CMG解旋酶解旋DNA的单分子实时可视化观察

摘要

本方案演示了通过单分子实验对CMG解旋酶解旋DNA的过程进行活体可视化观察。内容包括：（1）制备DNA底物，（2）纯化荧光标记的黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）CMG解旋酶，（3）为全内反射荧光（TIRF）显微镜准备微流控流动池，以及（4）单分子DNA解旋实验。

摘要

精确的基因组复制对于维持分裂细胞的遗传稳定性至关重要。DNA复制在S期由一个动态的蛋白质复合物——复制体来完成。复制体的核心是 CDC45-MCM2-7-GINS（CMG）解旋酶，它负责解开DNA双螺旋的两条链，使DNA聚合酶能够分别复制每条链。在基因组复制过程中，复制体必须克服多种障碍和挑战。这些障碍中的任何一项都可能威胁基因组的稳定性，因为DNA复制不完全或不准确可能导致突变、疾病或细胞死亡。因此，深入了解CMG在正常复制以及复制应激过程中于复制体内的功能具有重要意义。本文描述了一种利用重组纯化蛋白的全内反射荧光（TIRF）显微镜检测方法，可实现对单个CMG复合物锚定并拉伸的DNA分子进行实时可视化观察。该检测方法为在单分子水平上研究CMG的行为提供了强有力的平台，使解旋酶的动力学行为能够在实时调控反应条件的情况下被直接观测。

引言

DNA复制受到严格调控，因为细胞必须准确复制其基因组，以防止发生突变、疾病或死亡。真核生物的DNA复制由复制体复合物（replisome complex）执行，该复合物解开亲本DNA，并以单链DNA（ssDNA）为模板合成新的DNA链。在G1期，MCM2-7的催化失活双六聚体被加载到复制起点的双链DNA（dsDNA）上¹在S期，MCM2-7复合物通过与CDC45和GINS结合而被激活² 形成由11个亚基组成的CMG复合物（CDC45、MCM2-7、GINS）。每个CMG复合物向相反方向启动DNA解旋，构成复制体组装的核心单元³.

二十年前，CMG解旋酶首次被鉴定为一个由11个亚基组成的复合物，是DNA复制所必需的⁴。自那时以来，我们对CMG的理解已取得显著进展，涵盖了其加载与激活^5,6，以及DNA解链和终止过程⁷。传统的生物化学和结构生物学技术在这些发现中起到了关键作用；然而，这些方法在研究CMG更动态的特性方面往往存在局限性。单分子技术通过物理操控单个生物大分子，逐个分子地测量或观察其活性，可用于揭示其他技术常常遗漏或无法检测到的蛋白质实时动态行为^8,9。

本文介绍了一种全内反射荧光（TIRF）显微镜检测方法，用于实时观察CMG解旋酶对DNA的解链过程。将纯化的、荧光标记的CMG加载到含有预制DNA叉结构的长链DNA的游离3'末端。在微流控流动池中，通过依次将线性DNA的两端固定在生物素-PEG包被的盖玻片表面，使DNA被拉直。该方法可实现更均匀的DNA固定，显著减少了数据分析时需要考虑的变异因素。在ATP-γ-S存在下，CMG结合到DNA叉3'末端的单链DNA上。ATP-γ-S是一种水解缓慢的ATP类似物，可允许CMG结合DNA但不启动解链。随后加入ATP以及纯化的荧光标记RPA，可激活CMG并启动广泛的DNA解链。从视觉上可见，CMG沿DNA移动，其后留下不断延伸的RPA结合的单链DNA区域。未固定的DNA末端随CMG一起移动，由于RPA结合引起的压缩作用，形成一个"紧密球状结构"。流动池的设计允许在解链过程中的任意时刻更换缓冲液，从而在实验过程中实现高度的控制性。

本方案分为四个可独立进行的方法。第1节描述了用于单分子实验的20 kb线性分叉DNA底物的制备。第2节概述了黑腹果蝇CMG（Drosophila melanogaster CMG，DmCMG）的纯化及荧光标记，相关DmCMG表达的关键信息包含在注释部分。第3节介绍了可在全内反射荧光（TIRF）显微镜上使用的微流控流动池的制备。第4节描述了如何开展单分子DNA解旋实验。

方案

1. 单分子实验中使用的20 kb线性分叉DNA的制备（图1）

图1：DNA底物制备的图示。（A）通过退火两条部分互补的寡核苷酸（一条带生物素标记，另一条无生物素标记）形成带有生物素的DNA叉状末端。（B）主要的双链DNA片段（约20 kb）通过使用两种酶对pGC261质粒进行限制性酶切，产生两端具有不同粘性末端的线性DNA。（C）地高辛双链DNA末端通过在含有地高辛-dUTP的条件下进行PCR扩增，随后进行限制性酶切获得。请点击此处查看该图的放大版本。

1. 制备生物素标记的DNA叉状末端。
   1. 退火DNA叉状结构。
      1. 将两条寡核苷酸（oHY502和oHYbio85）混合于1×STE缓冲液（100 mM NaCl，10 mM Tris，pH 8.0；1 mM乙二胺四乙酸[EDTA]）中。寡核苷酸终浓度为10 µM，终反应体积为100 µL。
      2. 将反应体系置于金属浴中80 ˚C孵育5分钟。关闭金属浴，使反应体系在金属浴中自然缓慢冷却，直至温度降至30 °C以下。
   2. 在Tris-硼酸-EDTA（TBE）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）凝胶上验证退火效率。
      1. 配制8%丙烯酰胺-TBE凝胶（配制4块凝胶：32.8 mL H₂O；4.8 mL 10×TBE缓冲液（1 M Tris，1 M硼酸，20 mM EDTA）；9.6 mL 40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液，37.5:1；0.8 mL 10%过硫酸铵[APS]；40 µL四甲基乙二胺[TEMED]）。
         注意：TBE、丙烯酰胺、APS、TEMED具有毒性/有害性。
      2. 取少量退火后的寡核苷酸（1 µL），与经6×上样染料稀释的单链寡核苷酸一同在8%丙烯酰胺-TBE凝胶上以80 V室温电泳1小时。
      3. 将凝胶置于含适当核酸染料的1×TBE缓冲液中，在摇床（往复式）上染色30分钟，随后使用凝胶成像系统扫描凝胶。
   3. 在TBE-PAGE凝胶上分离退火后的DNA，用于切胶。
      1. 若寡核苷酸已正确退火，则将剩余样品与BSA一起上样（约100 µL退火产物，25 µL 6×上样染料，2 µL 33 mg/mL BSA）。为加载较大体积，可用无菌手术刀将多个加样孔连接起来。
      2. 将凝胶置于含适当核酸染料的1×TBE缓冲液中，在摇床（往复式）上孵育30分钟。
      3. 将凝胶转移至玻璃托盘中，在暗室中用蓝光激发观察DNA条带。使用蓝光时应佩戴适当的防护屏或护目镜。
      4. 用无菌手术刀切下目标条带，并去除多余凝胶。
   4. 通过电洗脱法纯化退火后的DNA叉状结构。
      1. 剪取一段透析袋，长度足以容纳凝胶块，用1×TBE润湿后，夹紧一端。
      2. 将BSA稀释至0.3 mg/mL，加入500 µL 1×TBE中，将全部液体用移液器转移至透析袋内。
      3. 用金属刮刀将凝胶块推入透析袋中，并将其移至透析袋一侧，为DNA在电洗脱过程中迁移至缓冲液中预留空间。
      4. 挤出多余缓冲液，夹紧透析袋另一端。
         注意：剩余体积将决定最终体积和浓度。
      5. 将透析袋放入含有1×TBE缓冲液的琼脂糖凝胶电泳槽中，确保透析袋完全浸没。
         注意：应将凝胶块置于靠近负极的一侧，以便DNA从凝胶中迁移至透析袋内。
      6. 以80 V进行电洗脱1–2小时。
   5. 将电洗脱所得DNA透析至10 mM Tris缓冲液（pH 8）中。
      1. 电洗脱完成后，从电泳槽中取出透析袋，用纸巾擦干一端。避免用纸巾接触透析袋中部，即凝胶和样品所在区域。
      2. 打开擦干端的夹子，轻轻吹打透析袋内部，使DNA与缓冲液充分混合。
      3. 将洁净的刮刀浸入1×TBE缓冲液后，从透析袋中取出凝胶块。
         注意：取出凝胶块时，应尽量减少缓冲液的损失。
      4. 再次夹紧透析袋开口端，并排出内部空气。
      5. 将透析袋放入盛有1.5 L 10 mM Tris缓冲液（pH 8）、20 mM NaCl和2 mM MgCl₂的2 L烧杯中。用Parafilm包裹夹子，将透析袋固定在烧杯边缘，同时确保透析袋完全浸入缓冲液中。
         注意：盐离子有助于稳定短链寡核苷酸双链结构。
      6. 使用磁力搅拌子在室温（RT）下轻柔搅拌缓冲液，透析至少3–4小时，或在4 ˚C下过夜透析。
      7. 透析完成后，用纸巾擦干透析袋一端（避免稀释DNA），打开夹子。
      8. 在透析袋内轻轻吹打样品，将其转移至洁净的1.5 mL离心管中。
      9. 使用微量分光光度计测定DNA浓度。
2. 制备20 kb片段
   1. 使用NotI/I-CeuI酶对pGC261质粒¹⁸进行限制性酶切。
      1. 在限制性内切酶供应商推荐的缓冲液中，轻轻混合8 µL NotI-HF（20,000 U/mL）、8 µL I-CeuI（5,000 U/mL）和pGC261质粒（终反应体积200 µL，质粒终浓度约40 ng/µL）。
      2. 37 ˚C孵育过夜。
   2. 通过电洗脱法纯化酶切后的质粒。
      1. 可选：在加载全部反应体系前，可先取少量反应产物在0.6%琼脂糖凝胶上电泳，以检测酶切效率。
      2. 按照步骤1.2.2.3–1.2.2.4制备0.6%琼脂糖凝胶。
      3. 将0.48 g琼脂糖粉末与80 mL 1×TBE缓冲液混合，微波加热至沸腾，摇匀确保琼脂糖完全溶解。冷却数分钟后倒入指定电泳槽。
      4. 为合并加样孔以容纳较大体积样品，可在制胶前用胶带覆盖梳子的多个孔。
      5. 待凝胶凝固后，轻轻拔出梳子，并向电泳槽中补加1×TBE缓冲液。将样品与DNA上样染料轻轻混合后，以120 V电泳1小时。
      6. 将凝胶置于含适当核酸染料的1×TBE缓冲液中，在摇床（往复式）上染色至可见条带。
      7. 将染色后的凝胶转移至玻璃托盘中，在暗室中用蓝光激发观察DNA。
      8. 用无菌手术刀切下目标条带，并去除多余凝胶。
      9. 按照步骤1.1.4和1.1.5所述方法，通过电洗脱法纯化目标片段。此处透析缓冲液中无需添加盐离子，因其仅用于稳定短链寡核苷酸双链。
   3. 可选：可跳过步骤1.2.2，改为按照供应商说明热失活限制性内切酶。此方法可减少DNA损伤。额外的DNA片段将在步骤1.4.3最终底物纯化时被去除。
3. 制备地高辛标记的双链DNA末端
   1. 以pGC261 DNA为模板，使用地高辛-dUTP（dig-dUTP）进行PCR扩增。
      1. 混合以下组分：400 µL水，8 µL pGC261（0.8 ng/µL），3.5 µL引物oHY507（100 µM），3.5 µL引物oHY508（100 µM），8 µL dig-dUTP（1 mM），400 µL 2×PCR混合液（由2,000 U/mL DNA聚合酶（20 µL）、10 mM dNTPs（40 µL）、5×高保真（HF）缓冲液（400 µL）和水（540 µL）配制而成）。
      2. 在PCR仪中运行以下程序：
         98 ˚C - 1分钟
         30个循环：98 ˚C - 20秒；65 ˚C - 20秒；72 ˚C - 30秒；
         72 ˚C - 10分钟
         4 ˚C - 保存
   2. 酶切并纯化地高辛标记的PCR产物
      1. 使用商业化DNA纯化试剂盒纯化PCR产物。
      2. 在酶供应商推荐的缓冲液中，将10 µL NotI-HF（20,000 U/mL）与PCR产物混合（终反应体积约200 µL，DNA终浓度约50 ng/µL）。37 ˚C孵育过夜。
      3. 使用商业化DNA纯化试剂盒纯化酶切后的DNA。
4. 组装各组分以制备DNA底物。
   1. 在酶供应商推荐的缓冲液中，将生物素标记的叉状末端、20 kb DNA片段和地高辛标记的经NotI处理的PCR片段与5 µL T4 DNA连接酶（400,000 U/mL）在200 µL反应体系中轻轻混合。根据所加入的20 kb DNA片段量（1–5 µg），生物素标记的叉状末端和PCR片段应分别加入约100倍摩尔过量。
   2. 将反应体系分装至PCR管中（每管50 µL），在PCR仪中16 ˚C孵育过夜。
   3. 将连接产物在0.6%琼脂糖凝胶上电泳分离，并按照步骤1.2.2和1.2.3所述方法通过电洗脱法纯化连接后的DNA。
   4. 将DNA快速冷冻后于-80 ˚C保存。

2. 纯化 黑腹果蝇 CMG（图2)

图 2：从 4 L Hi Five 细胞中纯化 Drosophila melanogaster CMG 复合物。 蛋白在 MOPS 缓冲液条件下，通过 200 V 电压在 4%–12% Bis-Tris 聚丙烯酰胺凝胶上进行分离。图中展示了纯化各阶段的样品（细胞裂解液 — 2 µL，FLAG 洗脱液 — 10 µL，第一轮离子交换柱后 — 10 µL，以及标记后和第二轮离子交换柱后 — 1 µL）。(A) 考马斯亮蓝染色证实，在荧光标记前（10 µL）和标记后（1 µL），CMG 复合物的全部 11 个亚基均存在。(B) MCM3 亚基的标记效率通过使用长通红光（LPR）滤光片的荧光成像仪对 Cy5 进行扫描验证。请点击此处查看该图的高清版本。

注意：为了制备荧光标记的Drosophila melanogaster CMG复合物，在MCM3亚基的N端FLAG标签下游（位于pFastBac1载体中）引入了一个TEV蛋白酶切割位点（ENLYFQG），其后连接四个甘氨酸残基¹⁰。该复合物的表达采用杆状病毒表达系统。初始转染时，每种CMG亚基分别使用Sf21细胞（P1病毒阶段）。为进一步扩增病毒，使用Sf9细胞（P2病毒阶段）。随后，用0.5 mL P2病毒接种Sf9细胞培养物（每种CMG亚基100 mL，细胞密度为0.5 × 10⁶ 个/mL），并补充10%胎牛血清（P3病毒阶段）。为在4 L的Hi Five细胞（细胞密度为1 × 10⁶ 个/mL）中表达完整的CMG复合物，每种亚基使用200 mL的P3病毒进行感染。收集表达CMG复合物的Hi Five细胞后，可将细胞沉淀迅速在液氮中冷冻，并于-80°C保存。整个纯化过程需在冰上或4°C条件下进行。缓冲液可预先配制，但还原剂（DTT或2-巯基乙醇）和蛋白酶抑制剂（注意）必须在使用前立即加入。确保所有缓冲液提前预冷，并经过过滤和脱气处理。

1. 配制以下缓冲液。
   1. 通过混合以下成分配制重悬缓冲液 A：25 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸 (HEPES) pH 7.5、0.02% Tween-20、10% 甘油、15 mM KCl、2 mM MgCl₂、2 mM 2-巯基乙醇、1 mM EDTA 和 1 mM 乙二醇双(β-氨基乙醚)四乙酸 (EGTA)。
      ​注意：2-巯基乙醇、DTT 和 EDTA 具有毒性/有害性
   2. 为制备 ANTI-FLAG M2 亲和凝胶，配制 Tris 缓冲盐水 (TBS；0.1 M 甘氨酸盐酸，pH 3.5) 缓冲液。
   3. 通过混合以下成分配制缓冲液 A-100：25 mM HEPES pH 7.5、0.02% Tween-20、10% 甘油、100 mM KCl、1 mM DTT、1 mM EDTA 和 1 mM EGTA。
   4. 通过加入以下成分配制透析缓冲液：25 mM HEPES pH 7.5、50 mM 醋酸钠、10 mM 醋酸镁、10% 甘油和 1 mM DTT。
   5. 通过混合 50 mM Tris-HCl pH 7.5 和 150 mM NaCl 配制 TBS 缓冲液。
2. 用 200 mL 冰冷的含蛋白酶抑制剂混合片的重悬缓冲液 A 重悬 4 L Hi Five 细胞培养物的沉淀。反复倒置试管，直至整个沉淀完全重悬。
3. 将重悬的细胞转移至预冷的 40 mL Dounce 匀浆器中。为尽可能回收细胞，用相同类型的缓冲液冲洗用于冷冻细胞沉淀的试管，并将冲洗液加入 Dounce 匀浆器中。确保匀浆器中的总体积不超过推荐上限。在冰上进行 60–70 次研磨以裂解细胞。
   注意：确保研杵到达管底，但不要施加过大压力，以免匀浆器破裂。注意不要将研杵提至液面以上，否则会引入气泡。
4. 重复上一步骤，直至整个样品完成匀浆，并将所有匀浆液合并至预冷的烧杯中。测定样品的最终体积。逐滴加入过滤的 KCl 至终浓度为 100 mM，并轻轻混匀。
5. 提前将离心机预冷至 4 °C。将样品倒入离心管中，确保达到生产商推荐的体积。在天平上平衡离心管。
   注意：体积过小的离心管在离心过程中可能破裂。
6. 在 4 °C 下以 23,500 × g 离心裂解液 15–30 分钟。同时，按照下一步准备 ANTI-FLAG M2 亲和凝胶。
7. 轻轻混匀含有 ANTI-FLAG M2 亲和凝胶（50% 悬液）的瓶子。剪去 P-100 移液器吸头末端（以扩大吸头口径），立即转移 4 mL 悬液（2 mL 凝胶珠）至 20 mL poly-prep 层析柱中。为回收吸附在吸头内的凝胶珠，用 TBS 冲洗吸头并将冲洗液加入层析柱中。让所有凝胶珠在柱内自然沉降，但注意不要使其干燥。
8. 用 0.1 M 甘氨酸盐酸（pH 3.5）缓冲液洗涤树脂，用量为凝胶珠体积的 3 倍（共 6 mL）。随后用 TBS 缓冲液洗涤 3–5 倍珠体积（6–10 mL）。接着用缓冲液 A-100 洗涤 3 次（每次 6 mL）。
   注意：凝胶珠在 0.1 M 甘氨酸盐酸（pH 3.5）溶液中停留时间不得超过 20 分钟。为提高流速和洗涤效率，可用盖子覆盖层析柱。切勿让树脂在任何阶段干燥。
9. 树脂准备完成后，在树脂上方保留 2 mL 缓冲液 A-100，并关闭层析柱出口。
10. 离心结束后，小心将上清液倒入预冷的 50 mL 离心管中，注意不要扰动沉淀。取少量等分试样（约 10 µL）以备后续 SDS-PAGE 电泳验证。
11. 向每个 50 mL 离心管中加入等量的 ANTI-FLAG M2 凝胶珠（按前一步骤制备）。尝试通过加入数毫升额外的缓冲液 A-100 重悬并回收柱中残留的所有凝胶珠，并将此重悬液转移至离心管中。
12. 将样品（上清液）与 ANTI-FLAG M2 树脂混合，在 4 °C 下旋转孵育 2.5 小时。
13. 孵育结束后，在 4 °C 下以 1,000 × g 离心 5 分钟。用移液器移除大部分上清液。使用剪去末端的吸头，将凝胶珠用剩余上清液重悬于几毫升液体中，并转移至两个 15 mL 离心管中。为回收吸附在 50 mL 管壁上的凝胶珠，加入数毫升缓冲液 A-100 并一同转移至 15 mL 管中。
14. 在 4 °C 下以 1,000 × g 离心 15 mL 管 5 分钟，弃去上清液。
15. 向每管中加入约 14 mL 缓冲液 A-100 洗涤凝胶珠，4 °C 下短暂轻柔旋转后，在 4 °C 下以 1,000 × g 离心 5 分钟。重复洗涤两次。每次洗涤取少量等分试样（约 10 µL）以备后续 SDS-PAGE 电泳验证。
16. 此步骤（2.16）为前几步（2.13–2.15）的替代方案。
    1. 与 ANTI-FLAG M2 树脂孵育后，将样品倒入两个 20 mL poly-prep 层析柱中。
    2. 若选择此方法，让凝胶珠在柱底自然沉降，未结合的样品通过重力流过柱子。随后直接向柱中加入缓冲液 A-100，通过重力流进行洗涤。
17. 将凝胶珠（重悬于缓冲液 A-100 中）转移至两个 10 mL poly-prep 层析柱中。
    1. 让缓冲液 A-100 流过树脂，当液面降至树脂顶部时关闭出口，然后加入含 200 µg/mL (DYKDDDDK) 肽（FLAG 洗脱缓冲液）的缓冲液 A-100 以从凝胶珠上洗脱蛋白。
    2. 首次洗脱时，加入 3 mL FLAG 洗脱缓冲液，在室温下轻轻旋转封闭的层析柱 15 分钟。打开出口收集第一洗脱组分。
    3. 关闭出口，向每根柱中加入 2 mL FLAG 洗脱缓冲液。再旋转 10 分钟，收集第二洗脱组分。
18. 合并所有洗脱组分（约 10 mL），置于 4 °C 保存。取少量洗脱组分（约 10 µL）以备后续 SDS-PAGE 电泳验证。
19. 使用 0.22 μm 注射式滤器过滤洗脱样品。
20. 提前按照生产商说明书准备连接至蛋白纯化系统的 CaptoHiRes Q (5/50) 柱（高分辨率离子交换层析柱）。随后用缓冲液 A-100 平衡柱子，并将过滤后的样品上样至平衡好的柱中。
21. 用 20 倍柱体积（CV）的缓冲液 A-100 洗涤柱子（总约 20 mL，因柱体积约为 1 mL）。
22. 为洗脱蛋白，提前配制两种缓冲液：缓冲液 A-100 和缓冲液 B（成分与 A-100 相同，但 KCl 浓度为 550 mM 而非 100 mM）。设置梯度洗脱程序，20 CV（约 20 mL）内盐浓度从 100 mM 逐步升至 550 mM KCl。使用组分收集器收集 0.3–0.5 mL 的洗脱组分。
    注意：CMG 应在缓冲液 B 浓度约 70%–75% 时洗脱。取少量洗涤液和洗脱组分进行 SDS-PAGE 电泳分析。
23. 进行 SDS-PAGE 电泳，确认目标组分中含有 CMG。同时，按照生产商说明书清洗层析柱和纯化系统。
24. 将目标组分与 TEV 蛋白酶在 4 °C 下孵育过夜，每 1 mL 样品中加入 50 µL TEV 蛋白酶（1 mg/mL）。
25. 预湿透析管并确认膜无破损。将 CMG/TEV 混合物加入透析袋中，放入含 1.5 L 预冷缓冲液 A-100 和磁力搅拌子的 2 L 烧杯中。在 4 °C 下轻柔搅拌透析过夜。
26. 在含 5 mM CaCl₂ 的条件下，将样品与 50 µM LD655 标记肽和 10 µg/mL Sortase 酶混合。在 4 °C 下旋转孵育 30 分钟，确保避光。标记前后各取少量样品进行 SDS-PAGE 电泳分析。
27. 上样至纯化系统前，使用 0.22 μm 离心滤器过滤标记后的样品，以防肽段沉淀。
28. 提前按前述方法（步骤 2.20）准备高分辨率离子交换层析柱。此次需用铝箔包裹层析柱和组分收集系统，以保护样品避光。
29. 为去除游离肽段，将过滤后的样品上样至高分辨率离子交换层析柱。纯化过程同前（步骤 2.21–2.22）。确保标记后的 CMG 在与之前相似的缓冲液 B 浓度下洗脱。
30. 进行 SDS-PAGE 电泳以验证目标组分的质量。为检测荧光，上样前勿煮沸样品，并确保电泳槽避光。先使用凝胶成像系统检测蛋白荧光，再用考马斯亮蓝染色凝胶并再次成像以观察全部蛋白。
31. 将目标组分在 4 °C 下与 1.5 L 透析缓冲液透析过夜。必要时可浓缩样品。
32. 将蛋白在液氮中速冻，并于 -80 °C 保存以备后续使用。

3. 流通池的制备（图3）

1. 按照先前描述的方案制备生物素-PEG盖玻片¹¹，省略烘箱烘烤步骤。生物素-PEG盖玻片在室温下真空保存至少可稳定1个月。制备流动池时，将生物素-PEG盖玻片（24 mm × 60 mm）切成两半（约24 mm × 30 mm）。
   注意：请勿触碰盖玻片中央区域，即流道所在的位置。
2. 通过蚀刻将载玻片折断成约 2.4 cm × 1 cm 的小玻璃片。
3. 使用0.8 mm的金刚石涂层钻头钻两个相距1.4 cm的孔，其中一个孔略大于另一个（0.043英寸为入口，0.048英寸为出口）。通过尝试插入进液管/出液管来测试孔的尺寸是否合适，必要时使用同一钻头扩大孔径，直至管路能够适配。确保管路配合紧密，不易脱落。
   注意：使用较窄的进样管以尽量减少死体积。
4. 将双面胶带裁剪成与玻璃片相同的形状。
5. 将载玻片在胶带上对齐，用针穿过每个孔以在胶带上标记其位置。使用剃刀刀片切割出一个包含两个孔的通道。
   注意：不要将通道切得过长，因为液体流动时每个孔远端的多余空间可能保持干燥，从而在流动过程中产生气泡问题。切割时，应尽量对长边进行一次完整的干净切割，多次切割造成的毛边会影响流道的质量。同样，不要切割到流道的边缘，因为对可用部分进行切割可能影响液体流动，甚至在组装后的流动池中造成泄漏。
6. 用丙酮和擦镜纸擦拭玻璃片直至干燥，然后将其放置在洁净的表面上。撕开双面胶带的一侧，将其粘贴到玻璃片上，确保两个孔完全位于通道内。
7. 使用 p1000 移液器吸头，以稳固但适度的压力按压表面，排除气泡，将胶带密封到玻璃片上。全面覆盖整个表面以确保密封。
8. 将胶带的第二层背衬从两块玻璃上剥离，并将玻璃片粘性面向上放置于清洁的表面上。将载玻片彼此靠近但不接触地摆放，位置即为其后续与盖玻片粘合时的位置（在两片玻璃之间预留足够空间，以便环氧树脂能在每块玻璃片周围形成完整的密封）。
9. 使用塑料镊子夹取半生物素-PEG盖玻片，仅捏住边缘（切勿触碰将形成流动通道的区域），将带有PEG功能化的一侧向下放置在粘合剂上。用手指轻压使其固定，然后用移液枪头适度用力擦拭表面以去除气泡（避免在流动通道区域操作，以防破损），完成密封后翻转。
   注意：请小心操作盖玻片。
10. 每个流式池准备约10 cm长的聚乙烯管（PE20和PE60）各一段。使用较细的导管作为流入通道，以减少死体积。
11. 用手将管路插入载玻片上的孔中。如果孔的直径合适，插入后管路应能自行直立于孔内。将管路末端以轻微倾斜角度剪切 <45˚，以便于插入管路，并防止管路末端与盖玻片形成密封，若管路末端为平口，则可能形成密封（这会阻碍液体流动）。
    注意：将管路准确地插入玻璃部件可提高流动池构建的可靠性，并有助于避免向流动池中引入气泡。
12. 充分混合环氧树脂组分，然后使用P200枪头蘸取环氧树脂，用于密封导管，并在每块玻璃周围形成密封。加入足够的环氧树脂，使其上升至盖玻片圆边的边缘，以增强脆弱盖玻片的结构强度。但需确保环氧树脂未沾到盖玻片底面，以免影响其在载物台上的平整贴合。
    注意：如有必要，可使用刀片刮除底部多余的少量环氧树脂。
13. 静置至少30至60分钟，使环氧树脂完全固化。
    注意：如果流式池不立即使用，应在完全固化后于室温下真空保存。
14. 使用流路池后，回收玻璃片并可无限次重复使用。拔出管路，将流路池放入盛有丙酮的载玻片染色缸中，至少浸泡24小时，以软化环氧树脂和双面胶，便于轻松取出玻璃片。在重新用于制作新的流路池之前，用海绵蘸取肥皂水擦洗玻璃片，冲洗并干燥后，再用丙酮和擦镜纸擦拭清洁。

图 3：流动池制备过程的图示。（A）将双面胶带裁剪至与玻璃片尺寸匹配。将载玻片置于胶带上方，用针标记每个孔的位置。使用剃刀刀片围绕每个孔切割，以形成通道。（B）剥离胶带一侧的保护膜，并将胶带粘贴到玻璃片上。确保两个孔均位于通道内。再剥离胶带另一侧的保护膜，将生物素修饰的PEG盖玻片贴于其上。（C）将聚乙烯管插入每个孔中，并用环氧树脂密封固定管路，同时将玻璃片与盖玻片之间也密封牢固。（D）在使用完两个通道后，拔出管路并将流动池放入盛有丙酮的染色缸中。约24小时后，环氧树脂和胶带会软化，流动池的各层即可剥离分开。玻璃片可回收并保存在丙酮中，以便无限次重复用于制备下一个流动池。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 单分子TIRF实验观察CMG介导的DNA解旋

1. 配制以下缓冲液。
   1. 配制封闭缓冲液（20 mM Tris，pH 8.0；50 mM NaCl；2 mM EDTA；0.2 mg/mL BSA）。使用0.22 µm针头滤器过滤该缓冲液，并于4 °C保存。
   2. 配制10倍反应缓冲液1（250 mM HEPES，pH 7.5；50 mM NaCl；100 mM醋酸镁）。使用0.22 µm针头滤器过滤该缓冲液，并于4 °C保存。
   3. 配制10倍反应缓冲液2（250 mM Tris，pH 7.5；100 mM醋酸镁；1.25 M谷氨酸钾；1 mM EDTA；0.025% Tween-20）。使用0.22 µm针头滤器过滤该缓冲液，并于4 °C保存。
2. 将约2.5 mL封闭缓冲液和5 mL超纯水置于敞口离心管中，放入真空干燥器内抽真空15分钟以去除溶解气体。
   注意：切勿将离心管装满，因脱气过程中产生的气泡可能导致液体飞溅。
3. 将流动池放置在显微镜载物台上，并在两端使用黏性橡皮泥将其固定。牢固固定非常重要，以防止在后续成像过程中流动池发生移动。
4. 将流动池出口管路连接至注射泵，该泵的管路一端连接注射器，另一端装有针头。将此针头插入流动池出口管路，以完成连接。
5. 开启物镜加热器，设定温度为30 °C。
6. 将装有1–2 mL脱气水的离心管用另一块黏性橡皮泥固定在流动池附近，确保进样管路可插入其中并触及管底。
7. 使水流经通道，随后以较快流速冲洗以去除进样管路附近可能滞留的气泡，必要时补充更多水。否则，实验后期可能有大气泡脱落并通过通道。快速流动停止后需静置数分钟，使流动完全停止，因为停止后注射器内压力稳定过程中仍可能产生持续的液体抽吸作用。
   注意：任何接触气泡的DNA即使重新水合后也无法使用。
8. 向20 µL浓度为1 mg/mL的链霉亲和素样品中加入100 µL脱气的封闭缓冲液。将敞口管固定于黏性橡皮泥上，并将进样管路由水中转移至链霉亲和素溶液中。以40 µL/min流速注入2分钟（共80 µL），随后孵育5分钟。
9. 用封闭缓冲液洗去多余的链霉亲和素（50 µL/min流速，共100 µL）。
10. 将生物素标记的DNA用含25 nM SYTOX橙染料的封闭缓冲液稀释后注入通道。使用532 nm激光在实时成像模式下观察DNA在表面的锚定过程。
11. 当表面DNA密度达到预期水平时，使用同样含有25 nM SYTOX橙的封闭缓冲液冲洗（50 µL/min流速，共100 µL），以去除未结合的游离DNA。
12. 将生物素化的抗地高辛抗体（约10 µg/mL）用含25 nM SYTOX橙的封闭缓冲液稀释后注入通道（100 µL/min流速，共300 µL）。
    注意：SYTOX橙可插入DNA碱基对之间，从而延长其轮廓长度。这意味着在SYTOX橙存在下DNA的端到端距离增加，使得第二个锚定点能够远离第一个锚定点结合于表面，从而在后续洗去SYTOX橙后获得更充分拉伸的DNA。在DNA两端使用不同的功能基团可实现更均匀的DNA在盖玻片表面的锚定（图4）。若两端均为生物素化，则在同一步骤中锚定，导致锚定位置存在显著差异。在一端使用地高辛可更好地控制在锚定第二端之前的DNA覆盖密度。此外，也可通过孵育进一步提高DNA覆盖度。
13. 用封闭缓冲液洗去生物素化的抗地高辛抗体及SYTOX橙（50 µL/min流速，共100 µL）。
14. 配制120 µL“ATP-g-s混合液”（1倍反应缓冲液1，0.75 mg/mL BSA，1.25 mg/mL酪蛋白，8 mM DTT，0.33 mM ATP-g-s），取30 µL加入新离心管中，然后将原管中50 µL以50 µL/min流速注入流动池（共50 µL）。此操作有助于最小化因回流或扩散导致的出口管路处缓冲液混合效应。
15. 将纯化的CMG蛋白加入30 µL ATP-g-s混合液中，使终浓度约为100 nM，随后以20 µL/min流速注入20 µL。孵育15分钟。
16. 配制120 µL“ATP/RPA混合液”（1倍反应缓冲液1，0.75 mg/mL BSA，8 mM DTT，3.3 mM ATP，20 nM EGFP-hRPA），并以40 µL/min流速注入80 µL至流动池中。
17. 立即开始采集图像。每帧采集6×6个视野，间隔30秒（或根据实验需求选择合适的帧率）。较低的帧率可减少激光照射时间和荧光团的光漂白。使用488 nm激光（功率1%）检测EGFP-hRPA。若CMG带有标记（如LD655），则使用640 nm激光（最大功率30 mW，设定为10%功率）检测CMG。使用532 nm激光（功率0.5%）检测SYTOX橙染色的DNA。各激光曝光时间设为50–100 ms。
    注意：每次将流动池进样管路由一个液体管转移至另一个液体管时，应在移出液面前多次轻触管底，以防止转移过程中引入气泡。尽量缩短进样管路末端暴露在液体外的时间，切勿将管路末端朝上或显著抬高，以免液体流向通道并吸入空气。转移过程中避免对管路施加张力，以防其从环氧树脂固定处脱出。若需成像DNA解链过程，在使用SYTOX橙标记双链DNA的条件下，应将ATP/RPA混合液中的10倍反应缓冲液1替换为10倍反应缓冲液2，因在此条件下SYTOX橙与DNA结合更佳。每次实验结束后应将注射泵完全排空。可定期通过多次注水并排空的方式进行清洗，或拆卸后用肥皂水清洗。

图4：DNA在表面的拴系。（A）当使用两端均带有生物素的DNA底物进行拴系时，两个拴系点之间的距离可能因末端与表面接触方式的不同而变化（i）。若在一端使用地高辛标记，则可将两端的拴系过程在时间上分步进行，从而获得更一致的拴系距离和更均匀拉伸的DNA（ii）。（B）显示两端均被拴系（用地高辛标记）并用荧光嵌入性核酸染料染色的DNA视野示例。两端均被拴系的DNA呈线状，而仅一端被拴系的DNA则呈点状。理想情况下，DNA应尽可能密集地被拴系，同时避免与其他DNA重叠。图像尺寸为512 × 512像素（像素大小 = 154.6 nm）。请点击此处查看该图的放大版本。

结果

当CMG解旋DNA时，会随时间逐渐形成一条特征性的RPA轨迹（图5）。解旋后的DNA的5'端被锚定在表面，因此表现为从锚定点到复制叉之间的一段线性RPA信号。而3'端未被锚定，因此随复制叉移动，表现为一个紧凑的EGFP-RPA信号。该紧凑的解旋后易位链的位置大致对应于复制叉的位置，后者与通过640 nm激光观察到的LD655-CMG共同移动。

尽量减少对DNA底物的损伤非常重要，因为单链DNA切口等损伤会减少可观察到的解旋事件数量，从而限制可收集的数据量（图6）。

图5：单分子DNA解链实验。 DNA底物被固定在盖玻片表面。将用LD655标记的纯化CMG在ATP-γ-S条件下与DNA孵育15分钟。随后加入ATP和用EGFP标记的纯化RPA，启动CMG介导的广泛DNA解链。左侧为示意图，右侧为代表性数据的延时成像图（kymograph）。请点击此处查看该图的放大版本。

图6：DNA损伤降低检测通量。（A）CMG无法解开DNA骨架断裂（DNA切口）之后的DNA。前导链模板上的切口会导致CMG从DNA上滑脱，CMG和前导链模板均丢失。滞后链模板上的切口会导致滞后链模板与其余DNA分离，每段DNA片段回缩至各自的锚定位点。此过程由（i）卡通示意图和（ii）这些事件的延时图像轨迹图（kymographs）展示。（B）轻微损伤的DNA底物与（C）更严重损伤的DNA底物在单个视野中的代表性数据，分别在（i）5分钟、（ii）15分钟和（iii）60分钟时采集。更严重损伤的DNA底物无法产生长片段的解链，因为CMG更早遇到切口，尽管解链活性水平相似（5分钟时RPA斑点增长密度相似，表明CMG加载/解链效率相似）。视野为512 × 512像素（像素大小 = 154.6 nm）。使用1%激光功率（488 nm）成像EGFP-RPA。比例尺显示为10 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

该实验提供了一个平台，可用于观察和研究单个CMG复合物在孤立状态以及在特定附加因子存在条件下的实时动态。然而，与许多单分子荧光技术一样，该方法也存在一些常见挑战，通常需要通过优化来克服。这些问题通常涉及长时间成像过程中荧光染料的稳定性（光漂白、亮度）、DNA底物的制备（DNA损伤）、流动池表面的质量（背景噪声、非特异性相互作用），或纯化蛋白样品的质量（核酸酶污染、标记效率）。

每种荧光染料在光稳定性和亮度上各不相同，因此选择合适的分子至关重要。在对荧光标记的寡聚蛋白（如RPA）进行成像时，由于多个荧光染料在相近位置被激发，可产生可见信号，因此可使用较低的激光功率。而对于单个荧光染料的成像（例如，在单一亚基上标记的CMG），则需要较高的激光功率才能清晰观察到荧光信号。通过减少激光照射时间（例如降低图像采集频率）可延长荧光染料的寿命。此外，激发荧光染料会产生活性氧（ROS），从而导致光漂白。在成像缓冲液中加入除氧系统可通过清除ROS来延长荧光染料的寿命。然而，某些除氧系统可能会影响pH¹²。

关于DNA底物的制备，关键在于尽量减少DNA损伤，例如切口或单链缺口。过度的损伤会阻碍DNA的充分解链，从而限制可收集的数据量。损伤可能来源于机械剪切、过度加热、核酸酶污染，或成像过程中产生的活性氧（ROS）。为减少剪切，应小心操作DNA样品，使用宽口吸头进行移液、缓慢移液，并 避免甩动样品。为减轻ROS的影响，可通过减少激光照射时间，或在成像缓冲液中添加除氧系统来实现。在DNA底物制备完成后，可在进行解链反应前使用商业化的DNA修复试剂盒对损伤进行修复。

DNA解旋的效率还取决于CMG的纯度和活性。建议在每一步纯化后通过SDS-PAGE电泳评估样品纯度，以确定需要优化的环节。如果在最后一步仍观察到过多杂质，可尝试调整CaptoHiRes Q (5/50)柱洗脱时所用的盐梯度体积。此外，必须彻底去除蛋白标记过程中过量的荧光肽，因其可能在盖玻片表面产生不良背景信号。避免核酸酶污染也至关重要，否则会导致DNA底物降解。实验结束后，可用SYTOX Orange对残留的DNA进行染色，以检测DNA是否发生显著降解。实验过程中一定程度的DNA损伤难以避免，但严重的损伤通常提示存在明显的核酸酶污染问题。

该检测方法本身受限于衍射极限光斑的分辨率，要求荧光蛋白之间相隔数百个碱基对（甚至更远），才能被区分为独立的信号点。这限制了对CMG进程及其相互作用细节的观察精度。

每次分析所观察到的解旋事件数量各不相同。对于一次成功的实验，我们期望在每个512×512像素的视野中（像素大小 = 154.6 nm）至少看到数条长度足够的RPA区段。同一次实验中可采集多个视野，以便在需要时获得更多数据。这些区段无需长度一致，也不必延伸至DNA末端才具有分析价值。例如，可通过在添加CMG之前测量SYTOX染色DNA的长度，来确定每次实验的平均拴系距离。只要解旋量足以使复制叉发生明显移动，即可利用该距离将“移动的微米数（µm traveled）”转换为“解旋的千碱基对数（kb unwound）”，从而估算任意RPA区段所对应的DNA解旋量。

CMG 在多种 DNA 底物上均表现出解旋活性，但必须在至少 30 个核苷酸长度的 polyT 突出端上提供一个游离的 3' DNA 末端，以容纳 CMG 的结合足迹¹⁰。在复制叉处引入多个生物素基团可确保牢固的表面锚定。其余的 DNA 底物可根据需要进行多种设计，例如包含不同的 DNA 序列、长度和化学修饰。通过使用不同浓度的乙酸镁可改变 DNA 的构象。在较高浓度（≥10 mM）乙酸镁条件下，RPA 包被的单链 DNA 纤维会发生压缩，导致在解旋过程中 RPA 的结合将 DNA 拉紧。这一特性具有实用价值，因为它可防止 DNA 过度移动，从而更准确地测量 CMG 的位置及解旋进程。而在较低浓度（约 3 mM）乙酸镁条件下，RPA-ssDNA 保持松弛状态。

所述的单分子检测方法提供了一个可扩展和改造的平台，用于进一步研究DNA复制的各个方面。在DNA复制过程中，CMG作为复制体及其组分组装的核心。因此，可以在该检测体系中加入其他纯化的蛋白质，包括TIMELESS、TIPIN和CLASPIN等辅助因子，以研究它们对CMG动态行为的影响。已有研究表明这些蛋白质会影响复制叉的移动速率¹³，但它们如何影响CMG解旋速率尚不清楚。因此，利用该检测方法研究不同复制体蛋白对CMG的影响将具有重要意义。如先前在酵母蛋白研究中所述¹⁴，加入DNA聚合酶可能有助于更深入地理解除DNA解旋之外的DNA复制过程。此外，纯化经过修饰的CMG有助于更好地理解特定突变或翻译后修饰如何影响解旋酶活性^15,16。另外，设计不同的DNA底物可使CMG介导的DNA解旋在多种模拟复制应激的条件下进行研究¹⁷。这些修饰包括DNA障碍物^9,18、链间交联^19,20,21以及DNA链中的断裂或不连续结构²²。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2-巯基乙醇	Sigma-Aldrich	M3148-25ML
丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液 40%	伯乐（BioRad）	1610148
Agarose UltraPure	Invitrogen	16500-500	用于配制 Tris 缓冲液（pH 8）
ÄKTA Pure	GE Healthcare	-	与组分收集器 F9-C 一起使用；蛋白纯化系统
ANTI-FLAG M2 亲和凝胶	Sigma-Aldrich	A2220
APS 10%	Sigma-Aldrich	A3678-25G
ATP（200 mM）	Sigma-Aldrich	A7699-5G
ATP-g-s（100 mM）	Sigma-Aldrich	11162306001
生物素-PEG 盖玻片	N/A	N/A	按如下方法制备：https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2012.03.033
生物素标记的抗地高辛抗体	Perkin Elmer	N/A
蓝丁胶	Bostik	N/A	粘性橡皮泥
硼酸	赛默飞世尔科技	B/3800/53
BSA；33 mg/mL	SIGMA-ALDRICH	A3858-10G	从原液稀释
CaCl2	Sigma-Aldrich	C7902
CaptoHiRes Q (5/50)	Cytiva	29275878	连接至AKTA蛋白纯化系统；高分辨率离子交换色谱柱
酪蛋白（水溶液，5%，50 mg/mL）	Sigma-Aldrich	C4765-10ML
ChemiDoc 系统	伯乐（Bio-Rad）	N/A
夹子	N/A	N/A
砧板	N/A	N/A
透析管（3.5 kDa）	Fisher Scientific	11425859
地高辛-11-dUTP	罗氏	11209256910
6× DNA上样缓冲液	NEB	B7024S
dNTP 10 mM	NEB	N0447S
双面胶带（0.14 mm 厚）	N/A	N/A
DTT	Fluorochem有限公司	M02712-10G
DYKDDDDK 肽	N/A	N/A	由弗朗西斯·克里克研究所化学生物学STP合成
EDTA	赛默飞世尔科技	D/0700/68
EGFP-RPA	N/A	N/A	纯化方法如所述 ‘单分子分析’《分子生物学方法系列》，第783卷（2011年），Peterman, E. J. G. 和 Wuite, G. J. L. 主编，Humana Press。蛋白质信息：2 mM，人源，于大肠杆菌中表达。
EGTA	Sigma-Aldrich	03779-10G
环氧树脂 - 5分钟	Devcon	20845
富士胶片 FLA-5000	富士胶片	FLA-5000	荧光图像分析仪
GelRed 核酸染料；10000 倍稀释液	剑桥生物科学	41003-BT	一种比溴化乙锭更安全的核酸染料示例。
带管孔的玻璃或石英载片	Dremel 型号 395		1 毫米厚的载玻片，裁剪为 2.4 厘米 × 1 厘米，钻两个相距 1.4 毫米的孔。两个孔应钻成不同大小，以适配两端不同的管路。
甘油	Fisher Scientific	G/0650/17
甘氨酸盐酸盐，pH 3.5	Sigma-Aldrich	G8898
哈密尔顿注射器，1000系列 GASTIGHT，PTFE鲁尔锁 1010TLL，带槽PTFE鲁尔锁，容积10 mL	默克	26211-U
HEPES pH 7.5	Sigma-Aldrich	H4034
I-CeuI	NEB	R0699L
KCl	Fisher Scientific	P/4280/53
乙酸镁	Sigma-Aldrich	M2545
Maxi GeBaFlex-tube 透析试剂盒；截留分子量 14 kDa	Generon	D055
金属刮勺	N/A	N/A
金属镊子	N/A	N/A
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2393
Millex-GP（注射器滤器）0.22 µm	默克	SLGP033RS
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
针	N/A	N/A
NotI-HF	NEB	R3189L
NuPAGE 4%–12% Bis-Tris 蛋白凝胶	赛默飞世尔科技	10247002;
NuPAGE MOPS SDS 电泳缓冲液	赛默飞世尔科技	NP0001
目标加热器	Okolab	N/A
PCR反应混合液 - 2倍浓度			由Phusion DNA聚合酶（20 µL），10 mM dNTPs（40 µL），5× Phusion HF 缓冲液（400 µ升）和水（540 µL)
肽 NH2-CHHHHHHHHHHLPETGG-COOH，标记 LD655-MAL	N/A	N/A	由弗朗西斯·克里克研究所肽化学技术平台（STP）合成并纯化的肽段 NH2-CHHHHHHHHHHLPETGG-COOH，在半胱氨酸残基上标记了 LD655-MAL（Lumidyne Technologies）
pGC261 质粒	N/A	N/A	https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.10.053
Phusion 高保真 DNA 聚合酶	NEB	M0530L
塑料镊子	N/A	N/A
聚乙烯管 PE20（内径 0.015”，外径 0.043”)	Becton Dickinson	427406
聚乙烯导管PE60（内径0.03”，外径 0.048”)	Becton Dickinson	427416
Poly-Prep 层析柱；10 ml 和 20 ml	伯乐（Bio-Rad）	7311550
谷氨酸钾（L-谷氨酸钾盐一水合物）	Sigma	G1501-1KG
蛋白酶抑制剂混合物（cOmplete，无EDTA）	罗氏	5056489001
Pump 11 Elite 注射/抽吸可编程单通道注射泵	哈佛仪器	70-4504
QIAquick PCR 纯化试剂盒	QIAGEN	28104
剃刀刀片	VWR International Ltd	233-0156
rCutSmart缓冲液；10倍浓缩液	NEB	B6004S
乙酸钠	赛默飞世尔科技	S/2120/53
分选酶（五重突变体）	N/A	N/A	纯化方法基于：https://doi.org/10.1073/pnas.1101046108
Spin-X 离心管滤器；0.22 µm 醋酸纤维素	Fisher Scientific	10310361
无菌手术刀	N/A	N/A
Steritop 真空驱动一次性过滤系统；0.22 μm；PES	Millipore	S2GPT05RE
链霉亲和素（1 mg/mL）溶于1× PBS缓冲液	Sigma	S4762-10MG	20 µL 等分试样
SYBR Gold	赛默飞世尔科技	S11494	我们使用高灵敏度核酸染料来可视化DNA复制叉底物。
SYTOX Orange；5 µM 在 DMSO 中	赛默飞世尔科技	S11368
T4 DNA连接酶	NEB	M0202M
T4 DNA连接酶反应缓冲液	NEB	B0202S
TEMED	Sigma-Aldrich	T9281-25ML
TEV蛋白酶（1 mg/mL）；EZCut	Biovision	7847-10000
Dounce型组织研磨器（40 mL，Wheaton）	DWK生命科学	432-1273
Tris 碱	Sigma-Aldrich	T1503	用于配制 Tris 缓冲液（pH 8）
Tris HCl	Sigma-Aldrich	T3253
Tween-20	普洛麦格（英国）有限公司	H5152