的 果蝇 眼睛系统是研究多种生物过程（尤其是人类神经退行性疾病）的有用工具。然而，人工量化粗糙的眼表型可能存在偏差且不可靠。本文介绍一种利用ilastik和Flynotyper无偏量化眼表型的方法。
方法文章
量化 Drosophila melanogaster 眼部表型：整合 ilastik 与 Flynotyper 的计算方法
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
Drosophila melanogaster 复眼是由约800个小眼组成的结构良好且完整的阵列，呈现出对称的六边形排列。这种规律性和易于观察的特性使 Drosophila 眼部系统成为模拟多种人类神经退行性疾病的有效工具。然而，现有的表型量化方法（如通过人工对眼睛严重程度评分进行排序）存在局限性，尤其是在评估眼部形态的微弱改变时。为克服这些局限性，已开发出诸如 Flynotyper 等计算方法。使用环形光源可以获得更高质量的图像，从而便于评估单个小眼的完整性。然而，由于环形光源会在小眼上产生阴影，这类图像无法被 Flynotyper 直接分析。本文介绍了一种结合 ilastik 和 Flynotyper 两种软件的无偏方法，用于量化在 Drosophila 疾病模型中观察到的粗糙眼表型。通过使用 ilastik 对图像进行预处理，即可成功利用 Flynotyper 实现对粗糙眼表型的定量分析。
引言
Drosophila melanogaster 基因组包含约 75% 的人类疾病相关基因直系同源物。此外，在 Drosophila 眼部发育过程中，基因组中约三分之二的基因会表达，这使得 Drosophila 眼成为一个优异的遗传系统，可用于研究多种分子和细胞功能、发育过程以及疾病模型1,2。因此，Drosophila 眼系统是研究各种生物学过程的有用实验工具。
Drosophila 复眼是由约800个小眼（ommatidia）组成的结构精密且完整的阵列，呈现出对称的六边形排列模式3。这种六边形排列的规则性可用于评估引入突变或基因表达改变对眼睛形态所产生的影响4。以往需要评估眼睛形态的研究主要依赖于通过肉眼观察，对手动分级判断眼表型严重程度。为了对眼表型进行分级，需使用体视显微镜获取外部眼睛形态的图像5,6。通过将外部眼睛划分为四个区域，并计算每个区域的退化比例，来评估每组果蝇的眼表型5,6。然后利用这些数值计算平均值，并与对照组果蝇获得的数值进行比较7。评分依据包括小眼融合程度、小眼丢失情况以及刚毛排列的有序性7,8。使用体视显微镜拍摄的果蝇眼睛照片由一名研究人员采集，而眼表型分析则由另一名研究人员完成，并采用三重验证数据集进行验证7,8。
通过肉眼对眼睛形态的微弱改变进行排序时，存在一定的局限性4。为了克服这些局限性，已开发出诸如 FLEYE 和 Flynotyper 等计算方法1,9。Flynotyper 是一种用于定量评估黑腹果蝇（Drosophila）眼部系统形态变化的新型计算方法1。该方法可自动识别Drosophila的眼睛及单个 facets（小眼），并根据眼部的不规则程度计算表型评分（P-Score）1。P-Score 越高，表明果蝇眼睛的退化程度越严重。该软件已成功用于量化Drosophila眼睛的异常程度10。尽管 Flynotyper 实现了自动化分析，但在某些由不同光学显微镜方法拍摄的眼部图像上仍无法成功应用。
定性而言，与单点光源相比，我们更倾向于使用环形光源，因为它能更准确地呈现每个小眼的形态。然而，当使用环形光源时，由于小眼呈半球形，会在每个小眼的顶部产生一个环形阴影。这种环形阴影会干扰Flynotyper对小眼的准确识别，导致P-Score计算错误。
为解决这些问题，我们采用了ilastik这一基于机器学习的工具，对果蝇眼部图像中的小眼进行分类分析11。随后，我们将ilastik生成的图像输入Flynotyper以计算P值。该方法使我们能够无偏倚地量化Drosophila果蝇眼部的形态学缺陷1。
方案
1. 准备定量分析
- 下载并安装 ilastik11、ImageJ 以及 ImageJ 插件 Flynotyper1。有关安装的网站链接，请参见材料表。根据计算机操作系统（Mac、Windows、Linux 等）下载相应的安装包，并严格按照所提供的说明进行安装。
注意：必须严格遵循链接中所述的安装说明。所使用的计算机需配备 64 位操作系统；除此之外无其他特殊配置要求。有关本实验方案所用系统的计算机配置，请参见材料表。 - 使用标准图像训练机器学习模型。利用带有环形光源的光学显微镜（例如 w1118 × GMR-GAL4），以果蝇复眼中心为焦点，拍摄健康果蝇眼睛的图像。雄性和雌性应分别分析，因此需分别为雄性和雌性获取标准图像。
注意：显微镜和相机的设置可能差异较大。有关果蝇样本制备和图像采集的一般性信息，请参见讨论部分的第二段。 - 使用与标准图像采集相同的设置，拍摄实验组果蝇眼睛的图像。
注意：良好的图像方向对准确量化至关重要。正确的方向示例请参见图 4。
2. 使用 ilastik 从果蝇眼睛图像中检测小眼
- 开始分析前，请确保所有实验组（无论实验条件如何）均位于同一文件夹中，以便简化后续操作流程。请确保文件命名恰当，能够识别实验分组，并区分雄性和雌性个体。
注意： 建议打印本实验方案，并在计算机上放大查看图示，以便更直观地跟随操作步骤。 - 打开软件。
注意： 运行软件时，建议不要同时打开其他应用程序；否则，计算机运行速度可能会显著降低，尤其是在较旧或性能较弱的系统上。 - 点击 创建新项目 | 其他工作流程，选择 细胞密度计数，并选择保存项目文件的位置（图1A）。
- 点击 1. 输入数据 | 添加新数据 | 添加独立图像(s)，选择标准图像（图1B）。
- 点击 2. 特征选择 并选择要使用的特征。选择 图1C 中所示的特征；增加 sigma 值的数量可提高灵敏度（例如 10、15、20 等）。
注意：若选中过多选项，程序运行时间可能会显著延长。 - 点击 3. 计数，将 前景 sigma 值设置为 5.00。在标准图像上使用 前景 工具标记 50 个或更多单个小眼。
注意： 通常标记 50 个已足以用于分析；但标记的小眼数量越多，结果越准确（图1D）。 - 点击 3. 计数 ，使用 背景 工具标记小眼外部区域（图1E）。在小眼周围以网格状绘制绿色线条。
注意：与增加小眼标记数量类似，绘制的绿色线条越多，结果越准确。 - 点击 4. 密度导出 | 选择导出图像设置 以设定图像参数（图1F）。点击 输出文件信息 | 选择 格式 为 tif ，以便在 Flynotyper 中进行后续分析。
- 点击 5. 批量处理 | 选择原始数据文件，选择所有待分析的果蝇照片（图1G）。导入的待分析图像列表将显示在 选择原始数据文件 下方（图1H）。点击 处理所有文件 按钮，位于 5. 批量处理 部分的底部。
注意：请再次确认，雄性和雌性样本应分别进行分析。根据所用计算机性能，此步骤可能需要 10 分钟或更长时间，尤其是当导入图像数量较多时。 - 软件运行完成后，检查存放实验果蝇眼部图像的同一文件夹；其中将出现名为 "YourSampleName_Probabilities" 的黑色图像（图1I）。
3. 使用 ImageJ 为 Flynotyper 准备照片
- 在 ImageJ 中打开 ilastik 生成的 .tif 文件（黑色方框）。
注意： 每个 ilastik 生成的 .tif 文件都需要单独处理。 - 使用矩形选择工具在眼睛周围绘制一个矩形。绘制完成后，通过选择Ctrl + X或Ctrl + C来裁剪该区域（图 2A）。等待一个与矩形轮廓形状相同的黑色方框出现。
注意： 使用“Ctrl + X”还是“Ctrl + C”取决于计算机的操作系统。通常，“Ctrl + X”用于 Windows 系统，“Ctrl + C”用于 Mac 系统。 - 使用 ImageJ 打开已裁剪的果蝇眼睛图像；点击文件 | 新建 | 内部剪贴板（图 2B）。
- 通过点击文件 | 另存为 | JPEG将裁剪后的果蝇眼睛图像保存为 JPEG 格式。裁剪后的图像现在位于与原始实验图像相同的文件夹中。
注意：为了便于下一步操作，建议创建一个名为“cut”的新文件夹，并将所有裁剪后的图像放入该文件夹中。
4. 使用 Flynotyper 计算表型评分
- 通过点击 插件 | Flynotyper 作为 ImageJ 插件打开 Flynotyper。
- 选择 添加基因型 ，然后打开包含切割后果蝇眼睛图像的文件夹（切割文件文件夹）。文件夹名称将显示在 基因型 下方（图 2C）。
- 勾选 光学显微镜 和 垂直方向 选项，但可根据需要进行调整。在 小眼排序依据： 下方，勾选 稳定性 和 距中心距离 选项（图 2C）。
- 对于 考虑排序的小眼数量，输入 200。
注意：通常情况下， 200 是一个合适的数值，但可根据偏好适当调整。 - 点击 运行 ，并等待分析结果出现（图 2D）。
注意：此步骤可能需要 5 分钟或更长时间（或更短），具体取决于所用计算机的处理能力。 - 将 样本文件 和 P 值 复制并粘贴到统计软件中以进行进一步分析。
结果
在之前的一项研究中，我们采用该方案确定了与额颞叶痴呆型肌萎缩侧索硬化症（ALS-FTD）相关的突变VCP蛋白的遗传修饰因子12。此外，该方法还在另一项研究中用于评估CHCHD10S59L介导的ALS-FTD的毒性，即使使用较旧的体视显微镜也获得了有效结果13。为进一步验证这些结果，我们在Baek等人13所用的同一ALS-FTD疾病突变模型中应用了ilastik和Flynotyper；实验由未经专门培训的实验室人员操作，仍获得了相似的结果。因此，联合使用ilastik与Flynotyper是一种对Drosophila 小眼结构退变进行无偏评分的稳健方法。
我们更倾向于使用环形光源，因为它能够实现更佳的定性评估（图3）。然而，使用环形光源会产生阴影，Flynotyper 无法直接分析此类图像。为克服这一问题，我们在使用 Flynotyper 量化 P-Score 之前，先用 ilastik 对图像进行预处理。总体而言，非退化果蝇复眼（GMR-GAL4）的 P-Score 显著低于中度退化复眼（2x_S81L）和重度退化复眼（3x_S81L）（图4A、B 和 表1）。这一结果符合预期，因为 Flynotyper 生成的 P-Score 越高，表明复眼退化程度越高1。当未使用 ilastik 时，非退化复眼与中度退化复眼之间的 P-Score 差异极小（图4C 和 表1）。这表明，在环形光源条件下，若不使用 ilastik，Flynotyper 难以准确识别小眼单元的排列模式。其原因是 Flynotyper 的设计基于双点光源拍摄的图像，需将图像转换为灰度图并进行额外调整，以识别小眼中心1。ilastik 通过在每个小眼中心添加一个点来模拟这一过程，从而实现 Flynotyper 中的定量分析。
图1：ilastik 软件工作流程示例。（A） 在 ilastik 中创建新项目。（B） 选择标准图像。（C） 在特征选择下选择 Sigma 值。（D） 标记小眼的前景以提高灵敏度。（E） 标记小眼的背景以提高灵敏度。（F） 选择软件导出处理后文件的方式。（G） 选择需要分析的实验果蝇眼部图像。（H） 显示将被分析的实验果蝇眼部图像。（I） 运行软件后的最终结果。请点击此处查看此图的放大版本。
图2：Flynotyper 工作流程示例。（A） 仅选择果蝇的眼睛用于后续分析。（B） 在新窗口中打开裁剪后的眼睛图像。（C） 选择要分析的裁剪图像以及用于分析的参数。（D） 分析结果示例。表型评分显示在最右侧。请点击此处查看此图的放大版本。
图3：定性 果蝇 眼部图像。 同一果蝇复眼在非退化（上）和退化（下）条件下，分别使用环形光源（左）和双点光源（右）拍摄的图像。 请点击此处以查看此图的放大版本。
图4：在使用Flynotyper对粗糙眼表型进行精确定量之前，先使用ilastik 果蝇.（A） 代表性 果蝇 非退化眼（GMR-GAL4）、中度退化眼（2x_S81L）和重度退化眼（3x_S81L）的眼部图像。 (B) 使用 ilastik 后通过 Flynotyper 获得的定量结果。双侧置换检验的 P 值 t-test 用于辅助结果解读（GMR-GAL4 与 2x_S81L 比较：p = 0；GMR-GAL4 与 3x_S81L 比较：p = 0） （C） Flynotyper 未使用 ilastik 时的定量结果。双侧置换检验的 P 值 t-检验用于辅助结果解读（GMR-GAL4 与 2x_S81L：p = 0.597，GMR-GAL4 与 3x_S81L：p = 0.687）。每组 N = 3。数据点在 x 轴上以抖动或堆叠方式呈现，以提高视觉清晰度。实心水平线代表平均值。误差线代表标准差。 请点击此处以查看此图的放大版本。
| GMR-GAL4 | 2x_S81L | 3x_S81L | |||
| 使用 ilastik | 不使用 ilastik | 使用 ilastik | 不使用 ilastik | 使用 ilastik | 不使用 ilastik |
| 26.7 | 55.7 | 52.5 | 51.2 | 59.9 | 55.6 |
| 17.4 | 53.5 | 50 | 54.9 | 60.7 | 52 |
| 22.8 | 55.5 | 56.8 | 55.2 | 60.1 | 55.1 |
表1：使用 Flynotyper 与 ilastik 联用以及单独使用 Flynotyper 时的 P-Scores。
补充图 S1：用于图像采集的果蝇头部固定装置示意图。 这是使用多张纸片进行图像采集设置的示例。但任何能够确保果蝇头部和复眼正确朝向的方法均可使用。请点击此处下载该文件。
补充图 S2：在特征选择下使用 2.5 的 sigma 值时，ilastik 与 Flynotyper 的定量结果。 在 ilastik 的特征选择中使用非 5.0 的 sigma 值可能导致定量不准确。具体而言，sigma 值为 2.5 时会降低检测灵敏度。双侧置换检验的 p 值 t-检验用于辅助结果解读（GMR-GAL4 与 2x_S81L：p = 0.192，GMR-GAL4 与 3x_S81L：p = 0）。每组 n = 3。数据点在 x 轴上以抖动或堆叠方式呈现，以提高视觉清晰度。实心水平线代表平均值。误差线代表标准差。 请点击此处下载此文件。
补充图 S3：由于坏死区域导致的敏感性丧失和不准确的 P 分数。 白色箭头指向坏死区域的片段。 请点击此处下载该文件。
补充表 S1：在特征选择中使用 2.5 的 sigma 值时的 P 值得分。 请点击此处下载该文件。
讨论
Drosophila的小眼是研究多种生物学功能和遗传疾病的有用体系。小眼排列的规则性是检测基因突变效应的良好指标4。尽管目前已有一些计算小眼规则性的方法，例如人工评分，但这些方法可能存在较大偏倚。为克服这种主观偏倚，已开发出半自动化的分析工具1,11。
为实现准确的眼部定量，必须优化果蝇的制备与实验设置。尽管我们理解每个实验室可能有不同的配置，但在此提供我们实验室的设置方案，以帮助读者了解如何准备果蝇用于图像采集。果蝇被冷冻并储存在 -80 °C 条件下。我们采用的样本量为 3，因为根据我们的经验，当 GMR-GAL4 与 S81L 突变组合时，群体间的变异极小。然而需注意，样本量应根据需要进行调整，以进行零假设显著性检验。为将果蝇固定用于图像采集，果蝇头部置于一张极小的纸片上作为支撑，使眼睛中心大致位于显微镜的焦平面（补充图 S1）。我们实验室使用带有 Z 轴层扫功能的显微镜与相机（见 材料表），因为该组合可获得整体更清晰的图像，从而最佳地呈现整个果蝇复眼的结构，因为果蝇的眼睛呈穹顶状。然而，Z 轴层扫功能并非本方案的必需条件，我们曾成功使用不具备 Z 轴层扫功能的旧款体视显微镜完成该方法13。环形光源的亮度调节旋钮最多仅旋转至¼位置，以避免过度曝光。我们样本的总厚度范围在 300 至 450 微米之间。
本研究中，我们证明了使用 ilastik 和 Flynotyper 分析果蝇眼睛可获得无偏且可靠的晶状体小眼量化结果。我们采用 ilastik（一种基于机器学习的生物图像分析工具）对黑腹果蝇（Drosophila）的小眼排列进行小眼标记，随后使用 Flynotyper（一种用于测量小眼规则性的计算方法）进行分析1,11。我们倾向于使用环形光源获取图像，以实现更佳的定性评估。然而，该方法所获图像无法直接由 Flynotyper 生成定量结果。因此，我们利用 ilastik 对这些图像进行预处理，并成功将预处理后的图像用于 Flynotyper 以获得定量结果。若在使用 Flynotyper 前未对图像进行 ilastik 预处理，则非退变眼与退变眼之间的总体 P-Score 相近。这凸显了在采用环形光源获取定量结果时，必须首先使用 ilastik 进行预处理的重要性。
我们的方法存在一些局限性。ilastik 中的设置可能差异较大，并可能导致数据无显著性。例如，我们使用相同的图像进行了另一组分析，但在 ilastik 中将前景 sigma 值调整为 2.5 而非 5，结果导致对中度退行性表型的敏感性下降（补充图 S2 和 补充表 S1）。另一个局限性在于，对于退化程度过高的眼睛，其检测敏感性会降低。与 3x_S81L 型眼睛相比，具有坏死斑块的眼睛在定性上退化更为严重。然而，3x_S81L 眼睛的平均 P-Score 为 60.2，而具有坏死斑块的眼睛的平均 P-score 为 60.9。因此，退化程度过高的眼睛（如出现坏死斑块）也可能导致敏感性下降（补充图 S3）。
本方案的关键步骤之一是选择合适的标准图像，用于训练 ilastik 软件。在 Flynotyper 中，使用眼面小眼结构与周围色素细胞对比清晰（例如红色或橙色眼睛）且无退变的标准图像，可获得更准确的定量结果。另一个关键步骤是在 ilastik 中进行特征选择，其中需选择以 sigma 值表示的灵敏度参数，以精细调节机器学习软件（图 1D）。若选择的特征过少，会降低 ilastik 的灵敏度，导致小眼结构标记不准确；若选择的特征过多，则会延长生成结果所需的时间并增加计算资源消耗，从而降低实验效率。此外，若观察到明显的眼部定性退变，但分析结果无统计学显著性，提高所选特征的 sigma 值可能是一种有效的解决方案。然而，本方案中提供的特征选择参数通常即可产生准确的结果。严格按照本方案所述步骤操作，有助于避免未来出现常见问题并减少故障排查的需要。
综上所述，该方法不仅能够提供更高质量的定性图像，还能对黑腹果蝇（Drosophila）眼部系统进行无偏倚且可靠的定量分析。因此，该方法有望在未来提升眼部退化模型作为研究退行性疾病强大工具的应用价值。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢Pedro Fernandez-Funez提供本方案中所使用的显微镜和相机。我们还要感谢Ava Schapman对本方案清晰度提供的反馈意见。Nam Chul Kim获得了Wallin神经科学发现基金的经费支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 计算机配置 | Ryzen 5, 16 GB RAM, Nvidia RTX 3070 Super, Windows 10 | ||
| Flynotyper | Iyer, J. et al. (2016) | 在此下载软件：https://flynotyper.sourceforge.net/imageJ.html | 开源软件。请勿使用 Flynotyper 2.0。在本出版物撰写时，2.0 版本较新，而本实验方案针对 Flynotyper 的原始版本进行了优化。 |
| ilastik | Berg, S. et al. (2019) | 在此下载软件：https://www.ilastik.org/download.html | 开源软件。请在 Regular Builds 下载与您计算机操作系统对应的版本 1.4.0.post1。 |
| ImageJ | 在此下载软件：https://imagej.net/ij/download.html | 开源软件。本研究使用了版本 1.53 和 1.54。1.54 为更新版本，也是默认下载版本。 | |
| Leica Application Suite (LAS X) | Leica Microsystems | LASX Office 1.4.6 28433 | 用于获取 z-stack 图像的系统与软件。 |
| 配备 DMC2900 相机的 Leica Z16 APO 显微镜 | Leica Microsystems | 10 447 173, 12 730 466 | 文中简称为 z-stack 显微镜和相机。该产品现已归档。 |
参考文献
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重印与许可
