一种在野外限制和安全处理蜜蜂的快速方法

摘要

我们展示了一种经过验证的方法，用于安全处理野外采集的蜜蜂。该方法可实现快速操作、鉴定、遗传取样，并通过采样时收集的花粉确认植物与昆虫之间的相互作用。此方法易于调整，为研究稀有昆虫类群提供了一种经济、非致死性的有效手段。

摘要

深入了解许多昆虫传粉者的生物学和生态学基础，特别是专性或稀有类群，是众多研究人员的优先事项。因此，通常需要以无伤害的方式临时圈养野外采集的生物体，以获取信息或支持进一步研究。本方案提供了一种经过充分验证、快速且低成本的野外方法，可安全处理受保护关注的蜜蜂，并可根据特定项目需求灵活调整，包括生物体鉴定、花粉采集、标记和/或采集非致死性组织样本用于遗传分析。该方法可作为研究人员工具箱中的额外选项，以应对特定情况。预计该方法也可适用于其他昆虫物种，并可供不同经验水平和技能层次的人员使用。对于研究专性蜜蜂或开展宿主特异性研究的研究人员而言，该方法具有重要价值。本方案所实现的数据采集将有助于填补众多传粉者物种、植物-传粉者网络结构以及传粉者保护与管理举措中的关键数据空白，具有不可估量的价值。

引言

越来越多的证据表明，野生蜜蜂及其他传粉昆虫的种群数量正在下降，同时传粉者群落结构也发生了相应变化^1,2,3,4。持续的种群损失威胁着昆虫传粉这一对维持生物多样性、生态系统功能和农业生产至关重要的生态服务⁵。此外，对于许多野生蜜蜂，尤其是稀有物种，仍存在显著的知识空白，这可能阻碍有效的管理与保护措施的实施^6,7。

为了弥补这些数据的不足，研究人员已开发出多种方法来研究昆虫传粉者、相关栖息地利用情况及其对花卉的偏好。尽管目前常使用盘状陷阱、蓝色诱捕板、马氏网、羽化陷阱以及徒手网捕等方法，但这些方法中的许多都存在显著缺陷^8,9,10,11。常用的传粉者鉴定方法往往会导致个体死亡，无论该标本是否需要在实验室环境中进行鉴定（例如，使用显微镜）。对于许多昆虫研究而言，造成个体死亡可能是合理且必要的。然而，在研究濒危、稀有或研究不足的昆虫时，若其种群状况有限或尚不明确，研究人员必须尽量减少对个体的致死、伤害或应激，以降低对这些昆虫种群产生负面影响的可能性。因此，在处理易受威胁的物种或可通过关键鉴别特征轻松识别的物种时，应尽可能采用破坏性较小的取样方法。

已提出的蜜蜂遗传物质采集非致死方法包括收集粪便、蜕皮¹²和翅尖¹³。然而，在野外采集的蜜蜂中使用这些方法可能不可行，原因在于所需时间较长和/或可能对翅膀造成损伤，从而对飞行及其他行为产生负面影响。部分触角切除已被证明不会影响被采样尤格蜂（euglossine bees）的存活率¹⁴。同样，采集中足跗节末端组织也不会显著降低熊蜂（Bombus terrestris）工蜂的存活率¹⁵。另一种非致死采样方法是将蜜蜂短暂浸入缓冲液中以收集蛋白质残留物，随后将其释放¹⁶。生存分析显示，经缓冲液冲洗与未经冲洗的蜜蜂之间无显著存活差异。每种技术均存在局限性，在针对特定研究问题和整体项目目标时应予以充分考虑。

准确的生物分类鉴定对于有效开展研究至关重要。然而，对于许多昆虫传粉者类群而言，鉴定结果在很大程度上依赖于目标物种以及研究人员或观察者的专业知识与经验水平。尽管许多蜜蜂物种可在野外直接鉴定，但提供支持观察结果的证据仍十分关键。虽然大多数传粉者研究通常通过采集并保存个体作为证据，但使用照片和视频，以及利用虚拟现实技术进行三维影像记录，也可作为替代手段，在不牺牲被观察个体的前提下区分特定物种¹⁷。某些物种之间的区分可能需要特别关注其特定的形态特征并拍摄相应照片；在此类情况下，必须能够对生物体进行操控并将其固定于特定位置，以便可靠地拍摄复杂的鉴别特征。

临时限制蜜蜂以进行鉴定可通过多种方式实现，包括降低样本温度和/或使用二氧化碳使蜜蜂活动减缓^18,19。然而，这些方法可能改变蜜蜂的行为，导致处理后的个体恢复活动较慢，从而可能影响其觅食行为、生物体适应性，或增加被捕食的风险^20,21,22。此外，这些技术最终会延长生物体被限制和操作的时间，进而增加生物体的应激反应以及野外处理时间。因此，更安全且高效的实验方法将极具应用价值。

已有许多研究利用从蜜蜂或其他来源采集的花粉，以更好地了解其觅食偏好、构建植物-传粉者相互作用网络、鉴定环境污染（例如农药残留）以及评估营养生态学特征^{23,24,25,26,27,28,29}。许多蜜蜂在被限制于容器中时会自行梳理身体。因此，已有研究采用非致死性花粉取样方法³⁰（例如使用微量离心管）。然而，在蜜蜂不进行自我梳理的情况下，使用触感更明显的容器（例如本实验方案中使用的可封口塑料袋），可通过轻柔按压其特定身体部位，使花粉与塑料袋内壁接触，从而提高获得花粉样本的概率，优于传统硬质容器的使用效果。

本文介绍了一种已在三种濒危蜂类分类群中经过充分验证的实验方案。尽管该方法较为耗时，但能够在最大限度降低对个体生物致死风险的前提下，从昆虫传粉者中全面收集数据。采用该方法的总体目标是提供一种安全且有效的手段，用于捕捉、鉴定并安全释放昆虫。本方案的一个额外优势在于，它克服了传统昆虫采集方法的诸多局限性。该方法可简便地标记个体、采集非致死性的遗传材料以及花粉样本，同时最大限度地减少对生物个体的操作时间和应激反应。尽管传统昆虫采集方法具有多种优点³¹，但为了弥补其中一些局限，我们建立了一种替代方案，使昆虫可在鉴定过程中短暂受限，随后迅速且安全地释放。根据具体研究目标，在蜜蜂受限期间还可进行额外操作，以收集其他重要数据。

方案

1. 野外采集准备工作

1. 确认项目目标（例如，生物体鉴定、遗传组织取样等）。
2. 查阅材料表，并收集与项目目标相关的所有物品。
3. 确保所有数字设备（例如，智能手机、相机、手持式全球定位系统 [GPS]）已充满电，并备有已充电的备用电池且已妥善携带。

2. 捕获并固定生物体

1. 到达野外后记录感兴趣的样地参数，包括日期、开始时间、野外地点/位置，以及其他可能需要的相关信息（例如天气状况、优势地表覆盖植物、正在开花的植物等）（图1）。
2. 使用适当的捕网技术捕捉目标个体蜜蜂。根据目标物种选择使用空中昆虫网或扫网进行手动捕获。
   注意：也可采用其他捕获方法，例如通过小瓶/离心管收集昆虫。
3. 通过网袋目视观察标本，判断其是否与目标分类群相似。若不相似，则安全释放该标本并继续调查。
4. 若标本疑似为目标物种，需在网袋内固定标本以防止其逃逸（例如将网袋顶部覆盖在框架上，或扭转/收紧网袋颈部，或其他方式封闭所有可能的出口）。
5. 取出可密封的样品袋并打开袋口。
6. 确保目标蜜蜂位于网袋的前端位置。
7. 用一只手在标本正下方抓紧网袋，使网袋保持顶端（即昆虫被困处）朝上、网口（即环形部分）朝下的方向。
   注意：大多数昆虫具有趋光性，当被限制时通常会向光源方向飞行或爬行。
8. 用另一只手（即未握住网袋的手）将可密封样品袋从网口导入，并穿过网袋内部，直至接近位于标本下方的手部位置。
9. 小心松开用于限制标本的手部握力，仅保持足够约束力，以便持可密封样品袋的手能够连同标本一起进入受限区域。操作过程中应注意标本在受限区域内的具体位置，以降低被蜇伤、损伤标本或导致其逃逸的风险。
10. 操作可密封样品袋，使其开口充分张开以允许昆虫标本进入。可通过按压封口两侧，或用拇指和中指在封口下方扭转袋子实现。
11. 将可密封样品袋的开口置于标本上方，轻柔地引导昆虫进入袋中。如前所述，由于大多数昆虫具有趋光性，可将持有可密封样品袋的手朝向太阳/天空方向，从而促进标本进入袋内。
12. 一旦标本进入袋中，立即牢固密封可密封样品袋。
13. 将装有标本的可密封样品袋从昆虫网中取出。
    注意：昆虫在密闭袋中可能迅速过热并致死，因此应避免标本暴露于直射阳光下，最好将其置于阴凉处或保温容器中直至处理，并尽量缩短处理时间。

3. 鉴定生物体

1. 仔细检查标本，确认其为目标分类群。若为其他物种，应安全释放并继续调查。
   注意：为避免对标本造成伤害，在标本位于袋内时切勿直接对其施加压力。可通过轻压塑料袋或拉伸袋体边缘使袋子紧贴标本，从而限制其活动，实现固定。
2. 若可通过视觉准确且明确地确认物种身份，应拍摄凭证照片（图2）。记录有关该标本的其他必要信息（例如捕获时间、精确GPS位置、访问的植物、独特斑纹、体型或体色特征、捕获前的行为等）。
3. 若需检查特定形态特征以确认物种身份，可通过可重复封口的样品袋拍摄详细微距照片，突出显示这些关键特征（图2）。
4. 若无法通过样品袋获得足够清晰、可用于特征辨识的照片，可剪开样品袋两个未密封角落之一（即缝合或不可重复封口的角落），暴露所需检查的标本部位以便近距离观察。例如，剪出一个小孔，仅暴露头部、腹部或腿部（图3A-C）。操作时应调整标本位置，使待观察部位首先移向切口或角落的小孔。
   注意：为获得所需照片，可能需要调整袋上开孔的大小与位置，以及昆虫的朝向。
5. 完成鉴定后，请跳转至后续所需方法的相应章节。天线节切除技术见第4节，昆虫标记方法见第5节，花粉样本采集见第6节。

4. 从触角获取非致死性遗传样本

1. 使用剪刀将可重新密封的样本袋两个未密封角中的一个（即缝合在一起或不可重新密封的角）沿对角线剪开。确保剪出的开口略大于蜜蜂头部的宽度（图4）。
2. 调整标本位置，使其头部朝前移向切口/角落的孔洞。
   注意：此步骤可根据需要调整，以采集其他用于遗传分析的组织样本（例如整条腿、部分腿）。相应地，可能需要调整样本袋上开孔的大小和位置，以及昆虫的方向，以获取所需的样本。
3. 当蜜蜂头部从袋中伸出后，轻轻按压周围的塑料袋壁，使其在昆虫周围绷紧，限制其活动（图3A）。
4. 如果孔过大，可将袋子自身翻卷以进一步缩小开口并固定标本。若不确定合适的孔径大小，可在昆虫网或飞行笼内执行步骤4.2和4.3，以确保标本不会完全逃脱。若原始剪裁的角过大，可使用另一个袋子替代。
5. 调整袋子位置，使昆虫头部正对收集容器（例如含有缓冲液或乙醇的微量离心管/小瓶），并确保遗传样本容器已正确标记与所有其他标本数据相对应的唯一标本编号（图3D）。
6. 使用洁净且已灭菌的解剖剪，剪下一小段触角。目视检查容器，确认样本已落入容器内。
   注意：剪切时，建议在洁净、灭菌的浅色基底（例如Kimwipe纸）上操作。这样可确保若样本未落入收集容器，也能用镊子轻松找回，且污染风险最小。
7. 盖紧组织样本收集容器的盖子，并轻轻旋转容器，使样本悬浮于溶液中（例如缓冲液或乙醇）。
8. 将含有触角样本的组织样本收集容器放入安全的容器中，最好置于阴凉、避光且避免阳光直射或极端温度的地方，例如野外冷藏箱。
9. 在接近原始捕获地点处安全释放标本。
   注意：在释放前，也可对标本进行标记（见第5节），以便在重新观察或再次捕获时能快速识别其已被采样。

5. 标记生物体

1. 将样本置于可密封的样品袋中，在样品袋中部剪开一个小孔。
   注意：此孔是除第4节中已创建的孔之外的额外孔。孔的大小不应超过昆虫胸部的面积。剪孔位置可根据昆虫的大小和期望的标记区域而有所变化。
2. 轻轻按压标本两侧的塑料袋，移动昆虫使其胸部正对小孔（即胸部顶端通过袋子暴露出来）。持续施加轻柔压力，确保标本保持原位（图5A）。
   注意：某些昆虫可能更适合其他标记区域（图5B）。一些使用者发现将第4节中已有的孔扩大，并在蜜蜂胸部伸出时捏住其胸部更为方便（图5C）。但这种方法可能增加被蜇伤的风险。此外，若使用者认为更方便，可改装蜜蜂蜂王标记装置用于限制和标记蜜蜂。然而，该方法需要转移到不同的装置，可能污染花粉样本。
3. 使用油漆标记笔（或其他被认为适合目标分类群的标记材料），按照预先确定的项目特定方法对标本进行标记。
   注意：标记方法因研究目标而异，可能较为简单，仅表示个体已被捕获；也可能较为复杂，可用于识别特定个体（例如，使用独特的颜色编码或图案）（图5C）。
4. 固定标本位置，直至标记完全干燥。
5. 对标记后的个体进行拍照，以确认其颜色特征和颜色位置的唯一性。
   注意：重捕个体可直接透过可密封样品袋快速、便捷地拍照（图5D）。
6. 在原始捕获地点附近安全释放标本。

6. 花粉样品采集

1. 将标本放入可重复封口的样品袋中，仔细检查其表面是否有可见的花粉。
   注意：由于花粉的类型和数量差异极大，有时肉眼无法观察到标本上的花粉。如果此前步骤已完成，则样品袋中可能已存在来自该标本的花粉残留物。
2. 若标本表面可见花粉，可通过轻轻按压标本两侧的塑料袋壁，限制标本的移动。
3. 用手指轻轻揉搓或推动塑料袋，使其紧贴刚毛或携带花粉的身体部位，以促进花粉脱落。
4. 若标本表面未见花粉，应尽量增大标本与塑料袋之间的接触面积，以检测是否有微小的花粉残留物从体表脱落。
5. 如有可能，目视确认花粉已落入可重复封口的样品袋中（图4）。
6. 在接近原始捕捉地点的安全位置释放标本。
7. 牢固密封含有花粉样品的可重复封口样品袋。
   注意：若可重复封口样品袋上已剪开小孔，应将其放入另一个可重复封口样品袋中，以防花粉污染或丢失。
8. 用唯一的标本编号对标有该个体昆虫信息的可重复封口样品袋进行标记，并注明其他相关数据（例如昆虫物种编号、日期、地点、时间、性别、访花记录等）。
9. 将装有花粉样品的可重复封口样品袋置于安全容器中，最好存放在较阴凉处，避免阳光直射和/或极端温度影响。
   注意：如适用，应遵循特定项目的野外花粉保存方案（例如用于遗传分析、花粉形态学研究等）。

结果

该方法已用于美国东南部三种濒危蜂类（Osmia calaminthae、Caupolicana floridana 和 C. electa）的研究。迄今为止，已有数百只蜜蜂和黄蜂通过该方法被安全地采集并释放。在使用该方法的过程中，未发生蜜蜂死亡；其中被指定为凭证标本、并交由相关管理机构保存以记录新分布地点的个体，在完成数据采集后已按规定实施安乐死。表1列出了通过本方案评估的不同形态特征以及其他可量化的数据^{14,32,33,34,35,36}。

图1：野外工作期间可采集的数据记录表示例。 具体采集的数据内容将根据项目目标而有所不同。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：用于凭证的照片。 拍摄照片作为物种出现的凭证标本，对于报告目的至关重要。当多个物种具有相似特征时，必须拍摄具有显著鉴别特征的照片。在佛罗里达发现的这种 Anthidium maculifrons 可根据其柄节和头部的黄色斑纹与其他同属物种相区分。 请点击此处查看该图的高清版本。

图3：在可密封样品袋上打孔的位置。 可根据需要调整可密封样品袋上打孔的位置，以暴露蜜蜂特定的身体部位，便于拍照或采集遗传样本。在此组合照片中，（A）蜜蜂的头部、（B）腹部和（C）腿部被暴露出来用于拍摄。一旦蜜蜂被固定且无法移动时，通常会处于静止状态，此时可调整其位置以拍摄微距照片。（D）也可在此状态下采集遗传样本。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4：装有蜜蜂的采集袋，显示袋子一角被对角剪开。 若需仔细观察蜜蜂头部，采集袋角落的剪口大小应根据蜜蜂头部尺寸进行调整。采集袋中可能留存花粉甚至蜜液分泌物，可用于后续花粉鉴定。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 5：装有蜜蜂的可密封样品袋图像。为避免在标记蜜蜂时被蜇伤，可在袋子上打一个小孔，将（A）胸部置于孔下方进行标记。根据蜜蜂体型大小，也可选择在（B）腹部进行标记。或者，也可从袋子的角落小孔中释放蜜蜂，并在（C）胸部位置轻轻按压以固定进行标记。该技术虽可能增加被蜇的风险，但可有效减少记号笔油墨涂抹扩散。可使用独特的颜色或编号以区分不同个体。对于将来重新捕获的个体，可直接透过可密封样品袋（D）快速、便捷地进行拍照记录后释放。请点击此处查看此图的高清版本。

表1：使用本方案评估的形态学特征。 样本还可进行人工操作，以观察并记录本表未列出的多种性状（例如，背板/腹板形状、总体长度、重量、齿数、翅脉、翅基间距等）。请点击此处下载该表格。

讨论

本方案概述了一种在野外安全处理和检查稀有蜜蜂的方法，最终目的是获取所需的非致死性样本或凭证信息，并将目标个体安全地放归至原始捕获地点。与使用小瓶等其他采集方法相比，本方案的优势在于能够安全地限制蜜蜂活动，以便近距离观察关键特征并准确鉴定物种，从而最大限度地减少对昆虫和操作人员的伤害。此外，与某些其他方法^18,19类似，本方案无需对样本进行麻醉，可在极短时间完成取样并释放，且操作过程极为简便。可重复封口的采样袋成本低廉、易于获取、重量轻、便携性强且可回收，是离心管的一种理想替代品。但由于其不具备某些替代容器（如Falcon管或其他硬质容器）的刚性结构，因此在处理活体昆虫样本时需格外小心。若需将整只个体作为凭证标本保存，则应将其置于坚固的容器中，以减少对标本的潜在损伤。

使用该方法的研究人员最好具备处理蜜蜂和/或其他昆虫的经验，因为在将标本放入袋中时施加过大的压力可能导致其受伤或死亡。初学者应先利用更常见的物种（例如蜜蜂）练习本方案，以积累操作经验。通过练习可最大限度地减少对昆虫的伤害或致死风险。需要注意的是，根据研究目标物种的不同，该方法可能存在一定局限性。某些类群体型较小，可能需要使用成本更高且更为专业的微距摄影设备和/或野外显微镜，因为其形态特征可能无法利用本方案所列材料进行清晰分离和拍摄；目标越小，获得足够清晰图像的难度越大³⁷。此外，若鉴定需要观察难以触及的身体部位（如舌、外生殖器等），则可能需要采用其他鉴定方法。外生殖器是昆虫最具诊断价值的特征之一，其在不同物种间变异显著，而在同种内相对稳定^38,39。在此情况下，可能需要采用致死性方法，例如解剖。然而，对于难以鉴定的物种，可在野外采集后利用微小的非致死性遗传样本进行分子鉴定⁴⁰，而本文所述方法可用于此类样本的采集。目前，统计建模方法也正在发展，以协助整合成像技术与DNA测序用于昆虫鉴定⁴¹。

本方法的另一局限性在于执行该方案时可能被蜇伤，尤其是在袋子上开孔的情况下。然而，该方案已尽可能降低了被蜇伤的风险；作者在处理标本时，仅极少数情况下曾透过标本袋被蜇伤。还应注意，某些种类的蜜蜂、甲虫和黄蜂能够用其上颚咬破袋子，因此在确定该方法是否适用于目标分类群时应格外谨慎；在这些情况下，建议使用较厚的塑料袋或其他方法。在所有情况下，使用者应尽量减少使用一次性塑料制品，并在可能时进行回收利用。

本方案开发所针对的焦点分类群为蓝花香蜂（Osmia calaminthae）（膜翅目：切叶蜂科），其体长约为10–11 mm³²。自该方法建立以来，作者已将其应用于多种不同体型的其他膜翅目昆虫，包括体型较大的熊蜂属（Bombus）物种（膜翅目：蜜蜂科）以及毛斑蜂属（Caupolicana）物种，如C. electa和C. floridana（膜翅目：分舌蜂科）。Caupolicana electa的体长范围为18–23 mm，而C. floridana的体长范围为16–18 mm³³。为尽量减少对濒危、受威胁或列入保护名录物种可能造成的不利影响，建议首先在亲缘关系较近和/或常见的替代物种上进行尝试，以积累经验并提高操作熟练度。蜜蜂及其他昆虫的外骨骼存在差异，结构较脆弱的标本应谨慎处理。在研究体型较小或身体较柔软的昆虫时，本方法可能不适用。使用者需自行判断本方法中哪些步骤适用于其研究对象分类群。

除了将野外采集的生物样本进行临时容纳以供鉴定这一主要目标外，本方案还可修改用于执行多种需要安全限制蜜蜂的研究相关任务。例如，可在野外将生物样本置于可重复密封的采样袋中进行称重。研究人员也可在蜜蜂被固定的情况下，使用卡尺对其标本进行各种测量。例如，可通过体型大小来估算蜜蜂的归巢能力⁴²；本研究方法有助于获取支持此类估算所需的数据。同样，在不使用卡尺的情况下，研究人员也可将直尺、比例尺或色卡直接放置在标本后方并拍照，以便在后续图像处理时测量关键的形态学特征。该方法未来的应用可结合人工智能与机器学习技术的进步。利用智能设备可在野外和实验室中加快鉴定流程，从而最大限度减少对标本的操作时间和应激影响。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
30倍 60倍照明珠宝商放大镜	JARLINK		手提放大镜（如有需要），用于观察诊断特征
空中捕虫网
洗瓶中的漂白剂			仅用于非致死性基因取样
圆头儿童剪刀	Fiskar		圆头剪刀更安全，可放心放入口袋
洗瓶中的乙醇			仅用于非致死性基因取样
FD-1 闪光灯扩散器	Olympus		闪光灯扩散器，用于拍摄凭证照片时照亮标本
野外记录板
野外冷藏箱
精细镊子
细头油性记号笔套装	Sharpie		用于标记蜜蜂的记号笔
吸水纸巾（Kimwipes）	Kimtech
微量离心管			仅用于非致死性基因取样
可密封样品袋	Amazon		根据目标标本而定。我们推荐使用 50.8 mm x 76.2 mm 或 50.8 mm x 50.8 mm  - Edvision 2" x 3" 塑料袋，200个装，2密耳透明可重复封口拉链聚乙烯袋，适用于珠宝配件、珠子、螺丝及小物件的可重复封口储存袋  - Soft 'N Style 500个装可重复封口拉链聚乙烯袋，2英寸×2英寸（50mm×50mm），透明
不锈钢虹膜解剖剪			比圆头剪刀更精确，应存放于安全位置
TG-7 或类似型号相机	Olympus		具备微距功能的相机，用于拍摄凭证照片