基于SV40的人工附加体中通过结构倾向性DNA重复序列的复制电泳分析

摘要

本文概述了利用二维凝胶电泳分析通过致病性、易形成结构的重复序列进行复制进程的实验步骤。

摘要

二维中性/中性凝胶电泳（2DGE）已成为分析DNA复制通过天然障碍物的基准技术。本实验方案描述了如何在人类细胞中基于猴病毒40（SV40）的附加体质粒内，分析复制叉通过具有形成结构倾向的可扩展DNA重复序列的进程。简言之，在将质粒转染至人类细胞后，通过改良的Hirt法分离复制中间体，并用DpnI限制性内切酶处理以去除未复制的DNA。随后使用适当的限制性内切酶对中间体进行消化，使目标重复序列位于长度为3–5 kb的DNA片段中远离复制起点的一半区域。复制中间体在两个垂直方向上进行分离，首先是按大小，然后是按形状。经过Southern印迹杂交后，该方法可使研究人员观察到在复制Y弧线下降支上的各种结构形成性重复序列处发生的复制叉停滞现象。此外，这种停滞位点的位置设置还允许观察由重复序列介导的复制叉停滞所导致的多种结果，例如复制叉逆转、对向复制叉的到达以及通过重组机制实现的复制叉重启。

引言

短串联重复序列（STR）是小型的、通常为2-9个碱基对（bp）的DNA重复序列，约占人类基因组的3%¹。STR在基因调控中发挥重要作用²；然而，其重复性序列组成使其易于形成非经典的DNA二级结构，进而导致遗传不稳定性^3,4。从左手螺旋到发夹/十字形结构，再到三链和四链螺旋，这些替代性DNA结构对复制体构成了内在挑战。二级结构形成的自然前提是DNA解链，而DNA解链也是DNA复制的前提。这为基因组功能带来了一个独特的难题：许多此类结构可在复制过程中形成，阻碍复制体的前进，最终导致复制叉停滞^5,6,7；在严重情况下，甚至导致复制叉崩溃和DNA断裂^8,9。研究表明，停滞复制叉的重启以及DNA修复通路均可导致重复序列的不稳定性，例如重复序列的扩增^10,11以及复杂的基因组重排（CGR）

方案

注意：为哺乳动物细胞中所述双向电泳分析所设计的质粒，应在易形成二级结构的重复序列上游数千碱基处包含一个SV40复制起点（图2）。在选择重复序列相对于复制起点的克隆方向时，应考虑前导链与滞后链的合成方向。

图2：用于二维凝胶电泳分析的含重复序列质粒的酶切图谱。 易形成二级结构的重复序列位于向右移动的复制叉下游数千碱基处。使用特异性的限制性内切酶1和2进行酶切后，由于重复序列位于酶切片段超过中点的位置，该重复序列将落在Y型复制弧的下降支上。缩写：2DGE = 中性/中性二维凝胶电泳。请点击此....

结果

如果实验成功，在观察时可以看到一条清晰的复制叉弧线从巨大的1n斑点处向上和向外延伸（图5A）。片段的大小或已复制的百分比决定了其在第一维中的迁移能力。随着复制中间体结构变得更加复杂，它们在第二维中的迁移速度会逐渐减慢。因此，若某一中间体在两个维度中均迁移缓慢，则可推断其为一个高度复制的分子，且在结构连接特征上显著不同于常规的复制叉。在(GAA)₁₀₀重复序列的滞后链合成过程中，复制叉停滞表现为弧线上一个深色、界限清晰的斑点（I），表明复制叉在遇到重复序列时发生堆积，可能与三链结构的形成有关（图5B）。该区域上方还伴随出现更重、分支更多的中间体（II和III）。我们已在Rastokina等2023²⁴中对这些中间体的性质进行了更深入的描述。简而言之，这些中间体可能代表了复制叉在停滞后发生逆转的产物（II），以及对向复制叉到达所形成的复合结构（图5B）（III）。

讨论

二维凝胶电泳（2DGE）可提供特定序列复制过程中产生的中间体相对丰度的半定量且全面的图像。鉴于复制叉的脆弱分子结构必须在整个实验过程中保持完整，因此应格外注意防止物理剪切和化学变性。因此，强烈建议在质粒分离过程中避免任何碱性处理。为避免此问题，我们及其他研究者采用了Hirt于1967年建立的DNA Hirt提取法的改良形式³³。该方法通过在4 °C下用1 M NaCl处理细胞裂解液过夜，使DNA与蛋白质、RNA及其他细胞碎片分离。尽管该方法在保持复制中间体质量方面表现优异，但似乎无法完全将质粒DNA与基因组DNA分开。因此，在设计放射性标记探针的序列时应牢记这一点，所设计的探针应与任何基因组DNA序列无高度相似性，以最大程度避免非特异性结合。此外，通过UV-补骨脂素交联可显著提高复制中间体的完整性。具体而言，可将细胞在避光条件下与补骨脂素孵育数分钟，随后在366 nm波长下进行UV照射³⁴，从而在DNA分子之间形成共价键。这种方法除了增强中间体结构的完整性外，还可能消除中间体结构是在分离过程中而非在活体（in vivo）内形.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10x TBE 缓冲液	Bio Rad	1610733
20x SSC 缓冲液	Fisher Scientific	BP1325-1
293T 细胞	ATCC	CRL-3216
a-32P dATP，3000 Ci/mmol	Revvity	BLU512H250UC
琼脂糖	Fisher Scientific	BP160-500
Amersham Hybond-N+	Fisher Scientific	RPN303B
BAS 储磷屏	Fisher Scientific	28956482
Church 和 Gibert 杂交缓冲液	Fisher Scientific	50-103-5408
DecaLabel DNA 标记试剂盒	ThermoFisher Scientific	K0622
DMEM，高葡萄糖，GlutaMAX 补充剂，丙酮酸	ThermoFisher Scientific	10569010
DpnI	New England Biolabs	R0176S	还需购买其他限制性内切酶
EDTA 0.5 M，pH 8	Fisher Scientific	BP2482500
70% 乙醇	Fisher Scientific	BP82031GAL
胎牛血清	VWR	97068-085
盐酸溶液，12 M	Millipore Sigma	13-1683
异丙醇	Fisher Scientific	BP26184
jetPRIME DNA 和 siRNA 转染试剂（含缓冲液）	VWR	101000027
MycoZap Plus-CL	VWR	75870-448
NaCl	Millipore Sigma	746398-500G
Nalgene Oak Ridge 高速离心管	ThermoFisher Scientific	3139-0050
磷酸盐缓冲液，pH 7.4	ThermoFisher Scientific	10010023
磷酸盐缓冲液，pH 7.5	ThermoFisher Scientific	10010024
蛋白酶 K	ThermoFisher Scientific	EO0491
蛋白酶 K	ThermoFisher Scientific	EO0492
纯纤维素层析纸	Fisher Scientific	05-714-4
纯纤维素层析纸	Fisher Scientific	05-714-5
直尺	Fisher Scientific	09-016
手术刀	Fisher Scientific	12-460-451
十二烷基硫酸钠	Millipore Sigma	436143-25G
氢氧化钠	Fisher Scientific	S25548
Sorval LYNX 4000 超速离心机	ThermoFisher Scientific	75006580
Sub-cell 水平电泳系统	Bio Rad	1704401
TH13-6 x 50 摆动桶转子	ThermoFisher Scientific	75003010
Tris-HCl 1 M，pH 7.5	Fisher Scientific	BP1757-500
胰蛋白酶-EDTA（0.25%），酚红	ThermoFisher Scientific	25200056