视网膜血管中糖尿病诱导的黏附白细胞定量

摘要

我们展示了一种标记视网膜血管壁及黏附白细胞的方法。随后可在荧光显微镜下计数这些黏附的白细胞，作为炎症程度或炎症对治疗反应的评估指标。

摘要

白细胞淤滞是指白细胞黏附于血管管腔壁的过程。白细胞与血管壁的这种相互作用是炎症的特征性表现，已被证实可导致多种组织和疾病中的毛细血管阻塞，包括糖尿病视网膜病变。

多年来，白细胞淤滞一直被报道为高白细胞血症的一种危及生命的并发症，且仅能通过临床诊断。鉴于该现象的重要性，研究人员已开展大量工作以深入探究其发生发展的潜在机制；然而，在实验室环境中，目前尚无公认的金标准技术可用于可视化观察并量化该事件的严重程度。

在下述方法中，首先用缓冲液灌注血管系统以清除血液，随后将刀豆球蛋白A（concanavalin A）灌注入血管系统，使其结合所有暴露的细胞壁，并特异性地使白细胞呈现强烈荧光染色。若灌注操作成功清除所有未结合的血细胞，则残留的荧光标记白细胞即为已结合于血管壁的细胞，可使用任意可用的荧光显微镜进行人工定量分析。

引言

白细胞（white blood cells, WBCs）发挥着重要作用 重要作用在 血管系统的最佳功能，例如维持血液流动性以及调节血栓溶解¹它们还在某些方面发挥着关键作用 病理的 条件，例如长时间附着于血管腔壁，从而导致 到 血管 阻塞，至少是暂时性的，这一现象称为白细胞淤滞^2,3.

糖尿病视网膜病变是长期糖尿病最常见的并发症之一，也是美国及全球20至75岁人群视力受损和失明的主要原因之一⁴。视网膜血管系统的缓慢进行性退变是该疾病早期阶段具有临床意义的组成部分，在部分患者中可导致视网膜缺血，并继发视网膜新生血管形成^5,6。累积证据表明，炎症在视网膜病变的发生发展中起重要作用⁷，而白细胞黏附（leukostasis）被认为是一种亚临床的血管内炎症反应。白细胞黏附发生在糖尿病早期，远早于任何可检测到的临床表现出现之前^8,9....

方案

本方案已通过加州大学欧文分校机构动物照护与使用委员会（IACUC）的审查与批准，并符合政府关于实验动物照护与使用的各项法规。本方案中无暂停点。每只小鼠的平均操作时间为30分钟。

1. 准备灌注阶段

1. 将0.9%生理盐水袋和刀豆蛋白A溶液在37℃下预热 ^o使用前在37°C水浴中孵育20-30分钟。
   注意：避光保存刀豆球蛋白A（用铝箔包裹）。
2. 准备一个托盘，用于盛接操作过程中滴落的血液和液体。在托盘上方放置一个加热垫，并用吸水实验台垫或其他吸水材料覆盖。
   注意：目的是避免小鼠在操作过程中体温下降，因为降温会使 灌流期间更难清除血液。

2. 设置加压输液器

1. 将0.9%生理盐水袋、静脉输液套件、四通阀止流夹和灌胃针串联连接。
2. 将0.9%生理盐水袋插入压力灌注器的网套与气囊之间，并悬挂在气囊背面的挂钩上。使用输液杆上的环形结构将压力灌注器固定在输液杆上。
3. 打开系统（运行）数分钟，以排除管路和端口中的所有气泡，并将流速设定为18–20 mL/min²⁴。为充胀压力灌注器的气囊，将止流夹手柄转向打开的通气口方向，然后按压充气球直至压力表显示所需....

结果

一个执行良好的灌注和染色方案应能清晰显示整个视网膜血管系统，其轮廓由刀豆蛋白A标记（图1）。若小鼠灌注不充分，则无法标记完整的血管树，进而影响对黏附于血管腔内白细胞的后续分析（图2）；而注射器推注过快（少于30–35秒）导致压力过高，则可能引起血管通透性增加甚至血管破裂（图3）。外渗的刀豆蛋白A可能导致外部结构被错误标记，从而干扰对黏附白细胞的定量分析。

安装视网膜后应立即通过荧光显微镜评估视网膜血管系统并定量附着的白细胞（图4）。在高倍镜下观察视网膜时需格外小心，因为毛细血管的弯曲处可能看起来像是标记的白细胞黏附于血管壁（图4B，虚线圈）。通过上下调节显微镜焦距观察可疑区域，通常可区分白细胞黏附与血管向视网膜内部延伸的结构。用户可根据所用显微镜配备的荧光滤光片，更换或选择与之匹配的刀豆.......

讨论

人类白细胞淤滞是指与高白细胞血症（总白细胞（WBC）计数升高）相关的症状和临床表现 >100,000/µL）时属于医疗急症²⁰导致白细胞淤滞的机制正在被深入研究。迄今为止，人类白细胞淤滞的研究 体内 尚无法实现，研究人员需要依赖动物模型来理解这一过程。不同疾病均会出现白细胞淤滞现象，因此需要一个详细的方案来观察该现象 离体 可为实验室研究人员提供帮助。本报告中所述方案已针对视网膜血管系统的研究进行了优化；然而，该方案亦可通过经验性优化，用于其他适宜血管床的研究，例如提睾肌血管系统。²⁷.

操作正确时，该技术可实现整个视网膜血管系统的灌注和标记，并可对黏附于血管壁的白细胞进行标记与定量分析。视网膜特别适用于该方法，因其血管结构在组织中局限于明确的平面内（而大多数其他组织的血管排列较为无序）。当使用透明组织（如视网膜）或非常薄的组织（如提睾肌²⁷）时，该方法在未染色组织中可获得良好的对比度。对于较厚的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 mL 注射器
四通旋塞鲁尔锁静脉输液管阀门	Baxter	2C6204
刀豆蛋白A溶液	Vector	FL-1001	用PBS配制，浓度为1 mg/mL
解剖工具套装			包括止血钳、剪刀和镊子
FIJI			图像处理软件
荧光显微镜	Nikon	Eclipse Ni
杜蒙特#5镊子，生物级尖端	Electron Microscopy Sciences (EMS)	72700-D
灌胃针，外径1.25 mm针头，长度30 mm	Fine Science	18060-20
哈尔斯特德蚊式镊	Fisher Scientific	13-812-10
带调节夹的静脉输液套件，70英寸	Baxter	2C5417s
静脉输液架
无尘纸巾			Kimpwipes为可选品牌
微型弹簧解剖剪，Vannas型，3 mm直头	ROBOZ	RS-5620
微型刮勺	Fine Science Tools (FST)	10091-12
Nikon		NIS-Elements (AR 5.30.03 64-bit)	图像采集软件
培养皿（100 mm × 15 mm）	Corning	351029
磷酸盐缓冲液（PBS）
粉色牙科蜡	Electron Microscopy Sciences (EMS)	72670
加压灌注器	Infusurge	4010
剃须刀片，GEM单刃不锈钢，特氟龙涂层	Electron Microscopy Sciences (EMS)	71970
0.9%生理盐水，兽用级，1000 mL	Baxter	04925-04-10
小型解剖剪，弯曲钝头，22 mm	ROBOZ	RS 5983