视网膜血管中糖尿病诱导的黏附白细胞定量

摘要

我们展示了一种标记视网膜血管壁及黏附白细胞的方法。随后可在荧光显微镜下计数这些黏附的白细胞，作为炎症程度或炎症对治疗反应的评估指标。

摘要

白细胞淤滞是指白细胞黏附于血管管腔壁的过程。白细胞与血管壁的这种相互作用是炎症的特征性表现，已被证实可导致多种组织和疾病中的毛细血管阻塞，包括糖尿病视网膜病变。

多年来，白细胞淤滞一直被报道为高白细胞血症的一种危及生命的并发症，且仅能通过临床诊断。鉴于该现象的重要性，研究人员已开展大量工作以深入探究其发生发展的潜在机制；然而，在实验室环境中，目前尚无公认的金标准技术可用于可视化观察并量化该事件的严重程度。

在下述方法中，首先用缓冲液灌注血管系统以清除血液，随后将刀豆球蛋白A（concanavalin A）灌注入血管系统，使其结合所有暴露的细胞壁，并特异性地使白细胞呈现强烈荧光染色。若灌注操作成功清除所有未结合的血细胞，则残留的荧光标记白细胞即为已结合于血管壁的细胞，可使用任意可用的荧光显微镜进行人工定量分析。

引言

白细胞（white blood cells, WBCs）发挥着重要作用 重要作用在 血管系统的最佳功能，例如维持血液流动性以及调节血栓溶解¹它们还在某些方面发挥着关键作用 病理的 条件，例如长时间附着于血管腔壁，从而导致 到 血管 阻塞，至少是暂时性的，这一现象称为白细胞淤滞^2,3.

糖尿病视网膜病变是长期糖尿病最常见的并发症之一，也是美国及全球20至75岁人群视力受损和失明的主要原因之一⁴。视网膜血管系统的缓慢进行性退变是该疾病早期阶段具有临床意义的组成部分，在部分患者中可导致视网膜缺血，并继发视网膜新生血管形成^5,6。累积证据表明，炎症在视网膜病变的发生发展中起重要作用⁷，而白细胞黏附（leukostasis）被认为是一种亚临床的血管内炎症反应。白细胞黏附发生在糖尿病早期，远早于任何可检测到的临床表现出现之前^8,9,10。在糖尿病中，黏附的白细胞在数月乃至数年内反复堵塞视网膜血管（慢性白细胞黏附），可能导致毛细血管闭塞和退化^11,12,13。这种白细胞黏附的严重程度具有病理学意义，可用于监测疾病进展的严重程度，或在科研环境中评估治疗干预的效果。

为进一步研究高血糖微环境对白细胞淤滞的特定影响， 体外 已设计出多种模型。分离的视网膜微血管内皮细胞可在二维或三维培养模型中生长并形成结构（器官芯片中的微血管系统）¹⁴）以模拟血管内皮（铺衬于血管管腔的单层细胞）。然而，这些模型的实验间变异限制了其应用。人类视网膜血管系统中白细胞停滞现象的研究 体内 仍然有限，因此目前关于视网膜白细胞淤积的大多数知识均来源于糖尿病视网膜病变的动物模型^13,15.

本报告旨在介绍一种基于已有文献所述方法的标准化实验方案¹⁶，用于定量视网膜血管中黏附的白细胞，作为白细胞淤滞（leukostasis）的评估指标。该检测方法也可用于研究其他存在白细胞淤滞的血管性疾病，例如恶性肿瘤^3,17,18,19以及某些感染性和过敏性疾病²⁰。本方案可在任何基础研究实验室中实施，无需特殊设备。在下述方法中，首先用缓冲液灌注血管系统以清除血液，随后将刀豆球蛋白A（concanavalin A）灌注入血管，该物质可结合所有暴露的细胞壁，并使白细胞呈现特别明亮的荧光染色^21,22,23。若灌注操作成功清除所有未结合的血细胞，则残留在血管壁上并被荧光标记的白细胞即可通过实验室现有的任何荧光显微镜进行人工定量分析。

方案

本方案已通过加州大学欧文分校机构动物照护与使用委员会（IACUC）的审查与批准，并符合政府关于实验动物照护与使用的各项法规。本方案中无暂停点。每只小鼠的平均操作时间为30分钟。

1. 准备灌注阶段

1. 将0.9%生理盐水袋和刀豆蛋白A溶液在37℃下预热 ^o使用前在37°C水浴中孵育20-30分钟。
   注意：避光保存刀豆球蛋白A（用铝箔包裹）。
2. 准备一个托盘，用于盛接操作过程中滴落的血液和液体。在托盘上方放置一个加热垫，并用吸水实验台垫或其他吸水材料覆盖。
   注意：目的是避免小鼠在操作过程中体温下降，因为降温会使 灌流期间更难清除血液。

2. 设置加压输液器

1. 将0.9%生理盐水袋、静脉输液套件、四通阀止流夹和灌胃针串联连接。
2. 将0.9%生理盐水袋插入压力灌注器的网套与气囊之间，并悬挂在气囊背面的挂钩上。使用输液杆上的环形结构将压力灌注器固定在输液杆上。
3. 打开系统（运行）数分钟，以排除管路和端口中的所有气泡，并将流速设定为18–20 mL/min²⁴。为充胀压力灌注器的气囊，将止流夹手柄转向打开的通气口方向，然后按压充气球直至压力表显示所需压力。每次灌注小鼠前需重新调整压力。如需放气，将止流夹手柄垂直向下转向充气球方向。
   注意：若使用新的0.9%生理盐水袋，通常150 mmHg的压力即可达到所需流速；但由于不同品牌压力灌注器之间以及生理盐水袋在使用过程中可能存在差异，压力应根据实际情况进行经验性调整。
4. 将装有预温Concanavalin A溶液的10 mL注射器连接至四通阀。
   注意：避免注射器暴露于光照下（可用铝箔包裹）。

3. 麻醉

1. 通过腹腔（I.P.）注射 Ketamine:Xylazine 进行麻醉；小鼠手术/操作中最常用的剂量为每千克体重 100:10 mg²⁵。通过足底反射（用力捏脚趾）评估麻醉效果。
   注意：该剂量麻醉起效时间为 4–6 分钟，外科麻醉持续时间为 45–60 分钟。麻醉混合液可在室温下保存最多 2 周。

4. 经心灌注及伴刀豆球蛋白A染色

1. 将小鼠仰卧位放置于灌注台上，以暴露胸腔 和腹腔。
2. 目视辨认剑突，用优势手持止血钳夹住皮肤并锁定。止血钳固定后，将其转移至非优势手并提起皮肤。
3. 用惯用手持剪刀进行剪切， 与脊柱呈90°角，切开皮肤暴露腹外壁。
4. 胸骨剑突和肋骨已清晰可见后，沿腹部两侧解剖腹壁，注意避免切伤任何器官或主要血管。
5. 膈肌已清晰可见后，透过膈肌观察心室和肺。使用剪刀尖端，在靠近脊柱的一侧腹部侧壁处剪开膈肌，注意避免损伤任何器官或主要血管。
   注意：此 "孔" 膈肌将使胸腔内的负压与大气压达到平衡，导致气胸发生，从而使肺塌陷并使心脏回缩，便于在不损伤肺或心脏的情况下解剖膈肌。
6. 继续沿肋骨平行于肺部进行解剖，以暴露胸腔 "瓣膜"松开止血钳，在矢状面剪断剑突。用手轻轻撑开剑突，观察心脏的四个腔室。
7. 用非优势手持镊子夹住心脏心尖附近。用优势手持灌胃针（连接静脉导管），穿刺心尖。为避免完全穿透左心室或进入肺血管导致体循环血管灌注不良，需检查灌胃针球形针尖末端的位置，应位于穿刺点边缘并略微突出于心脏表面。用止血钳固定灌胃针位置 弯头蚊式止血钳，或直接用手握住，同时操作静脉输液三通阀。
8. 打开止水夹以连通0.9%生理盐水，同时几乎同步剪开右心房 用剪刀剪开；灌注2-3分钟。灌注期间，轻轻左右和上下移动针头，以减少血管扭曲并促进血液从心脏排出。
9. 用生理盐水灌注后，旋转三通阀手柄以关闭生理盐水通路，使注射器中的溶液流向灌胃针。用手以稳态速率灌注刀豆蛋白A（concanavalin A）溶液，确保在30–35秒内将10 mL刀豆蛋白A溶液完全注入。
10. 用刀豆球蛋白A灌注后，转动阀门以关闭来自注射器的液体流动，重新使0.9%生理盐水流向灌胃针。再用0.9%生理盐水溶液灌注2-3分钟。将灌胃针从心脏移除。
    注意：本方案中建议使用的刀豆蛋白A与荧光素（绿色）偶联；但也有与其他荧光染料偶联的刀豆蛋白A可供选择。

5. 去核及新鲜视网膜的分离

1. 将小鼠侧放，用非惯用手的食指和拇指分别置于上眼睑和下眼睑。轻轻牵拉眼睑及周围皮肤，使眼球前突，部分突出于眼窝外。
2. 眼球突出时，用惯用手持弯剪，在眼球下方插入并托起 45°角。剪断肌肉附着点和视神经。使用同一把剪刀作为刮铲，将眼球转移至小型容器中，或直接转移至解剖显微镜的载物台上。
   注意：此步骤中需小心，避免切到眼睛后部，并防止牵拉眼球。
3. 将眼球置于牙科蜡上以打开眼眶。在解剖显微镜下，用非优势手使用显微镊子夹住仍附着于眼球后部外部的巩膜皱褶或肌肉残余，并调整眼球方向，使角膜朝向一侧。
   注意：为防止在打开眼球时眼睛移动或滑动，可在牙科蜡上放置一块湿润的无绒布。
4. 使用聚四氟乙烯涂层剃须刀片的一个锐角，在距角膜缘（角膜-巩膜交界处）后方1-2 mm处作一与之平行的切口。用显微镊夹住巩膜皱褶或眼外肌，以最小的向下压力将刀片沿角膜缘划过。继续用剃须刀片切割，直至完全分离前段结构（角膜、虹膜、晶状体和玻璃体）与后段结构（眼杯）。
   注意：不要来回锯切。
5. 将切开的视杯转移至含有PBS的小型培养皿中。
   注意：避免视网膜与滤纸（见步骤5.3）接触，因为视网膜会紧密粘附于滤纸上，几乎无法回收。
6. 用显微镊夹住巩膜外侧的巩膜皱褶或残留的肌肉组织。使用显微铲在眼球杯边缘的角巩膜缘处切断所有连接，将视网膜完全从巩膜上分离。用显微铲将视网膜从巩膜中取出。若视网膜仍通过视神经与巩膜相连，将显微剪插入视网膜与巩膜之间，剪断视神经。
7. 清除视网膜周边残留的玻璃体和睫状肌。立即将分离的视网膜转移至含有 PBS 的载玻片上。
   注意：可根据研究人员的偏好采用其他任何视网膜分离技术。

6. 视网膜的平铺装片

1. 将未固定的视网膜置于载玻片上，加入少量 PBS。使用显微铲轻轻调整视网膜方向，使玻璃体面朝上。如果视网膜向内折叠，可用显微镊夹住视网膜边缘，同时用显微铲将其展开。
2. 在视网膜上做 4–5 个放射状切口，使其平铺展开（呈三叶草形）。
3. 使用无绒布从视网膜周围吸去多余的 PBS。
   注意：切勿用布接触视网膜，否则样本可能丢失。建议加盖盖玻片以保持视网膜平整。

7. 显微镜检查

注意：任何带有GFP/FITC（480/530 nm）通道的荧光显微镜均可用于此步骤。本研究中，我们使用了配备488通道及相应图像采集软件的参考显微镜。

1. 在显微镜下以100倍放大倍数（10倍物镜）观察近期平铺的视网膜，并通过系统性地扫描整个组织（从右到左或从上到下），手动计数荧光标记的白细胞。
   注意：白细胞呈单个荧光点状，可呈圆形或椭圆形，直径为12–15 µm，且不突出于视网膜毛细血管之外（其结构完全受限于血管管腔内）。
2. 使用所需放大倍数获取代表性图像，并使用合适的软件（例如 ImageJ [Fiji]）对图像进行后期处理。
3. 将计数结果表示为每只视网膜的白细胞数量。以均值 ± 标准差的形式对数据进行作图。

结果

一个执行良好的灌注和染色方案应能清晰显示整个视网膜血管系统，其轮廓由刀豆蛋白A标记（图1）。若小鼠灌注不充分，则无法标记完整的血管树，进而影响对黏附于血管腔内白细胞的后续分析（图2）；而注射器推注过快（少于30–35秒）导致压力过高，则可能引起血管通透性增加甚至血管破裂（图3）。外渗的刀豆蛋白A可能导致外部结构被错误标记，从而干扰对黏附白细胞的定量分析。

安装视网膜后应立即通过荧光显微镜评估视网膜血管系统并定量黏附的白细胞（图4）。在高倍镜下观察视网膜时需格外小心，因为毛细血管的弯曲处可能看起来像是标记的白细胞黏附于血管壁（图4B，虚线圈）。通过在显微镜下上下调节焦距观察可疑区域，通常可区分白细胞黏附与血管向视网膜内部延伸的结构。用户可根据所用显微镜配备的荧光滤光片，更换或选择与之匹配的...

讨论

人类白细胞淤滞是指与高白细胞血症（总白细胞（WBC）计数升高）相关的症状和临床表现 >100,000/µL）时属于医疗急症²⁰导致白细胞淤滞的机制正在被深入研究。迄今为止，人类白细胞淤滞的研究 体内 尚无法实现，研究人员需要依赖动物模型来理解这一过程。不同疾病均会出现白细胞淤滞现象，因此需要一个详细的方案来观察该现象 离体 可为实验室研究人员提供帮助。本报告中所述方案已针对视网膜血管系统的研究进行了优化；然而，该方案亦可通过经验性优化，用于其他适宜血管床的研究，例如提睾肌血管系统。²⁷.

操作正确时，该技术可实现整个视网膜血管系统的灌注和标记，并可对黏附于血管壁的白细胞进行标记与定量分析。视网膜特别适用于该方法，因其血管结构在组织中局限于明确的平面内（而大多数其他组织的血管排列较为无序）。当使用透明组织（如视网膜）或非常薄的组织（如提睾肌²⁷）时，该方法在未染色组织中可获得良好的对比度。对于较厚的...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 mL 注射器
四通旋塞鲁尔锁静脉输液管阀门	Baxter	2C6204
刀豆蛋白A溶液	Vector	FL-1001	用PBS配制，浓度为1 mg/mL
解剖工具套装			包括止血钳、剪刀和镊子
FIJI			图像处理软件
荧光显微镜	Nikon	Eclipse Ni
杜蒙特#5镊子，生物级尖端	Electron Microscopy Sciences (EMS)	72700-D
灌胃针，外径1.25 mm针头，长度30 mm	Fine Science	18060-20
哈尔斯特德蚊式镊	Fisher Scientific	13-812-10
带调节夹的静脉输液套件，70英寸	Baxter	2C5417s
静脉输液架
无尘纸巾			Kimpwipes为可选品牌
微型弹簧解剖剪，Vannas型，3 mm直头	ROBOZ	RS-5620
微型刮勺	Fine Science Tools (FST)	10091-12
Nikon		NIS-Elements (AR 5.30.03 64-bit)	图像采集软件
培养皿（100 mm × 15 mm）	Corning	351029
磷酸盐缓冲液（PBS）
粉色牙科蜡	Electron Microscopy Sciences (EMS)	72670
加压灌注器	Infusurge	4010
剃须刀片，GEM单刃不锈钢，特氟龙涂层	Electron Microscopy Sciences (EMS)	71970
0.9%生理盐水，兽用级，1000 mL	Baxter	04925-04-10
小型解剖剪，弯曲钝头，22 mm	ROBOZ	RS 5983