一种用于小鼠肝脏研究的精准切割肝片（PCLS）制备与培养方案。本文重点介绍该方案的关键步骤，该方案仅需常规实验室设备并配备振动切片机，可使PCLS存活至少4天。
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本文内容
摘要
摘要
本方案介绍了一种用于制备和培养精密切割肝组织片（PCLS）的简易系统。PCLS 包含完整微环境中的所有细胞，因此可视为整个器官的微型模型，能够在维持其复杂表型的同时用于活体组织研究。本方案利用振动切片机和常规实验室设备，实现从小鼠肝脏制备组织切片。目前，PCLS 的制备与培养方案缺乏标准化，其具体操作可能因目标组织、所用振动切片机类型以及供氧需求的不同而存在显著差异。对于仅配备基础振动切片机和常规组织培养设施的实验室而言，某些方案可能难以重复。我们整合了现有多种方案中若干关键步骤的重要操作要点，重点强调包埋方法、切片方向、动态与静态培养系统的选择，以及最小培养体积的重要性。本方案可在大多数配备基础组织切片设备的实验室中简便地建立并重复实施。综合采用本方案的操作流程，PCLS 可存活至少 4 天。PCLS 是一种简单、经济且可重复的模型，适用于肝脏等器官的病理生理学研究及药物筛选。
引言
精密切割组织切片（PCTS）是器官的薄切片。该技术可在保留邻近细胞和细胞外基质三维结构的同时，维持器官的组织架构，模拟微型器官。由于其易于获取、成本较低且操作相对省力，同时又能保持组织结构完整性，因此是一种具有吸引力的研究模型。
PCTS 填充 一个间隙 体外 细胞研究和 体内 动物研究，克服了两种模型的大多数缺点。PCTS 已从多种器官生成，例如肝脏1肠道2,3结肠2, 大脑4,5，肺6,7,8肾脏9,10脾脏11,12心脏13,....
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方案
野生型 CD57Bl/6J 小鼠购自查尔斯河实验室。小鼠可自由获取食物和水，在独立通风笼具中饲养，环境温度和湿度受控，并维持 12 小时光照循环。3 周龄小鼠被处死，肝脏立即无灌流收获。所有动物实验均经伦敦大学学院动物福利与伦理审查委员会的本地伦理审查批准，并在英国内政部项目许可证 PP9223137 下进行，遵循英国内政部（动物）科学程序法案（1986 年）及 ARRIVE 指南。所有努力均按照伦敦大学学院生物服务部门的标准操作规范，以尽量减少对动物的伤害。
1. 实验准备工作
- 收获前一天，执行以下步骤。
- 将一管Krebs粉末溶解于1 L无菌水中，配制1 L Krebs-Henseleit缓冲液（KREBS）。将其冷却至4 °C，并置于湿冰上保存。
- 用70%乙醇对托盘进行消毒，并用无菌PBS冲洗。将托盘用锡箔纸包裹后放入冰箱过夜，以保持切割时的低温环境。
- 将所有其他可拆卸部件喷洒乙醇，用无菌PBS冲洗，晾干后保持无菌状态。将刀片进行高压灭菌，并保持无菌直至使用。
- 用无菌水配制4% w/v低熔点琼脂糖溶液。待其重悬并完全融化后，置于4 °C冰箱中保存。
- 收获当天，在肝脏收获前执行以下步骤。
- 将4%低熔点琼脂糖融化，并置于37 °C水浴中保温备用。使用前确保琼脂....
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结果
收获时，有意省略动物灌注步骤，以确保器官能够快速处理并防止器官损伤。肝脏在切开后迅速取出，并立即置于冰冻的器官保护缓冲液（如Krebs缓冲液24,29）中。尽管已有不经过包埋直接切取新鲜肝组织的报道1，但将肝脏包埋于低熔点琼脂糖30（图1）并结合使用器官保护缓冲液，可在振动切片机上实现最佳切片条件，减少组织损伤并提高切片厚度的一致性。组织厚度至关重要，较薄的切片可使更多细胞层获得营养和氧气31，从而减少细胞死亡。然而，切片过薄则难以均匀切割。相反，厚度超过400 µm的切片则表现出较低的营养渗透率。切片后，使用插入式培养装置（图1）在液-气界面进行培养，并在37 °C、5% CO2和21% O2条件下置于摇床上孵育。切.......
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讨论
我们证明，制备和培养PCLS可以轻松实现，同时确保至少4天的半衰期。本方案包含五个关键步骤：若使用此类振动切片机时的包埋方法、切片方向、动态培养系统、最小培养体积以及使用插入式培养插件。
PCLS 的制备与培养方案目前已有多种公开资源可供参考。然而，这些方案普遍缺乏标准化；尽管它们可能关注于方案中相似且特定的步骤，但在仅具备基础振动切片机的大多数实验室中，往往难以以简便的方式进行重复。振动切片机或组织切片设备的种类繁多，其价格和技术特性各不相同，例如是否配备集成冷却系统等，但它们的共同特点是均采用振荡式剃须刀片进行切割。在组织切片方面，主要差异在于是否需要包埋。出于显而易见的原因以及包埋对组织活性的影响，理想情况下应尽量避免包埋。一种无需包埋的参考型切片设备是 Krumdieck 切片机35。此类切片机可在冷却缓冲液中利用组织芯进行切割，从而获得大小均匀的组织切片，并避免包埋步骤。然而，这类设备通常比基础型振动切片机更昂贵，且在大多数实验室中较少使用或不易获得。本方案所使用的振动切片机通常已用于化学固定组织的切片，但需要对肝叶进行包埋.......
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披露
不存在需要披露的竞争利益。
致谢
作者感谢Mirabela Bandol、Samantha Richards、Louise Fisher、Rebecca Towns以及伦敦大学学院生物服务中心工作人员在动物种群繁育与维护方面提供的帮助。本研究得到了英国医学研究理事会临床科学家奖学金MR/T008024/1（JB）和英国国家健康研究所大奥蒙德街医院生物医学研究中心（JB）的资助。文中观点仅代表作者自身，不一定代表英国国家医疗服务体系（NHS）或英国国家健康研究所（NIHR）的观点。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 3 cm 培养皿 | 任意 | 任何适用于细胞培养的 | |
| 6、12、24 孔培养板 | 任意 | 任何适用于细胞培养的 | |
| 氰基丙烯酸酯瞬间胶 | 任意 | ||
| D-葡萄糖 | Gibco | A24940 | |
| 伊红 | Merck | HT110316 | |
| 乙醇 | 任意 | ||
| 胎牛血清 | ThermoFisher | 26400044 | |
| Gentamycin | Gibco | 15750060 | |
| 苏木精 | Merck | 51275 | |
| HEPES | Gibco | H0887 | |
| 8 µm 插入式培养小室，适用于 12 孔板 | Strastedt | 83.3931.800 | |
| 8 µm 插入式培养小室，适用于 24 孔板 | Strastedt | 83.3932.800 | |
| 8 µm 插入式培养小室，适用于 6 孔板 | Strastedt | 83.3930.800 | |
| KREBS | Merck | K3753 | |
| 层流罩 | HEPA 空气过滤 | ||
| 低熔点琼脂糖 | ThermoFisher | 16520050 | |
| MTS 四唑盐试剂 | Abcam | ab197010 | |
| 多孔板读板仪 | 任意 | ||
| PBS 片剂 | ThermoFisher | P4417 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15140-122 | |
| 手术刀片 | 任意 | ||
| 外科镊子 | 任意 | 带扁平方形尖端 | |
| 外科剪刀 | 任意 | ||
| 振动切片机 | Leica | VT1000 S | |
| 含 GlutaMAX 的 William’s E 培养基（WME） | ThermoFisher | W4125 |
参考文献
- Pearen, M. A., et al. Murine precision-cut liver slices as an ex vivo model of liver biology. J Vis Exp. (157), e60992(2020).
- De Kanter, R., et al. Prediction of whole-body metabolic clearance of dru....
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重印与许可
