拟人类糖尿病多种并发症的有效方法22。在本方法中，HFD与低剂量链脲佐菌素（STZ） 注射相结合，后者是一种可诱导胰腺胰岛损伤的试剂。该方法能更好地模拟胰岛素抵抗及相对性胰岛素不足的发生过程。

通常，糖尿病心...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由国家自然科学基金（资助编号：U23A20395、81900258 和 82170375）以及科学技术重点研发项目支持 &中国四川省科技厅（2022ZDZX0020）；中华医学会心血管病学分会（CSC）临床研究专项基金项目（CSCF2020B04）；四川大学华西医院“1·3·5工程”项目（ZYGD23021）。 感谢四川大学华西医院动物影像中心设施的杨青在小动物超声成像方面提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
动物超声系统Fujifilm Visual SonicsVEVO 3100超声心动图
血糖仪YuwellGU100评估血糖水平
柠檬酸Sigma-Aldrich251275
异氟烷RWD life scienceR510-22麻醉
异氟烷蒸发器RWD life scienceR500麻醉
小鼠胰岛素（INS）ELISA试剂盒武汉菲优生物技术有限公司FY-EM14029评估血清胰岛素水平
Nair脱毛膏Nair255g去除小鼠毛发
含60%千卡脂肪的啮齿类动物饲料Research Diets IncD12492高脂饮食喂养
柠檬酸钠Sigma-AldrichS4641
无菌滤器Merck MilliporeSLHV033N
链脲佐菌素SolarbioS8050
超声耦合剂KepplerKL-250超声心动图
工作站加密狗Fujifilm Visual SonicsVevo LAB超声心动图数据分析

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