的 果蝇 眼睛系统是研究多种生物过程（尤其是人类神经退行性疾病）的有用工具。然而，人工量化粗糙的眼表型可能存在偏差且不可靠。本文介绍一种利用ilastik和Flynotyper无偏量化眼表型的方法。
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方法文章
量化 Drosophila melanogaster 眼部表型：整合 ilastik 与 Flynotyper 的计算方法
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
Drosophila melanogaster 复眼是由约800个小眼组成的结构良好且完整的阵列，呈现出对称的六边形排列。这种规律性和易于观察的特性使 Drosophila 眼部系统成为模拟多种人类神经退行性疾病的有效工具。然而，现有的表型量化方法（如通过人工对眼睛严重程度评分进行排序）存在局限性，尤其是在评估眼部形态的微弱改变时。为克服这些局限性，已开发出诸如 Flynotyper 等计算方法。使用环形光源可以获得更高质量的图像，从而便于评估单个小眼的完整性。然而，由于环形光源会在小眼上产生阴影，这类图像无法被 Flynotyper 直接分析。本文介绍了一种结合 ilastik 和 Flynotyper 两种软件的无偏方法，用于量化在 Drosophila 疾病模型中观察到的粗糙眼表型。通过使用 ilastik 对图像进行预处理，即可成功利用 Flynotyper 实现对粗糙眼表型的定量分析。
引言
Drosophila melanogaster 基因组包含约 75% 的人类疾病相关基因直系同源物。此外，在 Drosophila 眼部发育过程中，基因组中约三分之二的基因会表达，这使得 Drosophila 眼成为一个优异的遗传系统，可用于研究多种分子和细胞功能、发育过程以及疾病模型1,2。因此，Drosophila 眼系统是研究各种生物学过程的有用实验工具。
Drosophila 复眼是由约800个小眼（ommatidia）组成的结构精密且完整的阵列，呈现出对称的六边形排列模式3。这种六边形排列的规则性可用于评估引入突变或基因表达改变对眼睛形态所产生的影响4。以往需要评估眼睛形态的研究主要依赖于通过肉眼观察，对手动分级判断眼表型严重程度。为了对眼表型进行分级，需使用体视显微镜获取外部眼睛形态的图像5,6。通过将外部眼睛划分为四个区域，并计算每个区域的退化比例，来评估每组果蝇的眼表型5,6。然后利用这些数值计算平均值，并与对照组果蝇获得的数值进行比较7。评分依据包括小眼融合程度、小眼丢失情况以及刚毛排列的有序性7,8。使用体视显微镜拍摄的果蝇眼睛照片由一名研究人员采集，而眼表型分析则由另一名研究人员完成，并采用三重验证数据集进行验证7,8。
通过肉眼对眼睛形态的微弱改变进行排序时，存在一定的局限性4。为了克服这些局限性，已开发出诸如 FLEYE 和 Flynotyper 等计算方法1,9。Flynotyper 是一种用于定量评估黑腹果蝇（Drosophila）眼部系统形态变化的新型计算方法1。该方法可自动识别Drosophila的眼睛及单个 facets（小眼），并根据眼部的不规则程度计算表型评分（P-Score）1。P-Score 越高，表明果蝇眼睛的退化程度越严重。该软件已成功用于量化Drosophila眼睛的异常程度10。尽管 Flynotyper 实现了自动化分析，但在某些由不同光学显微镜方法拍摄的眼部图像上仍无法成功应用。
定性而言，与单点光源相比，我们更倾向于使用环形光源，因为它能更准确地呈现每个小眼的形态。然而，当使用环形光源时，由于小眼呈半球形，会在每个小眼的顶部产生一个环形阴影。这种环形阴影会干扰Flynotyper对小眼的准确识别，导致P-Score计算错误。
为解决这些问题，我们采用了ilastik这一基于机器学习的工具，对果蝇眼部图像中的小眼进行分类分析11。随后，我们将ilastik生成的图像输入Flynotyper以计算P值。该方法使我们能够无偏倚地量化Drosophila果蝇眼部的形态学缺陷1。
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方案
1. 准备定量分析
- 下载并安装 ilastik11、ImageJ 以及 ImageJ 插件 Flynotyper1。有关安装的网站链接，请参见材料表。根据计算机操作系统（Mac、Windows、Linux 等）下载相应的安装包，并严格按照所提供的说明进行安装。
注意：必须严格遵循链接中所述的安装说明。所使用的计算机需配备 64 位操作系统；除此之外无其他特殊配置要求。有关本实验方案所用系统的计算机配置，请参见材料表。 - 使用标准图像训练机器学习模型。利用带有环形光源的光学显微镜（例如 w1118 × GMR-GAL4），以果蝇复眼中心为焦点，拍摄健康果蝇眼睛的图像。雄性和雌性应分别分析，因此需分别为雄性和雌性获取标准图像。
注意：显微镜和相机的设置可能差异较大。有关果蝇样本制备和图像采集的一般性信息，请参见讨论部分的第二段。 - 使用与标准图像采集相同的设置，拍摄实验组果蝇眼睛的图像。
注意：良好的图像方向对准确量化至关重要。正确的方向示例请参见图 4。
2. 使用 ilastik 从果蝇眼睛图像中检测小眼
- 开始分析前，请确保所有实验组（无论实验条件如何）均位于同一文件夹中，以便简化后续操作流程。请确保文件命名恰当，能够识别实验分组，并区分雄性和雌性个体。
注意： 建议打印本实验方案，并在计算机上放大查看图示，以便更直观地跟随操作步骤。 - 打开软件。
注意： 运行软件时，建议不要同时打开其他应用程序；否则，计算机运行速度可能会显著降低，尤其是在较旧或性能较弱的系统上。 - 点击 创建新项目 | 其他工作流程，选择 细胞密度计数，并选择保存项目文件的位置（图1A）。
- 点击 1. 输入数据 | 添加新数据 | 添加独立图像(s)，选择标准图像（图1B）。
- 点击 2. 特征选择 并选择要使用的特征。选择 图1C 中所示的特征；增加 sigma 值的数量可提高灵敏度（例如 10、15、20 等）。
注意：若选中过多选项，程序运行时间可能会显著延长。 - 点击 3. 计数，将 前景 sigma 值设置为 5.00。在标准图像上使用 前景 工具标记 50 个或更多单个小眼。
注意： 通常标记 50 个已足以用于分析；但标记的小眼数量越多，结果越准确（图1D）。 - 点击 3. 计数 ，使用 背景 工具标记小眼外部区域（图1E）。在小眼周围以网格状绘制绿色线条。
注意：与增加小眼标记数量类似，绘制的绿色线条越多，结果越准确。 - 点击 4. 密度导出 | 选择导出图像设置 以设定图像参数（图1F）。点击 输出文件信息 | 选择 格式 为 tif ，以便在 Flynotyper 中进行后续分析。
- 点击 5. 批量处理 | 选择原始数据文件，选择所有待分析的果蝇照片（图1G）。导入的待分析图像列表将显示在 选择原始数据文件 下方（图1H）。点击 处理所有文件 按钮，位于 5. 批量处理 部分的底部。
注意：请再次确认，雄性和雌性样本应分别进行分析。根据所用计算机性能，此步骤可能需要 10 分钟或更长时间，尤其是当导入图像数量较多时。 - 软件运行完成后，检查存放实验果蝇眼部图像的同一文件夹；其中将出现名为 "YourSampleName_Probabilities" 的黑色图像（图1I）。
3. 使用 ImageJ 为 Flynotyper 准备照片
- 在 ImageJ 中打开 ilastik 生成的 .tif 文件（黑色方框）。
注意： 每个 ilastik 生成的 .tif 文件都需要单独处理。 - 使用矩形选择工具在眼睛周围绘制一个矩形。绘制完成后，通过选择Ctrl + X或Ctrl + C来裁剪该区域（图 2A）。等待一个与矩形轮廓形状相同的黑色方框出现。
注意： 使用“Ctrl + X”还是“Ctrl + C”取决于计算机的操作系统。通常，“Ctrl + X”用于 Windows 系统，“Ctrl + C”用于 Mac 系统。 - 使用 ImageJ 打开已裁剪的果蝇眼睛图像；点击文件 | 新建 | 内部剪贴板（图 2B）。
- 通过点击文件 | 另存为 | JPEG将裁剪后的果蝇眼睛图像保存为 JPEG 格式。裁剪后的图像现在位于与原始实验图像相同的文件夹中。
注意：为了便于下一步操作，建议创建一个名为“cut”的新文件夹，并将所有裁剪后的图像放入该文件夹中。
4. 使用 Flynotyper 计算表型评分
- 通过点击 插件 | Flynotyper 作为 ImageJ 插件打开 Flynotyper。
- 选择 添加基因型 ，然后打开包含切割后果蝇眼睛图像的文件夹（切割文件文件夹）。文件夹名称将显示在 基因型 下方（图 2C）。
- 勾选 光学显微镜 和 垂直方向 选项，但可根据需要进行调整。在 小眼排序依据： 下方，勾选 稳定性 和 距中心距离 选项（图 2C）。
- 对于 考虑排序的小眼数量，输入 200。
注意：通常情况下， 200 是一个合适的数值，但可根据偏好适当调整。 - 点击 运行 ，并等待分析结果出现（图 2D）。
注意：此步骤可能需要 5 分钟或更长时间（或更短），具体取决于所用计算机的处理能力。 - 将 样本文件 和 P 值 复制并粘贴到统计软件中以进行进一步分析。
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结果
在之前的一项研究中，我们采用该方案确定了与额颞叶痴呆型肌萎缩侧索硬化症（ALS-FTD）相关的突变VCP蛋白的遗传修饰因子12。此外，该方法还在另一项研究中用于评估CHCHD10S59L介导的ALS-FTD的毒性，即使使用较旧的体视显微镜也获得了有效结果13。为进一步验证这些结果，我们在Baek等人13所用的同一ALS-FTD疾病突变模型中应用了ilastik和Flynotyper；实验由未经专门培训的实验室人员操作，仍获得了相似的结果。因此，联合使用ilastik与Flynotyper是一种对Drosophila 小眼结构退变进行无偏评分的稳健方法。
我们更倾向于使用环形光源，因为它能够实现更佳的定性评估（图3）。然而，使用环形光源会产生阴影，Flynotyper 无法直接分析此类图像。为克服这一问题，我们在使用 Flynotyper 量化...
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讨论
Drosophila的小眼是研究多种生物学功能和遗传疾病的有用体系。小眼排列的规则性是检测基因突变效应的良好指标4。尽管目前已有一些计算小眼规则性的方法，例如人工评分，但这些方法可能存在较大偏倚。为克服这种主观偏倚，已开发出半自动化的分析工具1,11。
为实现准确的眼部定量，必须优化果蝇的制备与实验设置。尽管我们理解每个实验室可能有不同的配置，但在此提供我们实验室的设置方案，以帮助读者了解如何准备果蝇用于图像采集。果蝇被冷冻并储存在 -80 °C 条件下。我们采用的样本量为 3，因为根据我们的经验，当 GMR-GAL4 与 S81L 突变组合时，群体间的变异极小。然而需注意，样本量应根据需要进行调整，以进行零假设显著性检验。为将果蝇固定用于图像采集，果蝇头部置于一张极小的纸片上作为支撑，使眼睛中心大致位于显微镜的焦平面（补充图 S1）。我们实验室使用带有 Z 轴层扫功...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢Pedro Fernandez-Funez提供本方案中所使用的显微镜和相机。我们还要感谢Ava Schapman对本方案清晰度提供的反馈意见。Nam Chul Kim获得了Wallin神经科学发现基金的经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 计算机配置 | Ryzen 5, 16 GB RAM, Nvidia RTX 3070 Super, Windows 10 | ||
| Flynotyper | Iyer, J. et al. (2016) | 在此下载软件：https://flynotyper.sourceforge.net/imageJ.html | 开源软件。请勿使用 Flynotyper 2.0。在本出版物撰写时，2.0 版本较新，而本实验方案针对 Flynotyper 的原始版本进行了优化。 |
| ilastik | Berg, S. et al. (2019) | 在此下载软件：https://www.ilastik.org/download.html | 开源软件。请在 Regular Builds 下载与您计算机操作系统对应的版本 1.4.0.post1。 |
| ImageJ | 在此下载软件：https://imagej.net/ij/download.html | 开源软件。本研究使用了版本 1.53 和 1.54。1.54 为更新版本，也是默认下载版本。 | |
| Leica Application Suite (LAS X) | Leica Microsystems | LASX Office 1.4.6 28433 | 用于获取 z-stack 图像的系统与软件。 |
| 配备 DMC2900 相机的 Leica Z16 APO 显微镜 | Leica Microsystems | 10 447 173, 12 730 466 | 文中简称为 z-stack 显微镜和相机。该产品现已归档。 |
参考文献
- Iyer, J., et al. Quantitative assessment of eye phenotypes for functional genetic studies using Drosophila melanogaster. G3. 6 (5), 1427-1437 (2016).
- Thomas, B. J., Wassarman, D. A. A fly's eye view of biology. Trends Genet. 15 (5), 184-190 (1999).
- Roignant, J. -Y., Treisman, J. E. Pattern formation in the Drosophila eye disc. Int J Dev Biol. 53 (5-6), 795-804 (2009).
- Diez-Hermano, S., Ganfornina, M. D., Vegas, E., Sanchez, D. Machine learning representation of loss of eye regularity in a Drosophila neurodegenerative model. Front Neurosci. 14 (1), 1-14 (2020).
- Appocher, C., Klima, R., Feiguin, F. Functional screening in Drosophila reveals the conserved role of REEP1 in promoting stress resistance and preventing the formation of Tau aggregates. Hum Mol Genet. 23 (25), 6762-6772 (2014).
- Pandey, U. B., et al. HDAC6 rescues neurodegeneration and provides an essential link between autophagy and the UPS. Nature. 447 (7146), 860-864 (2007).
- Outa, A. A., et al. Validation of a Drosophila model of wild-type and T315I mutated BCR-ABL1 in chronic myeloid leukemia: an effective platform for treatment screening. Haematologica. 105 (2), 387-397 (2019).
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- Diez-Hermano, S., Valero, J., Rueda, C., Ganfornina, M. D., Sanchez, D. An automated image analysis method to measure regularity in biological patterns: a case study in a Drosophila neurodegenerative model. Mol Neurodegener. 10 (1), 1-10 (2015).
- Yusuff, T., et al. Drosophila models of pathogenic copy-number variant genes show global and non-neuronal defects during development. PLoS Genet. 16 (6), e1008792-e1008792 (2020).
- Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nat Methods. 16, 1226-1232 (2019).
- Chalmers, M. R., Kim, J., Kim, N. C. Eip74EF is a dominant modifier for ALS-FTD-linked VCPR152H phenotypes in the Drosophila eye model. BMC Res Notes. 16 (1), 1-5 (2023).
- Baek, M., et al. TDP-43 and PINK1 mediate CHCHD10S59L mutation-induced defects in Drosophila and in vitro. Nat Commun. 12 (1), 1-20 (2021).
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重印与许可
