本文介绍了一种利用I型胶原酶消化与超速离心相结合的方法，从小鼠脾脏中分离外泌体的实验方案。
本文内容
摘要
摘要
外泌体（Exo）是由多种细胞分泌的脂质双层结构，这些细胞包括动物、植物和原核生物的细胞。先前的研究表明，来源于体液或细胞上清液的外泌体是新型诊断或预后生物标志物的有前景靶标，突显了其在疾病发病机制中的重要作用。组织来源的外泌体（Ti-Exo）因其能够准确反映组织特异性和微环境而受到越来越多的关注。Ti-Exo存在于间质空间中，在细胞间通讯和跨器官信号传递中发挥关键作用。尽管Ti-Exo在阐明疾病机制方面具有公认的价值，但由于组织基质的复杂性和提取方法的变异性，其分离仍具挑战性。在本研究中，我们建立了一种从小鼠脾脏组织中分离外泌体的实用方案，为后续的鉴定分析和功能研究提供了可重复的技术方法。我们采用I型胶原酶消化结合差速超速离心法来分离脾脏来源的外泌体。通过电子显微镜、纳米流式细胞仪和蛋白质印迹法对所分离外泌体的特性进行了鉴定。分离得到的脾脏来源外泌体呈现出典型的脂质双层囊泡形态，粒径范围为30 nm至150 nm。此外，外泌体标志物的表达谱证实了外泌体的存在及其纯度。综上所述，我们成功建立了一种适用于小鼠脾脏来源外泌体分离的实用方案。
引言
外泌体（Exo）是一类细胞外囊泡（EVs），大小在30至150 nm之间，包裹着多种生物分子，包括蛋白质、核酸和脂质1。这些生物分子来源于母体细胞，并被释放到细胞外空间。Exo介导细胞与其周围微环境之间的生物分子信息交换，在原核和真核系统中均发挥重要作用2。外泌体的特征（如内容物、大小、膜成分和细胞来源）具有高度变异性，受来源细胞类型、细胞状态及环境条件的影响。
外泌体通常根据其来源分为三类：细胞培养来源、体液来源和组织来源（Ti-Exo）。尽管细胞培养来源的外泌体因其易于获取和产量稳定而被广泛研究，但其应用受到限制，因为在长期培养后细胞特性可能发生改变，从而可能无法真实反映其生物学功能3,4,5。此外，大多数细胞培养是在二维环境中进行的，无法模拟体内复杂的细胞间相互作用，这可能影响数据的解读6。相比之下，从生物体液中分离的外泌体提供了一种微创手段，可用于实时监测疾病进展7。然而，这些样本通常包含来自多种来源的外泌体混合物，使得准确识别其主要来源变得复杂8。鉴于上述挑战，人们对存在于细胞外间质中、作为细胞间信号传导关键介质的组织来源外泌体（Ti-Exo）的兴趣日益增加。
脾脏在免疫功能和维持内环境稳态中发挥着关键作用。尽管已有从脑、肝和肿瘤等器官分离组织来源外泌体（Ti-Exo）的现有方案，但针对脾脏来源外泌体的实用分离方法报道较少9,10。本研究旨在建立一种从小鼠脾脏组织中分离外泌体的实用方案，该方法基于先前报道进行改进11。我们详细描述了一种结合胶原酶消化与超速离心的方法，该方法可最大限度减少细胞膜的破坏，确保获得高纯度和高得率的脾脏来源外泌体（Exo）。通过透射电子显微镜（TEM）、纳米流式细胞仪（Nano-FCM）以及蛋白质印迹（western blot）对所分离外泌体的特性进行了验证，结果证实该方案有效，适用于后续实验研究。
方案
样本取自小鼠，广东医科大学伦理委员会已批准本研究的伦理申请。材料表中提供了本实验方案所用材料、仪器和软件的详细说明。提取前的准备工作详见图1，脾脏外泌体（Spleen-Exo）的提取与富集流程见图2。
1. 准备
- 将高速和超高速离心机预冷至 4 °C，并将台式摇床的温度设置为 37 °C。
- 准备细胞培养皿（
100 mm）、50 mL 无菌离心管、冰和无菌细胞筛（70 µm），如图 1A、B所示。 - 使用 75% 酒精喷雾对剪刀和镊子进行消毒，随后进行高温灭菌。这些工具如图 1C所示。
- 将脾组织置于冰上的无菌 100 mm 培养皿中，用 1× 冰预冷的无菌磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗表面血液。用无菌纱布吸干脾组织，并在干燥后称重。
注意：如果组织已冷冻，请先在冰上解冻 15 分钟后再进行后续操作。 - 使用无菌移液管向细胞筛（70 µm）中加入 1 mL 无菌 PBS 以润湿筛网。
- 使用涡旋混合器将 I 型胶原酶（0.1%）溶于 1× PBS 中，配制消化缓冲液。
注意：每 100 mg 脾组织使用 10 mL 消化缓冲液。本研究中胶原酶的浓度依据产品说明书选定。对于其他类型的组织，研究人员可能需要根据组织密度和组成调整参数。建议通过初步实验，测试不同浓度和消化时间，以确定每种组织类型的最优条件。
2. 组织消化
- 将组织置于冰上的培养皿中，用剪刀剪成大小均匀的小块（图 3A），然后用无菌移液管转移至 50 mL 离心管中。
- 根据上述脾组织重量向离心管中加入消化缓冲液（图 3B），随后在 37 °C 条件下，于水平摇床以 45° 角度振荡。观察消化进程，当组织块已分散且大部分失去原有形态时，停止消化。消化时间因组织类型而异。在本研究的实验条件下，消化时间约为 30 min。
- 将消化后的混合液在室温（RT）下转移至细胞滤筛（Ф70 µm），以去除纤维组织和较大的组织碎片。
注意：消化完成后应立即完成过滤。 - 将滤液收集至新的 50 mL 离心管中。
3. 通过差速离心法分离外泌体
- 在 4 °C 条件下，以 500 × g 离心滤液 10 分钟。离心后可见含有残留细胞、细胞碎片和细胞核的沉淀，如图 3C所示。
- 将上清液转移至新离心管中，在 4 °C 条件下以 3000 × g 离心 20 分钟。离心后可见含有凋亡小体和微粒体的沉淀，如图 3D所示。
- 将上清液转移至新离心管中，在 4 °C 条件下以 10,000 × g 离心 30 分钟。离心后可见含有微囊泡和质膜的沉淀，如图 3E所示。
- 将所得上清液在 4 °C 条件下以 120,000 × g 超速离心 2 小时。离心后可在离心管底部观察到沉淀，如图 3F所示。
- 弃去上清液，用 PBS 洗涤沉淀，再在 4 °C 条件下以 120,000 × g 超速离心 2 小时，以获得外泌体。离心后可在离心管底部观察到沉淀，如图 3G所示。
- 用无菌 PBS（每脾 200 µL）溶解分离得到的外泌体，并将外泌体储存于新的 2 mL 离心管中，置于 -80 °C 保存。
4. 通过透射电子显微镜（TEM）表征外泌体
注意：采用透射电子显微镜（TEM）检测提取的外泌体是否具有囊泡特征。通过电子显微镜鉴定的外泌体样品必须为新鲜样品，或短暂储存在4 °C条件下。
- 将外泌体（2-6 µg/µL）用2%电子显微镜（EM）级多聚甲醛在室温下固定2小时。
- 取10 µL外泌体溶液置于铜网上，在室温孵育10分钟，用无菌蒸馏水冲洗，并用吸水纸吸去多余液体。
- 用2%醋酸铀染色铜网1分钟，用滤纸吸去多余液体，并在白炽灯下干燥2分钟。
- 在80 kV下用透射电子显微镜观察制备好的样品。
5. 外泌体的粒径分布与颗粒浓度测定
- 将标准聚苯乙烯纳米颗粒（250 nm）加入纳米流式细胞仪。
- 使用BCA蛋白检测试剂盒测定Exo样品的蛋白浓度。根据BCA蛋白测定结果，用PBS稀释Exo样品（将外泌体稀释至1–10 ng/µL），然后将Exo样品加入纳米流式细胞仪，测量其侧向散射强度（SSI）。
- 根据标准聚苯乙烯纳米颗粒中SSI与颗粒浓度的比值，计算Exo浓度。
注意：对于粒径测量，通过将不同粒径的标准二氧化硅纳米颗粒（68 nm、91 nm、113 nm、155 nm）依次加入纳米流式细胞仪，建立标准曲线。随后加入Exo样品进行检测，并根据该标准曲线计算Exo的粒径分布。
6. 外泌体蛋白的裂解与免疫印迹验证
- 向外泌体沉淀中加入 100 µL RIPA 裂解缓冲液，用于蛋白质分析。
- 剧烈涡旋，用封口膜封住管口，在室温下摇动 20 分钟，然后再次涡旋。
- 在 1000 × g 条件下短暂离心 30–60 秒以收集样品，转移至新的 1.5 mL 微量离心管中，并在 -20 °C 至 -80 °C 下保存直至分析。
- 进行免疫印迹时，将样品与 5× 上样缓冲液混合，使其达到 1× 浓度，并准备进行凝胶电泳。
- 如需全组织匀浆对照，可使用含蛋白酶抑制剂的强效裂解缓冲液裂解组织，具体步骤如上所述。然后在 10,000 × g 条件下离心 10 分钟，弃去残留的细胞外基质、完整细胞或完整的细胞碎片。
- 将含有外泌体或组织匀浆的样品缓冲液在 95 °C 下煮沸 5–10 分钟。每泳道加入等量蛋白质，上样至 10% SDS-PAGE 凝胶。以等量蛋白质的组织匀浆作为对照上样。
- 使用常规电泳缓冲液，在 80 V 电压下进行约 2 小时的凝胶电泳。随后进行蛋白质印迹分析，以确认纯化裂解物中外泌体蛋白的表达，并比较各组分中外泌体的相对丰度。
结果
脾源性外泌体的分离与纯化
为从小鼠脾组织中分离外泌体，我们采用了胶原酶消化联合差速超速离心的方法（图2）。初始步骤包括对脾组织进行预处理以去除表面血液，随后使用I型胶原酶进行消化。该酶解处理有助于降解细胞外基质成分，从而释放外泌体并保持其结构完整性。消化完成后，通过一系列离心步骤依次去除细胞碎片、凋亡小体及较大囊泡，最终将上清液在120,000 x g 条件下进行超速离心，使外泌体沉淀。后续的分离步骤获得了富含脾源性外泌体（Exo）且可溶于PBS的沉淀物，如 图3G所示。
TEM 结果
采用透射电子显微镜（TEM）这一外泌体表征研究的金标准方法，对外泌体的形态进行了观察。TEM 常用于验证外泌体的存在、评估外泌体的质量以及观察其形态特征。图 4A 所示的 TEM 图像显示存在杯状囊泡，这是外泌体的典型特征。这些囊泡呈现出清晰的脂双层结构，证实了从小鼠脾脏组织中成功分离出外泌体。
脾脏来源外泌体的粒径分布
采用纳米流式细胞仪测定外泌体的粒径分布及浓度。结果（图4B）显示，分离得到的外泌体直径范围为30–150 nm，峰值浓度出现在约60 nm处。分离颗粒的粒径主要分布在50–80 nm之间，平均颗粒浓度为4.6 × 109 个/mL。该粒径范围与既往报道的外泌体特征一致，进一步验证了分离方案的有效性。
Western blot 分析
为确认外泌体标志物的存在，我们进行了 Western blot 分析。在脾脏外泌体（Spleen-Exo）样本中检测到外泌体标志物 TSG101 和 CD9，而作为阴性对照的高尔基体基质蛋白 GM130 未被检测到（图 4C）。相比之下，这些标志物的蛋白在小鼠脾组织（Spleen-T）中均有表达。这表明所分离的外泌体纯度较高，不含细胞污染物。
图1：试剂与耗材准备。（A）将50 mL离心管、培养皿、冰块和手术器械置于生物安全柜中。（B）无菌细胞筛（70 µm）。（C）已灭菌的手术器械。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2：脾脏外泌体（Spleen-Exo）分离流程。 取脾组织，置于预冷的 PBS 中剪碎，随后按所示步骤使用 I 型胶原酶进行消化，并进行离心处理。请点击此处查看该图的高清版本。
图3：脾脏外泌体（Spleen-Exo）分离的代表性图像。 （A）准备进行后续消化的小块脾组织。（B）加入消化缓冲液的脾组织块。（C）500 × g 离心后的沉淀物。（D）3,000 × g 离心后的沉淀物。（E）10,000 × g 离心后的沉淀物。（F）120,000 × g 离心后的沉淀物。（G）120,000 × g 离心后获得的外泌体沉淀物。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：脾脏来源外泌体（Spleen-Exo）的鉴定。（A）透射电子显微镜（TEM）结果显示，分离的颗粒呈圆形或椭圆形的膜性囊泡，具有杯状形态。比例尺分别为 200 nm 和 50 nm。（B）通过纳米流式分析仪进行的粒径分布分析显示，Spleen-Exo 的直径主要分布在 50 nm 至 80 nm 之间，平均颗粒浓度为 4.6 × 109 粒粒/mL。（C）Western blot 分析显示 Spleen-Exo 表达外泌体特异性标志蛋白（TSG101 和 CD9），而 GM130 呈阴性表达。这些标志物在从小鼠脾脏提取的蛋白样品（Spleen-T 组）中均可检测到。图中展示了典型的 Western blot 结果（n = 6 个组织）。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
最近的研究报道，脾脏来源的外泌体（Spleen-Exo）在胃癌治疗中发挥关键作用12。为了进一步阐明Spleen-Exo的功能，有必要建立一种可重复且优化的方法，用于从脾脏组织中提取这些外泌体。尽管已有从脑和肝癌组织中分离外泌体的实验方案13,14，但针对其他组织的方法仍不完善，需要进一步验证。本研究中，我们提出了一种从脾脏组织中分离外泌体的实用方法。
近年来，在科学研究和应用中已采用多种方法提取外泌体（Exo），包括超速离心法、密度梯度离心法、磁珠免疫吸附法、超滤法和聚合物沉淀法15。超速离心法仍是从未同来源中提取外泌体的金标准方法。以往的研究主要集中在破坏组织结构以获得更高浓度的外泌体，这些外泌体来源于细胞内和细胞外16。胶原酶对细胞膜完整性的影响较小，可确保组织来源外泌体（Ti-Exo）的纯度3。胶原酶已被用于从人转移性黑色素瘤、脂肪组织、结肠癌和肝癌组织中提取细胞外囊泡5,10,13,17。然而，不同组织所适用的胶原酶浓度和消化时间各不相同。
我们建立了一种特异性的脾脏外泌体（Spleen-Exo）分离方案，首先使用I型胶原酶进行组织消化，随后通过差速超速离心结合过滤的方法，以获得高质量的脾脏外泌体。超速离心可有效去除样品中残留的细胞、大囊泡、细胞碎片及凋亡小体16。Crescitelli 等人采用胶原酶D结合梯度超速离心法，分离得到平均直径为75 nm的小细胞外囊泡5。与该方案相比，我们的方法使用I型胶原酶，并额外增加了一步在120,000 × g 条件下的超速离心，以实现外泌体最佳纯度。与以往采用组织匀浆法获取组织悬液的研究14,18不同，我们的方法能够保持组织中细胞的膜完整性。此外，Vella 等人曾应用密度梯度离心法（三重蔗糖梯度）分离出三类颗粒，但该操作耗时较长10。该方法获得的产物包括尺寸超过200 nm的大囊泡、大小在50 nm至200 nm之间的异质性囊泡群体，以及约20 nm的小囊泡。本研究所述方案通过一系列超速离心步骤，系统性地去除残留细胞、细胞碎片、凋亡小体及较大囊泡，从而提高所获得外泌体的纯度。我们强调在收集上清液过程中需小心操作，避免扰动已沉淀的沉淀物。
我们通过透射电子显微镜（TEM）和纳米颗粒追踪分析评估分离所得脾脏来源外泌体（Spleen-Exo）的形态学特征和纯度。两种检测结果均显示，通过本方案分离的脾脏来源颗粒具有脂质双层结构，呈杯状囊泡，粒径范围为30 nm至150 nm，符合外泌体的典型特征19。CD9和TSG101是外泌体标志物19，而高尔基体蛋白GM130则作为外泌体鉴定的阴性标志物20。实验结果表明，Spleen-Exo对CD9和TSG101呈阳性反应，而未检测到GM130，证实已成功从脾脏组织中分离出高质量的组织来源外泌体（Exo）。
为获得高质量的Ti-Exo，选择合适的酶种类、浓度和消化时间，以及适当的组织保存条件至关重要。我们观察到，来自新鲜脾组织与冷冻脾组织的Exo在蛋白浓度方面无显著差异（数据未显示），表明处理大量冷冻组织以减少操作流程是可行的。Ti-Exo的分离需要长时间的超速离心操作，因此在临床应用中若使用新鲜组织，难以在合理时间内完成整个实验流程。因此，使用冷冻组织进行外泌体分离是更优的选择。在37 °C下解冻不适用于冷冻组织，因为 cryoprotective agents（冷冻保护剂）在组织中的渗透不完全。已有报道指出，在使用冰上解冻的冷冻组织进行外泌体分离时，其外泌体产量在含量上与新鲜组织相比无显著差异21。因此，当使用-80 °C保存的样本时，我们采用在冰上解冻冷冻脾组织的方式进行外泌体分离。
然而，本研究中描述的方案存在若干局限性。提取和鉴定所涉及的步骤繁多，耗时较长。鉴于外泌体（Exo）研究最终目标是应用于临床疾病治疗，更快且更具成本效益的方法正变得日益重要。此外，尽管研究结果基于小鼠组织样本，但其在人体组织中的适用性仍有待确定。
综上所述，该方案提供了一种从脾脏组织中提取高纯度外泌体（Exo）的方法，适用于深入的下游分析。来源于组织的外泌体能更准确地反映其来源微环境的特征，在阐明生物体内的生理与病理过程方面具有重要意义。未来的研究可将此方案应用于人类组织，从而实现具有临床相关性的外泌体的提取，用于诊断和治疗目的。鉴于脾脏在免疫系统中的关键作用，该技术在研究外泌体于免疫应答中所起作用方面可能尤为有用。此外，该方案还可经修改用于从其他组织中分离外泌体，有望促进组织特异性生物标志物及靶向治疗策略的开发。通过加深对外泌体生物学特性的理解，本方案有助于推动精准医学的进步以及新型治疗策略的研发。
披露
作者声明不存在任何竞争利益。
致谢
这项工作得到了国家的资助 中国国家自然科学基金（82370281，81870222），自然科学 广东省基础与应用基础研究基金（2022A1515012103），以及科学技术 湛江市科技发展专项资金竞争性分配项目 （2021A05086）以及启动基金 来自第二附属医院的 广东医科大学（23H03）
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 70 µm细胞筛 | Biologix Group Co., Ltd.USA | 15-1070 | |
| 抗CD9抗体 | Cell Signaling Technology, Inc (CST), 美国 | 983275 | |
| 抗GM130抗体 | Proteintech Group, Inc.中国 | 66662-1-lg | |
| 抗TSG101抗体 | Abcam Plc，英国 | 125011 | |
| 细胞培养皿 | 中国无锡巢生生物科技有限公司 | 704001 | |
| 离心管 | 中国无锡巢生生物科技有限公司 | 788211 | |
| I型胶原酶 | Sigma-Aldrich 公司，美国 | C2674 | |
| 台式恒温振荡器 | 中国上海柏帕德仪器有限公司 | THZ-100 | |
| 电泳缓冲液 | 中国武汉赛维尔生物科技有限公司 | G2081-1L | |
| 增强型 BCA 蛋白检测试剂盒 | 中国上海碧云天生物技术有限公司 | P0010S | |
| Flow NanoAnalyzer | 中国纳迅科技有限公司 | N30E | |
| 荧光/化学发光成像系统 | 中国广州博莱特生物科技有限公司 | GelView 6000Plus | |
| HRP 标记的山羊抗小鼠 IgG | Proteintech Group, Inc.中国分公司 | 15014 | |
| HRP 标记的山羊抗兔 IgG | Proteintech Group, Inc.中国 | 15015 | |
| 酶标仪 | Molecular Devices，美国 | CMax Plus | |
| 显微剪 | 上海 医学 仪器（组） 有限公司，中国 | WA1010 | |
| 显微镊子 | 上海 医学 仪器（组） 有限公司，中国 | WA3010 | |
| Multifuge X1R Pro 离心机 | 赛默飞世尔科技公司，美国 | 75009750 | |
| 眼科剪刀 | 上海 医学 仪器（组） 有限公司，中国 | Y00030 | |
| 眼科镊子 | 上海 医学 仪器（组） 有限公司，中国 | JD1060 | |
| Optima XPN-100 超滤离心机 | 贝克曼库尔特，美国 | A94469 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | 北京索莱宝科技有限公司 & 技术有限公司，中国 | P1003 | |
| RIPA 裂解缓冲液（强效，不含抑制剂） | 中国上海碧云天生物技术有限公司 | P0013K | |
| 尺子 | 德利 制造 公司，中国 | ||
| 5× SDS-PAGE样品上样缓冲液 | 中国上海碧云天生物技术有限公司 | P0015 | |
| 移液管 | Biologix Group Co., Ltd.USA | 30-0238A1 | |
| 透射电子显微镜 | 日本，日立 | H-7650 | |
| 超速离心管 | 贝克曼库尔特，美国 | 355618 | |
| Western 转膜缓冲液 | 中国武汉赛维尔生物科技有限公司 | G2028-1L |
参考文献
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重印与许可
