量化 黑腹果蝇 眼睛表型:一种整合 ilastik 和 Flynotyper 的计算方法

摘要

果蝇眼系统是研究各种生物过程的有用工具，尤其是人类神经退行性疾病。然而，粗眼表型的手动定量可能存在偏差且不可靠。在这里，我们描述了一种使用 ilastik 和 Flynotyper 以无偏倚的方式量化眼睛表型的方法。

摘要

黑腹果蝇复眼是一个结构良好且全面的阵列，由大约 800 个 ommatidia 组成，呈现出对称的六边形图案。这种规律性和易于观察性使果蝇眼系统成为模拟各种人类神经退行性疾病的有力工具。然而，量化异常表型的方法，例如对眼睛严重程度评分进行手动排序，具有局限性，尤其是在对眼睛形态的微弱改变进行排名时。为了克服这些限制，已经开发了计算方法，例如 Flynotyper。使用环形灯可以获得更好的定性图像，从而获得单个 omatidia 的完整性。但是，由于环形光引入的 ommatidia 上的阴影，Flynotyper 无法直接分析这些图像。在这里，我们描述了一种无偏的方法，通过结合 ilastik 和 Flynotyper 两种软件来量化在果蝇疾病模型中观察到的粗糙眼睛表型。通过使用 ilastik 预处理图像，可以使用 Flynotyper 成功量化粗糙的眼睛表型。

引言

黑腹果蝇基因组包含 ~75% 的人类疾病相关基因直系同源物。此外，在果蝇眼睛发育过程中，基因组中大约三分之二的基因被表达，使果蝇眼睛成为研究各种分子和细胞功能、发育和疾病模型的出色遗传系统 ^1,2。因此，果蝇眼系统是研究各种生物过程的有用实验工具。

果蝇复眼是一个结构良好且全面的 ~800 个 ommatidia 阵列，呈现对称的六边形图案³。这种六边形模式的规律性可用于估计在眼睛形态中引入突变和基因表达变化的影响⁴。以前需要评估眼睛形态的研究严重依赖肉眼检测到的眼睛表型严重程度的人工排序。为了对眼睛表型进行排名，通过立体显微镜拍摄外部眼睛形态图像 ^5,6。通过将外眼分成四个区域并计算每个区域的变性比例来评估每组的眼睛表型 ^5,6。然后，这些值用于计算平均值，这些平均值与从对照苍蝇⁷ 获得的值进行比较。评分基于融合程度、钌毛丢失和刷毛组织 ^7,8。用立体显微镜拍摄的苍蝇眼照片由一名研究人员获取，眼睛表型分析由另一名研究人员使用三重验证集进行 ^7,8。

在用肉眼对眼睛形态的微弱变化进行排名时，有局限性⁴.为了克服这些限制，已经开发了 FLEYE 和 Flynotyper 等计算方法 ^1,9。Flynotyper 是一种用于定量估计果蝇眼系统形态变化的新型计算方法¹。它会自动检测果蝇的眼睛和单个 ommatidium，根据眼睛的不规则性计算表型评分 （P 分数） ¹。较高的 P 分数表明苍蝇眼更退化。该软件已成功用于量化果蝇眼睛的异常¹⁰。尽管 Flynotyper 确保了自动化过程，但它仍然无法成功应用于通过各种光学显微镜方法拍摄的某些眼睛图像。

从定性上讲，与单点光源相比，我们更喜欢环形光源，因为它可以更准确地表示每个 ommatidium。然而，当使用环形灯时，由于 ommatidium 的半球形形状，它会在每个 ommatidium 的顶部产生一个环形阴影。这个环形阴影会抑制 Flynotyper 的准确 ommatidial 检测，从而导致 P 分数的计算错误。

为了克服这些问题，我们实施了 ilastik，这是一种基于机器学习的工具，用于各种分析，用于对苍蝇眼图像中的 ommatidia 进行分类¹¹。然后，我们将 ilastik 生成的图像馈送到 Flynotyper 中以计算 P 分数。这使我们能够无偏倚地量化 果蝇 眼睛的形态缺陷¹.

方案

1. 准备定量

1. 下载并安装 ilastik¹¹、ImageJ 和 ImageJ 插件 Flynotyper¹。有关安装的网站链接，请参阅 材料表 。根据计算机操作系统（Mac、Windows、Linux 等）下载相应的软件包。完全按照说明进行操作。
   注意:必须严格按照提供的链接中的说明进行操作。使用的计算机需要 64 位操作系统;否则，没有其他必需的规范。有关用于此协议的系统的计算机规格，请参阅 材料表 。
2. 使用标准图像训练机器学习模型。使用带有环形光的光学显微镜（例如 w1118 x GMR-GAL4）拍摄健康苍蝇眼的图像，以眼睛中心为焦点。分别分析雄性和雌性;因此，请获取男性和女性的标准图像。
   注意:根据显微镜和相机的不同，设置会有很大差异。有关苍蝇制备和图像采集的更多一般信息，请参阅讨论中的第二段。
3. 使用与标准图像采集相同的设置拍摄实验苍蝇眼的图像。
   注:良好的方向对于准确定量至关重要。参见 图 4 作为正确方向的示例。

2. 使用 ilastik 从苍蝇眼图像中检测 ommatidia

1. 在开始分析之前，请确保所有实验组（无论实验条件如何）都在同一个文件夹中，以简化以下过程。确保文件命名正确，以识别实验组并区分男性和女性。
   注意:我们建议打印出协议并使用计算机放大图表，因为该协议最容易在视觉上遵循。
2. 打开软件。
   注意: 建议在运行软件时不要打开其他应用程序;否则，计算机可能会运行得非常慢，尤其是在较旧或不太可靠的系统中。
3. 单击 Create New Project |其他工作流程，选择 细胞密度计数，然后选择保存项目文件的位置（图 1A）。
4. 点击 1。输入数据 |新增 |添加单独的图像。选择标准图像（图 1B）。
5. 点击 2.Feature Selection 并选择要使用的功能。选择 图 1C 中所示的功能;选择更多的 Sigma 值以提高灵敏度（即 10、15、20 等）。
   注意:如果选中的框过多，程序可能会运行很长时间。
6. 点击 3.计数 ，然后将 Foreground sigma 值设置为 5.00。使用 "前景 "工具在标准图像上标记 50 个或更多单独的 ommatidium。
   注意:50 个标记通常足以进行分析;然而，标记的 ommatidia 越多，结果就越准确（图 1D）。
7. 点击 3.计数 并使用 背景 工具标记 ommatidia 的外部（图 1E）。在 ommatidia 周围画出格子形状的绿线。
   注意:与 ommatidia 上的标记更多类似，绘制的绿线越多，结果就越准确。
8. 点击 4。密度导出 |选择 Export Image Settings （导出图像设置 ） 以设置图像设置（图 1F）。单击 Output File Info | 选择 Format 和 tif 以在 Flynotyper 中进行进一步分析。
9. 点击 5。批处理 |选择原始数据文件 并选择要分析的所有实验苍蝇照片（图 1G）。要分析的导入图像列表在 "选择原始数据文件 "下看到（图 1H）。点击 处理所有文件 在 底部 5.Batch Processing 部分。
   注意:提醒一下，雄性和雌性分析应分别进行。根据所使用的计算机，此步骤可能需要 10 分钟或更长时间，尤其是在导入许多图像时。
10. 软件完成后，检查包含实验蝇眼图像的相同文件夹;将有名为 "YourSampleName_Probabilities" 的黑色图像（图 1I）。

3. 使用 ImageJ 为 Flynotyper 准备照片

1. 在 ImageJ 中打开 ilastik 生成的 .tif 文件（黑框）。
   注意:每个 ilastik 生成的 .tif 文件都需要单独处理。
2. 使用 矩形选择 工具在眼睛周围创建一个矩形。绘制矩形后，通过选择 Ctrl + X 或 Ctrl + C 裁剪区域（图 2A）。等待矩形轮廓形状的黑框出现。
   注意: 计算机操作系统将决定是使用 'Ctrl + X' 还是 'Ctrl + C'。通常，"Ctrl + X"适用于 Windows，"Ctrl + C"用于 Mac。
3. 使用 ImageJ 打开现在切割的苍蝇眼;点击 文件 |新品 |内部剪贴板 （图 2B）。
4. 通过单击文件 |另存为 |Jpeg 格式。剪切的图像现在与原始实验图像位于同一文件夹中。
   注意:为了简化下一步，建议创建一个名为 'cut' 的新文件夹，并将所有剪切的图像放入该文件夹中。

4. 使用 Flynotyper 计算表型评分

1. 通过单击 插件 |Flynotyper.
2. 选择 Add Genotypes 并打开包含剪切的 fly eye 图像的文件夹（剪切文件夹）。文件夹名称将出现在 基因型 下（图 2C）。
3. 选中 Light microscope 和 Vertically 框，但根据需要进行相应调整。检查 Rank Ommatidia 下的 Stability 和 Distance to the Center 框:（图 2C）。
4. 对于 Number of ranked ommatidia considered （考虑的排名 ommatidia 数量），输入 200。
   注意:一般来说，200 是一个不错的数字，但请根据偏好进行相应调整。
5. 单击 Run 并等待分析结果出现（图 2D）。
   注意:此步骤可能需要 5 分钟或更长时间（或更短），具体取决于所用计算机的处理能力。
6. 将 样品文件 和 P 分数 复制并粘贴到统计软件中，以便进一步分析。

结果

在之前的一项研究中，我们使用该方案来确定与肌萎缩侧索硬化症伴额颞叶痴呆 （ALS-FTD） 相关的突变 VCP 蛋白的遗传修饰物¹²。此外，该方法还在另一篇论文中用于评估 CHCHD10^S59L 介导的 ALS-FTD 的毒性，即使使用较旧的立体显微镜¹³。为了进一步验证这些结果，我们在与 Baek 等人相同的 ALS-FTD 疾病突变中使用了 ilastik 和 ^Flynotyper13;然而，未经培训的实验室人员进行了实验并获得了类似的结果。因此，结合 ilastik 和 Flynotyper 是一种对果 蝇 变性进行无偏倚评分的稳健方法。

我们更喜欢使用环形灯，因为它可以更好地进行定性评估（图 3）。但是，使用环形光源会导致 Flynotyper 无法直接分析的阴影。为了克服这个问题，我们在使用 Flynotyper 量化 P 分数之前，在 ilastik 中对图像进行了预处理。总体而言，与中度退化的眼睛 （2x_S81L） 和严重退化的眼睛 （3x_S81L） 相比，未退化 （GMR-GAL4） 的苍蝇眼的 P 分数显着降低（图 4A、B 和 表 1）。这是预期的结果，因为 Flynotyper 生成的 P 分数越高，表明眼睛退化程度越高¹。当不使用 ilastik 时，未退化的眼睛和中度退化的眼睛之间的 P 分数差异可以忽略不计（图 4C 和 表 1）。这表明 Flynotyper 在不使用 ilastik 的情况下难以在环形光条件下准确识别 ommatidia 图案。这是因为 Flynotyper 旨在使用双点光拍摄的图像，该双点光转换为灰度，并进行额外调整以识别 ommatidial center¹。Ilastik 通过在每个 ommatidium 的中心加入一个点来复制这个过程，从而在 Flynotyper 中实现量化。

图 1:ilastik 工作流程示例。（A） 在 ilastik 中创建新项目。 （B） 选择标准图像。 （C） 在特征选择下选择 sigma 值。 （D） 标记 ommatidia 的前景以提高敏感性。 （E） 标记 ommatidia 的背景以提高敏感性。 （F） 选择软件如何导出已处理的文件。 （G） 选择要分析的实验蝇眼图像。 （H） 显示将分析哪些实验性蝇眼图像。 （I） 运行软件后的成品。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2:Flynotyper 工作流示例。（A） 仅选择苍蝇的眼睛进行进一步分析。 （B） 在新窗口中打开割伤的眼睛图像。 （C） 选择要分析的剪切图像以及要检查的参数以进行分析。 （D） 示例结果。表型评分显示在最右侧。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3:果 蝇 的定性眼睛图像。 在未退化（上）和退化（下）条件下，使用环形灯（左）和双点灯（右）拍摄的同一只飞眼。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 4:在 Flynotyper 之前使用 ilastik 准确定量果 蝇中的粗眼表型。（A） 未退化的眼睛 （GMR-GAL4）、中度退化的眼睛 （2x_S81L） 和严重退化的眼睛 （3x_S81L） 的代表性 果蝇 眼睛图像。 （B） 使用 ilastik 后 Flynotyper 的定量结果。计算双侧排列 t 检验的 P 值以帮助促进结果的解释 （GMR-GAL4 vs 2x_S81L:p = 0，GMR-GAL4 vs 3x_S81L:p = 0） （C） 不使用 ilastik 的 Flynotyper 的定量结果。计算双侧排列 t 检验的 P 值以帮助促进结果的解释 （GMR-GAL4 vs 2x_S81L: p = 0.597， GMR-GAL4 vs 3x_S81L: p = 0.687）。N = 3 对于每组。数据点在 x 轴上抖动或堆叠，以实现视觉清晰度。水平实线表示平均值。误差线表示标准差。 请单击此处查看此图的较大版本。

GMR-GAL4		2x_S81L		3x_S81L
使用 ilastik	无 ilastik	使用 ilastik	无 ilastik	使用 ilastik	无 ilastik
26.7	55.7	52.5	51.2	59.9	55.6
17.4	53.5	50	54.9	60.7	52
22.8	55.5	56.8	55.2	60.1	55.1

表 1:将 Flynotyper 与 ilastik 一起使用以及单独使用 Flynotyper 时的 P 分数。

补充图 S1:用于图像采集的飞头安装设置。 这是一个如何使用多张纸进行图像采集设置的示例。但是，可以使用任何确保头部和蝇眼正确方向的方法。 请点击此处下载此文件。

补充图 S2:在特征选择下使用 sigma 值 2.5 时 ilastik 和 Flynotyper 的定量结果。 在 ilastik 的特征选择下使用非 5.0 的 sigma 值可能会导致量化不准确。具体来说，sigma 值为 2.5 会导致灵敏度损失。计算双侧置换 t 检验的 P 值以帮助促进结果的解释 （GMR-GAL4 vs 2x_S81L: p = 0.192， GMR-GAL4 vs 3x_S81L: p = 0）。N = 3 对于每组。数据点在 x 轴上抖动或堆叠，以实现视觉清晰度。水平实线表示平均值。误差线表示标准差。 请点击此处下载此文件。

补充图 S3:由于坏死斑块导致的灵敏度损失和不准确的 P 分数。 白色箭头指向坏死斑块的片段。 请点击此处下载此文件。

补充表 S1:在特征选择下使用 sigma 值 2.5 时的 P 分数。请点击此处下载此文件。

讨论

果蝇的 ommatidia 构成了研究各种生物学功能和遗传疾病的有用系统。ommatidia 的规律性是检查基因突变影响的良好衡量标准⁴。尽管存在几种计算 ommatidial 规律性的方法，例如手动排序，但这些方法可能会有很大偏差。为了克服这种偏颇的方法，已经开发了半自动工具 ^1,11。

为了准确定量眼睛，必须优化果蝇的制备和设置。虽然我们知道每个实验室都会有自己的设置，但我们在实验室中提供了以下设置，以便让读者了解如何为图像采集准备果蝇。将果蝇冷冻并储存在 -80 °C。 我们使用 3 个样本量，因为根据我们的经验，当 GMR-GAL4 与 S81L 突变结合时，人群之间的差异非常小。但是，请记住，应调整样本量以执行零假设显著性检验。为了安装苍蝇进行图像采集，苍蝇头放在一张非常小的纸上，该纸充当枕头，因此眼睛的中心大致是焦平面（补充图 S1）。我们的实验室使用 Z 轴堆栈显微镜和相机（参见 材料表），因为这可以产生整体更清晰的图像，由于苍蝇眼是圆顶形的，因此可以最好地看到整个眼睛。然而，Z 堆栈功能不是该协议的要求，因为我们成功地将这种方法与没有 Z 堆栈功能的旧立体显微镜一起使用¹³。用于亮度的环形灯拨盘调高不超过 1/4 度，以避免过度曝光。我们样品的总厚度在 300 到 450 微米之间。

在这项研究中，我们表明使用 ilastik 和 Flynotyper 对苍蝇眼进行分析可产生无偏且可靠的 ommatidia 定量结果。我们使用 ilastik（一种基于机器学习的生物图像分析工具）来标记 ommatidia，然后是 Flynotyper（一种用于测量 ommatidia 规律的计算方法）分析了果蝇 ommatidia 模式^1,11。我们更喜欢使用环形灯来获取图像，以便更好地进行定性评估。但是，这种方法不允许 Flynotyper 使用这些图像生成定量结果。因此，实施了 ilastik 来预处理这些图像，并且这些处理后的图像成功地与 Flynotyper 一起使用以产生定量结果。当在 Flynotyper 之前未使用 ilastik 对图像进行预处理时，非退行性眼和退行性眼之间的总体 P 分数相似。这凸显了在实施环形灯以获得定量结果时首先使用 ilastik 的重要性。

我们的方法有一些局限性。ilastik 中的设置可能会有很大差异，并可能导致数据不重要。例如，我们使用相同的图像执行了另一组分析，但将 ilastik 中的前景 sigma 值调整为 2.5 而不是 5。这导致中度退行性表型的敏感性丧失 （补充图 S2 和 补充表 S1）。另一个限制是过度变性会导致眼睛的敏感性丧失。与3x_S81L眼相比，带有坏死斑块的眼睛在质量上要退化得多。然而，3x_S81L 只眼睛的平均 P 分数为 60.2，而有坏死斑块的眼睛的平均 P 分数为 60.9。因此，退化过多的眼睛，例如坏死斑块，也会导致敏感性丧失（补充图 S3）。

该协议的一个关键步骤是选择合适的标准图像，用于训练 ilastik。在 Flynotyper 中，如果 ommatia 与周围色素细胞（例如红色或橙色眼睛）之间具有明显对比，则未退化的标准图像将导致更准确的量化。另一个关键步骤是 ilastik 中的特征选择，其中选择以 sigma 值表示的灵敏度来微调机器学习软件（图 1D）。选择太少的特征会降低 ilastik 的灵敏度，导致 ommatidia 标记不准确。选择过多的特征会增加生成结果所需的时间和处理能力，从而降低程序的效率。或者，如果眼睛有明显的定性退化，但分析结果没有统计学意义，则增加所选特征的 sigma 值将是一个潜在的解决方案。但是，该协议中提供的特征选择通常会产生准确的结果。遵循所写的关键步骤将有助于缓解最常见的问题和将来的故障排除。

总之，这种方法提供了更好的定性图像，同时还产生了果 蝇 眼系统的无偏和可靠的量化。因此，这种方法可以提高眼睛退化作为未来模拟退行性疾病的有力工具的实用性。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
计算机规格			Ryzen 5、16 GB RAM、Nvidia RTX 3070 Super、Windows 10
Flynotyper	Iyer， J. et al. （2016）	在此处下载软件：https://flynotyper.sourceforge.net/imageJ.html	开源软件。不要使用 Flynotyper 2.0。在发布时，2.0 是相当新的，该协议针对 Flynotyper 的原始版本进行了优化。
ilastik	Berg， S. et al. （2019）	在此处下载软件：https://www.ilastik.org/download.html	开源软件。在与您的计算机作系统对应的 Regular Builds 下下载版本 1.4.0.post1。
ImageJ		在此处下载软件：https://imagej.net/ij/download.html	开源软件。使用了 1.53 和 1.54 版本。1.54 是更新版本，是默认下载版本。
徕卡应用套件 （LAS X）	徕卡显微系统	LASX Office 1.4.6 28433	用于 z 堆栈采集的系统和软件。
配备DMC2900相机的徕卡 Z16 APO 显微镜	徕卡显微系统	10 447 173， 12 730 466	在文中称为 Z 轴堆栈显微镜和相机。此产品现已存档。