小鼠脾脏组织来源的外泌体的分离和表征

摘要

在这里，我们提出了一种使用消化与 I 型胶原酶和超速离心相结合来分离小鼠脾脏衍生的外泌体的方案。

摘要

外泌体 （Exo） 是由各种细胞（包括动物、植物和原核生物的细胞）分泌的脂质双层结构。先前的研究表明，来自体液或细胞上清液的 Exo 是新型诊断或预后生物标志物的有希望的靶标，强调了它们在疾病发病机制中的重要作用。组织来源的 Exo （Ti-Exo） 因其能够准确反映组织特异性和微环境而受到越来越多的关注。Ti-Exo 存在于间质间隙中，在细胞间通讯和跨器官信号传导中起着至关重要的作用。尽管它们在阐明疾病机制方面具有公认的价值，但由于组织基质的复杂性和提取方法的可变性，分离 Ti-Exo 仍然具有挑战性。在这项研究中，我们开发了一种从小鼠脾组织中分离外泌体的实用方案，为随后的鉴定分析和功能研究提供了一种可重复的技术。我们使用 I 型胶原酶消化结合差异超速离心分离脾源性 Exo。通过电子显微镜、纳流式细胞仪和 western blot 确定分离的 Exo 特性。分离的脾源性 Exo 显示出脂质双层囊泡的典型形态，粒径范围为 30 nm 至 150 nm。此外，外泌体标志物的表达谱证实了外泌体的存在和纯度。综上所述，我们成功地建立了一种在小鼠中分离脾脏衍生的 Exo 的实用方案。

引言

外泌体 （Exo） 是细胞外囊泡 （EV） 的一个亚组，大小范围为 30 至 150 nm，封装了多种生物分子，包括蛋白质、核酸和脂质¹。这些生物分子来源于亲本细胞并释放到细胞外空间。外显生物促进细胞与其周围微环境之间的生物分子信息交换，在原核和真核系统中发挥作用²。外泌体的特性，如含量、大小、膜成分和细胞起源，是高度可变的，并受起始细胞类型、细胞状态和环境条件的影响。

外泌体通常根据其来源分为三类:细胞培养来源、体液来源和组织来源 （Ti-Exo）。虽然细胞培养衍生的外泌体因其可及性和一致的产量而被广泛研究，但它们的使用受到长时间培养后细胞特性潜在变化的限制，这可能会歪曲其生物学功能 ^3,4,5。此外，大多数细胞培养物维持在二维环境中，这些环境不模拟复杂的体内细胞间相互作用，这可能会影响数据解释⁶。相反，从生物体液中分离的外泌体提供了一种微创选择，可以实时监测疾病进展⁷。然而，这些样品通常包含来自不同来源的外泌体混合物，这使得准确鉴定其主要来源变得复杂⁸。鉴于这些挑战，人们对 Ti-Exo 越来越感兴趣，Ti-Exo 位于细胞外间质中，是细胞间信号传导的关键介质。

脾脏在免疫功能和维持内部稳态中起着至关重要的作用。尽管已有从脑、肝脏和肿瘤等器官中分离 Ti-Exo 的方案，但脾源性外泌体的实用方法报道有限 ^9,10。本研究旨在建立一种从小鼠脾组织中分离外泌体的实用方案，该方案根据先前的报告修改而来¹¹.我们详细介绍了一种涉及胶原酶消化后超速离心的方法，该方法最大限度地减少了细胞膜的破坏，并确保了脾源性 Exo 的高纯度和产量。使用这种既定方案的分离 Exo 的特性通过电子显微镜 （TEM）、纳流式细胞仪 （Nano-FCM） 和蛋白质印迹进行了验证，证实了该方案对进一步实验研究的有效性。

方案

样本来自小鼠，并获得了广东医科大学伦理委员会的伦理批准。 材料表中提供了本协议中使用的材料、设备和软件的详细说明。提取前的制备细节如图 1 所示，而脾外显生提取和富集的过程如图 2 所示。

1. 准备工作

1. 将高速和超高速离心机预冷至 4 °C，并将台式摇床的温度设置为 37 °C。
2. 准备细胞培养皿 （100 mm）、50 mL 无菌离心管、冰和无菌细胞过滤器 （70 μm），如图 1A、B 所示。
3. 使用 75% 酒精喷雾对剪刀和镊子进行消毒，然后进行高温消毒。 这些工具如图 1C 所示。
4. 将脾组织置于冰上的无菌 100 mm 培养皿中，并用 1x 冰无菌磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 洗去表面血液。用无菌纱布擦干脾组织，晾干后称重。
   注意:如果组织被冷冻，请在培养皿中冰解冻 15 分钟，然后再继续。
5. 使用无菌移液管将 1 mL 无菌 PBS 滴入过滤器 （70 μm） 中，以润湿细胞过滤器 （70 μm）。
6. 使用带有涡旋混合器的 1x PBS 制备消化缓冲液（0.1% I 型胶原酶）。
   注意:每 10 毫克脾组织使用 100 mL 消化缓冲液。本研究根据产品说明选择胶原酶浓度。对于其他组织类型，研究人员可能需要根据组织密度和成分调整这些参数。建议对不同浓度和消化时间进行初步实验，以确定每种组织类型的最佳条件。

2. 组织消化

1. 在冰上的培养皿中用剪刀将组织切成均匀的小块（图 3A），然后用无菌移液管转移到 50 mL 离心管中。
2. 如上所述，根据脾组织重量向试管中加入消化缓冲液（图 3B），然后在 37 °C 的水平振荡器上以 45° 的角度摇动试管。 监测消化进度，并在组织块分散且大多数组织块变形时停止消化。消化时间应因组织而异。在本研究的实验条件下，消化时间约为 30 分钟。
3. 在室温 （RT） 下将消化的混合物转移到细胞过滤器 （Ф70 μm） 中，以去除纤维状和较大的组织碎片。
   注:消解后立即完成过滤。
4. 将滤液收集在新的 50 mL 离心管中。

3. 通过差速离心分离外泌体

1. 将滤液在 4 °C 下以 500 x g 离心 10 分钟。 离心后可以看到含有残留细胞、细胞碎片和细胞核的沉淀，如图 3C 所示。
2. 将上清液转移到新管中，并在 4 °C 下以 3000 x g 离心 20 分钟。 离心后可以看到含有凋亡小体和微粒体的沉淀，如图 3D 所示。
3. 将上清液转移到新管中，并在 4 °C 下以 10,000 x g 离心 30 分钟。 离心后可以看到含有微泡和质膜的沉淀，如图 3E 所示。
4. 在 4 °C 下以 120,000 x g 超速离心所得上清液 2 小时。 离心后，可以在管底部看到沉淀，如图 3F 所示。
5. 弃去上清液，用PBS洗涤沉淀，并在4°C下再次以120,000 x g 超速离心2小时以获得外泌体。离心后，可以在试管底部看到沉淀，如图 3G 所示。
6. 用无菌 PBS（每个脾脏 200 μL）溶解分离的外泌体，并将分离的外泌体储存在 -80 °C 的新 2 mL 离心管中。

4. 通过透射电子显微镜 （TEM） 进行外泌体表征

注:TEM 用于确定提取的 Exo 是否显示囊泡特性。通过电子显微镜鉴定的 Exo 样品必须是新鲜样品或在 4 °C 下短暂储存短时间。

1. 在 RT 下用 2% 电子显微镜 （EM） 级多聚甲醛固定外泌体 （2-6 μg/μL） 2 小时。
2. 将 10 μL 外泌体溶液放在铜网上，在 RT 下孵育 10 分钟，用无菌蒸馏水冲洗，并用吸水纸吸干多余的液体。
3. 用 2% 乙酸铀酰染色铜网 1 分钟，用滤纸吸干多余的液体，然后在白炽灯下干燥 2 分钟。
4. 在 80 kV 的透射电子显微镜下观察制备的样品。

5. 外泌体的粒度分布和颗粒浓度测量

1. 将标准聚苯乙烯纳米颗粒 （250 nm） 加载到纳米流式细胞仪中。
2. 使用 BCA 蛋白检测试剂盒测量 Exo 样品的蛋白浓度。根据 BCA 蛋白测定结果（将外泌体稀释至 1-10 ng/μL），用 PBS 稀释 Exo 样品，然后将 Exo 样品加载到纳流中以测量侧向散射强度 （SSI）。
3. 根据标准聚苯乙烯纳米颗粒中 SSI 与颗粒浓度的比率计算 Exo 浓度。
   注:对于尺寸测量，通过将具有梯度尺寸（68 nm、91 nm、113 nm、155 nm）的标准二氧化硅纳米颗粒加载到纳米流式细胞仪中来生成标准曲线。Exo 样品的加载遵循此步骤。根据标准固化计算 Exo 的大小分布。

6. 外泌体蛋白的裂解和免疫印迹确认

1. 向外泌体沉淀中加入 100 μL 放射免疫沉淀测定 （RIPA） 裂解缓冲液进行蛋白质分析。
2. 剧烈涡旋，用封口膜覆盖，在 RT 下摇动 20 分钟，然后再次涡旋。
3. 以 1000 x g 的离心力短暂离心 30-60 秒以收集样品，转移到新的 1.5 mL 微量离心管中，并在 -20 °C 至 -80 °C 下储存直至分析。
4. 对于免疫印迹，将样品与 5x 上样缓冲液混合以达到 1x 浓度，并准备进行凝胶电泳。
5. 如果需要全组织匀浆对照，请使用含有蛋白酶抑制剂的强裂解缓冲液来裂解组织，如上所述。然后，将样品以 10,000 x g 离心 10 分钟，并丢弃剩余的细胞外基质、全细胞或完整的细胞碎片。
6. 将含有外泌体或组织匀浆的样品缓冲液在 95 °C 下煮沸 5-10 分钟。将每个泳道的相同蛋白质上样到 10% SDS-PAGE 凝胶中。加载相等的组织匀浆蛋白质作为对照。
7. 使用常规电泳缓冲液在 80 V 电压下进行凝胶电泳约 2 小时。进行蛋白质印迹分析以确认纯化裂解物中的 Exo 蛋白表达，并比较组分中的 Exo 相对丰度。

结果

分离和纯化脾源性外泌体
为了从小鼠脾组织中分离外泌体，我们采用了胶原酶消化和差异超速离心的组合（图 2）。初始步骤包括预处理脾脏组织以去除表面血液，然后用 I 型胶原酶消化。这种酶处理促进了细胞外基质成分的分解，从而释放了外泌体，同时保持了它们的完整性。消化后，采用一系列离心步骤依次去除细胞碎片、凋亡小体和较大的囊泡，最终以 120,000 x g 的离心力超速离心上清液以沉淀外泌体。随后的分离程序产生了富含脾源性 Exo 的 PBS 可溶性沉淀，如图 3G 所示。

TEM 结果
使用透射电子显微镜检查分离的外泌体的形态，透射电子显微镜是研究外泌体表征的金标准方法。TEM 通常用于验证外泌体的存在、评估外泌体的质量以及观察外泌体的形态。TEM 图像（图 4A）揭示了杯状囊泡的存在，这是外泌体的特征。这些囊泡显示出清晰的脂质双层结构，证实了从脾组织中成功分离出外泌体。

脾外泌体的大小分布
使用纳米流式细胞仪测定外泌体的大小分布和浓度。结果（图 4B）表明分离的外泌体的直径范围为 30-150 nm，峰浓度约为 60 nm。分离颗粒的直径主要在 50-80 nm 范围内，平均颗粒浓度为 4.6 x 10⁹ 个颗粒/mL。该大小范围与先前报道的外泌体特性一致，进一步验证了分离方案。

蛋白质印迹分析
为了确认外泌体标志物的存在，我们进行了蛋白质印迹分析。在脾外泌体样本中检测到外泌体标志物 TSG101 和 CD9，而未检测到用作阴性对照的高尔基体基质蛋白 GM130（图 4C）。相比之下，这些标志物的蛋白质在小鼠脾组织 （Spleen-T） 中表达。这表明分离的外泌体纯度高，因为它们不含细胞污染物。

图 1:备件准备。 （A） 将 50 mL 离心管、培养皿、冰和手术工具置于生物安全柜中。（B） 无菌细胞过滤器 （70 μm）。（C） 消毒的手术工具。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2:脾外显分离程序。 准备脾组织并在冰 PBS 中将其切成小块，然后用 I 型胶原酶消化并按指示离心。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3:Spleen-Exo 分离的代表性图像。 （A） 小脾块准备随后消化。（B） 用消化缓冲液的脾脏组织块。（C） 500 x g 离心后的沉淀。（D） 离心 3,000 x g 后的沉淀。（E） 离心 10,000 x g 后的沉淀。（F） 离心 120,000 x g 后的沉淀物。（G） 120,000 x g 离心后的外泌体沉淀。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 4:脾外生的鉴定。 （A） TEM 结果显示分离的颗粒为具有杯状形态的圆形或椭圆形膜囊泡。比例尺 = 分别为 200 nm 和 50 nm。（B） Flow Nano 分析仪的粒度分布分析表明，Spleen-Exo 的直径主要在 50 nm 到 80 nm 之间，平均颗粒浓度为 4.6 × 10⁹ 粒/mL。（C） Western blot 分析显示外泌体特异性标记蛋白（TSG101 和 CD9）在 Spleen-Exo 中表达，GM130 阴性表达。这些标志物在小鼠脾脏提取的蛋白质样品中可检测到 （Spleen-T 组）。显示了具有代表性的蛋白质印迹图像 （n = 6 个组织）。 请单击此处查看此图的较大版本。

讨论

最近的研究报告称，脾源性外泌体 （Spleen-Exo） 在胃癌的治疗中起着关键作用¹²。为了进一步阐明 Spleen-Exo 的功能，有必要建立一种可重复和最佳的方法来从脾组织中提取它们。虽然存在从脑癌和肝癌中分离外泌体的方案 ^13,14，^但其他组织的方法仍然不成熟，需要进一步验证。在这项研究中，我们概述了一种从脾组织中分离 Exo 的实用方法。

在过去的几年里，科学研究和应用中使用了各种方法提取 Exo，包括超速离心、密度梯度离心、磁珠免疫吸附、超滤和聚合物沉淀¹⁵。超速离心仍然是从各种来源提取 Exo 的金标准方法。以前的研究侧重于破坏组织结构以获得更高浓度的 Exo，它由 Exo¹⁶ 的细胞内和细胞外来源组成。胶原酶最大限度地减少了对细胞膜完整性的影响，确保了 Ti-Exo³ 的纯度。胶原酶已用于从人转移性黑色素瘤、脂肪、结肠癌和肝癌组织中提取细胞外囊泡 5,10,13,17。然而，胶原酶的浓度和消化时间因组织而异。

我们建立了一个特定的方案，使用 I 型胶原酶进行消化分离脾-Exo，然后通过差速超速离心过滤，以产生高质量的 Spleen-Exo。超速离心可有效去除样品中的残留细胞、大囊泡、细胞碎片和凋亡小体¹⁶。Crescitelli 等人采用胶原酶 D 和梯度超速离心分离出平均直径为 75 nm 的小细胞外囊泡⁵。与他们的方案相比，我们的方案使用 I 型胶原酶和 120,000 x g 的额外超速离心步骤来实现外泌体的最佳纯度。与之前使用组织匀浆获得组织悬液的报道相比 ^14,18，^我们的方法保留了组织中细胞的膜完整性。此外，Vella 等人应用密度梯度离心（三重蔗糖梯度）生成三组颗粒，这需要额外的作时间¹⁰.这种方法产生了大小超过 200 nm 的大囊泡，大小从 50 nm 到 200 nm 不等的异质囊泡群，以及大小约为 20 nm 的小囊泡。本研究方案中描述的方案涉及一系列超速离心步骤，以系统地消除残留细胞、细胞碎片、凋亡小体和较大的囊泡，从而提高获得的 Exo 的纯度。我们强调在上清液收集过程中小心处理，以避免干扰沉淀的沉淀。

我们通过 TEM 和纳米颗粒跟踪分析评估分离的 Spleen-Exo 的形态和纯度。两种测定都表明，通过该方案分离的脾衍生颗粒表现出脂质双层和杯状囊泡，尺寸范围为 30 nm 至 150 nm，这是外泌体的典型特征¹⁹。CD9 和 TSG101 是外泌体标志物¹⁹，而 GM130 是一种高尔基体蛋白，用作外泌体鉴定的阴性标志物²⁰。结果显示，Spleen-Exo 的 CD9 和 TSG101 阳性，而未检测到 GM130，证实了从脾脏中成功分离出高质量的组织来源的 Exo。

为了获得高质量的 Ti-Exo，选择合适的酶类型、浓度和消化持续时间，以及适当的组织储存，是必不可少的。我们观察到新鲜脾脏组织与冷冻脾脏组织来源的 Exo 之间的蛋白质浓度没有显著差异（数据未显示），表明处理大量冷冻组织以减少工作流程的可行性。分离 Ti-Exo 需要较长的超速离心机作时间，因此在临床应用中使用新鲜组织时，在适当的时间内完成整个方案是不切实际的。因此，使用冷冻组织进行外泌体分离将是更好的选择。由于 37 °C 冷冻保护剂未完全渗透到组织中，因此不适用于冷冻组织。据报道，当使用在冰上解冻的冷冻组织进行外泌体分离时，与新鲜组织相比，外泌体的产量在含量上没有显着性²¹。因此，我们在冰上解冻冷冻的脾组织，以便在 -80 °C 下使用储存样品时进行外泌体分离。

但是，本研究中描述的协议有几个局限性。提取和鉴定涉及的大量步骤非常耗时。鉴于将 Exo 研究应用于临床疾病治疗的最终目标，更快、更具成本效益的方法变得越来越重要。此外，虽然结果基于小鼠组织样本，但对人体组织的适用性仍有待确定。

总之，该方案提供了一种从脾组织中提取高纯度 Exo 的方法，适用于详细的下游分析。组织来源的 Exo 更准确地反映了其来源的微环境，并且在阐明生物体的生理和病理过程方面具有重要潜力。未来的研究可以将该方案应用于人体组织，从而能够提取临床相关的外泌体用于诊断和治疗目的。鉴于脾脏在免疫系统中的关键功能，该技术在研究外泌体在免疫反应中的作用可能特别有用。此外，可以修改该方案以从其他组织中分离外泌体，从而可能有助于开发组织特异性生物标志物和靶向治疗。通过提高我们对外泌体生物学的理解，该方案可以促进精准医学的进步和新型治疗策略的开发。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
70 µm Cell Strainer	Biologix Group Co.， Ltd.美国	15-1070
抗 CD9 抗体	Cell Signaling Technology， Inc.（CST），美国	983275
抗 GM130 抗体	Proteintech Group， Inc.China	66662-1-lg
抗 TSG101 抗体	英国 Abcam Plc	125011
细胞培养皿	无锡巢生物科技有限公司	704001
离心管	无锡巢生物科技有限公司	788211
型胶原酶	Sigma-Aldrich Corp.，美国	C2674
台式恒温摇床	上海蓝帕德仪器有限公司	THZ-100
电泳缓冲液	武汉服务生物科技有限公司	G2081-1L
增强型 BCA 蛋白检测试剂盒	上海碧晟生物科技有限公司，中国	P0010S
流动纳米分析仪	NanoFCM Inc.，中国	N30E
荧光/化学发光成像系统	广州博莱特生物科技有限公司	GelView 6000Plus
HRP 山羊抗小鼠 IgG	科技集团有限公司	15014
HRP 山羊抗兔 IgG	Proteintech Group， Inc.China	15015
微孔板检测仪	美国 Molecular Devices	CMax Plus
微型剪刀	上海 医疗 仪器仪表（集团）有限公司	WA1010
微型镊子	上海 医疗 仪器仪表（集团）有限公司 中国	WA3010
Multifuge X1R Pro 离心机	美国赛默飞世尔科技	75009750
上海眼科剪刀	医疗 仪器仪表（集团）有限公司 中国	Y00030
眼用镊子	上海 医疗 仪器 （集团） Co.， Ltd.， 中国	JD1060
Optima XPN-100 超滤离心机	美国贝克曼库尔特	A94469
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	北京阳光生物科技股份有限公司中国	P1003
RIPA 裂解缓冲液（强效，无抑制剂）	上海碧泓生物科技有限公司，中国	P0013K
标尺	熟食店 制造 公司， 中国
SDS-PAGE 样品上样缓冲液， 5x	上海碧晟生物科技有限公司， 中国	P0015
移液管	Biologix Group Co.， Ltd.美国	30-0238A1
透射电子显微镜	日本日立	H-7650
超速离心管	美国贝克曼库尔特	355618
Western 转移缓冲液	Wuhan Servicebio Technology Co.， Ltd.， 中国	G2028-1L