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由人诱导性多能干细胞生成三维中脑类器官

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DOI：

10.3791/67228

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2025年2月14日

 ,  , 
1Department of Clinical Medicine (K1), University of Bergen, 2Centre for International Health, Department of Global Public Health and Primary Care, University of Bergen, 3Department of Neurosurgery, Xinhua Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine

本文内容

摘要

本方案描述了一种利用人诱导多能干细胞构建三维中脑类器官的新方法，通过引导其形成以模拟天然中脑组织，从而有助于发育过程及疾病机制的研究。

摘要

由人多能干细胞（hPSCs）发育中脑类器官（MOs）代表了理解脑发育、实现精确疾病建模以及推动治疗研究的重要进展。本方案概述了一种利用诱导性多能干细胞（iPSCs）生成中脑特异性类器官的方法，采用了一种策略性的分化途径。关键技术包括使用双SMAD抑制剂抑制SMAD信号通路、施加成纤维细胞生长因子8b（FGF-8b），以及利用激动剂purmorphamine激活Sonic Hedgehog信号通路，从而引导iPSCs向中脑命运分化。

通过该方法生成的类器官直径可达2 mm，并包含多种神经上皮细胞类型，反映了中脑固有的细胞多样性。验证这些类器官是否为真实的中脑结构，需检测中脑特异性标志物的表达，以确认其身份。该方法的一个显著成果是能够有效地将诱导多能干细胞（iPSCs）分化为具有中脑特征的多巴胺能神经元。

该方案的重要意义在于能够生成功能成熟且具有中脑特异性的类器官，这些类器官可高度模拟中脑的关键特征，为深入研究中脑的发育过程及相关疾病（如帕金森病）的病理生理机制提供了有价值的模型。因此，该方案为致力于增进人类脑科学认知并开发神经退行性疾病新疗法的研究人员提供了重要资源，成为神经科学研究领域不可或缺的工具。

引言

人脑具有复杂的结构以及高度精细的细胞和分子组成，在神经科学研究中带来了巨大挑战，尤其是在疾病建模和细胞治疗开发方面1。由于目前缺乏能够真实反映人脑复杂性的先进体外模型，这些挑战变得更加复杂。然而，近年来人类诱导多能干细胞（iPSC）技术取得了显著进展，能够实现向特定神经元亚型的定向分化，为人脑发育、疾病发病机制以及基于细胞的治疗策略研究开辟了极具前景的新途径。

传统上，源自诱导多能干细胞（iPSCs）的二维（2D）神经元培养一直是 体外 旨在模拟人类神经元生理学与病理学的研究。这些单层培养体系在增进对神经系统疾病的理解以及发现神经保护剂方面发挥了重要作用2,3,4,5,6,7尽管这些二维系统具有实用性，但它们在模拟人类大脑真正的细胞多样性和三维（3D）结构方面仍存在不足。

脑类器官技术的出现代表了 体外 建模，提供了一种在生理相关框架内紧密模拟人脑....

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方案

诱导多能干细胞（iPSCs）由人正常成纤维细胞 Detroit 551 和人胚胎干细胞（ESCs）hESC 360 细胞系生成，方法如前所述4。iPSCs 的获取已获得挪威西部健康研究伦理委员会（REK 编号：2012/919）的批准。所有细胞均定期使用 MycoAlert 支原体检测试剂盒检测支原体污染。 材料表 包含本实验方案中使用的所有材料、试剂和设备的信息。表 1 描述了所用的培养基及其他储备液。

1. iPSCs 的解冻

  1. 基质包被板与Essential 8（E8）培养基的制备
    1. 将基底膜基质小瓶置于冰上过夜解冻。用预冷的Advanced Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）/Ham's F12 DMEM/F12培养基按1:100稀释（终浓度为1%）（见材料表和表1）。分装后于-20 °C长期保存。
    2. 在4 °C条件下解冻稀释后的基底膜基质；每孔加入1 mL溶液，对6孔板进行包被。于37 °C孵育1小时。
    3. 从培养箱中取出培养板，使其平衡至室温 (RT)。
      注意：包被后的板可在冰箱中冷藏保存最多2周（使用前需恢复至室温）。若需长期保....

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结果

本研究中，我们介绍了一种从诱导多能干细胞（iPSCs）衍生脑类器官（MOs）的开创性方案。该方法的核心在于创新性地联合使用双SMAD抑制、FGF-8b以及 sonic hedgehog（SHH）通路激动剂 purmorphamine（PM）。该流程如图1所示。分化过程首先通过双SMAD信号通路抑制，将iPSCs定向诱导为神经外胚层谱系，形成神经上皮或神经玫瑰花结样克隆。其中，SB2431542是实现这一过程的关键化合物29。随后阶段是在悬浮培养体系中培养三维神经球。该过程借助轨道摇床实现，有助于提升营养物质和氧气的可及性30，对类器官的发育至关重要。

我们使用明场显微镜仔细监测了这些类器官的形态发育过程，详见图2。观察结果显示，类器官从初始的诱导多能干细胞（iPSC）克隆（图2A）开始分化，逐渐形成早期类器官结.......

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讨论

在本研究中，我们建立了一种将诱导多能干细胞（iPSCs）分化为中脑类器官（MO）的方法。我们的方案采用双SMAD抑制策略，并结合形态发生因子（包括FGF-8b和SHH激动剂PM）进行优化，该策略高度模拟了中脑发育过程中关键的发育信号。我们所建立的分化路径可诱导形成类似于天然脑发育过程中所见的神经上皮结构，即神经玫瑰花结样结构。这种从二维培养向三维神经球转化的过程代表了类器官技术的重要进展，为研究细胞动态行为和组织结构提供了更接近生理状态的实验体系。通过轨道摇床辅助将这些神经球维持在悬浮培养状态，对于实现均匀的生长与分化至关重要，可有效改善营养物质和氧气的分布。

OTX2、FOXA2 和 PAX6 等标志物证实了我们中脑模式形成的可靠性，确认了适当祖细胞状态的建立。类器官在后续发育阶段中检测到 MAP2，表明神经元成功成熟，这是构建真实脑类器官模型的关键特征。经过90天的分化后，发现共表达 TH 和 MAP2 的细胞尤为重要，表明类器官中成功生成了具有 TH+/DAT+ 表达特征的多巴胺能神经元。这些神经元对神经功能至关重要，尤其与帕金森病.......

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

图1 使用 BioRender.com 制作。感谢卑尔根大学 Meltzers Høyskolefonds（项目编号：103517133）、Gerda Meyer Nyquist Guldbrandson 以及 Gerdt Meyer Nyquists legat（项目编号：103816102）提供的经费支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Leica DFC3000 G CCD显微镜相机Leica Microsystems, Germany
化学成分明确的脂质浓缩液Thermo Fisher Scientific11905031CDM组分
胶原酶 IVThermo Fisher Scientific17104019用于温和解离人iPSCs的试剂
Corning 未处理培养皿Sigma-AldrichCLS430589悬浮培养 
DMEM/F-12，含GlutaMAX补充剂Thermo Fisher Scientific10565018星形胶质细胞分化基础培养基
DPBSThermo Fisher Scientific14190250用于多种细胞培养洗涤步骤
EDTAThermo Fisher Scientific15575020用于温和解离人iPSCs的试剂
Essential 8基础培养基Thermo Fisher ScientificA1516901iPSC培养的基础培养基
Essential 8补充剂（50倍浓缩）Thermo Fisher ScientificA1517101iPSC培养补充剂
FCCPAbcamab120081消除线粒体膜电位及TMRE染色
碱性成纤维细胞生长因子（FGF-basic）PeproTech100-18B星形胶质细胞分化培养基组分
BVC控制液体抽吸系统Vacuubrand, Germany
甲醛（PFA）16%Thermo Fisher Scientific28908细胞固定 
GDNFPeprotech450-10多巴胺能神经元培养基组分
Geltrex（基底膜基质）Thermo Fisher ScientificA1413302用于人iPSCs的贴壁与维持
GlutaMAX补充剂Thermo Fisher Scientific35050061NSC培养补充剂
Heracell 150i CO2培养箱Fisher Scientific, USA
IMDMThermo Fisher Scientific21980032CDM基础培养基
InSolution AMPK抑制剂Sigma-Aldrich171261神经诱导培养基组分
胰岛素Roche1376497CDM组分
源自Detroit 551成纤维细胞的iPSCs ATCCCCL-110
Leica TCS SP8 STED共聚焦显微镜Leica Microsystems, Germany
MatrigelLife Science354230Matrigel包埋
单硫代甘油Sigma-AldrichM6145CDM组分
正常山羊血清Thermo Fisher ScientificPCN5000用于封闭缓冲液
轨道摇床 - SSM1Stuart Equipment, UK
类器官包埋片STEMCELL Technologies8579Matrigel包埋
类器官包埋片STEMCELL Technologies 8579
PBS 1xThermo Fisher Scientific18912014用于多种洗涤步骤
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐Sigma-AldrichP7405促进神经细胞在体外的贴壁与生长
聚-L-鸟氨酸溶液Sigma-AldrichP4957促进神经细胞在体外的贴壁与生长
ProLong Gold抗荧光淬灭封片剂Thermo Fisher ScientificP36930共聚焦成像时盖玻片的封固
PurmorphamineSTEMCELL Technologies72204促进多巴胺能神经元分化
重组人/小鼠FGF-8b蛋白 R&D Systems423-F8-025/CF促进多巴胺能神经元分化 
SB 431542Tocris BioscienceTB1614-GMP神经诱导培养基组分
TRITON X-100VWR International9002-93-1用于免疫染色实验中的细胞通透处理
SSM1紧凑型轨道摇床 Norrscope51901-10 SSM1 Shaker, orbital, mini 230V类器官培养用旋转器
水浴锅 Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant InstrumentsGrant Instruments, USA
免疫染色所用抗体
一抗
抗DAT抗体Abcamab128848, RRID:AB_2665470兔源；1:100 
抗FOXA2抗体ProteinTech22474-1-AP, RRID:AB_2879110兔源；1:100 
抗FOXG1抗体Abcamab196868, RRID:AB_2892604兔源；1:200
抗LMX1抗体Abcamab139726, RRID:AB_2827684兔源；1:100 
抗MAP2抗体Abcamab5392 ,RRID:AB_2138153鸡源；1:500
抗OTX2抗体ProteinTech13497-1-AP, RRID:AB_2157176兔源；1:100 
抗TH抗体Abcamab75875, RRID:AB_1310786兔源；1:100 
二抗稀释比例（μL）
 Alexa Fluor  594 山羊抗兔IgGThermo Fisher ScientificA-11012 1:400
Alexa Fluor  488 山羊抗兔IgGThermo Fisher ScientificA- 11008 1:400
Alexa Fluor  488 山羊抗兔IgGThermo Fisher ScientificA- 11008 1:400
Alexa Fluor  488 山羊抗兔IgGThermo Fisher ScientificA- 11008 1:400
Alexa Fluor  594 山羊抗兔IgG Thermo Fisher ScientificA-11012 1:400
Alexa Fluor  594 山羊抗兔IgG Thermo Fisher ScientificA-11012 1:400
Alexa Fluor  647 山羊抗鸡IgG Thermo Fisher ScientificA-21469 1:400

参考文献

  1. Markram, H. Seven challenges for neuroscience. Funct Neurol. 28 (3), 145-151 (2013).
  2. Liang, K. X., et al. N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neuro....

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