本文详细介绍了表征酶在人血清中于37 °C孵育时保持其功能能力的方法，这一药理学特性被称为血清稳定性。这种能力可能是预测酶的药代动力学特征及其是否适用于治疗用途的关键因素。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
酶稳定性的概念通常指酶的热稳定性，即酶在温度升高时保持其结构和活性的能力。对于治疗性酶而言，其他稳定性指标也可能至关重要，尤其是其在37 °C人血清中维持功能的能力，我们称之为血清稳定性。本文描述了一种 体外 评估野生型血清稳定性的检测方法 Homo sapiens 使用基于吸光度的微孔板法测定人腺苷脱氨酶I（HsADA1）酶活性。具体而言，本文描述了缓冲液和试剂的配制方法、HsADA1在血清中与样本共孵育的操作流程、利用微孔板读数仪分析测试样品的方法，以及相应的数据分析方法，用以确定HsADA1酶在血清中随时间变化所保留的活性比例。我们进一步讨论了将本方案拓展应用于其他酶类时需考虑的因素，并以一个实例加以说明 智人 犬尿氨酸酶，以帮助将该方案拓展适用于其他关注血清稳定性的酶。
引言
以下方法可让用户定量评估酶在暴露于模拟静脉注射后所遇条件时，保持其活性的能力。体外方法模拟了此类体内环境，包括将酶在37 °C下与混合人血清共同孵育，并在不同时间点分析酶活性的保留情况。我们将酶在这些条件下保持活性的能力称为其血清稳定性，而酶活性的分析方法则利用了酶底物与其反应产物在吸光度上的差异。血清稳定性的概念不仅适用于酶，也已应用于其他多种治疗方式。例如，此前通过监测RNA适配体在胎牛血清中孵育后的降解情况，评估了靶向新冠病毒刺突蛋白的RNA适配体的血清稳定性1。抗菌肽在与混合人血清孵育后抑制细菌生长的能力也已被评估2。
HsADA1 是一种催化腺苷或2-脱氧腺苷分别转化为肌苷或2-脱氧肌苷的酶3。腺苷在260 nm处有吸收峰，而肌苷在250 nm处的吸收最强4。当HsADA1加入腺苷后，可在酶标仪上通过260 nm处吸收强度的降低检测到吸收峰的这一变化。HsADA1酶在人体中具有重要意义，其缺乏会导致严重的联合免疫缺陷症（ADA-SCID）5。HsADA1的牛同源物BtADA1可作为酶替代疗法用于治疗ADA-SCID，我们先前已证明野生型HsADA1在与人混合血清孵育后会失去活性，这可能限制其作为治疗剂的应用6。因此，我们选择野生型HsADA1酶来演示测定酶在血清中稳定性的实验流程。HsADA1的详细纯化方法此前已有报道6。
在以下方案中（详见图1），我们演示了如何将野生型HsADA1与混合人血清在37 °C下共同孵育。在此期间，于规定时间点采集测试样品，并迅速冷冻以供后续分析。待所有样品采集完成后，进行微孔板检测，将每个样品与底物混合，通过检测吸光度的下降程度来反映酶活性的保留情况。本文展示了HsADA1在血清中稳定性的代表性结果。由于该指标可能与评估其他酶的潜在治疗价值相关，我们还讨论了将本方案适用于改造后的Homo sapiens犬尿氨酸酶（HsKYNase）及其他酶类时需考虑的因素。HsKYNase是一种参与色氨酸代谢的酶，能够将色氨酸代谢产物犬尿氨酸和羟基犬尿氨酸（OH-Kyn）分别降解为邻氨基苯甲酸和羟基邻氨基苯甲酸（OH-AA）。通过酶介导调控色氨酸代谢可能具有治疗意义7。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 血清孵育
- 在 1× PBS pH 7.4（1× PBS）中配制 HsADA1 的 10 倍储备液，终浓度为 10 µM。解冻 15 mL 混合人血清，并预热至 37 °C。同时将 50 mL 的 1× PBS 预热至 37 °C。
- 在低吸附微量离心管中，将 100 µL 的 10× HsADA1 储备液加入 900 µL 混合人血清中，制备酶-血清孵育混合液，记为“酶 + 血清”混合液。另取一支低吸附微量离心管，将 100 µL 的 10× HsADA1 储备液加入 900 µL 的 1× PBS 中，作为无血清对照，记为“酶 + 1× PBS”混合液。每种混合液中 HsADA1 的终浓度为 1 µM。
- 另设一个对照组：在低吸附微量离心管中，将 100 µL 的 1× PBS 与 900 µL 混合人血清混合，作为“酶 + 血清”混合液的无酶对照。此外，制备 1 mL 的 1× PBS 作为空白对照，作为“酶 + 1× PBS”混合液的无酶对照。
- 从步骤 1.2 中每种混合液取 100 µL 分装至不同的低吸附管中，加入 100 µL 含 30%（v/v）甘油的 1× PBS 进行 1:1 稀释。用液氮速冻后于 -80 °C 保存。这些样品为第 0 天时间点，其中 HsADA1 浓度为 500 nM。对步骤 1.3 中的无酶对照混合液重复此操作。用透明封膜密封所有酶液及对照混合液，置于 37 °C 培养箱中孵育。
- 孵育 24 小时后，取每种孵育样品 100 µL，加入 100 µL 含 30%（v/v）甘油的 1× PBS 进行 1:1 稀释。用液氮速冻后于 -80 °C 保存。这些样品为第 1 天时间点。将所有酶液及对照混合液重新放回 37 °C 培养箱继续孵育。分别在 72 小时和 120 小时重复此步骤。
注意：分装后的样品不一定需要速冻。用户也可在取样后立即进行基于微孔板的检测，但每次检测时均需重新配制新鲜的标准曲线和腺苷底物储备液。
2. 基于微孔板的检测方法
- 通过设置动力学读数程序（图2）来准备酶标仪，以最短读数间隔在260 nm波长下连续测定吸光度30分钟，并将酶标仪预热至37 °C。
- 将所有收集的样品在冰上解冻。使用预热至37 °C的1×PBS作为稀释液，在低吸附微量离心管中将每个解冻后的样品按1:10比例稀释。这些样品中的HsADA1终浓度为50 nM。
- 同样将非酶血清对照样品用1×PBS进行10倍稀释。此外，通过将66.8 mg腺苷加入50 mL的1×PBS中配制5 mM腺苷储备液。取400 µL腺苷储备液加入7,600 µL的1×PBS中，配制成250 µM的腺苷稀释液，并在培养箱中预热至37 °C。
- 向96孔紫外兼容微孔板中，每孔加入160 µL的250 µM腺苷稀释液和40 µL稀释后的蛋白样品，每个样本设三个复孔，总体积为200 µL。此步骤中腺苷的终浓度为200 µM，酶的终浓度为10 nM。
- 对对照样品重复稀释操作：每孔加入40 µL稀释后的血清或1×PBS对照样品以及160 µL的250 µM腺苷稀释液，设三个复孔。此步骤中腺苷终浓度同样为200 µM，但不含酶。
注意：建议先将所有稀释后的酶样品和对照样品单独加入微孔板中，再使用12通道移液器加入腺苷底物，以缩短总加样时间。此外，本步骤必须使用紫外透光板，以避免微孔板本身干扰吸光度信号的测定。 - 在37 °C条件下，连续30分钟测定各孔在260 nm处的吸光度。完成后，将数据导出至电子表格进行后续分析。
3. 微孔板读数仪数据的分析
- 确定微孔板数据在最初几分钟内吸光度数据随时间变化的线性区域斜率。对于血清稀释的样品，对应前约 120 秒；对于 1x PBS 稀释的样品，对应前约 270 秒。该吸光度下降的斜率将为负值，单位为每秒吸光度单位的变化（ΔA260/s）。
- 从酶 + 血清数据的斜率中减去由混合人血清组成的阴性对照的斜率。对酶 + 1x PBS 混合物进行相同操作，即减去 1x PBS 对照的斜率。
- 将所有校正后的斜率归一化至 t=0 h 时的原始斜率，使用公式 1 计算剩余活性分数。
公式 1 - 绘制剩余活性分数随时间变化的曲线。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
图中显示了使用野生型 HsADA1 进行检测时得到的结果。图 3A、B 展示了在向野生型 HsADA1 的 1× PBS/血清-酶混合物样品中加入腺苷后，其在 260 nm 处的吸光度随时间下降的曲线。这种随时间变化的吸光度下降数据是用户在成功完成基于微孔板的检测后可预期的结果，与向腺苷中加入足量功能性 HsADA1 后所产生的吸光度数据相似。图 3C、D 展示了阴性对照组的吸光度曲线，这些对照组在加入腺苷后不含任何酶。与实际的酶样品相比，这些阴性对照组的吸光度变化几乎可以忽略不计。从图 3可以看出，酶反应曲线的斜率随孵育时间而变化。例如，第 0 天时间点的斜率明显比第 5 天时间点的斜率更陡峭。
图4展示了野生型HsADA1在37 °C下分别于1×PBS或混合人血清中孵育时，其...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本实验方案通过检测底物转化为产物过程中吸光度的变化来评估酶的活性。因此，底物和产物必须具有不同的光谱特征。腺苷和肌苷在260–265 nm波长范围内的光谱特征和消光系数均明显不同，符合这一要求6,8,12,13。本检测方法受到多项前期研究的启发。例如，Kalackar 利用265 nm处吸光度的变化作为腺苷脱氨酶活性的直接指标14。Gracia 等人和 Lu 等人则采用基于比尔-朗伯定律的方法，将初始反应速率与腺苷和肌苷之间消光系数的差异相关联8,13。类似地，OH-Kyn 和 OH-AA 也具有不同的光谱特征：OH-Kyn 在379 nm处有强吸收，而 OH-AA 则无明显吸收9
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
JB 和 MRJ 是与腺苷脱氨酶和/或犬尿氨酸酶相关的专利或专利申请的发明人。其余所有作者均无利益冲突需要披露。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院 [1DP2CA280622-01] 和 Biolocity 资助支持。我们感谢 Maria Jennings 博士和 Andrea Fox 提供 HsADA1 和 HsKYNase 表达载体。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 腺苷 | Sigma Aldrich | A9251-25G | 25 g |
| BioTek Synergy HT 微孔板读板仪 | |||
| Eppendorf LoBind 微量离心管：蛋白级 | 菲舍尔科技 | 13-698-795 | 2 mL |
| 甘油 | 菲舍尔科技 | G33-4 | 4 L |
| HsKYNase66-W102H-T333N | 本实验室制备 | ||
| 人混合血清 | MP Biomedicals | 92931149 | 100 mL |
| 羟基犬尿氨酸 | Cayman Chemicals | 27778 | |
| 肌苷 | TCI | I0037 | 25 g |
| PBS，1× pH 7.4±0.1 | Corning | 21-040-CM | |
| 5'-磷酸吡哆醛一水合物，99% | Thermo Scientific | 228170010 | 1 g |
| UV-STAR 微孔板，96 孔，COC 材质，平底 | Greiner Bio | 655801 | |
| 野生型人腺苷脱氨酶1 | 本实验室制备 |
参考文献
- Valero, J., et al. A serum-stable RNA aptamer specific for SARS-COV-2 neutralizes viral entry. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (50), e2112942118(2021).
- Iannuzo, N., et al. High-throughput screening identifies synthetic peptides with antibacterial activity against mycobacterium abscessus and serum stability. ACS Omega. 7 (27), 23967-23977 (2022).
- Ma, M. T., Jennings, M. R., Blazeck, J., Lieberman, R. L. Catalytically active holo homo sapiens adenosine deaminase i adopts a closed conformation. Acta Crystallograph Sect D. 78 (1), 91-103 (2022).
- Li, W., et al. Determination of 4 nucleosides via one reference compound in chinese cordyceps by hplc-uv at equal absorption wavelength. Natural Prod Comm. 18 (3), 1934578X231161410(2023).
- Whitmore, K. V., Gaspar, H. B. Adenosine deaminase deficiency - more than just an immunodeficiency. Front Immunol. 7, 314(2016).
- Jennings, M. R., et al. Optimized expression and purification of a human adenosine deaminase in E. coli and characterization of its asp8asn variant. Prot Express Purificat. 213, 106362(2024).
- Blazeck, J., et al. Bypassing evolutionary dead ends and switching the rate-limiting step of a human immunotherapeutic enzyme. Nat Catalysis. 5 (10), 952-967 (2022).
- Lu, J., Grenache, D. G. Development of a rapid, microplate-based kinetic assay for measuring adenosine deaminase activity in body fluids. Clinica Chimica Acta. 413 (19), 1637-1640 (2012).
- Maciel, L. G., Dos Anjos, J. V., Soares, T. A. Fast and low-cost evaluation of hydroxykynurenine activity. MethodsX. 7, 100982(2020).
- Bokman, A. H., Schweigert, B. S. 3-hydroxyanthranilic acid metabolism. Iv. Spectrophotometric evidence for the formation of an intermediate. Arch Biochem Biophys. 33 (2), 270-276 (1951).
- Tanford, C. Advances in protein chemistry. 23, Academic Press. 121-282 (1968).
- Tritsch, G. L. Validity of the continuous spectrophotometric assay of kalckar for adenosine deaminase activity. Anal Biochem. 129 (1), 207-209 (1983).
- Gracia, E., et al. The catalytic site structural gate of adenosine deaminase allosterically modulates ligand binding to adenosine receptors. FASEB J. 27 (3), 1048-1061 (2013).
- Kalckar, H. M. Differential spectrophotometry of purine compounds by means of specific enzymes: Iii. Studies of the enzymes of purine metabolism. J Bio Chem. 167 (2), 461-475 (1947).
- Hartwick, R., Jeffries, A., Krstulovic, A., Brown, P. R. An optimized assay for adenosine deaminase using reverse phase high pressure liquid chromatography. J Chromatographic Sci. 16 (9), 427-435 (1978).
- Paul, M. K., Grover, V., Mukhopadhyay, A. K. Merits of hplc-based method over spectrophotometric method for assessing the kinetics and inhibition of mammalian adenosine deaminase. J Chromatography B. 822 (1), 146-153 (2005).
- Ubbink, J. B., Vermaak, W. J. H., Bissbort, S. H. High-performance liquid chromatographic assay of human lymphocyte kynureninase activity levels. J Chromatography B: Biomed Sci Appl. 566 (2), 369-375 (1991).
- Tsentalovich, Y. P., Snytnikova, O. A., Forbes, M. D. E., Chernyak, E. I., Morozov, S. V. Photochemical and thermal reactivity of kynurenine. Exp Eye Res. 83 (6), 1439-1445 (2006).
- Demain, A. L., Vaishnav, P. Production of recombinant proteins by microbes and higher organisms. Biotechnol Adv. 27 (3), 297-306 (2009).
- Gräslund, S., et al. Protein production and purification. Nat Methods. 5 (2), 135-146 (2008).
- Faber, M. S., Whitehead, T. A. Data-driven engineering of protein therapeutics. Curr Opin Biotechnol. 60, 104-110 (2019).
- Das, S., Zhao, L., Elofson, K., Finn, M. G. Enzyme stabilization by virus-like particles. Biochemistry. 59 (31), 2870-2881 (2020).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
