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可扩展的生物制造工艺流程用于生产与分离自然杀伤细胞来源的基于细胞外囊泡的癌症生物治疗剂

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DOI：

10.3791/67227

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2024年8月16日

 ,  ,  , 
1Biologic and Radiopharmaceutical Drugs Directorate, 2Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology Institute, University of Ottawa, 3Centre for Infection, Immunity and Inflammation Institute, University of Ottawa, 4Regenerative Medicine Program, Ottawa Hospital Research Institute

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

自然杀伤细胞来源的细胞外囊泡（NK-EVs）作为癌症生物治疗剂具有广阔的应用前景。本研究基于方法学，提出了一种可放大的封闭式生物制造工艺流程，旨在持续生产并分离出大量高纯度的NK-EVs。在整个生物制造过程中进行过程控制检测，确保所获得的EVs符合产品放行的质量标准。

摘要

自然杀伤细胞来源的细胞外囊泡（NK-EVs）正在被研究作为癌症生物治疗剂。这类囊泡具有独特的性质，既可作为靶向癌细胞的细胞毒性的纳米囊泡，又可作为免疫调节信号传递介质。一种可放大的生物制造工艺流程能够生产出大量高纯度的NK-EVs，以满足临床前及临床应用的需求。该工艺采用封闭式中空纤维生物反应器，在符合药品生产质量管理规范（GMP）标准的无血清、无异源物、无饲养层细胞且无抗生素的条件下，实现NK92-MI细胞系持续生产NK-EVs。本研究基于标准化操作流程，概述了利用尺寸排阻色谱法、超滤法以及基于滤膜的除菌工艺来分离纯化NK-EVs的生物制造流程。通过纳米颗粒追踪分析对NK-EVs产品进行关键表征，并采用经验证的基于细胞活力的效价检测方法评估其对癌细胞的功能活性。该可放大的生物制造工艺通过遵循最佳实践并确保可重复性，有望显著推动NK-EV类癌症生物治疗药物的临床转化。

引言

在21世纪st 世纪以来，人类在抗击癌症方面取得了显著进展，这主要得益于癌症免疫治疗药物的兴起。这类药物通过调动免疫系统来对抗癌症。自然杀伤细胞来源的细胞外囊泡（NK-EVs）已成为免疫治疗新兴领域中极具前景的候选手段。自然杀伤细胞（NK细胞）在固有免疫和适应性免疫中均发挥整合性作用，对病毒感染细胞、应激细胞及恶性肿瘤细胞的清除至关重要。它们通过一系列强大的抗癌机制，以细胞毒性方式清除异常细胞。1,2,3其中一种机制是细胞外囊泡（EVs）的产生与分泌，这些纳米级双层结构含有多种生物分子，如蛋白质、RNA和DNA，在介导细胞间通讯中发挥关键作用。4,5,6NK-EVs 由于其独特的载体特性，成为极具前景的无细胞治疗剂。这些特性包括体积小，可实现基于滤膜的除菌；生物相容性高；在肿瘤组织中具有优先富集的倾向；可递送多种类型的 cargo；能够跨越血脑屏障等生物屏障；且毒性极低。NK-EVs 在多个方面避免了给药前需通过化疗进行患者淋巴细胞耗竭的必要性：1）传统上，淋巴细胞耗竭旨在为细胞治疗创造更有利的体内环境，使输注的细胞得以增殖并发挥治疗作用；2）与细胞不同，EVs 不具备复制能力，且体积显著更小；3）EVs 通过与细胞不同的机制发挥作用，且相较于细胞具有更低的免疫原性。5,6,7此外，NK-EVs 始终表现出 体外 在多种癌症模型中表现出疗效，并且还显示出对促进抗癌反应的免疫细胞具有免疫调节作用8,9. 体内 结果证实了这些发现，显示经 NK-EV 治疗后肿瘤发生退缩，且毒性反应可忽略不计10,11,12因此，基于NK-EV的治疗策略在应对冷型、免疫惰性实体瘤的治疗挑战方面具有广阔前景13,14,15,16,17.

我们最近的研究通过生物制造技术解决了一个制约NK-EVs临床转化的重大瓶颈7。该文章提出了一种经济高效且可放大的NK-EVs生物制造工作流程的概念验证，该流程经过精心设计，以确保生产过程中的质量控制检测。该方法持续生产出大量高纯度的基于NK-EVs的癌症生物治疗产品，并依据MISEV2018指南对产品进行了全面表征18。通过增大生物反应器卡匣尺寸或并行运行多个生物反应器，可实现生物制造流程的可扩展性。同样，通过采用基于快速蛋白液相色谱（FPLC）的尺寸排阻色谱（SEC）、超滤（UF）以及基于滤膜的除菌技术，EV分离流程的可扩展性也易于实现。封闭式中空纤维生物反应器（HFB）系统在无需添加血清、饲养细胞体系或抗生素的条件下，成功培养了IL-2自给型NK细胞系（NK92-MI细胞）。该过程使用了一种商业化的化学成分明确且无异源成分的培养基（目前已有符合GMP标准的商业化版本）。结果表明，在单个中等尺寸生物反应器卡匣中，仅用5至7天即可成功生产出大量NK细胞（109个活细胞）和NK-EVs（1012个EVs），并对两种产物进行了广泛表征。在整个生物制造过程中，通过pH值、葡萄糖和乳酸水平等可量化指标，以及培养基颜色变化和污染迹象等视觉指标，每日监测细胞健康状况，这些是预测细胞和EV质量的关键因素。对HFB系统中收获的NK细胞活力和功能（特别是细胞毒性）的后续评估显示，其显著优于传统培养瓶培养体系7。同样，纯化后的NK-EVs表现出高纯度特征，不含细菌、支原体、常见病毒及细胞组分，且内毒素水平极低。重要的是，纯化后的NK-EVs占最终产品中所有纳米颗粒的99.9%以上7。最后，这些纯化的NK-EVs保留了NK细胞的关键特征，包括表面标志物（CD2、CD45、CD56）、细胞因子载荷（GzmB、PFN、IFN-g），并在针对白血病K562细胞的实验中表现出强效的细胞毒性，而K562细胞系是评估NK细胞毒性的金标准细胞系7。

本方案详细阐述了上述可扩展的生物制造流程。该方案阐明了利用FPLC-SEC联合超滤（UF）及基于滤膜的除菌方法来分离自然杀伤细胞外囊泡（NK-EVs）的技术方法。此外，方案还描述了关键步骤，包括通过纳米颗粒追踪分析（NTA）对产品进行表征、利用多种工具（蛋白质/双链DNA定量及微生物检测）进行质量评估，以及通过细胞活力检测对纯化的NK-EV产品在抗癌细胞中的功能进行验证。通常情况下，该流程可从约40 mL富含EV的条件培养基中获得1.0–1.5 mL的NK-EV产品，平均浓度为1.18 × 1012 EVs/mL7，总产量至少达到1 × 1012 个EVs。该工艺可释放满足多种下游应用需求的产品，适用于需要大量高质量EVs的探索性研究、临床前研究以及多组学研究（蛋白质组学、转录组学、基因组学、代谢组学、脂质组学和表观基因组学），并具备向临床转化的潜力，且已证明具有良好的可重复性。

方案

1. 使用闭环生物反应器从NK92-MI细胞进行NK-EV的生物制造

注意：NK-EVs 采用可放大的生物制造工艺生产，该工艺遵循药品生产质量管理规范（GMP），并使用 NK92-MI 细胞（见图1）。我们近期发表的研究已详细阐述了该生物制造流程以及 NK-EVs 产品的身份特征和安全性概况7。

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图1：在封闭式中空纤维生物反应器（HFB）中进行自然杀伤细胞来源的细胞外囊泡（NK-EVs）的生物制造，并结合可放大的分离流程。 生物制造流程的示意图，用于大规模生产高纯度的NK-EV产品。将IL-2自给型NK92-MI细胞接种至封闭式HFB模块中，在无血清（SF）、无异源物（XF）、无饲养层且无抗生素的条件下培养，持续收集富含EV的条件培养基。通过基于快速蛋白液相色谱的尺寸排阻层析（FPLC-SEC）联合超滤（UF）技术，从富含EV的条件培养基（CM）中分离NK-EVs。通过多种检测方法对NK-EVs进行表征和评估，并利用细胞活力效价实验评价其对K562白血病细胞的功能活性。本图经修改自7（使用Biorender.com创建）。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 从 1 - 5 x 10 开始6 NK92-MI 细胞并维持细胞密度在 3 - 8 x 105 细胞/mL，使用预热的培养基在T25-T175培养瓶中培养细胞。于37℃、5% CO₂培养箱中孵育 37 °C 含5% CO2 （参见 材料表）。每2-3天更换一次培养基，直至达到1 x 108 NK92-MI 细胞的存活率至少为 70%。
    注意：保留1/5th-1/3rd 在重新接种细胞时保留条件培养基（CM），因其含有利于细胞生长的生长因子。
  2. 进行中等HFB cartridge的制备及NK细胞接种，具体步骤如下所述。
    注意：所有操作均应在II级生物安全柜内进行，以确保并维持无菌状态。将 cartridge 系统移入生物安全柜前，应使用70%乙醇充分喷洒，特别注意储液瓶瓶颈和注射器连接处。
    1. 根据制造商的说明准备 HFB 羧酸酯柱19 （参见 材料表；参见 图2如下所述。
      1. 用石蜡膜包裹鲁尔锁扣连接处，并根据制造商说明书调整泵的流速19. 通过加入150 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS；参见 材料表至少循环五天。
      2. 为去除细胞外毛细血管空间（ECS；体积约为29 mL）中的空气，通过左侧ECS端口注入约40 mL PBS，并使空气从右侧ECS端口排出。操作过程中，关闭左侧和右侧末端端口的夹具。确保注射器始终连接在左侧和右侧ECS端口。
      3. 完成后，将 cartridge 置于流泵上（参见 材料表) 置于设定为 37 °C 和5% CO₂2确保循环数天后无泄漏。
    2. 在将细胞接种至 cartridge 前 2 天，将储液瓶中的 PBS 替换为 150 mL 培养基。使用培养基重复之前的预处理步骤（步骤 1.2.1），持续循环 2 天。
    3. 在接种细胞前，将储液瓶和ECS中的内容物更换为250 mL新鲜培养基。
    4. 从培养箱中取出培养瓶，将细胞转移至50 mL离心管中。以300 x g 5 分钟后，用 21 mL 培养基重悬细胞沉淀。
    5. 制备两份等量样品 20.5 µL 每次从细胞悬液中取样，用于自动细胞计数仪进行细胞计数（参见 材料表）。向每个 20.5 µL 细胞悬液等分试样，加入等量的AO/PI染料（参见 材料表）并上下混匀至少10次。
      注意：不建议使用台盼蓝进行准确的NK细胞计数。可选择使用血细胞计数板进行人工计数。
    6. 加载 20 µL 将细胞悬液分别加入计数板的每个计数室中，使用相应的程序进行自动细胞计数。计算平均活细胞浓度，并记录细胞活力。
    7. 在使用20 mL注射器和18 G针头吸取前，将NK细胞溶液轻轻混匀数次以保持无菌状态。该溶液应含有约1 × 108 约20 mL或约5 x 10的活NK细胞6 cells/mL
    8. 移除注射器针头后，通过左侧ECS端口将NK细胞轻柔地注入 cartridge 中。为确保细胞在 cartridge 内均匀分散，使用连接在左侧和右侧ECS端口的注射器，轻柔地来回推动细胞悬液至少10次。
      注意：溶液在两个注射器中的浑浊度应均匀一致，且左右两端的端口应处于关闭状态。
    9. 打开左侧和右侧端口，注入注射器中剩余的液体。使用夹具关闭左侧和右侧ECS端口。
    10. 将 cartridge 转移至培养箱中，静置 30 min 后正确安装到流泵上。将 cartridge 保留在系统中用于生物制造。根据制造商说明调整流速。
    11. 为监测细胞健康指标，每天从储液瓶中充分混匀的培养基中取 0.5 mL 样本，并于 -20 °C 在验证葡萄糖和 pH 水平后。L-乳酸水平可后续验证（参见 材料表).
    12. 每隔1至2天更换储液器中的培养基（250–500 mL），以维持培养基中葡萄糖含量高于初始水平的50%，且pH值高于7.0（范围为7.0–8.0）。
  3. 在首次接种 cartridge 后休息 1 天，随后每日进行富含 NK-EV 的 CM 收集，具体操作如下所述。
    1. 将 cartridge 系统移入生物安全柜中。通过左侧 ECS 端口缓慢注入约 21 mL 培养基，以推动等体积的富含 EV 的 CM 从右侧 ECS 流出——切勿混合（参见 图3).
      注意：始终使用新的塑料器皿，以防止污染。
    2. 将富含EV的CM溶液转移至50 mL离心管中，于300 x g离心 g 5 分钟。同时，将 cartridge 系统移回流泵上的培养箱中。
    3. 将上清液转移至新管中，在2000 x g条件下离心 g 10分钟。再次将上清液转移至新管中。然后，将富含EV的CM等量分装至3个50 mL离心管中（每管约7 mL），并于−80 °C 直至进一步处理。
      注意：分步收集的富含EV的CM合并至这三个管中，生成三个技术重复样本管。
  4. 进行HFB-NK细胞收获，以继续使用相同的HFB cartridge产生富含EV的CM，具体步骤如下所述。
    注意：可通过执行HFB-NK细胞收获方案，从HFB的ECS中收获NK细胞" 当培养筒达到汇合状态时（最多1 x 109 细胞） 这通常在每批培养 5 至 7 天后发生，或当连续两天测得的葡萄糖含量低于血糖仪的检测限（例如无读数或读数约为 0）时发生。如果这是最终的细胞收获，可用 PBS 替代培养基冲洗 cartridge 以收集细胞。
    1. 按照上述步骤1.3中详细说明的方法收集富含EV的条件培养基。
    2. 通过左侧ECS端口注入约50 mL培养基。为确保细胞在 cartridge 内均匀分散，使用连接在左侧和右侧ECS端口的注射器轻柔地前后推动细胞悬液至少10次，以松解细胞，最后通过右侧ECS端口用注射器推动并收集细胞。将收集到的富含EV的CM转移至50 mL离心管中。置于一旁备用 37 °C （水浴锅或培养箱）暂存。
      注意：在细胞被完全推出并通过右侧 ECS 端口用注射器收集之前，推回操作有助于松动细胞。当左侧和右侧末端端口关闭时，两个注射器中的溶液应具有相同的浑浊度。轻敲生物反应器 cartridge（物理扰动）可预先松动 cartridge 底部的细胞簇。剧烈的来回混悬细胞悬液可能对回收细胞的活力产生不利影响。应谨慎操作并保持耐心，以最大限度地提高细胞活力。
    3. 重复上一步骤两次，总共应获得150 mL细胞悬液。在300 x g 5 分钟。弃去上清液。
    4. 将两个细胞沉淀分别重悬于20 mL新鲜培养基中，然后混合。取两份等量样品 20.5 µL 每份细胞悬液用于在自动细胞计数仪上进行细胞计数（参见 材料表).
      注意：通常需要使用 PBS 作为稀释液进行多次细胞稀释，以使细胞浓度落在细胞计数仪的动态范围内。
    5. 加入到 20.5 µL 细胞悬液等分试样，加入等量的AO/PI染料（参见 材料清单）并上下吹打至少10次。上样 20 µL 将样品加入计数板的每个计数室中，并使用相应的程序进行自动细胞计数。
    6. 对所有经稀释校正后的活细胞浓度取平均值，计算活细胞总数，并记录细胞活力。如上所述，为了使用同一生物反应器 cartridge 持续生产富含 EV 的 CM，重新接种 1 x 108 HFB 制备的 NK 细胞
      注意：如有需要，可使用冷冻保存培养基和控制冷冻速率的冻存容器来冻存HFB产生的NK细胞（参见 材料表).

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图2：中空纤维生物反应器（HFB）系统的组件与装置设置。 储液瓶（1）中含有完全培养基，通过蠕动泵（未显示）作用于泵管（3）使培养基在生物反应器 cartridge（2）中循环。细胞通过左侧（4）和右侧（5）的胞外毛细管空间（ECS）侧端口引入ECS。当ECS滑动夹关闭后，左侧（6）和右侧（7）的末端侧端口保持开放，以允许培养基在整个系统中循环。请注意，在培养基瓶盖附近的鲁尔锁连接处添加了石蜡膜，以防止潜在污染。请点击此处查看该图的放大版本。

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图3：NK-EV 分离流程的示意图。 每日收集富含细胞外囊泡（EV）的条件培养基（CM）后，通过差速离心去除细胞（第一次离心，300 × g，5 分钟）和细胞碎片（第二次离心，2000 × g，10 分钟）。澄清后的富含 EV 的 CM 储存于 -80 °C，待进一步处理。准备进行 NK-EV 分离时，将冷冻的富含 EV 的 CM 解冻，并再次离心以确保彻底去除细胞碎片（第三次离心，10,000 × g，30 分钟）。随后，在 37 °C 下用核酸内切酶处理富含 EV 的 CM 2–4 小时，以降解被视为宿主细胞污染物的核酸。接下来，采用基于快速蛋白液相色谱的尺寸排阻层析法（FPLC-SEC），利用双峰树脂对富含 EV 的 CM 进行纯化。收集约 10–15 mL 的洗脱组分，合并后经 0.22 µm 滤器过滤，以确保最终 NK-EV 产品的无菌性。通过超滤浓缩，产品浓度可提高约 35–50 倍，最终浓度保证超过 1 × 1012 个 EV/mL，总体积为 1.0–1.5 mL。该图已根据文献7 修改（使用 Biorender.com 创建）。请点击此处查看此图的放大版本。

2. 通过FPLC-SEC联合超滤及滤膜除菌法纯化NK-EV

  1. 配制以下溶液，并进行两次过滤 使用一个 0.1 µm 滤膜（参见 材料表：水（电导率为 0 mS/cm），PBS：50 mL 10x PBS + 450 mL 水（电导率约为 14.7 mS/cm），20% 乙醇，清洗液（0.5 M NaOH 和 30% 异丙醇溶于水中）
  2. 根据制造商的说明启动FPLC系统（参见 材料表）。根据制造商说明书进行运行前和运行后的原位清洗（CIP）步骤。使用双滤水（DF水）、清洗液、DF水和DF-PBS清洗所有管路和柱树脂并进行冲洗。
    注意：如有需要，CIP 可在另一天进行。
  3. 使用装有双峰型树脂的层析柱（参见 材料表) ，床层高度为 20 cm。使用滴对滴连接法进行连接，以确保柱内不引入空气。
  4. 使用合适的收集管安装馏分收集器，并将分馏设置调整为所需的收集体积（例如，15 mL）。放置足够数量的收集管，另加两支额外的收集管，以确保收集全部样品体积。
  5. 按照下述方法进行样品制备。
    1. 取40 - 80 mL富含EV的CM，来自-80 °C 冷冻并迅速解冻于 37 °C将样品加入超速离心机，以10,000 x g 30 分钟 4 °C.
      注意：离心管必须按重量精确平衡，而非按体积。
    2. 离心后，收集上清液并转移至新管。为降低双链DNA水平，用50 U/mL核酸内切酶和1.5 mM MgCl₂处理富含细胞外囊泡的条件培养基。2 （参见 材料表）。在培养箱中孵育2 - 4小时（37 °C），允许适度混合。
  6. 当系统（管路和柱子）准备好用于EV分离时，将富含EV的CM加入60 mL注射器中，并连接至样品管路。点击启动系统 手动运行 并将流速设为 0。按照软件提示预先保存运行数据，然后点击 开始.
  7. 选择 B线（DF-PBS） 以150 cm/h的流速（流速为2.0 mL/min）进行洗脱，确保溶液流经层析柱。
  8. 当电导率稳定后，按下“Auto Zero UV”按钮。切换流路，使样品在进入色谱柱前直接流入废液瓶。确保系统中未引入气泡。
  9. 最多5至20秒后，将样品导入色谱柱。点击 组分分离 当紫外读数达到约 230 mAU 时。
  10. 样品完全注入系统后，将缓冲系统切换至DF-PBS（在样品阀处）以继续纯化。点击 组分分离 当紫外值再次达到约1600 mAU时。
    注意：这对应于紫外吸收读数与电导率读数的交点。延长分级时间只会稀释截留液，而不会提高EV得率。
  11. 合并所有组分（稀释的NK-EVs），并于 4 °C 直至准备进行滤膜除菌和超滤（UF）。
  12. 继续运行 DF-PBS，直至紫外吸收值达到约 1000 mAU。此后停止运行，并将色谱图保存为 PDF 文件。

3. 基于NK-EV产品滤膜的超滤除菌与浓缩

  1. 将离心机冷却至 10 °C。用 20 - 30 mL 的 90% 乙醇冲洗超滤装置的每个部件（见材料表）以进行消毒。在 4000 x g 条件下离心 5 - 10 分钟。
    注意：滤膜由 10 kDa 截留分子量（MWCO）的再生纤维素制成。
  2. 弃去滤过液，然后使用无菌 PBS 再次冲洗，以平衡装置。总共重复此步骤 2 次。
  3. 为最大限度保证无菌性，使用预先用 DF-PBS 润湿的 0.22 µm 注射器滤器（见材料表）过滤稀释后的 NK-EV 溶液。将滤液直接收集至已灭菌的浓缩装置中。
  4. 在 4000 x g 条件下离心 15 - 40 分钟（离心时间取决于样品）。离心后，使用移液管在滤膜上层腔室中轻轻混匀溶液，再于 4000 x g 条件下额外离心 10 分钟。
    注意：混匀步骤为可选，其作用仅为防止外泌体堵塞膜孔，从而便于浓缩过程。
  5. 暂时保留滤过液，通过将过滤装置倒置并连接至收集装置来收集 NK-EV 样品。
  6. 在 2000 x g 条件下离心 2 分钟。将纯化后的 NK-EV 产物转移至 2 mL 离心管中。短期使用（≤ 7 天）时可在 4 °C 保存，长期使用时应于 -20 °C 冷冻保存。

4. 通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）表征NK-EV

  1. 配制溶液并用 0.1 µm 滤膜过滤两次（见材料表）：水、PBS、清洗液（水中含 10% 次氯酸钠（注意））。
  2. 根据制造商说明启动纳米颗粒追踪分析（NTA）系统。同样地，执行运行前和运行后的原位清洗（CIP）步骤。使用双次过滤水（DF 水）、清洗液和 DF 水清洗所有管路并冲洗。使用 DF-PBS 平衡管路。
  3. 检查流动池并查看是否存在气泡。如有气泡则将其去除。确认无气泡后，小心地将流动池重新插入 NTA 仪器中。
    注意：尽管制造商不推荐，但难以去除的气泡可通过用 20% 乙醇冲洗，随后用 DF 水冲洗轻松去除。
  4. 当流动池安装到位且仪器门关闭后，点击启动相机。当管路中充满 DF-PBS 时，屏幕上应显示极少数量的颗粒。
  5. 将捕获参数设置为屏幕增益 2、相机水平 14。同时开启加热器，以使流动池温度稳定。
  6. 点击标准测量，在 SOP 选项卡下创建一个脚本，用于以每帧 30 个颗粒、23 °C 的条件进行 1 分钟的单次捕获。
  7. 在其下方，向路径名称中添加文件夹和文件名，以保存数据。
  8. 提前使用 DF-PBS 对纯化的 NK-EV 产物进行稀释。进行 NTA 检测时，准确量化要求每帧可见 30–80 个颗粒。
  9. 上样前将样品涡旋混匀（见材料表）。
  10. 小心地将 1 mL 采样注射器连接至仪器进样管路。管路中不得含有空气，否则会影响采集和分析结果。缓慢推动一半样品，使注射器中保留约 0.5 mL。
  11. 当屏幕上可见颗粒时，调节相机焦距，使每个颗粒周围最多出现一个光晕。在“硬件”选项卡下点击注入，以 1000 的速率持续 5 秒，然后将速率降至 30。
  12. 点击运行脚本并按照提示操作。软件将确认温度设置，并询问参数是否正确。点击是并继续遵循软件提示。
  13. 完成捕获后，当软件提示处理或导出文件时，点击取消。然后在“硬件”选项卡下点击注入，以 1000 的速率持续 10–15 秒。同时重新开启加热器和相机。随后将流速降至 30，直至颗粒开始移动。
  14. 重复前述步骤，再采集四次数据。每种稀释度完成总共五次捕获后，导入全部五次捕获数据进行分析。
  15. 通过高亮选择需处理的文件，点击处理所选文件。在“处理”选项卡下，将分析参数设置为屏幕增益 2、检测阈值 15。
    参数设置依赖于样品特性；确保每帧可见 30–80 个颗粒。
  16. 检查无误后点击确定开始分析。
  17. 文件处理完成后，软件将提示是否导出。点击是（不要勾选其他选项）或直接点击导出。
  18. 对所有 EV 稀释样品或样本重复上述步骤。所有样品检测完毕并完成 CIP 后，关闭 NTA 仪器。

5. 质量保证测试

  1. 采用以下两种方法进行微生物检测：1）将少量纯化的NK-EVs加入到高压灭菌的LB肉汤培养基中，以及2）使用少量纯化的NK-EVs进行支原体PCR检测（参见材料表）。
    1. 检测1：将LB培养基在37 °C下培养，最长培养5天，并设置阳性和阴性对照。如有需要，记录OD600值。
    2. 检测2：根据试剂盒制造商的操作说明进行支原体PCR检测。
  2. 按照制造商说明书，使用基于荧光计的检测方法对纯化的NK-EVs稀释液中的蛋白质和双链DNA（dsDNA）进行定量分析（参见材料表）。

6. 使用经验证的高灵敏度基于刃天青的细胞活力检测法评估经NK-EV处理的癌细胞的效力 20

  1. 在进行效力检测前数天，使用含10%热灭活FBS的RPMI-1640培养人K562白血病细胞（参见材料表）。维持细胞密度在2 - 8 × 105 个细胞/mL之间，每2 - 3天更换一次培养基。
  2. 取一个96孔平底板（参见材料表），预先加入用于归一化目的的检测培养基体积（补充5%去EV的FBS）（参见材料表），每孔终体积为150 µL。
    注意：建议使用重复加样器以减少孔间差异。
  3. 取细胞培养物转移至离心管中，在300 × g 条件下离心5分钟。用2 - 5 mL检测培养基将细胞沉淀重悬为单细胞悬液。
  4. 取20.5 µL细胞悬液用于自动细胞计数仪进行细胞计数（参见材料表）。
  5. 向20.5 µL细胞悬液中加入等体积的AO/PI染料（参见材料表），上下吹打混合至少10次。
    注意：推荐使用AO/PI进行准确的细胞计数；也可选择使用血细胞计数板进行手动计数。
  6. 将20 µL样品分别加入细胞计数板的每个计数室，使用相应程序进行自动细胞计数。取活细胞浓度的平均值并记录细胞活力。
  7. 将约1 × 106 个细胞转移至另一离心管中，用检测培养基精确稀释至7 mL，并重复细胞计数。细胞浓度应约为1.2 - 1.5 × 105 个活细胞/mL。
  8. 如上所述，将单细胞悬液浓度调整至1 × 105 个活细胞/mL，必要时重复细胞计数。
    注意：技术重复计数之间的变异系数应低于25%；使用AO/PI计数时通常低于5%。
  9. 达到目标浓度后，向每孔加入50 µL（±1 µL）细胞悬液，使每孔细胞数尽可能接近5000个（4900 - 5100个细胞/孔）。每个检测条件设置技术重复三孔，并使用重复加样器以减少孔间差异。
  10. 将培养板置于摇床（350 - 500 RPM）上振荡2分钟，随后将细胞放回培养箱，待进行NK-EV处理。
  11. 使用检测培养基配制所需NK-EV稀释液（1:5、1:10和1:100）。
  12. 从上述稀释液中测试以下EV浓度：1 × 108、5 × 108、1 × 109、5 × 109、1 × 1010、5 × 1010 和 1 × 1011 粒子/mL。给药体积不得超过总检测体积的20%。
  13. 准备就绪后，将所需稀释液的相应体积加入目标EV浓度处理孔中。向阳性对照孔中加入15 µL 10× Triton-X（参见材料表）。最终每孔体积应归一化至150 µL。
  14. 将培养板置于摇床（350 - 500 RPM）上振荡2分钟，随后在37 °C、5% CO2 培养箱中孵育3小时。
  15. 将酶标仪预热至37 °C（参见材料表），并加载以下程序：37 °C孵育（减少温度波动引起的差异），450 RPM振荡混匀1分钟，然后读数。
  16. 向每孔加入15 µL基于刃天青的检测试剂（参见材料表）。避免光照，使用重复加样器以减少孔间差异。
  17. 将培养板置于摇床（350 - 500 RPM）上振荡2分钟，随后转移至培养箱中孵育60分钟。使用蘸有乙醇的枪头去除气泡。使用激发波长560 nm、发射波长590 nm读取数据。
  18. 数据分析：对技术重复样本取平均值，并在进行剂量-反应分析前扣除背景值。采用非线性回归拟合抑制效应曲线，绘制log(抑制剂) vs. 归一化反应-可变斜率（无约束条件）曲线。记录Hill斜率（Hillslope）和EC50 值。

结果

NK-EVs 具有内在的细胞毒性功能，并在多种癌症模型中表现出高效性。然而，目前关于适用于 NK-EVs 大规模生产的生物制造工艺流程，尚缺乏统一的标准6,21。我们之前的研究已证实，采用封闭式中空纤维生物反应器（HFB）系统可大量制备高纯度的 NK-EVs 产品7。作为后续研究，本基于实验方案的研究详细描述了该生物制造工艺流程，并通过制备和分离 NK-EVs 产品来验证其可重复性（图 1）。此外，在产品放行前必须进行关键的产品表征与验证，本研究中展示了相关的新颖且原始的数据。

由于HFB系统具有操作简便、可靠性高、可扩展性强以及符合GMP规范等优点，因此被选用于NK-EV的生产7。在HFB系统的设置过程中，NK细胞通过左侧ECS端口注入，并接种至生物反应器盒中（图2）。同时，将培养基瓶通过侧端口连接至HFB系统，使培养基在整个系统中循环流动。NK细胞在无血清、无异源成分、无饲养层细胞且无抗生素的培养基中进行培养，当葡萄糖含量降至50%以下时更换培养基，以维持并最大程度保障细胞的长期健康状态。条件培养基（CM）每日收集，经差速离心处理后，于-80 °C冷冻保存，直至进行后续处理。随后，通过差速离心联合FPLC-SEC并结合超滤（UF）和过滤技术进行EV的分离纯化（图3）。最终获得浓缩且无菌的NK-EV产品，终体积约为1.0 - 1.5 mL。文中提供了NK-EV经FPLC-SEC分离的代表性层析图谱（图4）。在进行FPLC-SEC处理前，富含NK-EV的条件培养基需经核酸内切酶处理，显著降低双链DNA（dsDNA）水平，从而减少潜在的宿主（NK）细胞污染物7。因此，该EV分离流程可有效去除NK-EV产品中的细胞碎片及RNA/DNA污染物，这对于确保终产品具有较低的非预期免疫原性，并适用于后续研究至关重要。

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图4：快速蛋白液相色谱尺寸排阻法分离NK-EV过程中生成的色谱图。 蓝线代表吸光度（mAU；最大读数为2000 mAU），红线代表电导率，红色文字代表运行日志，灰色阴影区域代表分步收集的NK-EV（由T2至T7组分表示）。 请点击此处查看该图的放大版本。

分离后，通过基础的NK-EV表征和质量控制检测，评估NK-EV产品是否可用于后续下游实验。采用纳米颗粒追踪分析（NTA）测定NK-EV产品的粒径范围和浓度，其直径范围为76.30 - 174.30 nm（D10 78.38 ± 2.07 nm, D50 106.72 ± 2.43 nm，以及 D90 169.80 ± 4.17 nm）和平均浓度为1.39 × 1012 EVs/mL（图 5A- B）。此外，荧光计定量显示蛋白质和双链DNA浓度为298.90 ± 66.62 mg/mL 和 225.60 ± 37.7 ng/mL，分别对应于最终产品图5C- D）。这相当于平均比率为 5.06 x 106 EV/µg 蛋白质和6.16 x 1012 EV/µg DNA。微生物和支原体检测结果均为阴性（数据未显示）。这些结果与先前研究中对NK-EVs的表征一致7较早的出版物7 还依据MISEV指南对NK-EV产品进行了进一步的深入表征（即透射电镜、Western印迹、内毒素水平、病毒实体检测，以及表面抗原和细胞因子的流式细胞术分析）。

最后，通过经验证的高灵敏度、基于刃天青的细胞活力检测法评估了NK-EV产品的功能（即对癌细胞的细胞毒性），该检测在NK-EV处理白血病细胞系K562后进行7,20。NK-EV处理K562细胞3小时后，细胞活力呈现剂量依赖性变化，对应的EC50为9.33 × 109 EVs/mL（即杀死50%细胞群体所需的剂量；图6A-B）。因此，根据上述产品放行标准，NK-EV产品被认为适用于进一步的实验研究。

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图5：纯化后的NK-EV产物表征。（A）通过NTA测定的NK-EV产物粒径分布，数据表示5次独立实验的平均值，每次实验包含10个技术重复（5次视频采集×2种稀释度）。（B）通过NTA测定的NK-EV颗粒产物浓度（particles/mL），数据表示5次独立实验的平均值±标准差（SD），每次实验设技术重复2次。（C）使用荧光计测定的NK-EV产物蛋白浓度（mg/mL），数据表示5次独立实验的平均值±标准差（SD），每次实验设技术重复3次。（D）使用荧光计测定的NK-EV产物双链DNA浓度（ng/mL），数据表示5次独立实验的平均值±标准差（SD），每次实验设技术重复3次。请点击此处查看该图的放大版本。

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图6：纯化后的NK-EV产物功能验证。 通过高灵敏度的基于刃天青的细胞活力检测法，检测不同浓度NK-EV处理3小时后对人K562白血病细胞的杀伤效应，结果显示NK-EV具有剂量依赖性的细胞毒性。(A) 标准化的检测结果（绿色实线代表未处理的K562白血病细胞对照组，黑色虚线代表经去垢剂裂解的K562白血病死细胞对照组）；数据来自11次独立实验，每组设三个技术重复，以均值±标准误（SEM）表示。(B) NK-EV处理的EC50曲线分析（采用可变斜率拟合），包含95%置信区间/预测带（红色虚线代表50%效应响应水平）。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

多项研究表明，NK-EVs 作为抗癌治疗剂具有巨大的潜力4,5,7,9,16,22,23,24,25,26,27,28,29,30。然而，为进一步开展临床前测试及未来的临床应用，亟需建立一种可扩展且符合药品生产质量管理规范（GMP）的生物制造系统，以实现高纯度 NK-EVs 的大量生产。为解决这一问题，先前一项研究采用封闭式中空纤维生物反应器（HFB）系统，持续培养 NK 细胞并获得富含 NK-EVs 的条件培养基（CM），适用于后续实验。由于其三维结构设计，HFB 系统能够高度模拟血管系统的环境，并具有极高的比表面积，可支持超过十亿个细胞长期培养，从而显著提高 EV 的产量7,31,32。尤为重要的是，该研究首次报道了利用 HFB 系统培养 NK 细胞，这可能得益于所用细胞系对 IL-2 的自给自足特性7。

必须采取额外步骤以确保HFB系统的无菌性以及高纯度NK-EVs的生产。这些预防措施在缺乏无菌洁净室的条件下尤为重要，而许多研究机构可能正面临这种情况。在将HFB系统移入生物安全柜之前，需仔细喷洒70%乙醇，以对所有外表面进行消毒。此外，所有鲁尔锁接头均需用封口膜包裹，以最大限度降低污染风险。这一点尤为关键，因为该生物制造流程不使用抗生素，而抗生素已知会影响细胞及其衍生产品的生化特性33。在细胞产品生物制造过程中，采用了多种指标评估细胞健康状况。例如，每日检测储液罐培养基的pH值、葡萄糖和乳酸水平，这些是监测细胞健康状况的重要替代指标。除定量评估外，对HFB系统的定性观察（如培养基颜色以及浑浊等污染的可见迹象）也有助于监测细胞健康状况。每日收集的条件培养基（CM）中的细胞计数并未被发现能代表整体培养物活力的有效指标（数据未显示）。这可能是由于在CM取样时收集到了滞留在管路中无法循环区域（即ECS与ECS注射器端口之间的小段管路）的死亡细胞，从而低估了整体细胞培养的活力。只有在每批次生产结束时从HFB系统收获的NK细胞才能提供反映培养体系健康状况的可靠指标。这些细胞在不同生产批次中始终表现出高于70%的活力值7。综上所述，这些质量评估方法共同确保了高纯度NK-EVs的持续生产。

已开发出多种分离技术用于纯化和分离EVs34。其中一种方法是尺寸排阻色谱法（SEC），该方法利用填充有多孔材料——树脂的色谱柱，根据分子大小进行分离。在此过程中，较大的EVs更快地流出色谱柱；该方法被称为基于尺寸排阻的穿流纯化。同时，较小的污染物（如双链DNA、游离蛋白（如核酸内切酶）、盐类、酚红等）则因静电作用力被保留在树脂中并进一步滞留（即使用了双模态树脂）。基于SEC的处理可去除非EV结合的蛋白质，同时保持EV原有的结构和功能35，36。此外，SEC纯化易于放大，且不会影响高得率和高纯度，因此是分离用于生物治疗用途的NK-EVs的合适选择。尽管具有上述优势，SEC仍存在一些缺点，例如穿流液（洗脱液）相对稀释；因此需要通过超滤（UF）进行浓缩，同时UF也允许缓冲液置换。非无菌的UF装置在使用前需用70%乙醇和PBS冲洗，并置于生物安全柜中以确保无菌状态。通常，穿流液可浓缩至初始体积的35–50倍，同时去除可能进入洗脱液的小分子物质。在进行FPLC-SEC联合UF操作之前，需先进行差速离心和核酸内切酶处理，以去除残留的细胞、细胞碎片以及长片段的抗原性双链DNA7。

NK-EV 产品分离后，根据 MISEV2018 和 MISEV2023 指南进行表征和功能验证，以确定该产品是否适用于后续使用6,18每次分离可获得 1.0 - 1.5 mL 高纯度 NK-EV 产物，其最低浓度为 1 × 1012 EVs/mL，平均浓度为1.39 × 1012 颗粒/mL。此前，Gupta 等人确定中位 EV 剂量 体内 是 3.37 × 108 小鼠每公斤体重的EVs数量37. 采用中位剂量进行治疗需要 8.43 x 106 每只体重为25 g的小鼠所接受的EVs剂量，远低于保证的最低剂量（1 x 1012 颗粒/mL），通过该工艺获得的产量足以满足临床前实验或达到给药剂量目标。每次分离均进行支原体和微生物检测，作为产品质量控制评估的一部分。此外，先前的研究已证实终产品中不存在常见病毒成分和内毒素，且经Western blot分析未检测到被视为宿主细胞污染物的细胞组分。7,34最后，采用经过验证的高灵敏度基于刃天青的细胞活力检测法对NK-EVs的功能性进行功能评估。20. 该活力检测法通过代谢活跃的细胞将刃天青（弱荧光）还原为试卤灵（强荧光），从而评估经NK-EV处理后的细胞活力。与其他替代性细胞活力检测方法相比，本研究采用的基于刃天青的检测法对细胞活力变化高度敏感（背景噪声极低），且可在更短的孵育时间内观察结果（获得具有统计学意义的结果所需时间少于30分钟）20通常，NK-EVs 对 K562 细胞活力表现出剂量依赖性效应。综上所述，上述结果表明，该 NK-EVs 产品已达到临床前评估的产品放行标准，适用于后续应用。

综上所述，本基于方案的研究描述了具有临床级潜力的自然杀伤细胞外囊泡（NK-EVs）的生物制造过程。如前所述，NK-EVs 是在无血清、无异源物、无饲养层细胞且无抗生素的条件下，利用封闭式中空纤维生物反应器（HFB）系统生产的7。采用快速蛋白液相色谱-尺寸排阻层析结合超滤（FPLC-SEC/UF）的方法对 NK-EVs 进行分离与纯化。在将产品用于下游应用之前，必须对 NK-EVs 进行表征和功能验证，以确保其适用性。如研究结果所示，遵循该生物制造方案可成功制备大量高纯度的 NK-EVs，这些囊泡对癌细胞表现出靶向性的细胞毒性。因此，所述的生物制造方案可为未来需要生产临床级 NK-EVs 的研究提供重要支持。

披露

所有作者均声明无利益冲突或披露事项。

致谢

作者谨此感谢 Simon Sauvé、Roger Tam 和 Xu Zhang 博士对本文手稿的审阅意见。本研究得到了加拿大政府基因组研究与发展计划（GRDI）第七阶段（2019–2025）的运营资助，由 JRL 和 LW 获得；同时获得加拿大自然科学与工程研究委员会 RGPIN-2019-05220 项目资助、癌症研究学会/渥太华大学 24064 项目资助、加拿大卫生研究院（CIHR）研究运营资助 175177（由 LW 获得）、CIHR 硕士奖学金（由 MK 获得），以及伊丽莎白二世科学与技术研究生奖学金（QEII-GSST）（由 FSDB 获得）的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.1 µm 真空过滤装置 Filtropur V50 Sarstedt83,3941,002
0.22 µm Acrodisc 注射器滤器 Pall CorporationPN4612
1 mL 注射器 Thermo Fisher ScientificMB9204560TF-LAB
10 kDa Centricon Plus-70 离心过滤器SigmaUFC701008
60 mL 注射器 BD Biosciences309653
96孔平底透明黑色聚苯乙烯TC处理微孔板 Costar3603
琼脂糖 Thermo Fisher ScientificR0491
AKTA 快速蛋白液相色谱仪 GE Lifesciences29022094
BD PrecisionGlide 针头 - 18GBD Biosciences305196
Benzonase 核酸酶 SigmaE1014-25KU
BioTek Synergy H1 多功能酶标仪BioTek SH1M2G-SN
Blue Juice 凝胶上样缓冲液 Invitrogen10816015
CaptoCore 700 树脂 Cytiva17548102
Cellometer Auto 2000 细胞活力计数仪 Nexcelom BioScience LLC
CryoStor CS10 冻存培养基 SigmaC2874
DPBS−/− FisherBP399-1
双LED蓝光/白光透射仪 InvitrogenLB0100
Duet P3202 流量控制泵 FiberCell Systems
杜氏磷酸盐缓冲液Gibco14190250
乙醇 Commercial AlcoholsP006EAAN
外泌体耗竭型胎牛血清 GibcoA2720803
Fluorobrite DMEM GibcoA18967-01
血糖仪AccuCheckModel 930
HiScale 层析柱 10/40 Cytiva29360550
ImmunoCult-XF（GMP级培养基替代品）StemCell Technologies100-0956
ImmunoCult-XF T细胞扩增培养基 StemCell Technologies10981
异丙醇 EMDPX1834-1
K562 细胞ATCCCCL-243
LB 培养基 BioBasicSD7002
L-乳酸检测试剂盒 Abcamab65331
中空纤维培养器（中等规格） FiberCell SystemsC2011
MgCl2 SigmaM1028
支原体PCR检测试剂盒 Abcamab289834
NanoSight NS300 Malvern
NaOH SupelcoSX0607N-6
NK92-MI 细胞 ATCCCRL-2408
pH 试纸-Mquant Sigma1,09533
PrestoBlue HS 细胞活力检测试剂 InvitrogenP50200
Qubit 4 荧光计 Invitrogen
Qubit dsDNA BR 检测试剂盒InvitrogenQ33262
Qubit dsDNA HS 检测试剂盒InvitrogenQ33231 
Qubit Flex 检测管条 InvitrogenQ33252
Qubit Flex 荧光计 InvitrogenQ33327
Qubit 蛋白质 BR 检测试剂盒 InvitrogenA50669
Quick Load 1Kb Plus DNA 标准品 NEBN0469S
SYBRSafe DNA 凝胶染料 InvitrogenInvitrogenS33102
注射泵 Harvard Apparatus984730
Triton-X 100 SigmaT-9284
UltraPure TAE 缓冲液 Invitrogen15558042
ViaStain 吖啶橙和碘化丙啶（AO/PI）染色液 ESBE ScientificCS2-0106

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