由人诱导性多能干细胞生成三维中脑类器官

摘要

本方案描述了一种利用人诱导多能干细胞构建三维中脑类器官的新方法，通过引导其形成以模拟天然中脑组织，从而有助于发育过程及疾病机制的研究。

摘要

由人多能干细胞（hPSCs）发育中脑类器官（MOs）代表了理解脑发育、实现精确疾病建模以及推动治疗研究的重要进展。本方案概述了一种利用诱导性多能干细胞（iPSCs）生成中脑特异性类器官的方法，采用了一种策略性的分化途径。关键技术包括使用双SMAD抑制剂抑制SMAD信号通路、施加成纤维细胞生长因子8b（FGF-8b），以及利用激动剂purmorphamine激活Sonic Hedgehog信号通路，从而引导iPSCs向中脑命运分化。

通过该方法生成的类器官直径可达2 mm，并包含多种神经上皮细胞类型，反映了中脑固有的细胞多样性。验证这些类器官是否为真实的中脑结构，需检测中脑特异性标志物的表达，以确认其身份。该方法的一个显著成果是能够有效地将诱导多能干细胞（iPSCs）分化为具有中脑特征的多巴胺能神经元。

该方案的重要意义在于能够生成功能成熟且具有中脑特异性的类器官，这些类器官可高度模拟中脑的关键特征，为深入研究中脑的发育过程及相关疾病（如帕金森病）的病理生理机制提供了有价值的模型。因此，该方案为致力于增进人类脑科学认知并开发神经退行性疾病新疗法的研究人员提供了重要资源，成为神经科学研究领域不可或缺的工具。

引言

人脑具有复杂的结构以及高度精细的细胞和分子组成，在神经科学研究中带来了巨大挑战，尤其是在疾病建模和细胞治疗开发方面¹。由于目前缺乏能够真实反映人脑复杂性的先进体外模型，这些挑战变得更加复杂。然而，近年来人类诱导多能干细胞（iPSC）技术取得了显著进展，能够实现向特定神经元亚型的定向分化，为人脑发育、疾病发病机制以及基于细胞的治疗策略研究开辟了极具前景的新途径。

传统上，源自诱导多能干细胞（iPSCs）的二维（2D）神经元培养一直是 体外 旨在模拟人类神经元生理学与病理学的研究。这些单层培养体系在增进对神经系统疾病的理解以及发现神经保护剂方面发挥了重要作用^2,3,4,5,6,7尽管这些二维系统具有实用性，但它们在模拟人类大脑真正的细胞多样性和三维（3D）结构方面仍存在不足。

脑类器官技术的出现代表了 体外 建模，提供了一种在生理相关框架内紧密模拟人脑复杂生物学特性的工具⁸早期的脑类器官培养技术利用了iPSCs固有的调控特性，使其自发形成外胚层衍生物，从而模拟大脑发育的早期阶段^5,9,10,11,12鉴于神经元与其他神经元及非神经元细胞之间形成的复杂网络，三维建模对于准确研究神经退行性疾病变得至关重要。三维培养能够提供更具代表性的模型 体内 环境，促进神经元快速分化和网络形成^12,13,14与二维培养相比，促进神经元基因的更广泛表达¹⁵神经元在三维环境中发育时，其形态和生理特性更类似于体内真实情况 体内 对应物¹⁶.

近年来，三维脑模型的进展在更有效地模拟人脑的空间和功能复杂性方面发挥了关键作用。在过去十年中，生成全脑类器官和特定脑区模型的多种方案不断取得进展^{11,17,18,19,20,21,22}在模拟小头症等神经系统疾病方面已证明具有重要价值¹¹阿尔茨海默病^14,23，以及帕金森病²⁴本方案的目标是开发并优化一种由人诱导多能干细胞（iPSCs）衍生三维人脑类器官（MOs）的方法。该方案特别旨在生成富含多巴胺能神经元、且在空间结构上高度模拟人中脑天然结构与功能的类器官。这些类器官的主要用途是作为先进的 体外 用于研究帕金森病的模型，为探索与该疾病相关的神经发育过程及病理机制提供了更准确且具有生理相关性的系统。通过利用患者来源的诱导多能干细胞（iPSCs）生成这些中脑特异性类器官，本方案旨在加深对帕金森病发病机制的理解，促进潜在治疗靶点的发现，并推动细胞治疗策略的优化。这一创新性方法旨在克服传统二维神经元培养的局限性，为神经退行性疾病研究领域提供一种强有力的工具，从而作出重要贡献。 体外 疾病建模及新治疗策略的探索

在过去10年中，多个研究团队已开发出中脑类器官（MOs）^{8,21,25,26,27,28}，采用具有若干关键相似性的方法。为了深入理解帕金森病，我们开发了一种从人诱导多能干细胞（iPSCs）衍生三维人脑类器官（MOs）的实验方案。这些富含空间有序排列的多巴胺能神经元的类器官，为研究帕金森病提供了理想的模型。我们对中脑特异性类器官方案的建立与优化已取得进展 体外 显著促进我们对神经发育过程和神经退行性疾病理解的模型。这些模型，尤其是应用于患者来源的类脑器官时，已证明其作为强大研究工具的有效性 体外 疾病建模，为先进三维细胞培养领域提供了新的视角和方法学。

方案

诱导多能干细胞（iPSCs）由人正常成纤维细胞 Detroit 551 和人胚胎干细胞（ESCs）hESC 360 细胞系生成，方法如前所述⁴。iPSCs 的获取已获得挪威西部健康研究伦理委员会（REK 编号：2012/919）的批准。所有细胞均定期使用 MycoAlert 支原体检测试剂盒检测支原体污染。 材料表 包含本实验方案中使用的所有材料、试剂和设备的信息。表 1 描述了所用的培养基及其他储备液。

1. iPSCs 的解冻

1. 基质包被板与Essential 8（E8）培养基的制备
   1. 将基底膜基质小瓶置于冰上过夜解冻。用预冷的Advanced Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）/Ham's F12 DMEM/F12培养基按1:100稀释（终浓度为1%）（见材料表和表1）。分装后于-20 °C长期保存。
   2. 在4 °C条件下解冻稀释后的基底膜基质；每孔加入1 mL溶液，对6孔板进行包被。于37 °C孵育1小时。
   3. 从培养箱中取出培养板，使其平衡至室温 (RT)。
      注意：包被后的板可在冰箱中冷藏保存最多2周（使用前需恢复至室温）。若需长期保存，应在包被板中加入1 mL E8培养基（见材料表和表1），以防止凝胶干燥。
2. E8培养基的制备
   1. 在无菌环境下，将E8基础培养基与E8添加剂混合（见材料表和表1）。
      注意：此混合液可在4 °C保存2周。配制完全培养基前，需在4 °C过夜解冻冷冻的E8添加剂。切勿在37 °C解冻，以免影响其稳定性。使用前仅将所需体积的E8培养基升温至室温（RT），直至触感不再冰凉即可。

2. 接种iPSCs

1. 将基质包被的培养板和 E8 培养基在室温或 37 °C 培养箱中预温。
2. 吸除培养基；用不含钙和镁的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS Ca²⁺/Mg²⁺-free，6 孔板每孔 4 mL）冲洗汇合度为 60%–70% 的诱导多能干细胞（iPSCs）。
3. 加入乙二胺四乙酸（EDTA，0.5 mM，每孔 1 mL，参见材料表和表 1）；在 37 °C 培养箱中孵育至克隆边缘脱落（3–5 分钟）。
4. 吸除消化液；为使克隆脱落，用移液器以略强于常规的力度将预温的 E8 培养基（每孔 4 mL）直接吹打至克隆表面，从而在细胞表面产生局部流体运动。
5. 按 1:2 比例传代细胞，将细胞转移至新的基质包被 6 孔板中的两个孔，每孔加入 2 mL 培养基，随后在 37 °C 培养箱中培养。
6. 每日更换培养基，直至克隆达到 80% 汇合度。
7. 在 10 倍显微镜下观察克隆，确保其大小适宜，通常呈明显圆形，直径范围为 0.5 至 1 mm，并确认克隆为致密、紧凑的结构，具有清晰、光滑的边界。

3. 神经诱导

1. 培养基制备及第0天操作
   1. 分别准备500 mL的化学成分确定培养基（CDM）、神经诱导培养基（NIM）和无血清神经干细胞培养基（NSC SF），参见材料表和表1。
   2. 在6孔板中，每孔用4 mL DPBS（1x）（无Ca²⁺/Mg²⁺）冲洗细胞，随后每孔加入3 mL NIM，进行第0天的设置。
   3. 在第1、3、5天更换NIM（每孔3 mL）；每天在显微镜下观察细胞状态。
   4. 第6天，使用以下步骤将神经样集落解离为悬浮培养。
      1. 用DPBS（1x）（无Ca²⁺/Mg²⁺）（6孔板每孔4 mL）轻轻冲洗一次。每孔加入胶原酶IV（6孔板每孔1 mL），孵育1分钟。吸除胶原酶IV，并用DPBS（1x）（无Ca²⁺/Mg²⁺）（6孔板每孔4 mL）轻柔冲洗一次。
      2. 向6孔板每孔加入2 mL NSC SF培养基。用200 µL移液枪头在孔底划网格，轻轻刮取，使细胞脱离。
      3. 将细胞悬液从6孔板转移至10 cm非黏附培养皿中。用NSC SF培养基调整总体积至12 mL。
      4. 将非黏附培养皿置于摇床（ssm1 compact orbital shaker）上，在37 °C、5% CO₂的培养箱中以85 rpm、0°角度振荡，以防止细胞聚集。

4. 中脑的图式形成

1. 第7天，加入12 mL含100 ng/mL FGF-8b的CDM；置于轨道摇床培养箱中。
2. 第8至13天，每2天更换一次培养基；每天在显微镜下观察。
3. 第14天，加入12 mL含100 ng/mL FGF-8b和1 µM purmorphamine（PM）的CDM；置于轨道摇床上。
4. 第15至20天，每2天更换一次培养基；每天在显微镜下观察。

5. Matrigel 包埋及类器官终止与成熟

1. 在 2 °C 至 8 °C 的温度下，将 Matrigel 置于冰上解冻 1–2 小时。
   注意：解冻足够量的 Matrigel，以确保每个类胚体（EB）可获得 15 µL。保持 Matrigel 处于冰上低温状态，防止提前聚合。所有将与 Matrigel 接触的塑料器皿在使用前需在 -20 °C 预冷至少 30 分钟。
2. 将无菌的类器官包埋片放入空培养皿中。
3. 使用宽口 200 µL 移液枪头，轻柔地将类器官从培养皿中取出，并转移至包埋片表面，每个孔放置一个类器官。重复此操作，直至在包埋片表面收集到 12–16 个 EB。
4. 小心移除每个 EB 上的多余培养基，然后将 15 µL 冷 Matrigel 逐滴加至每个 EB 上。借助移液器将 EB 调整至 Matrigel 液滴中央位置。
5. 将培养板置于 37 °C 培养箱中孵育 15–20 分钟，使 Matrigel 完成聚合。
6. 使用无菌镊子夹起带有 Matrigel 液滴的包埋片，将其悬于 6 孔超低吸附培养板的一个孔上方。用移液器吸取 3 mL 含 10 ng/mL 脑源性神经营养因子（BDNF）和 10 ng/mL 胶质细胞系源性神经营养因子（GDNF）的 CDM，轻柔冲洗包埋片上的 Matrigel 液滴，使其落入孔中。重复此操作，直至将全部 6–8 个 Matrigel 液滴转移至同一孔内。
7. 将培养板置于 37 °C 培养箱内的轨道摇床上，以 85 rpm 振荡培养，并每 3 天更换一次含 10 ng/mL BDNF 和 10 ng/mL GDNF 的 CDM。
   注意：分化培养可维持长达 3 个月；终止培养后约 2 周出现神经样形态。超过 3 个月的培养无需继续添加 BDNF 和 GDNF。

6. 免疫荧光染色

1. 使用 1,000 µL 移液器轻轻从培养基中取出类器官，并将其连同少量培养基轻柔地放置在显微镜载玻片上。
2. 在室温下使其完全自然干燥。每样本加入 300 µL 4% 多聚甲醛（PFA），固定 30 分钟。
   注意：PFA 具有危害性，可能具有致癌性。操作时应谨慎，避免与皮肤和眼睛直接接触，并确保在化学通风橱内使用。
3. 向载玻片上每样本加入 300 µL 30% 蔗糖溶液，于 4 °C 过夜孵育。
4. 使用封闭缓冲液（BB，每样本 300 µL）对类器官进行封闭和通透处理，缓冲液包含 PBS（含 Ca²⁺/Mg²⁺）、0.3% Triton X-100 和 10% 正常山羊血清，在室温下孵育 2 小时（或 4 °C 过夜）。使用疏水性屏障笔标记类器官区域，以限制缓冲液在载玻片上的扩散。
5. 在封闭缓冲液中加入适量体积的一抗溶液（每样本 300 µL），包括抗叉头框蛋白 G1（FOXG1, 1:200）、抗正齿蛋白同源框 2（OTX2, 1:100）、抗叉头框蛋白 A2（FOXA2, 1:100）、抗酪氨酸羟化酶（TH, 1:100）、抗SRY（Y 染色体性别决定区）-box 2（SOX2, 1:100）、抗配对盒蛋白（PAX6, 1:100）和抗微管相关蛋白 2（MAP2, 1:500），于 4 °C 避光过夜孵育（参见 材料表）。
6. 在轻度摇床上用 1× PBS 洗涤样本，每次 3 小时，期间更换缓冲液两至三次。
7. 加入二抗溶液（每样本 300 µL），包括抗 Alexa Fluor 488（1:800）、抗 Alexa Fluor 594（1:800）和抗 Alexa Fluor 647（1:800），于 4 °C 湿润避光环境中过夜孵育。同时加入 Hoechst 33342（1:5,000）进行核染色（参见 材料表）。
8. 去除抗体溶液，用 PBS 快速冲洗，随后加入含 0.01% 叠氮化钠的 PBS，于 4 °C 保存 1–2 天以防止污染。
9. 吸去 PBS，去除多余液体，使用封片剂封固类器官（参见 材料表）。盖上盖玻片，注意避免产生气泡，并于室温避光环境中静置至少 12 小时，使封片剂充分聚合。
   注意：样本现已准备好，可用于荧光显微镜观察。

结果

本研究中，我们介绍了一种从诱导多能干细胞（iPSCs）衍生脑类器官（MOs）的开创性方案。该方法的核心在于创新性地联合使用双SMAD抑制、FGF-8b以及 sonic hedgehog（SHH）通路激动剂 purmorphamine（PM）。该流程如图1所示。分化过程首先通过双SMAD信号通路抑制，将iPSCs定向诱导为神经外胚层谱系，形成神经上皮或神经玫瑰花结样克隆。其中，SB2431542是实现这一过程的关键化合物²⁹。随后阶段是在悬浮培养体系中培养三维神经球。该过程借助轨道摇床实现，有助于提升营养物质和氧气的可及性³⁰，对类器官的发育至关重要。

我们使用明场显微镜仔细监测了这些类器官的形态发育过程，详见图2。观察结果显示，类器官从初始的诱导多能干细胞（iPSC）克隆（图2A）开始分化，逐渐形成早期类器官结...

讨论

在本研究中，我们建立了一种将诱导多能干细胞（iPSCs）分化为中脑类器官（MO）的方法。我们的方案采用双SMAD抑制策略，并结合形态发生因子（包括FGF-8b和SHH激动剂PM）进行优化，该策略高度模拟了中脑发育过程中关键的发育信号。我们所建立的分化路径可诱导形成类似于天然脑发育过程中所见的神经上皮结构，即神经玫瑰花结样结构。这种从二维培养向三维神经球转化的过程代表了类器官技术的重要进展，为研究细胞动态行为和组织结构提供了更接近生理状态的实验体系。通过轨道摇床辅助将这些神经球维持在悬浮培养状态，对于实现均匀的生长与分化至关重要，可有效改善营养物质和氧气的分布。

OTX2、FOXA2 和 PAX6 等标志物证实了我们中脑模式形成的可靠性，确认了适当祖细胞状态的建立。类器官在后续发育阶段中检测到 MAP2，表明神经元成功成熟，这是构建真实脑类器官模型的关键特征。经过90天的分化后，发现共表达 TH 和 MAP2 的细胞尤为重要，表明类器官中成功生成了具有 TH⁺/DAT⁺ 表达特征的多巴胺能神经元。这些神经元对神经功能至关重要，尤其与帕金森病...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Leica DFC3000 G CCD显微镜相机	Leica Microsystems, Germany
化学成分明确的脂质浓缩液	Thermo Fisher Scientific	11905031	CDM组分
胶原酶 IV	Thermo Fisher Scientific	17104019	用于温和解离人iPSCs的试剂
Corning 未处理培养皿	Sigma-Aldrich	CLS430589	悬浮培养
DMEM/F-12，含GlutaMAX补充剂	Thermo Fisher Scientific	10565018	星形胶质细胞分化基础培养基
DPBS	Thermo Fisher Scientific	14190250	用于多种细胞培养洗涤步骤
EDTA	Thermo Fisher Scientific	15575020	用于温和解离人iPSCs的试剂
Essential 8基础培养基	Thermo Fisher Scientific	A1516901	iPSC培养的基础培养基
Essential 8补充剂（50倍浓缩）	Thermo Fisher Scientific	A1517101	iPSC培养补充剂
FCCP	Abcam	ab120081	消除线粒体膜电位及TMRE染色
碱性成纤维细胞生长因子（FGF-basic）	PeproTech	100-18B	星形胶质细胞分化培养基组分
BVC控制液体抽吸系统	Vacuubrand, Germany
甲醛（PFA）16%	Thermo Fisher Scientific	28908	细胞固定
GDNF	Peprotech	450-10	多巴胺能神经元培养基组分
Geltrex（基底膜基质）	Thermo Fisher Scientific	A1413302	用于人iPSCs的贴壁与维持
GlutaMAX补充剂	Thermo Fisher Scientific	35050061	NSC培养补充剂
Heracell 150i CO2培养箱	Fisher Scientific, USA
IMDM	Thermo Fisher Scientific	21980032	CDM基础培养基
InSolution AMPK抑制剂	Sigma-Aldrich	171261	神经诱导培养基组分
胰岛素	Roche	1376497	CDM组分
源自Detroit 551成纤维细胞的iPSCs	ATCC	CCL-110
Leica TCS SP8 STED共聚焦显微镜	Leica Microsystems, Germany
Matrigel	Life Science	354230	Matrigel包埋
单硫代甘油	Sigma-Aldrich	M6145	CDM组分
正常山羊血清	Thermo Fisher Scientific	PCN5000	用于封闭缓冲液
轨道摇床 - SSM1	Stuart Equipment, UK
类器官包埋片	STEMCELL Technologies	8579	Matrigel包埋
类器官包埋片	STEMCELL Technologies	8579
PBS 1x	Thermo Fisher Scientific	18912014	用于多种洗涤步骤
聚-D-赖氨酸氢溴酸盐	Sigma-Aldrich	P7405	促进神经细胞在体外的贴壁与生长
聚-L-鸟氨酸溶液	Sigma-Aldrich	P4957	促进神经细胞在体外的贴壁与生长
ProLong Gold抗荧光淬灭封片剂	Thermo Fisher Scientific	P36930	共聚焦成像时盖玻片的封固
Purmorphamine	STEMCELL Technologies	72204	促进多巴胺能神经元分化
重组人/小鼠FGF-8b蛋白	R&D Systems	423-F8-025/CF	促进多巴胺能神经元分化
SB 431542	Tocris Bioscience	TB1614-GMP	神经诱导培养基组分
TRITON X-100	VWR International	9002-93-1	用于免疫染色实验中的细胞通透处理
SSM1紧凑型轨道摇床	Norrscope	51901-10 SSM1 Shaker, orbital, mini 230V	类器官培养用旋转器
水浴锅 Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant Instruments	Grant Instruments, USA
免疫染色所用抗体
一抗
抗DAT抗体	Abcam	ab128848, RRID:AB_2665470	兔源；1:100
抗FOXA2抗体	ProteinTech	22474-1-AP, RRID:AB_2879110	兔源；1:100
抗FOXG1抗体	Abcam	ab196868, RRID:AB_2892604	兔源；1:200
抗LMX1抗体	Abcam	ab139726, RRID:AB_2827684	兔源；1:100
抗MAP2抗体	Abcam	ab5392 ,RRID:AB_2138153	鸡源；1:500
抗OTX2抗体	ProteinTech	13497-1-AP, RRID:AB_2157176	兔源；1:100
抗TH抗体	Abcam	ab75875, RRID:AB_1310786	兔源；1:100
二抗			稀释比例（μL）
Alexa Fluor  594 山羊抗兔IgG	Thermo Fisher Scientific	A-11012	1:400
Alexa Fluor  488 山羊抗兔IgG	Thermo Fisher Scientific	A- 11008	1:400
Alexa Fluor  488 山羊抗兔IgG	Thermo Fisher Scientific	A- 11008	1:400
Alexa Fluor  488 山羊抗兔IgG	Thermo Fisher Scientific	A- 11008	1:400
Alexa Fluor  594 山羊抗兔IgG	Thermo Fisher Scientific	A-11012	1:400
Alexa Fluor  594 山羊抗兔IgG	Thermo Fisher Scientific	A-11012	1:400
Alexa Fluor  647 山羊抗鸡IgG	Thermo Fisher Scientific	A-21469	1:400