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设定外泌体分离的成功分选条件

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DOI：

10.3791/67232

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2024年10月11日

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1FRACTAL - Flow cytometry Resource, Advanced Cytometry Technical Applications Laboratory, IRCCS Ospedale San Raffaele, 2Laboratorio di Biotecnologie Applicate all'Ortopedia, IRCCS Istituto Ortopedico Galeazzi, 3Università Vita-Salute San Raffaele

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案详细描述了间充质基质细胞释放的细胞外囊泡（EVs）的分选方法。特别是，重点介绍了仪器设置以及分选条件的优化。目标是在保持细胞外囊泡特性的同时对其进行分选。

摘要

间充质基质细胞（MSCs）释放的细胞外囊泡（EVs）含有具再生和抗炎作用的一组微小RNA。因此，纯化的MSC-EVs被视为多种疾病下一代治疗的潜在选择。在本方案中，我们报告了从常用于骨科再生医学应用的脂肪来源MSCs（ASCs）上清液中成功分离EVs的策略。

首先，我们介绍了样品制备过程，重点描述了细胞外囊泡（EV）的分离以及使用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）进行荧光标记的步骤；随后，我们详细说明了分选过程，该过程是本实验方案的主要部分。

除了遵循 MISEV 2023 和 MIFlowCyt EV 指南所定义的规则外，我们还采用了针对喷嘴尺寸、频率和鞘液压力的特定实验条件。形态学参数通过使用选定直径的微球建立，这些微球的直径覆盖了细胞外囊泡（EV）尺寸的理论范围。在 ASC-EV 分选后，我们通过分选仪重新分析分选组分，并结合纳米颗粒追踪分析技术验证 EV 尺寸分布，以进行纯度检测。

由于细胞外囊泡（EVs）的重要性日益增加，获得纯净的EV群体用于研究和表征变得至关重要。在此，我们展示了一种有效的分选策略，可用于实现这一目标。

引言

细胞外囊泡（EVs）是一类由几乎所有细胞释放的、具有膜结构的异质性囊泡，由脂质双分子层包被，自身无法复制1。它们存在于多种生物体液中，如血液血浆、血清、唾液、母乳、尿液、支气管肺泡灌洗液、羊水、脑脊液以及恶性腹水2。EVs的主要功能之一是在供体细胞与受体细胞之间转运多种分子，包括核酸、蛋白质、脂质和碳水化合物。这一过程可通过多种机制实现，例如直接膜融合、受体-配体相互作用、内吞作用以及吞噬作用3,4。因此，研究表明EVs在众多生理和病理过程中发挥着重要作用，并在疾病新型生物标志物、药物递送载体以及治疗剂方面展现出巨大潜力5,6。

间充质基质细胞（MSCs）是一类多能细胞，可从多种组织中分离获得，包括脂肪组织、牙髓、脐带血、胎盘、羊水、华通胶，甚至脑、肺、胸腺、胰腺、脾脏、肝脏和肾脏。近年来，这类细胞在再生医学领域引起了广泛关注7。脂肪来源的间充质干细胞（ASCs）可通过比骨髓等其他来源更为微创的方式从脂肪组织中获取，从而降低严重并发症的风险，并避免伦理问题8。

此外，脂肪组织中的间充质干细胞浓度显著高于骨髓（1% 对比 >0.01%）以及其他来源，如真皮、牙髓、脐带和胎盘。间充质干细胞因其具有分化能力以及能够分泌多种生长因子、趋化因子和细胞因子，在受损组织和细胞的再生中发挥关键作用；这些治疗益处不仅归因于其分化能力，还归因于其分泌多种生长因子、趋化因子和细胞因子的特性。一个显著的例子是间充质干细胞在骨科疾病治疗中的潜力，这一术语 "肌肉骨骼系统疾病" 在中国临床试验注册中心（clinicaltrials.gov，访问于13日）注册的临床研究数量更多th 2024年5月

此外，间充质干细胞（MSCs）还能分泌细胞外囊泡（EVs），通过向受损细胞或组织传递信息，发挥与母细胞相似的生物学活性，从而参与组织再生9,10。因此，MSC-EVs 可能成为细胞治疗的一种有价值的替代方案，实现无细胞治疗策略11，目前已有两项涉及 MSC-EVs 用于骨科疾病的临床研究（NCT05261360 和 NCT04998058）。然而，EVs 在临床应用方面仍存在若干挑战。例如，EV 分离技术存在一些问题：大多数方法无法保证囊泡的纯度或完整性。此外，某些分离技术操作复杂、耗时较长且重复性低，不适合临床应用12。

另一方面，细胞分选是一种常用的方法，可通过特异性荧光标记物从异质性细胞悬液中分离单个细胞13。该方法可用于多种应用，并可适用于不同类型的样本。然而，尽管细胞分选是一项成熟且广泛应用的技术，外泌体（EV）分选仍然极具挑战性，因为大多数外泌体的尺寸低于即使最灵敏的流式细胞仪的最低检测阈值。某些特性使分选仪更适用于此目的。首先，采用气流中的液流系统（Jet-in-air），即悬浮颗粒的液流在空气中而非流动池内被激光检测，该系统通过减少样本所受的应力来保护样本。第二个重要特点是，在液流与收集透镜之间设有"遮蔽"杆，可降低仪器的背景光学噪声。尽管背景噪声较低，但并未完全消除，其构成一个参考信号，为低于检测阈值的事件提供部分观察窗口：这对于分析接近仪器"检测限"的事件极为重要14。最后，该分选仪配备双通路前向散射光（FSC）检测系统，并配有两种不同的掩模，可提高对样本中大小颗粒的分辨能力。

基于此，我们开发了一种利用高灵敏度细胞分选仪分离羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记的间充质干细胞来源细胞外囊泡（MSC-EVs）的方案。为了尽量减少对细胞外囊泡（EVs）的操作并保持其完整性和数量，我们在样本制备过程中避免了超速离心步骤。此外，我们调整了分选条件以最大限度地减少对囊泡的应力损伤，包括进一步优化仪器参数，通过减小喷嘴尺寸相关的分选压力（70 μm 喷嘴，压力为 35 psi）来实现。

方案

本方案包含四个部分：（1）样品制备，（2）ASC-EVs 表征，（3）ASC-EVs 分选，以及（4）分选后分析。流程示意图如下所示 图1.

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图 1： 实验流程图。该流程图展示了本实验方案所包含的步骤：（1）样品制备，（2）分选前囊泡的表征，（3）分选，以及（4）分选后囊泡的分析。请点击此处查看此图的放大版本。

1. 样品制备

  1. 细胞外囊泡（EV）富集上清液的收集
    1. 解冻或收集在采集EV前一代培养的脂肪间充质干细胞（ASCs）（通常为第1至第5代），并对每份ASC分离株接种相同数量的细胞（例如，每175 cm2培养瓶表面积接种100万个细胞，可达到约60%-70%融合度）。
    2. 将ASCs在适当的培养基中（本方案使用DMEM-F12）培养48-72小时，培养基中需添加无EV的胎牛血清（FBS）或人血小板裂解物（hPL），具体根据实验要求进行。
      1. 为获得无EV的FBS或hPL，需在4 °C条件下以120,000 × g超速离心过夜，并取上清液使用。
        注：此后所提及的离心力均指所用仪器、转子和离心管组合下的平均值。请注意，不同转子或离心管可能导致每转每分钟（rpm）对应的g力和k因子存在差异。如需简便比较转子性能并调整g力和转速，请参考可用的换算表之一 https://www.beckman.it/centrifuges/rotors/calculator。
    3. 当细胞融合度达到90%时，消化并计数ASCs，用适量无血清培养基重悬细胞，理想情况下每1×106个ASCs使用1 mL培养基。将细胞悬液以每孔1 mL接种至24孔板中。由于无血清环境，细胞将保持悬浮状态并形成球状体。培养96小时后，收集上清液。
    4. 通过系列离心（4 °C）去除漂浮细胞和碎片：依次以400 × g离心10分钟、1,000 × g离心10分钟、2,000 × g离心10分钟，以及4,000 × g离心两次，每次10分钟。
    5. 使用0.22 µm滤膜过滤上清液，以去除大于220 nm的残留颗粒。
      注：可立即用于后续实验，或在4 °C保存最多一晚；若24小时内不进行后续操作，则应于-80 °C冷冻保存。
  2. 用于分选的EV染色
    1. 配制5 mM的5(6)-羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯（CFSE）溶液。现配现用，或避光保存于-20 °C备用。
    2. 直接从步骤1.1.1-1.1.5（24小时内）进行，或在4 °C条件下解冻-80 °C保存的含EV上清液。
    3. 染色前将上清液预热至37 °C，并加入CFSE使其终浓度为10 µM（500倍稀释）。在避光条件下37 °C孵育1小时。
    4. 孵育期间，向离心浓缩装置（再生纤维素膜，截留分子量100 kDa）中加入2 mL PBS，盖紧盖子，在水平转子中以4,000 × g离心10分钟。弃去滤器底部未过滤的PBS，并吸除收集管中的滤液。
      注：所述离心超滤方案适用于处理最多15 mL样品（最大体积）。
    5. 向离心浓缩装置中加入最多15 mL样品，盖紧盖子，以4,000 × g离心最多30分钟。
      注：通常最终样品体积约为500 µL。然而，具体离心时间可能因样品性质和流速等因素而异，需根据实际情况调整以达到目标浓缩程度。
    6. 从离心机中取出装置，清空收集管。向滤器中加入14 mL PBS，以4,000 × g离心最多30分钟。
    7. 重复步骤1.2.6。
    8. 从滤器中回收浓缩后的CFSE染色EV样品（约500 µL），取100 µL避光保存于4 °C，其余样品立即用于分选操作。

2. ASC-EVs 的表征

  1. EV标志物的Western印迹分析
    1. 在室温下以376 × g离心5分钟，沉淀1 × 106个ASCs，并将其重悬于含有蛋白酶抑制剂的适当裂解缓冲液中。使用合适的蛋白定量方法进行蛋白浓度测定。
      注意：根据本研究经验，使用二辛可宁酸（Bicinchoninic acid）法可获得最佳的定量结果。
    2. 使用Bradford法对相当于1 × 106个ASCs的浓缩上清液进行定量，或在4 °C下以100,000 × g离心1小时，沉淀相当于1 × 106个ASCs的EVs，并将其重悬于含有蛋白酶抑制剂的适当裂解缓冲液中，随后使用合适的蛋白定量方法进行测定。
      注意：根据本研究经验，对EV沉淀物而言，使用二辛可宁酸（Bicinchoninic acid）法可获得最佳的定量结果。
    3. 若使用浓缩上清液而非纯化的EVs，则在5% 2-巯基乙醇和2× Laemmli缓冲液中裂解样品。
      注意：根据本研究经验，浓缩上清液和纯化的EVs在EV阳性与阴性标志物检测中均能提供可比的结果。
    4. 将样品（1–10 µg）上样并在10%聚丙烯酰胺凝胶中以110 V电泳90分钟进行分离。
    5. 以250 mA电流将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，持续120分钟。
    6. 使用Ponceau S染色膜以观察样品和蛋白Marker的转移情况，随后在轻柔振荡下用PBS洗去Ponceau S染料。
    7. 用含5%脱脂奶粉和0.1% Tween的PBS溶液封闭膜60分钟。
    8. 在4 °C下，以工作浓度的适当一抗孵育膜过夜，包括EV阳性标志物（如本研究中使用的CD9、CD81、TSG101和Flotillin）和阴性标志物（如本研究中使用的Calnexin）。
    9. 用含0.1% Tween的PBS洗涤后，在室温下孵育适当的辣根过氧化物酶标记的二抗45分钟，随后使用ECL显色系统显影。使用可用的成像系统获取图像（图2A）。
  2. EV标志物的流式细胞术分析：表面染色
    1. 使用前，将每种单克隆抗体（mAb）在4 °C下以15,000–17,000 × g离心30分钟，以去除可能引起假阳性信号的聚集体。此外，将mAb分别通过0.22 µm离心滤管在4 °C下以1,000 × g过滤，直至所有液体完全通过滤膜且滤膜表面无残留抗体液体。将mAb储存于4 °C。
    2. 将CFSE标记的EVs（参见步骤1.2.1–1.2.8）用0.22 µm滤过的PBS稀释至1:10。
    3. 将100 µL样品或0.22 µm滤过的PBS，分别与已滴定的EV特异性mAb（抗CD9/63/81）或MSC特异性mAb（抗CD44）孵育，或不加抗体作为对照。在4 °C避光条件下孵育30分钟。
      注意：本方案旨在检测典型的EVs和MSC谱系标志物，但可扩展至其他所有细胞谱系或EV亚型特异性表面标志物。避免使用落入异硫氰酸荧光素（FITC）通道的荧光染料，以防止与EVs的CFSE染色发生重叠。建议使用每种与单一荧光染料（如别藻蓝蛋白APC）偶联的mAb进行单色染色。多色染色是可行的，但必须设置对照以排除抗体空间位阻的潜在影响。需单独或混合测试各抗体，确保信号具有可比性。此外，对照中应包含FMO对照。
    4. 按照步骤3.2所述设置散射校准。
    5. 建立侧向散射（SSC）对数刻度与FITC对数刻度的散点图，运行0.22 µm滤过的PBS或未染色EVs的样本管；在FITC通道设置阈值，并调整至排除大部分背景噪声的最高值。圈选CFSE阳性事件区域。
    6. 在CFSE阳性事件区域设门，建立APC直方图并运行0.22 µm滤过的PBS或未染色EVs的样本管。
      注意：对于APC增益，可使用仪器质控（QC）设定的增益值，但建议进行专门的增益滴定以优化仪器性能。
    7. 向染色后的样品中加入200 µL 0.22 µm滤过的PBS，开始采集。采集时使用低流速（10 µL/分钟）。如有可能，记录至少5,000个FITC阳性门内的事件。
    8. 使用mAb染色的PBS对照检测mAb可能产生的非特异性信号。所有样本管均以相同流速读取，以确保运行间的一致性。
    9. 为避免样本交叉污染，每分析一个样本管后，先运行10秒去垢剂，再运行10秒去离子水（DI水）（图2B）。
      注意：为避免流路系统不稳定，先采集10秒，再开始正式记录。
  3. EV标志物的流式细胞术分析：胞内染色
    注意：进行胞内染色时，使用含有固定和通透试剂的专用试剂盒。抗Caveolin mAb与Alexa 488偶联。本实验在未使用CFSE标记的条件下进行胞内染色。
    1. 使用前，按前述方法（步骤2.2.1）对mAb进行离心处理。
    2. 进行胞内染色时，遵循试剂盒制造商的说明（图2C）。
  4. 通过纳米颗粒追踪分析（NTA）表征EV的浓度与粒径
    1. 对样品进行适当稀释，使NTA仪器显示视野中每帧可见20–120个颗粒。
    2. 使用1 mL胰岛素注射器将样品注入NTA仪器的样品室。
    3. 设置NTA软件记录参数如下：5次标准测量，每次60秒，流泵设定为30。
    4. 将光强调节至适当值，以清晰区分颗粒与背景，并在NTA软件中运行捕获程序。
      注意：相机水平设置可能影响颗粒检测。若设置过高，背景呈乳白色且颗粒光散射强烈，可能掩盖大部分颗粒信号；若设置过低，虽可获得较暗背景，但可能遗漏大部分较弱信号事件。应对每个样品进行监测以确定最佳设置。
    5. 若每帧颗粒数低于20或高于80，需调整稀释倍数。
    6. 将阈值设为4，用于分析上清液的平均众数粒径和颗粒浓度。分析时需考虑初始稀释倍数。
    7. 每次检测后，用去离子水清洗仪器样品室，以避免交叉污染。
    8. 打开NTA分析软件，对采集的样品进行分析，并计入稀释倍数（图2D）。
  5. 通过透射电子显微镜（TEM）表征EV形态
    1. 收集ASCs浓缩上清液，或通过超速离心（4 °C下100,000 × g离心1小时）分离EVs，随后将沉淀重悬于等体积PBS中。
    2. 将5 μL浓缩上清液或EVs滴加至碳支持膜铜网上，吸附10分钟。用滤纸吸去多余液体。
    3. 使用2%醋酸铀水溶液进行负染，染色10分钟，染液体积与样品液滴相同（5 µL）。用滤纸轻触铜网以去除多余染液。
    4. 在室温下干燥铜网，并在120 kV透射电子显微镜下观察（图2E）。

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图2：ASC-EVs 的表征。（A）EVs 阳性标志物（CD9、CD81、TSG101 和 Flotillin）和阴性标志物（Calnexin）的代表性 Western blot 结果。已标注相应的分子量，ASC 裂解液作为对照。 （B）EVs 标志物的流式细胞术分析。分析了以下标志物的表达：CD9、CD63、CD81 和 CD44。仅对 CFSE 阳性的 ASC-EVs 进行标志物表达分析。直方图显示未染色（红色直方图）和染色（蓝色直方图）的 ASC-EVs。（C）EVs 标志物 Caveolin 的流式细胞术胞内分析。直方图显示未染色（灰色直方图）和染色（蓝色直方图）的 ASC-EVs。（D）通过 NTA 对 ASC-EVs 进行表征。直方图显示样品的浓度（颗粒数/mL）/粒径（nm）。 （E）透射电子显微镜（TEM）观察 ASC-EVs。比例尺 = 100 nm。 请点击此处查看该图的放大版本。

3. ASC-EVs 的分选

  1. 细胞分选仪设置
    注意：细胞分选仪是一种流式细胞仪，能够从异质性起始样本中分离出纯的细胞群体。分选仪通过压电晶体高频振荡液流，使其断裂成包含单个事件的液滴。含有目标颗粒（如细胞或囊泡）的液滴被充电，并通过金属偏转板发生偏转。收集分选后的组分用于后续分析。
    1. 打开压力管线和真空系统。
      注意：部分分选仪具有自动启动功能，而另一些则为手动启动。推荐使用手动启动的分选仪，因其允许优化频率、压力及喷嘴头选择等技术参数。建议工作条件为：频率66,000 Hz、压力35 psi、使用70 µm喷嘴。
    2. 开启仪器，打开生物安全柜，并启动分选仪软件。
    3. 对流路系统加压，然后开启流路系统。
    4. 激活Drop Drive，即喷嘴内的压电晶体，使其振动以形成液滴。
    5. 执行Debubbling程序以消除系统中的气泡，随后以高差压运行5 mL清洗液5分钟，再运行5 mL去离子水5分钟。
    6. 执行手动Startup程序。
      1. 在激光控制标签页中，按下激光功率按钮以开启激光电源。
        注意：对所有激光重复此操作：蓝色488 nm、黄绿色561 nm、紫色405 nm和红色640 nm。
      2. 检查液流的垂直对齐情况。
        注意：如有需要，调节喷嘴组件的前后微调旋钮、左右微调旋钮和万向节，以调整垂直对齐，并使用上下微调旋钮验证液流的垂直性；最佳对齐状态下，液流在每束激光下均应保持垂直。若首次使用特定喷嘴，需执行激光延迟。在触摸屏面板的激光与液流交汇标签页中，选择正确的喷嘴尺寸，点击激光延迟按钮，并按照屏幕提示完成激光延迟程序。通常情况下，当改变鞘液压力从而更换喷嘴头时，应在寻找对齐前先执行激光延迟测定。完成激光延迟程序后，建议根据屏幕提示执行背景图像减除程序，以最小化背景信号。
      3. 通过点击激光流交汇标签页中的绿色箭头按钮，并按照触摸屏显示器上的指示，执行激光光斑测定。
    7. 初始化Intellisort。设置液滴驱动频率和默认振幅值，使液流形成液滴。
      1. 完成此步骤后，加载已保存的配置。要加载已保存的设置配置，请在分选仪软件工具栏中选择加载分选设置。在测试不同频率和振幅后，选择能确保最佳液滴稳定性的参数组合。建议工作频率为66,000 Hz，振幅约为40–45 V。
    8. 执行精细激光对齐程序。
      1. 在进样器中加载含有5 mL QC对齐微球的离心管并运行；在精细对齐标签页中，选择X轴和Y轴上的目标参数，以便清晰观察到紧密且准直的微球信号。在数据显示区域中，首先选择488 - 513/26-H作为Y轴参数，488-FSC1-H作为X轴参数。随后为精细调节所有激光，选择405-488/59-H作为Y轴参数，640-795/70-H作为X轴参数。
        注意：所选参数取决于分选仪的激光配置。仪器手册建议选择在针孔条带上空间分离度最大的激光组合。为此目的，使用紫色激光（405 nm）和红色激光（640 nm）。
      2. 在分选仪专家确认手动对齐无误后，执行自动QC。选择QC微球的直径：3 µm。
        注意：该程序结束后，结果可能为QC未通过或QC通过。若QC失败，则需手动优化对齐。
      3. 将QC采集结果保存至软件的对齐协议中。
    9. 完成Intellisort程序
      1. 将偏转板正确安装在分选仪中，并开启电压（建议偏转板电荷为3,000 V）。
      2. 选择6管架分选输出，在液流指示器中选中相应液流，并执行测试液流。
        注意：若液流未清晰分离或定义不清，应调整电荷相位、去扇化或其他参数，以获得清晰且不振荡的液流。
      3. 启用Intellisort自动液滴延迟测定按钮。此步骤用于设定正确的液滴延迟。完成后再次验证液流状态。
      4. 激活Intellisort维持模式。手动验证液滴延迟。
      5. 在分选仪软件中加载手动液滴延迟协议。采集荧光对照微球。
      6. 插入正确的载片架。在分选仪软件中选择分选 > 液滴延迟向导。选择分选逻辑。
      7. 使用荧光显微镜验证第五个液滴中是否存在97%的荧光微球。
  2. 仪器设置：散射光校准
    注意：散射光校准使用Verity Shells微球（以下简称中空有机硅酸盐微球）。这类有机硅酸盐微球的折射率分布和光散射特性比聚苯乙烯微球更接近细胞外囊泡（EVs），因此可用于设置SSC和FSC电压，以更好地区分EV样事件与电子噪声。该微球包含两个小瓶的混合物：VER01A（189 nm微球）和VER01B（374 nm微球）。每个小瓶均含有中空有机硅酸盐微球和380 nm绿色荧光微球（称为参考微球）的混合物。中空有机硅酸盐微球的浓度为1 × 108 个/mL。
    1. 通过将每种微球各一滴（50 μL）稀释于1 mL 0.22 µm滤过的PBS中，制备VER01A和VER01B微球样本，最终浓度为5,000 个/µL。
      注意：使用前涡旋振荡微球5秒。
    2. 创建SSC对数尺度与FITC对数尺度的散点图。
    3. 采集VER01B微球，并调节电压，使参考微球在SSC/FITC散点图的右上区域清晰可辨（图3A）。
    4. 在该微球群体周围设置一个区域。
    5. 创建SSC对数尺度与FSC对数尺度的散点图。识别参考微球和VER01B微球群体，并在VER01B微球群体周围设置一个区域（图3B）。
    6. 采集VER01A微球，并在该微球群体周围创建一个区域（图3C）。
      注意：该微球群体部分与仪器背景噪声重叠。
    7. 采集0.22 µm滤过的PBS，并调节阈值，在不丢失最小微球可视化的情况下降低仪器背景噪声。
      注意：散射光校准也可使用FSC Megamix微球（以下简称FSC聚苯乙烯微球），其为直径分别为100 nm、300 nm、500 nm和900 nm的荧光微球混合物。应优先使用中空有机硅酸盐微球而非FSC聚苯乙烯微球，因其折射率分布和光散射特性更接近EVs。300 nm FSC聚苯乙烯微球群体与中空有机硅酸盐微球的参考微球重叠。因此，基于中空有机硅酸盐微球的设门可在流式细胞仪上选择尺寸相似的EVs。
  3. 样本采集
    1. 创建SSC对数尺度与FITC对数尺度的散点图，采集0.22 µm滤过的PBS，并定义参考背景噪声（图4A）。
      注意：将流式细胞仪的流速设为“低”，并控制流速。事件数/秒不得超过2,000个/秒。“低流速”表示低差压。
    2. 采集对照样本（未染色EVs）并检查流速。确保事件数/秒约为5,000个/秒。
      注意：若事件数超过建议值，应稀释样本。
    3. 采集经PBS染色并按CFSE样本方式处理的样本，检查是否无阳性事件可见（图4B）。
    4. 采集CFSE染色样本。根据流速进行稀释。绘制一个区域以识别CFSE阳性事件，另一个区域识别CFSE阴性事件。使用未染色样本作为对照（图5A、B）。这些即为分选区域。
  4. 样本分选
    1. 在分选仪软件中新建一个协议（在工具栏中选择文件 > 协议 > 新建）。
    2. 在分选仪软件中点击数据采集设置；在采集参数窗口中选择感兴趣的通道，禁用其他通道。对于本特定面板，启用的信号为：488-FSC1、488-FSC2、488-SSC和488-513/26（用于CFSE信号）。
    3. 在进样器中放置含有5 mL样本的离心管。在触摸屏上点击加载按钮，并在分选仪软件工具栏中选择采集 > 开始（或按下F2按钮）。将弹出样本属性窗口；输入样本名称并点击确定。
    4. 创建面板，绘制目标图并建立设门策略。
      1. 在分选仪软件工具栏中选择直方图 > 创建直方图。
      2. 在工作区中创建三个散点图：第一个X轴为488-FSC1 Height-Log参数，Y轴为488-SSC Height-Log；第二个X轴为488-FSC2 Height-Log参数，Y轴为488-SSC Height-Log；第三个X轴为488-513/26 CFSE Height-Log参数，Y轴为488-SSC Height-Log。
    5. 在分选标签页中，确定待分选的区域。在分选仪软件中点击分选设置。在分选逻辑与统计窗口中，在逻辑构建器中选择待分选的区域。
      注意：进行分选决策时需考虑多个设置：分选逻辑、分选模式和液滴包络。分选逻辑指设门策略。位于选定门之外的事件不会被分选。分选模式与最终输出相关。建议使用纯化模式，以确保所有分选液滴仅包含目标阳性事件。液滴包络定义了根据阳性事件在液滴中的位置而被充电和分选的液滴数量：选择1–2个液滴，以确保所有阳性事件均被分选。
    6. 当流速稳定后，停止采集（在分选仪软件工具栏中选择采集 > 停止或再次按下F2按钮）。开始分选（在分选仪软件工具栏中选择分选 > 开始或按下F4按钮）。
      注意：开始分选前，检查测试液流，确认分选组分正确落入收集管中。
    7. 保存分选设置。在分选仪软件工具栏中选择分选 > 保存分选设置。
  5. 分选群体纯度检测
    1. 通过以高差压采集5 mL清洗液10分钟和5 mL去离子水10分钟，清洗仪器。
    2. 采集0.22 µm滤过的PBS，检查是否存在CFSE阳性事件。
    3. 将5 μL分选样本稀释于100 µL 0.22 µm滤过的PBS中。
    4. 采集并记录所有样本体积（图5C、D）。
      ​注意：报告了CFSE阳性与阴性分选EVs的再分析结果。

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图3：使用中空有机硅胶珠设置物理参数。（A）SSC/FITC 散点图：使用参考绿色荧光珠设置SSC参数。SSC/FSC散点图显示（B）VER01B 和（C）VER01A 珠。 请点击此处查看该图的放大版本。

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图4：参考背景噪声。 (A) PBS 样品的 SSC/CFSE 散点图。(B) PBS + CFSE 样品的 SSC/CFSE 散点图。请点击此处查看此图的放大版本。

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图5： CFSE 标记的 ASC-EVs 分选。（A）未标记 EVs 的 SSC/CFSE 散点图，（B）CFSE 标记的 EVs，（C）分选后 CFSE 阴性的 EVs，以及（D）分选后 CFSE 阳性的 EVs。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 分选后分析

注意：由于分选后材料量有限，可能无法进行所有分析。根据所获得的材料量，将执行以下分析。

  1. 通过流式细胞术表征EV：表面染色（参见步骤2.2）
    注意：除样本制备外，其余操作同前述用于分选前样本的方法。分选后的样本可直接使用，无需稀释。
    1. 使用未经稀释的分选后样本，并按照步骤2.2.3进行操作。（图6A）
  2. 通过NTA表征EV浓度和粒径（参见步骤2.4）
    注意：除样本制备外，其余操作同前述用于分选前样本的方法。分选后的样本可直接使用，无需稀释。
    1. 使用未经稀释的分选后样本，并按照步骤2.4.2进行操作。（图6B）
  3. 通过TEM表征EV形态（参见步骤2.5）
    注意：除样本制备外，其余操作同前述用于分选前样本的方法。
    1. 向离心浓缩装置（再生纤维素膜，截留分子量100 kDa）中加入2 mL PBS，盖紧盖子，在水平转子中以4,000 × g离心10分钟。从滤器底部移除未过滤的PBS。
    2. 吸除收集管中的滤液。所述离心超滤方案适用于处理最多15 mL样本（最大体积）。
    3. 向AU-15滤器中加入最多15 mL样本，并盖紧装置。以4,000 × g离心最多30分钟。浓缩至该装置允许的最小体积，约为100–150 µL。
    4. 从滤器装置中回收浓缩后的分选EV样本，并按照前述用于分选前样本的TEM操作步骤（步骤2.5.2）进行后续操作。（图6C）

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图6： 分选后ASC-EVs的表征。 对EV标志物进行流式细胞术分析。分析了以下标志物的表达：CD9、CD63、CD81和CD44。仅对CFSE阳性的ASC-EVs进行标志物表达分析。（A）直方图显示未染色（红色直方图）和染色后（蓝色直方图）的ASC-EVs。（B）通过NTA对ASC-EVs进行表征。直方图显示分选前（左）和分选后（右）样本的浓度（颗粒数/mL）与粒径（nm）分布。（C）通过TEM观察分选前（左）和分选后（右）样本中的ASC-EVs。比例尺 = 100 nm。 请点击此处查看该图的放大版本。

结果

已使用FSC聚苯乙烯微球进行分选，以验证仪器设置和分选条件。FSC聚苯乙烯微球为混合荧光微球，粒径分别为100 nm、300 nm、500 nm和900 nm，在FITC通道中可见。图7A显示了分选前四群微球在SSC对数刻度与FITC对数刻度的散点图。对100 nm、300 nm和500 nm的荧光微球群体进行设门并分选。分选后的微球用于纯度与富集度分析，作为初步的概念验证（图7B）。所有群体在分选后均达到高纯度。参考背景噪声在分选前后的散点图中始终可见。

为满足MISEV2018/2023中列出的要求，并证明囊泡的性质及其纯度水平，研究人员开展了实验以分析细胞外囊泡（EVs）上存在或缺失的标志物。EVs对某些特定表面标志物呈阳性15：CD9、CD63、CD81和CD44。其中，CD9、CD63和CD81属于膜蛋白中的四跨膜蛋白家族，是鉴定外泌体最常见的标志物16。CD44是一种在间充质干细胞（MSCs）和脂肪源性干细胞（ASCs）中高表达的标志物17。

细胞内流式细胞术实验表明，EVs 对细胞质蛋白 Caveolin 呈阳性。此外，Western 印迹证实 EVs 对 CD9、CD81、TSG101 和 Flotillin 呈阳性，而对 Calnexin 呈阴性（图 2）。

接下来，按照本方案中所述的方法对CFSE标记的ASC-EVs进行分选。该分选程序重复进行了四次，每次均严格保持相同的样本制备、染色和分选条件（表1）。通过这种方式，验证了本方案的可重复性。

为分析经CFSE分选的ASC-EVs群体，并证明其特性在分选后未发生变化，进行了一系列实验。特别是，分选后CD9、CD63、CD81和CD44的表达水平未发生改变（图6A）。

另一个关键点涉及细胞外囊泡（EVs）的尺寸，以及由于压力诱导的应力，在分选过程后其尺寸可能发生的变化。由于样品量较少，分选后的分析难以进行，但纳米颗粒追踪分析表明，两个ASC-EVs样品（分选前和分选后）的粒径分布相同（图6B）。最后，通过透射电子显微镜（TEM）对EVs进行分析表明，分选后的EVs形态似乎未发生显著改变（图6C）。

值得注意的是，根据 MIFlowCyt-EV 框架指南的建议18，经0.1% Triton X-100处理样本后，CFSE阳性EVs数量减少，从而支持其囊泡来源（图8).

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图7： FSC 聚苯乙烯微球分选。（A）分选前微球的SSC/FITC散点图。分选后重新分析微球的SSC/FITC散点图：（B）100 nm分选微球，（C）300 nm分选微球，以及（D）500 nm分选微球。请点击此处查看此图的放大版本。

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图 8： 在 Triton X-100 存在下细胞外囊泡膜的降解。将浓度为 0.1% 的 Triton X-100 加入样品中，在室温下孵育 15 分钟。图中展示了三次独立实验中未经处理（左）和经处理（右）样品的代表性散点图。 请点击此处查看该图的放大版本。

实验分选出的EVs数量 CFSE+ 分选EVs数量压力 (psi)喷嘴直径 (mm)频率 (Hz)
174 x 1064.8 x 106357066000
244 x 1067 x 106357066000
338 x 1063 x 106357066000
416 x 1062 x 106357066000

表1：分选程序的重复性

讨论

由于细胞外囊泡（EVs）体积微小，且接近大多数流式细胞仪的检测极限，因此对其分析和分选具有挑战性。我们的目标是建立一种分离经CFSE标记的AMSC来源EVs的实验方案。选择CFSE作为染色方法，是因为其报道的EVs标记效率高（≥90%），且不会像抗体染色那样产生蛋白聚集体等非特异性颗粒。然而，仍有可能遗漏少数不含酯酶的EVs，未来需要进一步研究以鉴定能够标记此类颗粒的染色方法，从而优化分选方案19。

我们的目标是建立一种分选条件，能够在不改变细胞外囊泡（EVs）物理特性的前提下实现高纯度EVs的收集。通过充分利用所用分选仪的技术性能，并采取特定措施（例如根据喷嘴尺寸降低标准分选压力），成功实现了该条件的建立。我们利用FSC聚苯乙烯微球对这些分选条件进行了建立和验证。随后，将该方案应用于脂肪来源干细胞（ASC）EVs的分选，共重复实验四次，均获得一致的结果，从而证实了本方案的可重复性。

然而，需要注意一些关键方面和局限性，我们在此列出。（i）分选样品的纯度：由于仪器的背景噪声在重新分析时始终存在，因此很难确凿地证明分选后的CFSE阳性细胞外囊泡（EVs）的纯度。但是，我们可以认为已富集了CFSE阳性的群体。在CFSE阴性群体中未检测到CFSE阳性事件，表明我们的分选过程是成功的，间接证明了分选样品的纯度。（ii）分选样品的潜在污染：我们不能排除分选组分中可能含有仪器无法检测的小囊泡，这些小囊泡可能会被无意中包含在分选液滴中。（iii）分选后EVs的完整性：我们意识到仪器施加的压力可能会对囊泡造成损伤。为减轻这一影响，我们采用了70 µm喷嘴，并将压力从标准的60 psi降低至35 psi。此外，我们谨慎地制备样品，避免使用可能改变EVs物理特性的超速离心步骤。尽管采取了这些预防措施，我们仍无法保证分选后的EVs保持完整且未发生改变。因此，我们建议进行分选后的分析，并在可能的情况下开展功能测试，以评估EVs的状态。

以下是一些可能的方案修改与故障排除建议。本方案所设定的参数基于可调节压力的仪器；然而，对于压力设置较为固定的仪器，建议使用100 µm喷嘴，以降低压力，从而尽可能保持细胞外囊泡（EVs）的完整性。

尽管存在上述考虑，我们仍认为本方案相较于其他EV分离方法具有显著优势。首先，该方法能够分离特定的EV亚群。虽然我们选择使用CFSE（一种可标记具有完整细胞膜结构的荧光染料）对囊泡进行染色，但也可利用单克隆抗体对特定EV亚群进行分选。在此类情况下，额外的染色对照至关重要。国际细胞外囊泡学会（International Society for Extracellular Vesicles, ISEV）、国际流式细胞术促进学会（International Society for Advancement of Cytometry, ISAC）以及国际血栓与止血学会（International Society on Thrombosis and Haemostasis, ISTH）已发布了关于开展可重复流式细胞术实验的全面指南。详细说明可参见MISEV 20231 和MIFlowCyt-EV指南18。其次，该方法相较于需多次超速离心的其他方法更为省时。

在我们看来，该方案可能是分离和收集特定群体细胞外囊泡的有效策略，这些细胞外囊泡在治疗方面具有潜在应用价值。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢 Emanuele Canonico 提供的技术支持。本研究的部分工作在 ALEMBIC 完成，ALEMBIC 是由 IRCCS Ospedale San Raffaele 和 Università Vita-Salute San Raffaele 建立的先进显微镜实验室。Enrico Ragni 和 Laura de Girolamo 的工作得到了意大利卫生部“"Ricerca Corrente"”项目的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
5(6)-羧基荧光素二乙酸盐 N-琥珀酰亚胺酯Merck150347-59-4
脂肪间充质基质细胞Wepredic, Parc d'affaires, 35760 Saint-Grégoire, France本研究中使用的细胞
Alexa 488 抗小窝蛋白抗体R&D SystemsIC5736G流式细胞术抗体
APC 抗人 CD44 抗体BioLegend338805流式细胞术抗体
APC 抗人 CD63 抗体BioLegend353007流式细胞术抗体
APC 抗人 CD81 (TAPA-1) 抗体BioLegend349509流式细胞术抗体
APC 抗人 CD9 抗体BioLegend312107流式细胞术抗体
BC CytoFLEX SBeckman Coulter配备蓝光、红光和紫光三种激光器的 BC CytoFLEX S
Flow-Check Pro 荧光微球Beckman CoulterA63493用于 MoFLO Astrios EQ 的荧光对照微球
FlowJo 软件（版本 10.8.1）BDversion 10.8.1分析软件
IntraSure 试剂盒BD Biosciences641776用于细胞内染色的固定和透化处理
Megamix-Plus FSCBioCytex7802FSC 聚苯乙烯微球 
MoFLO Astrios EQBeckman Coulter配备蓝光、黄绿光、紫光和红光四种激光器的 MoFLO Astrios EQ
小鼠抗 FLOT1 抗体BD Transduction Laboratories610820Western Blot 抗体
NanoSight NS300MalvernNS300
兔抗 Calnexin 抗体OrigeneTA336279Western Blot 抗体
兔抗 CD9 和 CD81 抗体（ExoAb 抗体试剂盒）System BiosciencesEXOAB-KIT-1Western Blot 抗体
兔抗 TSG101 抗体 MerckHPA006161Western Blot 抗体
Triton X-100Merck9036-19-5
Ultra Rainbow 荧光颗粒SpherotechURFP-30-2
Ultracel 100 kDa MWCOMerckUFC910024
VER01 - Verity 微壳Exometry用于散射校准的有机硅酸盐微球

参考文献

  1. Welsh, J. A., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (misev2023): From basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2024).
  2. Xu, R., Greening, D. W., Zhu, H. J., Takahashi, N., Simpson, R. J. Extracellular vesicle isolation and characterization: Toward clinical application. J Clin Invest. 126 (4), 1152-1162 (2016).
  3. Dixson, A. C., Dawson, T. R., Di Vizio, D., Weaver, A. M. Context-specific regulation of extracellular vesicle biogenesis and cargo selection. Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (7), 454-476 (2023).
  4. Witwer, K. W., Wolfram, J. Extracellular vesicles versus synthetic nanoparticles for drug delivery. Nat Rev Mater. 6 (2), 103-106 (2021).
  5. Cheng, L., Hill, A. F. Therapeutically harnessing extracellular vesicles. Nat Rev Drug Discov. 21 (5), 379-399 (2022).
  6. Du, S., et al. Extracellular vesicles: A rising star for therapeutics and drug delivery. J Nanobiotechnology. 21 (1), 231(2023).
  7. Keshtkar, S., Azarpira, N., Ghahremani, M. H. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: Novel frontiers in regenerative medicine. Stem Cell Res Ther. 9 (1), 63(2018).
  8. Orbay, H., Tobita, M., Mizuno, H. Mesenchymal stem cells isolated from adipose and other tissues: Basic biological properties and clinical applications. Stem Cells Int. 2012, 461718(2012).
  9. Caplan, A. I., Dennis, J. E. Mesenchymal stem cells as trophic mediators. J Cell Biochem. 98 (5), 1076-1084 (2006).
  10. Rani, S., Ryan, A. E., Griffin, M. D., Ritter, T. Mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles: Toward cell-free therapeutic applications. Mol Ther. 23 (5), 812-823 (2015).
  11. Galipeau, J., Sensébé, L. Mesenchymal stromal cells: Clinical challenges and therapeutic opportunities. Cell Stem Cell. 22 (6), 824-833 (2018).
  12. Jia, Y., et al. Small extracellular vesicles isolation and separation: Current techniques, pending questions and clinical applications. Theranostics. 12 (15), 6548-6575 (2022).
  13. Ohnuma, K., Yomo, T., Asashima, M., Kaneko, K. Sorting of cells of the same size, shape, and cell cycle stage for a single cell level assay without staining. BMC Cell Biol. 7, 25(2006).
  14. Morales-Kastresana, A., et al. High-fidelity detection and sorting of nanoscale vesicles in viral disease and cancer. J Extracell Vesicles. 8 (1), 1597603(2019).
  15. Mortati, L., et al. In vitro study of extracellular vesicles migration in cartilage-derived osteoarthritis samples using real-time quantitative multimodal nonlinear optics imaging. Pharmaceutics. 12 (8), 734(2020).
  16. Andreu, Z., Yanez-Mo, M. Tetraspanins in extracellular vesicle formation and function. Front Immunol. 5, 442(2014).
  17. Mildmay-White, A., Khan, W. Cell surface markers on adipose-derived stem cells: A systematic review. Curr Stem Cell Res Ther. 12 (6), 484-492 (2017).
  18. Welsh, J. A., Tang, V. A., Van Der Pol, E., Gorgens, A. MIFlowCyt-EV: The next chapter in the reporting and reliability of single extracellular vesicle flow cytometry experiments. Cytometry A. 99 (4), 365-368 (2021).
  19. Maia, J., et al. Employing flow cytometry to extracellular vesicles sample microvolume analysis and quality control. Front Cell Dev Biol. 8, 593750(2020).

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