设定外泌体分离的成功分选条件

摘要

本方案详细描述了间充质基质细胞释放的细胞外囊泡（EVs）的分选方法。特别是，重点介绍了仪器设置以及分选条件的优化。目标是在保持细胞外囊泡特性的同时对其进行分选。

摘要

间充质基质细胞（MSCs）释放的细胞外囊泡（EVs）含有具再生和抗炎作用的一组微小RNA。因此，纯化的MSC-EVs被视为多种疾病下一代治疗的潜在选择。在本方案中，我们报告了从常用于骨科再生医学应用的脂肪来源MSCs（ASCs）上清液中成功分离EVs的策略。

首先，我们介绍了样品制备过程，重点描述了细胞外囊泡（EV）的分离以及使用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）进行荧光标记的步骤；随后，我们详细说明了分选过程，该过程是本实验方案的主要部分。

除了遵循 MISEV 2023 和 MIFlowCyt EV 指南所定义的规则外，我们还采用了针对喷嘴尺寸、频率和鞘液压力的特定实验条件。形态学参数通过使用选定直径的微球建立，这些微球的直径覆盖了细胞外囊泡（EV）尺寸的理论范围。在 ASC-EV 分选后，我们通过分选仪重新分析分选组分，并结合纳米颗粒追踪分析技术验证 EV 尺寸分布，以进行纯度检测。

由于细胞外囊泡（EVs）的重要性日益增加，获得纯净的EV群体用于研究和表征变得至关重要。在此，我们展示了一种有效的分选策略，可用于实现这一目标。

引言

细胞外囊泡（EVs）是一类由几乎所有细胞释放的、具有膜结构的异质性囊泡，由脂质双分子层包被，自身无法复制¹。它们存在于多种生物体液中，如血液血浆、血清、唾液、母乳、尿液、支气管肺泡灌洗液、羊水、脑脊液以及恶性腹水²。EVs的主要功能之一是在供体细胞与受体细胞之间转运多种分子，包括核酸、蛋白质、脂质和碳水化合物。这一过程可通过多种机制实现，例如直接膜融合、受体-配体相互作用、内吞作用以及吞噬作用^3,4。因此，研究表明EVs在众多生理和病理过程中发挥着重要作用，并在疾病新型生物标志物、药物递送载体以及治疗剂方面展现出巨大潜力^5,6。

间充质基质细胞（MSCs）是一类多能细胞，可从多种组织中分离获得，包括脂肪组织、牙髓、脐带血、胎盘、羊水、华通胶，甚至脑、肺、胸腺、胰腺、脾脏、肝脏和肾脏。近年来，这类细胞在再生医学领域引起了广泛关注⁷。脂肪来源的间充质干细胞（ASCs）可通过比骨髓等其他来源更为微创的方式从脂肪组织中获取，从而降低严重并发症的风险，并避免伦理问题⁸

方案

本方案包含四个部分：（1）样品制备，（2）ASC-EVs 表征，（3）ASC-EVs 分选，以及（4）分选后分析。流程示意图如下所示 图1.

图 1： 实验流程图。该流程图展示了本实验方案所包含的步骤：（1）样品制备，（2）分选前囊泡的表征，（3）分选，以及（4）分选后囊泡的分析。请点击此处查看此图的放大版本。

1. 样品制备

1. 细胞外囊泡（EV）富集上清液的收集
   1. 解冻或收集在采集EV前一代培养的脂肪间充质干细胞（ASCs）（通常为第1至第5代），并对每份ASC分离株....

结果

已使用FSC聚苯乙烯微球进行分选，以验证仪器设置和分选条件。FSC聚苯乙烯微球为混合荧光微球，粒径分别为100 nm、300 nm、500 nm和900 nm，在FITC通道中可见。图7A显示了分选前四群微球在SSC对数刻度与FITC对数刻度的散点图。对100 nm、300 nm和500 nm的荧光微球群体进行设门并分选。分选后的微球用于纯度与富集度分析，作为初步的概念验证（图7B）。所有群体在分选后均达到高纯度。参考背景噪声在分选前后的散点图中始终可见。

为满足MISEV2018/2023中列出的要求，并证明囊泡的性质及其纯度水平，研究人员开展了实验以分析细胞外囊泡（EVs）上存在或缺失的标志物。EVs对某些特定表面标志物呈阳性¹⁵：CD9、CD63、CD81和CD44。其中，CD9、CD63和CD81属于膜蛋白中的四跨膜蛋白家族，是鉴定外泌体最常见的标志物¹⁶。CD.......

讨论

由于细胞外囊泡（EVs）体积微小，且接近大多数流式细胞仪的检测极限，因此对其分析和分选具有挑战性。我们的目标是建立一种分离经CFSE标记的AMSC来源EVs的实验方案。选择CFSE作为染色方法，是因为其报道的EVs标记效率高（≥90%），且不会像抗体染色那样产生蛋白聚集体等非特异性颗粒。然而，仍有可能遗漏少数不含酯酶的EVs，未来需要进一步研究以鉴定能够标记此类颗粒的染色方法，从而优化分选方案¹⁹。

我们的目标是建立一种分选条件，能够在不改变细胞外囊泡（EVs）物理特性的前提下实现高纯度EVs的收集。通过充分利用所用分选仪的技术性能，并采取特定措施（例如根据喷嘴尺寸降低标准分选压力），成功实现了该条件的建立。我们利用FSC聚苯乙烯微球对这些分选条件进行了建立和验证。随后，将该方案应用于脂肪来源干细胞（ASC）EVs的分选，共重复实验四次，均获得一致的结果，从而证实了本方案的可重复性。

然而，需要注意一些关键方面和局限性，我们在此列出。（i）分选样品的纯度：由于仪器的背景噪声在重新.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5(6)-羧基荧光素二乙酸盐 N-琥珀酰亚胺酯	Merck	150347-59-4
脂肪间充质基质细胞	Wepredic, Parc d'affaires, 35760 Saint-Grégoire, France		本研究中使用的细胞
Alexa 488 抗小窝蛋白抗体	R&D Systems	IC5736G	流式细胞术抗体
APC 抗人 CD44 抗体	BioLegend	338805	流式细胞术抗体
APC 抗人 CD63 抗体	BioLegend	353007	流式细胞术抗体
APC 抗人 CD81 (TAPA-1) 抗体	BioLegend	349509	流式细胞术抗体
APC 抗人 CD9 抗体	BioLegend	312107	流式细胞术抗体
BC CytoFLEX S	Beckman Coulter		配备蓝光、红光和紫光三种激光器的 BC CytoFLEX S
Flow-Check Pro 荧光微球	Beckman Coulter	A63493	用于 MoFLO Astrios EQ 的荧光对照微球
FlowJo 软件（版本 10.8.1）	BD	version 10.8.1	分析软件
IntraSure 试剂盒	BD Biosciences	641776	用于细胞内染色的固定和透化处理
Megamix-Plus FSC	BioCytex	7802	FSC 聚苯乙烯微球
MoFLO Astrios EQ	Beckman Coulter		配备蓝光、黄绿光、紫光和红光四种激光器的 MoFLO Astrios EQ
小鼠抗 FLOT1 抗体	BD Transduction Laboratories	610820	Western Blot 抗体
NanoSight NS300	Malvern	NS300
兔抗 Calnexin 抗体	Origene	TA336279	Western Blot 抗体
兔抗 CD9 和 CD81 抗体（ExoAb 抗体试剂盒）	System Biosciences	EXOAB-KIT-1	Western Blot 抗体
兔抗 TSG101 抗体	Merck	HPA006161	Western Blot 抗体
Triton X-100	Merck	9036-19-5
Ultra Rainbow 荧光颗粒	Spherotech	URFP-30-2
Ultracel 100 kDa MWCO	Merck	UFC910024
VER01 - Verity 微壳	Exometry		用于散射校准的有机硅酸盐微球