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方法文章

利用肝脏代谢组学评估一种传统草药糖浆治疗贫血的作用机制

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DOI：

10.3791/67225

⸱

2024年8月30日

 ,  ,  , 
1School of Basic Medical Sciences, Hubei University of Chinese Medicine, 2School of Chinese Materia Medica, Guangdong Pharmaceutical University, 3Xinjiang Uygur Pharmaceutical Co., Ltd.

本文内容

摘要

本研究主要介绍了肝脏代谢组学在探究石榴补血糖浆治疗贫血疗效中的应用。

摘要

作为著名的维吾尔族药物，石榴补血糖浆（SLBXS）在中国已广泛用于治疗贫血超过20年。然而，其治疗贫血作用的潜在机制尚不明确。本研究主要采用肝脏代谢组学方法，以确定SLBXS治疗贫血的潜在调控机制。通过在乙酰苯肼诱导的贫血小鼠模型中进行肝脏代谢组学分析，系统表征SLBXS的作用机制。结果显示，SLBXS可降低肝脏指数、白细胞计数和血小板计数，同时升高红细胞计数、血红蛋白水平和红细胞压积。核心靶点通过Western blotting进行验证。SLBXS主要通过调节半乳糖代谢和HIF-1信号通路发挥显著的抗贫血治疗作用，表现为贫血小鼠肝组织中HIF-1α、NOS3、VEGFA和GLA蛋白的表达下调。本研究阐明了SLBXS给药后在治疗贫血过程中对肝脏代谢的潜在调控机制。

引言

贫血是一种紧迫且普遍的全球性健康问题，影响着全球25%的人口，涉及所有年龄段的人群，尤其是青少年和孕妇1,2,3。该病症与早产和孕产妇死亡风险增加相关，并可能导致身体发育障碍以及心血管功能受损4。此状况还可能对青少年的健康产生负面影响，引发感染和心力衰竭5。目前的治疗方法主要包括输血、补铁以及促红细胞生成素治疗。然而，这些治疗方法存在缺点和不良反应，例如过敏反应、胃肠道不适、铁过载和荨麻疹1。因此，寻找副作用较少且有效的治疗贫血药物至关重要。

包括维吾尔医药在内的传统中医药具有多种优势，例如多成分组方、多靶点效应、多环节相互作用以及在防治多因素疾病时副作用较少。石榴补血糖浆（SLBXS）是维吾尔医药中一种重要的传统药物，用于补血和促进血液生成。它被公认为一种具有调节血液功能、减轻肝热作用的药物，并已被纳入少数民族药物治疗贫血的临床使用指南。该药也已获得中国国家食品药品监督管理局批准（Z20026094）6,7,8。在过去二十年中，SLBXS 在中国被广泛用于治疗与贫血相关的病症。然而，其治疗贫血的潜在作用机制尚不明确，仍需进一步研究。代谢组学通过检测生物系统在疾病、药物干预或环境条件影响下的动态代谢响应9，正越来越多地被用于评估外界刺激后生物样本中代谢生物标志物的变化，从而阐明传统中医药的作用机制9,10。

因此，本研究采用肝脏代谢组学方法，以确定四物汤治疗贫血的潜在治疗机制。首先，建立乙酰苯肼（APH）诱导的小鼠贫血模型。随后，在给予四物汤后，结合气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）和多变量数据分析方法，对内源性代谢物的代谢通路进行研究。最后，通过实验分析关键靶点，阐明四物汤的抗贫血作用及其分子机制。

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方案

所有实验程序均经湖北中医药大学实验动物伦理委员会批准（HBUCMS201912015）。雄性C57BL/6小鼠（体重20–22 g）饲养于相对湿度50%–60%、温度22 °C ± 2 °C的SPF级环境中，维持12小时光照/12小时黑暗循环，并可自由摄食和饮水。实验开始前，所有小鼠均适应环境1周。小鼠被随机分为以下四组（n = 12）：对照组、模型组、复方阿胶浆组（FFEJS，阳性药物，按7.8 mL/kg剂量灌胃给药）和SLBXS组（按11.7 mL/kg剂量灌胃给药）。对照组和模型组小鼠给予等体积生理盐水。各组小鼠均每日灌胃给药1次，持续2周。本研究中所用药物、试剂及设备的详细信息列于 材料表.

1. 小鼠贫血模型的建立

  1. 使用电子天平称取2 g乙酰苯肼（APH），转移至150 mL烧杯中。加入100 mL生理盐水，用玻璃棒搅拌至APH完全溶解。
  2. 通过皮下注射步骤1.1中配制的2% APH建立小鼠贫血模型。st, 4th，以及 7th 分别以200 mg/kg、100 mg/kg和100 mg/kg的剂量给药数天11.
    注意：从第1天开始，FFEJS（7.8 mL/kg）组和SLBXS（11.7 mL/kg）组小鼠每日一次给予灌胃，持续2周。对照组和模型组小鼠每日一次给予等体积生理盐水，持续2周。

2. 确定肝脏指数

  1. 实验结束时，使用电子天平称量每只小鼠的体重。
  2. 通过吸入2%异氟烷对小鼠进行麻醉。挤压小鼠眼球使其充血并突出，迅速用镊子摘除眼球，并将血液收集至含肝素的样品管中。
  3. 将步骤2.2中已麻醉的小鼠固定于手术操作板上。
  4. 用手术刀沿腹部正中线做完全切口。仔细解剖并分离完整肝脏组织12，然后用电子天平称量其重量。
    注意：每只小鼠的肝脏指数按以下公式计算：肝脏指数 = 肝脏重量 / 体重。

3. 血液学分析

  1. 轻轻摇动步骤 2.2 中含有肝素化血液样本的试管，以防止血液凝固。
  2. 将血液样本置于注射针下方，确保其完全浸没在针头中。
  3. 点击 自动检测 按钮，使用全自动血细胞分析仪测量红细胞计数（RBC）、红细胞压积（HCT）、白细胞计数（WBC）、血红蛋白（HGB）水平和血小板计数（PLT）。

4. 肝脏代谢组学研究

  1. 肝脏样品制备
    1. 取步骤2.4中的肝组织样品（50 mg），用1 mL预冷的甲醇进行匀浆。在4 °C条件下，以18,759 × g离心10分钟，去除沉淀。
    2. 用移液器将200 µL上清液转移至样品瓶中，并在35 °C下使用冷冻干燥机真空干燥2小时。
    3. 将干燥后的样品与40 µL吡啶中含40 mg/mL盐酸甲氧胺的溶液在30 °C下反应90分钟。然后加入80 µL含1%三甲基氯硅烷（TMCS）的N-甲基-N-(三甲基硅基)三氟乙酰胺（MSTFA），在37 °C下孵育60分钟。
    4. 向样品瓶中加入10 µL正己烷以终止衍生化反应。
  2. 肝脏代谢物分析
    1. 使用气相色谱-质谱联用系统（GC-MS）分析衍生化后的样品（1 µL），采用DB-5MS毛细管柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 µm）进行分离。
      注：程序升温条件设置如下：60 °C保持1分钟；以10 °C/min升至325 °C，再保持10分钟。进样口、离子源和质谱温度分别设定为250 °C、230 °C和150 °C。载气为氦气（纯度99.999%），流速为1.1 mL/min，分流比为10:1。电子轰击能量为70 eV，溶剂延迟时间为5.9分钟。
  3. 数据处理与分析
    1. 使用配套的MassHunter软件采集并转换原始GC-MS数据。
    2. 利用自动质谱解卷积与鉴定系统（AMDIS）工具进行谱图分析12。
    3. 通过NIST和HMDB数据库鉴定所有代谢物（参见材料表）。
    4. 将数据导入MetaboAnalyst工具，进行偏最小二乘判别分析（PLS-DA）、t检验、通路分析和网络分析12。

5. 蛋白质印迹分析

  1. 从鼠肝脏组织中提取总蛋白
    1. 取步骤2.4中的50 mg肝脏组织和250 µL细胞裂解液加入1 mL玻璃匀浆器中，冰上研磨5 min。
    2. 用移液器将步骤5.1.1中的肝脏组织匀浆液转移至1.5 mL微量离心管中，在4 °C条件下以18,759 × g离心10 min，然后用移液器将上清液转移至新的1.5 mL离心管中。
  2. 测定蛋白浓度并预处理蛋白样品
    1. 取步骤5.1.2中的上清液2 µL、PBS 18 µL和BCA工作液180 µL加入96孔微孔板8中。
    2. 将微孔板在振荡器上振荡30 s，于37 °C孵育30 min，使用酶标仪测定562 nm处的吸光度。
  3. 采用SDS-PAGE分离总蛋白，转至聚偏二氟乙烯膜，并用5%脱脂奶粉封闭8。
  4. 将步骤5.3中的膜与针对HIF-1α（1:1000）、VEGFA（1:1000）、GLA（1:1000）、NOS3（1:1000）和β-actin（1:5000）的一抗在4 °C孵育过夜。
  5. 将步骤5.4中的膜放入抗体孵育盒中，加入10 mL TBST，室温下以111 × g水平摇动，每次5 min，共洗涤三次以去除未结合的一抗。
  6. 向步骤5.5中的每张膜加入200 µL山羊抗兔IgG（H + L）-HRP（1:1000），室温孵育2 h，然后重复步骤5.5以洗去未结合的二抗（山羊抗兔IgG（H + L）-HRP）。
  7. 向步骤5.6中的每张膜表面加入200 µL超敏ECL化学发光液，立即使用自动化学发光成像分析系统检测蛋白条带。

6. 统计学分析

  1. 使用统计和绘图软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA），随后采用 Tukey 检验分析数据。
  2. 结果以均值 ± 标准差（SD）表示，当 P值 < 0.05 时认为具有统计学显著性。

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结果

为确认贫血小鼠模型的成功建立并分析SLBXS对贫血的影响，首先检测了肝指数及血液学参数。图1显示，与对照组相比，模型组的红细胞计数（RBC）、血红蛋白（HGB）和红细胞压积（HCT）显著降低（P < 0.01）。相反，模型组的肝指数、白细胞计数（WBC）和血小板计数（PLT）明显升高（P < 0.05 或 P < 0.01）。这些结果证实贫血模型已成功建立。与模型组相比，SLBXS组的肝指数、WBC和PLT显著降低（P < 0.05 或 P < 0.01），而模型组降低的RBC、HGB和HCT在SLBXS治疗后显著升高（P < 0.05 或 P < 0.01）。SLBXS组与复方阿胶浆（FFEJS）组之间的各项参数无显著差异。这些结果表明，SLBXS可改善贫血症状。

对照组、模型组、SLBXS组和FFEJS组肝脏样本的典型总离子流色谱图（TIC）见

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讨论

贫血是一种影响全球许多人群的常见疾病，尤其在发展中国家更为普遍1。在中国，患者常使用包括维吾尔医药在内的传统中医药来缓解贫血的症状和体征。SLBXS 是一种已在临床实践中应用多年的维吾尔医药，但其治疗贫血的确切作用机制仍不明确13。本研究建立了乙酰苯肼（APH）诱导的贫血小鼠模型，通过代谢组学分析阐明 SLBXS 治疗贫血的潜在作用机制。

代谢组学是一种有价值的工具，可通过定性和定量分析生物样本中的小分子代谢物来诊断疾病、发现潜在的生物标志物并探索疾病的发病机制。本研究采用乙酰苯肼（APH）构建贫血模型。APH是一种强氧化剂，可对红细胞造成缓慢且进行性的氧化损伤，尤其通过干扰葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，促进血红蛋白（HGB）变性及海因茨小体的形成。此外，APH还可直接破坏红细胞的膜蛋白和脂质，导致红细胞膜裂解、破裂和解体，从而引起溶血性贫血14,15。肝脏作为人体最大的消化腺...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了少数民族科技人才特殊培养计划、新疆维吾尔自治区自然科学基金（2020D03021）、湖北中医药大学中医药重点项目基金（2022ZZXZ004）以及天山创新团队计划（2020D14030）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
乙酰苯肼上海阿拉丁生化科技股份有限公司C13979660
全自动化学发光成像分析系统上海天能生命科学有限公司Tanon-5200
双辛酸（BCA）蛋白定量检测试剂盒赛默飞世尔科技公司QPBCA-1KT
毛细管色谱柱安捷伦 J&W 科学公司，安捷伦科技有限公司DB-5MS
Western与免疫沉淀用细胞裂解液碧云天生物技术公司P0013
三甲基氯硅烷上海阿拉丁生化科技股份有限公司C104814
电子天平梅特勒-托利多国际有限公司ME203E
电子秤梅特勒-托利多国际有限公司LE104E
复方阿胶浆口服液东阿阿胶股份有限公司214020031
全自动血细胞分析仪深圳迈瑞动物医疗科技有限公司IDEXX ProCyte Dx
气相色谱-质谱联用系统（GC-MS）安捷伦科技有限公司7890B-5977B 
GLA一抗博奥世公司BS77041
玻璃匀浆器上海雷鼓仪器有限公司B-013001
玻璃棒 上海雷鼓仪器有限公司B-003904
GraphPad Prism 软件 GraphPad, La Jolla版本 9.0
肝素抗凝采血管常德百康美安生物科技有限公司B-ACT1P5
HIF-1α一抗博奥世公司BS3514
HMDB数据库http://www.hmdb.ca/—
异氟烷河北金达富制药有限公司20231202
雄性C57BL/6小鼠辽宁长生生物技术股份有限公司编号 SCXK [辽] 2015-0001
MassHunter安捷伦科技有限公司B.08.00
MetaboAnalyst 5.0https://www.metaboanalyst.ca/—
甲氧胺盐酸盐上海阿拉丁生化科技股份有限公司E1818113
正己烷上海阿拉丁生化科技股份有限公司C14878803
NIST数据库http://webbook.nist.gov/chemistry/—
NOS3一抗博奥世公司BS3625
吡啶上海阿拉丁生化科技股份有限公司C13026996
生理盐水百奥赛图生命科学公司2308262009
十八补血口服液新疆维吾尔药业股份有限公司211277
手术操作板DIXSGZK-JPB-A
VEGFA一抗博奥世公司AP0742
β-actin艾博克隆（上海）贸易有限公司AC026

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