体外模型中组织矿化的全面表征

摘要

本方案提出一种综合性方法，通过多模态分析手段在全球范围内评估骨再生过程中的骨形成情况。该方法旨在提供有关新骨形成定性与定量的信息，从而提高基础研究和临床前研究的严谨性与有效性。

摘要

在骨再生背景下对组织矿化进行广泛表征是一项重大挑战，原因是目前可用于分析的方法众多。本文提出一种工作流程，用于对新骨形成进行综合评估，所用模型为一种相关的大型动物骨组织离体ex vivo外植体。在离体的绵羊股骨头中制造一个骨缺损（直径 = 3.75 mm；深度 = 5.0 mm），并注入一种负载促成骨生长因子（骨形态发生蛋白2 - BMP2）的多孔骨替代材料。随后，将该外植体在体外培养28天，以允许细胞定植及后续的骨形成过程。为评估新生矿化组织的质量与结构，建立以下连续分析方法：（i）利用显微CT对整个外植体进行表征并获取高分辨率三维图像，随后采用深度学习图像分析技术以增强对矿化组织的识别能力；（ii）纳米压痕法测定新生组织的力学性能；（iii）组织学检查，包括苏木精/伊红/沙黄（HES）染色、Goldner三色染色和Movat五色染色，以对矿化组织进行定性评估，尤其关注类骨质边界及骨细胞存在的可视化；（iv）背散射扫描电子显微镜（SEM）成像结合内部参照，用于量化矿化程度，并深入揭示表面形貌、矿物成分以及骨-生物材料界面的特征；（v）拉曼光谱法表征矿化基质的分子组成，并通过检测肽键来评估BMP2在骨水泥中是否持续存在。该多模态分析方法将有效评估新生骨组织，并提供关于矿化组织的全面定性与定量信息。通过标准化这些实验方案，我们旨在促进不同研究间的可比性，并提高科研结果的有效性与可靠性。

引言

骨缺损，无论是由创伤、肿瘤切除、先天性畸形还是感染引起，都是再生医学面临的主要挑战。这些改变会破坏骨骼系统的结构完整性，导致患者不适、功能障碍以及生活质量下降。

为了克服这些挑战，人们提出了创新的骨修复策略，重点在于增强成骨作用和骨组织再生。这些方法包括使用可植入、可注射或可3D打印的骨替代材料，这些材料可以来源于天然（例如生物来源的大分子、动物源性羟基磷灰石）或为合成材料（例如生物活性玻璃、磷酸钙）¹。为了提高骨替代材料本身在引导和刺激骨再生方面能力不足的问题，可将成骨诱导因子（如骨形态发生蛋白（BMPs））负载于材料中，以促进前体细胞的成骨分化并增强骨形成²。

骨形成始于胶原基质的初始形成，随后由羟基磷灰石晶体对其进行矿化，从而增强骨的结构³。这一过程赋予骨特定的刚度和强度。矿化组织的质量由其微观结构特征和矿化程度精细调控⁴。这种质量在骨愈合及再生骨的功能中起着关键作用⁵。然而，由于多变量研究之间存在固有的变异性，对骨矿化进行表征仍然是一项具有挑战性的任务^6,7,8。

此外，骨移植替代物的生物相容性、细胞相容性及分化潜能的初步评估通常在体外（in vitro）进行。然而，方法学上的差异阻碍了结果之间的直接比较。此外，这些体外（in vitro）研究无法充分模拟多细胞间的相互作用以及细胞群体（包括骨髓细胞）之间复杂的相互对话，而这些相互作用对于调控骨再生过程至关重要⁹。这种对骨微环境缺乏准确模拟的情况可能会影响后续临床前研究的准确性¹⁰。

尽管 体内 评估虽然能更准确地反映生理环境，但受限于伦理、操作和经费等方面的因素。因此， 离体 评估在接口中起着关键作用 体外 和 体内 研究，作为在开展活体实验之前必不可少的中间步骤^11,12,13.

在此背景下，需要采用全面的表征方法来评估再生骨组织的质量，并在进入临床前模型之前确保该策略的相关性。因此，我们提出了一种基于羊膝关节组织移植模型分析的实验方案。该创新性方法包括将负载BMP2的骨水泥植入移植组织，并在培养28天后对组织矿化进行详细分析。

本研究采用的技术方法多样且相互补充，共同为评估再生骨组织的质量提供了全面的分析手段（图1）。高分辨率显微CT成像可实现骨组织结构的三维精细可视化，为新生组织的矿化密度、形态学特征及结构完整性提供重要信息。该技术对于评估骨再生效果以及动态监测矿化过程的进展至关重要。纳米压痕是一种精确测定组织力学性能（如硬度和强度）的方法。通过测量材料在纳米尺度受力后的响应，该技术可评估矿化组织的坚固性与质量。利用苏木精/伊红/沙黄（HES）、Goldner三色染色和Movat五色染色等常规染色方法进行组织学检查，可深入揭示组织的结构与组成。这些染色方法能够区分不同的组织成分，包括细胞、细胞外基质和矿化沉积物，从而对骨再生过程进行系统的定性评估。背散射扫描电子显微镜（SEM）成像可对样品表面进行高分辨率可视化，实现对骨基质矿化程度以及植入材料与宿主组织界面的详细分析。最后，拉曼光谱技术可提供有关组织分子组成的信息，尤其可通过识别蛋白质、脂质和矿物质等特定成分实现分析。该方法可用于表征矿化基质，并检测如BMP2等生长因子的存在，从而为再生微环境中成骨促进信号的持续性提供关键信息。

本研究采用多学科方法，整合多种分析技术，旨在对再生骨组织的质量进行系统而全面的评估，从而为骨移植替代材料的评价及其潜在的临床应用提供坚实的基础。

方案

本研究已获得伦理与动物福利委员会以及法国国家兽医和食品管理局的批准，批准编号为 G44171。

1. 骨软骨组织外植体的制备与培养

1. 在无菌环境中，从刚处死的动物体内采集绵羊关节标本。将绵羊仰卧位固定，剃除左侧后肢毛发，并用酒精对膝关节周围进行消毒。采用外侧髌旁关节切开术暴露前、后交叉韧带，随后进行髌骨脱位以显露股骨滑车。
   1. 组织采集后，使用自体骨软骨移植系统在股骨外侧髁上制备直径为4.75 mm的缺损。
2. 使用骨科锤制备深度为10 mm的缺损，并从髁部取出离体组织。随后，以第一个缺损为中心，使用自体骨软骨移植系统再制备一个直径为8 mm的二次缺损。最终获得尺寸为8 mm × 10 mm的骨软骨离体组织，其中包含一个4.75 mm × 10.0 mm的中心缺损。
3. 如因物流需要，可将离体组织置于添加了1%青霉素-链霉素的汉克斯平衡盐溶液（hBSS）中运输，并在4 °C下保存。
4. 用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗离体组织3次，然后向4.75 mm × 10.0 mm的缺损中注射添加了40 µg/mL BMP2的磷酸钙水泥。水泥的制备方法如下所述。
   1. 通过在1364 °C下对类羟基磷灰石三钙磷酸盐棒材（等静压成型，压力120 MPa）进行至少12小时的热处理，随后空气淬火，制备α-三钙磷酸盐（α-TCP）¹⁴。
   2. 将α-TCP棒材置于无水乙醇中，使用行星式球磨机以500 rpm转速研磨2次，每次5分钟，得到粒径为13.1 ± 1.7 µm的细粉（采用激光衍射法测定，方法见前文¹⁴）。
   3. 将α-TCP粉末在180 °C下干热灭菌45分钟。通过将α-TCP粉末与2.5%（w/v）Na₂HPO₄溶液（经0.22 µm滤膜过滤）按液粉比0.35混合，搅拌1分钟，制备磷酸钙水泥。
   4. 在使用18 G针头注射前，将水泥糊剂装入3 mL注射器中。
5. 室温（RT）静置10分钟后，将离体组织转移至25 cm²培养瓶中，轻轻加入10 mL完全培养基，培养基成分为高糖杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM），添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素。
6. 将离体组织置于37 °C、5% CO₂的培养箱中培养最多28天，在超净工作台中每2天更换一次完全培养基。
7. 用PBS冲洗离体组织3次，转移至50 mL离心管中，加入20 mL 4%多聚甲醛（PFA），于4 °C保存3天。随后用PBS冲洗，并在后续分析前将其保存于70%乙醇中。

2. 微型计算机断层扫描分析

1. 使用微型计算机断层扫描（micro-CT）X射线设备进行显微断层扫描分析。以10.7 µm分辨率采集X射线投影，曝光时间为1200 ms，采用1 mm铝滤片（80 kV和125 µA）。每个0.45°旋转步进采集时，对三幅图像取平均，以提高信噪比。
2. 通过参考扫描完成X/Y方向对准后，使用制造商提供的重建软件重建三维（3D）图像，参数设置如下：平滑度：0，环形伪影校正：3，射束硬化校正：35%。使用图像处理软件对图像序列进行去噪处理，并借助二维（2D）和三维（3D）可视化工具进行观察。

3. 深度学习图像分析

1. 使用专用的专业软件进行图像分割。利用集成的分割向导训练深度学习模型，以区分骨组织和骨水泥。
2. 从重建的显微CT图像中选择一个包含骨组织、骨水泥和背景的代表性区域（即帧）。使用软件提供的简单工具（如阈值法）或高级工具（如传播工具）对该第一帧进行手动分割。
3. 在“模型”选项卡中生成深度学习模型，并在下拉菜单中选择3D-Unet Routine。通过右键单击生成的模型，根据待分析图像定义其实验参数；此处参数为：深度为5，图像块大小为32 × 32，Adadelta算法，步幅比为0.25，数据增强倍数为10倍。
4. 使用已分割的帧来训练深度学习流程（点击Train Button），该方法因其快速且准确的图像分割能力而被广泛认可^3,15。训练完成后，定义第二个工作区域（帧），并使用预测功能进行自动分割。
   1. 如有需要，进行手动校正以生成更精确的训练数据。再次训练该流程。重复此过程直至获得满意结果；随着训练帧数量的增加，数据增强次数逐步减少。
      注意：模型训练过程中提供的DICE指数可反映模型的准确性（相对于输入信息），但并不充分。模型的有效性应通过3名独立且经验丰富的研究人员对自动分割结果进行验证来确认。
5. 点击Export按钮发布模型，并通过点击Segment > Exported Model > Segment Full Dataset将该模型应用于整个显微CT数据集。

4. 包埋

1. 将骨外植体置于含有25 mL脱水液（由70%丙酮和30%二甲苯组成）的40 mL玻璃小瓶中进行脱水处理。将玻璃小瓶放置在旋转轮上，在室温下旋转1小时。重复此步骤3次。
2. 将脱水液替换为25 mL二甲苯，将玻璃小瓶置于旋转轮上，在室温下旋转1小时。
3. 将二甲苯溶液替换为25 mL甲基丙烯酸甲酯（MMA），其中添加10%过氧化苯甲酰（BPO）和10%邻苯二甲酸二丁酯（DBP）。将小瓶置于旋转轮上，在室温下旋转1小时。重复此步骤2次。
4. 将MMA溶液替换为25 mL MMA，其中添加10% BPO、10% DBP以及450 µL N,N-二甲基苯胺（用异丙醇按1:20稀释）。将玻璃小瓶置于-20 °C过夜。溶液变为淡黄色。
5. 将外植体放入中等大小的包埋模具中，并将MMA-BPO-DBP-N,N-苯胺混合液倒入模具内。将模具放入塑料盒中，通入氮气5分钟。然后将盒子密封，置于4 °C环境中48小时，以完成MMA的聚合与硬化。
6. 从模具中取出含有外植体的树脂块，并在4 °C保存，直至进行后续分析处理。

5. 扫描电子显微镜（SEM）- 定量背散射电子成像（qBEI）

1. 用金刚石锯沿长轴方向切割含有外植体的pMMA包埋块。将包埋块的前半部分保留用于组织学分析。将另一半进一步切割，制成厚度为1.5 mm的切片。切割时转速设为3000 rpm，进刀速度为3 mm/min。
2. 使用碳化硅砂纸按目数递增（对应粒径递减）的顺序研磨切片：320目碳化硅砂纸研磨10秒，1000目碳化硅砂纸研磨15秒，2000目碳化硅砂纸研磨30秒，4000目碳化硅砂纸研磨30秒。
3. 使用金刚石抛光膏和专用抛光布进行抛光：先用含3 µm Mol B3金刚石溶液的抛光布抛光1分钟，再用含1 µm Nap B1金刚石溶液的无纺布抛光1分钟。
4. 用双蒸水冲洗切片，并用棉签擦去金刚石颗粒。用氮气吹干切片。
5. 对厚切片进行碳镀膜（碳膜厚度为10 nm），并用银漆将其固定在铝质样品台上。在切片表面与样品台之间用银漆搭建导电桥，以便将电子电荷导至地面。
6. 将样品台置于SEM载物台上。在样品旁边，插入一个对照样品台，该对照样品台由法拉第杯及碳、铝和硅标准物质组成，放入SEM腔室中。此对照样品台用于校准电子束，并将灰度值转换为Ca的百分比含量。关闭SEM腔室并抽真空。
7. 打开电子束，调节扫描电镜（SEM）参数以在背散射电子模式下运行。在背散射电子图像中，碳标准样的灰度值为25，铝标准样为225，硅标准样为253。作为参考，所用系统的SEM参数如下：加速电压20 keV，法拉第杯测得的探针电流：250 pA，工作距离：15 mm，光阑：30 µm，图像分辨率：1024 x 768像素，真空度： < 4.10^-4 Pa，停留时间为 100 µs/像素，亮度约 38，对比度约 72。
8. 使用标准样品校准扫描电镜后，以背散射电子模式采集样品的图像。
9. 使用样品的背散射电子图像，按照 Roschger 等人的方法，将灰度值转换为钙含量。¹⁶使用任意图像分析软件执行此操作。
10. 绘制钙含量分布图。钙含量分布呈高斯分布。计算三个主要关注参数：Ca_平均值，作为图像上的平均钙含量，Ca_峰值 图像中最常见的钙浓度以及 Ca_宽度 作为钙含量分布的半高全宽。
    注意：qBEi 的可重复性已通过对同一感兴趣区域连续 5 天成像（每天一次采集）进行验证。这意味着在每次成像会话之间电子束被关闭和重新开启。Ca 的误差百分比_平均值，Ca_峰值，Cawidth 的估计值分别为 0.5%、0.7% 和 1.2%。此外，通过能量色散X射线分析（EDS）检测了钙含量。在 Ca_平均值 通过EDS估算的钙含量，其R²值为0.99，与Roschger等先前获得的数据相似。¹⁷.

6. 组织学

1. 每个样本使用硬组织切片机和钨钢刀片切取 7 µm 厚的切片^18,19。使用自动染色系统对切片进行Goldner三色染色、HES染色和MOVAT染色。
2. 进行脱塑料处理：将样本依次在丙酮中浸泡 5 分钟，重复 2 次；随后用蒸馏水冲洗 5 分钟，重复 2 次。
3. 按以下步骤进行Goldner三色染色：
   1. 将样本置于Weigert铁苏木精液中染色 20 分钟，用自来水冲洗；再将样本浸入 0.5% 酸性乙醇中 30 秒至 1 分钟，然后用自来水冲洗 20 分钟。
   2. 将样本放入猩红/酸性品红/偶氮品红溶液中染色 5 分钟，随后浸入 1% 乙酸中 1 分钟。
   3. 用磷钼酸/橙黄 G 溶液染色 20 分钟，再浸入 1% 乙酸中 1 分钟。
   4. 用快绿溶液在室温下染色 15 分钟，或在 60 °C 下染色 8 分钟；用自来水彻底冲洗，重复 3 次。
4. 按以下步骤进行Movat五色染色：
   1. 阿利新蓝染色：将样本浸入阿利新蓝溶液中 30 分钟，用自来水冲洗 5 分钟；将样本置于碱性乙醇中 60 分钟，再用自来水冲洗 10 分钟，最后用蒸馏水进行终末冲洗。
   2. Weigert苏木精染色：将样本置于Weigert铁苏木精液中 20–30 分钟，用自来水冲洗 15 分钟，再用蒸馏水冲洗一次。
   3. 亮胭脂红/酸性品红染色：将样本浸入亮胭脂红/酸性品红溶液中 10 分钟，用 0.5% 乙酸冲洗；再将样本浸入 5% 磷钨酸溶液中 20 分钟，用 0.5% 乙酸冲洗 2 分钟；最后用 100% 乙醇连续冲洗三次，每次 5 分钟。
   4. 加蒂奈红染色：将样本置于加蒂奈红（Safran du Gatinais）中染色 15 分钟，最后用自来水进行终末冲洗。
5. 按以下步骤进行HES染色：
   1. Weigert苏木精染色：将样本浸入Weigert苏木精液中 30 分钟，用自来水冲洗 2 分钟。
   2. 脱色：将样本浸入盐酸乙醇中 10 秒，用自来水冲洗 2 分钟。
   3. 返蓝：将样本浸入碳酸锂溶液中 1 分钟，用自来水冲洗 2 分钟，最后用蒸馏水终末冲洗 1 分钟。
   4. 伊红-赤藓红染色：将样本置于伊红-赤藓红溶液中染色 3 分钟，用自来水冲洗 10 秒。
   5. 脱水：将样本浸入 95% 乙醇中 15 秒，转移至 100% 乙醇中 15 秒，再重复浸入 100% 乙醇中 30 秒。
   6. 醇溶性沙黄终末染色：将样本浸入醇溶性沙黄中染色 10 分钟，最后用自来水进行终末冲洗。
6. 按以下步骤进行封片：
   1. 将样本依次在 95% 乙醇、100% 乙醇和甲基环己烷中冲洗，每个步骤重复 3 次。
   2. 使用封片试剂盒进行封片，并加盖盖玻片；使用数字切片扫描仪扫描图像。

7. 拉曼显微光谱法

1. 使用与拉曼分析相同的样品区域进行扫描电镜（SEM）分析。按照步骤5.2–5.3所述，对该区域进行短暂研磨和抛光，以去除为扫描电镜所添加的薄碳层，该碳层会阻碍样品的热扩散。
2. 将样品置于拉曼显微光谱仪的载物台上。在测量前校准波数以确保准确性，并对激光进行准直。由于这些操作步骤因仪器而异，本文不再详细描述。
3. 在组织中定位需要分析的感兴趣区域。将待分析区域置于视频工具的中心位置，并使用以下参数采集拉曼光谱：785 nm 激光，功率 30 mW，积分时间：20 s，重复 3 次，光谱范围：350–1800 cm⁻¹^-1，光栅为1200线/毫米。
4. 以相同的拉曼设置采集包埋树脂的10张光谱并取平均值，用于在步骤7.6中扣除树脂的信号贡献。
5. 按如下步骤对光谱进行预处理，以消除荧光、噪声和树脂的干扰：采用五阶多项式拟合进行基线校正，使用Savitzky-Golay滤波器（阶数为4，窗口大小介于17至21之间），并通过数字树脂扣除法减去约812 cm⁻¹处的树脂信号。^-1 树脂峰。此类预处理可通过多种专用于数据分析与可视化的软件完成。
6. 进一步分析预处理后的光谱，通过将目标振动峰强度与参考振动峰强度的比值来提取有价值的参数。例如，在骨组织分析中，使用以下参数进行计算。
   1. 矿物与基质比值：将约 960 cm⁻¹ 处 v1PO₄ 振动的峰强度除以基质峰强度^-1 由酰胺I带（~1668 cm⁻¹）的峰值强度决定^-1)，酰胺III（~1250 cm⁻¹）^-1），CH2摇摆（~1450 cm⁻¹）^-1）或脯氨酸的总和（~854 cm⁻¹）^-1）和羟脯氨酸（Hyp，~872 cm⁻¹）^-1）振动模式。v2PO4 位于约 430 cm⁻¹ 处。^-1, 或位于约 600 cm 的 v4PO4^-1，也可与酰胺III振动进行比值分析²⁰这些参数代表了骨基质有机相矿化的程度。
   2. 碳酸盐/磷酸盐：将 v1CO 的峰强度除以₃，位于约 1070 cm⁻¹ 处^-1，由v1PO₄表示。这代表了磷灰石晶格中B型碳酸盐取代的程度。Hyp/Pro代表羟脯氨酸含量，约1375 cm⁻¹^-1酰胺III，代表蛋白聚糖含量，~1150 cm⁻¹^-1/CH2-摇摆振动和约1495 cm⁻¹^-1/CH2-wag，代表晚期糖基化终末产物羧甲基赖氨酸和戊糖素的含量，1670 cm⁻¹^-1/1690 cm^-1 和 1670 cm⁻¹^-1/1640 cm^-1 分别代表胶原蛋白的无序二级结构（也称为胶原成熟度）和Ⅰ型胶原中α-螺旋形式的有序结构。
7. 通过连续5天每天一次对同一感兴趣区域进行拉曼测量，评估其重复性。对于每个分析参数，其方差均低于参数值的0.2%，表明具有良好的重复性。各研究峰的特异性已在相关领域得到广泛讨论，近期Unal的综述中对此进行了概述²¹.

8. 纳米压痕

注意：由于纳米压痕具有破坏性，通常在样品分析流程的最后阶段进行。我们所使用的纳米压痕系统配备了一个锥形伯科维奇（Berkovitch）金刚石压头。然而，存在多种压头形状，目前在文献中尚未就骨组织或生物材料样品的压头选择达成共识。

1. 在进行纳米压痕测试前，将包埋的骨样本在室温下用生理盐水水化 16 小时。
2. 使用熔融石英校准纳米压痕系统，并记录所得的压痕模量。对于熔融石英，当泊松比系数为 0.17 时，其压痕模量约为 72 GPa。
3. 完成纳米压痕系统的校准后，将用于拉曼分析的样本置于纳米压痕设备的光学系统中，以确定将进行纳米压痕的位置。
   注意：该操作方式因设备而异；本文不详细说明纳米压痕系统及软件的具体工作原理，仅提供应执行各步骤的一般性建议。
4. 选定纳米压痕位置后，将样本移至压头下方并进行压痕。以恒定深度 900 nm 进行纳米压痕，加载/卸载速率为 40 mm/min，加载与卸载之间保持 15 秒的停顿时间。设定骨组织的泊松比系数为 0.3。
5. 从纳米压痕曲线中提取各项参数，并依据 Oliver 和 Pharr 理论²²进行计算。
   1. 压痕模量（E_IT）由压头的已知特性与约化模量推导得出，反映样本局部的弹性模量。按以下公式计算压痕模量：
      
      其中 v_s、v_i、E_i 和 E_r 分别表示样本的泊松比系数（骨组织假设为 0.3）、金刚石压头的泊松比系数（假设为 0.07）、金刚石压头的弹性模量（固定为 1140 GPa）以及约化模量，其计算公式为：
      
      其中 S 表示卸载段的斜率，Ap 为投影面积，计算公式如下：
      
   2. 硬度（H_IT）：对应骨组织抵抗裂纹萌生与扩展的能力，即骨韧性的指标。H_IT 的计算公式为：
      
   3. 压痕蠕变速率（C_IT）：反映在恒定载荷下骨组织随时间发生的变形，体现样本的黏弹性特性，计算公式为：
      
   4. 最大载荷（L_m）：指穿透矿化骨基质至指定深度所需的对抗性加载力。
   5. 压痕功（W_plast）：对应于载荷-卸载变形曲线下的面积，直接反映诱导塑性变形所耗散的能量。
      注意：由于该方法具有破坏性，骨样本的纳米压痕重复性较难评估。尽管如此，我们仍对标准且均匀的熔融石英样本进行了重复性估计。对于上述所有参数，在 5 个不同日连续测量 5 次的结果中，变异率均低于 0.26%，表明具有非常好的重复性。然而，由于骨样本具有各向异性，其重复性的评估更为困难。

结果

移植物的显微CT图像如图2所示。使用手动分割方法无法通过全局阈值法有效区分存在于中央管中的骨组织与骨水泥。为了提高对骨小梁和骨水泥的识别效果，我们建议采用深度学习方法。深度学习在识别生物材料特征方面具有强大能力，有助于改善骨组织与骨水泥之间的分离效果，从而更准确地评估骨-水泥界面的相互作用。这一点至关重要，可确保精确量化骨-水泥界面处形成骨组织的数量，避免在计算中引入错误的像素。

然而，仅定量分析界面处的骨量不足以表征新形成骨的特性。要更深入理解新骨的强度及其基质形成的细胞机制，还需对骨基质质量和细胞组成进行更深入的研究。骨基质可通过两种互补的方法进行表征：定量背散射电子成像（qBEI）和拉曼显微光谱法。图3展示了一幅qBEI图像的示例。在qBEI中，每个以灰度编码的像素被转换为钙浓度值。这是评估松质骨中钙含量分布的前提，有助于理解（i）新形成骨在与骨水泥界面处的矿化程度，以及（ii）骨水泥的存在是否干扰了松质骨的正常矿化过程。qBEI的优势在于能够在极短时间内获得高分辨率图像，而拉曼显微光谱法则需要较长的采集时间。随后可从钙分布中提取qBEI参数，如Ca_mean、Ca_peak和Ca_width，用于比较两种骨水泥或生物材料之间的生物学反应差异。

另一方面，qBEI 无法提供关于骨基质有机相在与生物材料界面处质量的任何信息。有关有机相材料特性的额外信息来自拉曼显微光谱分析。拉曼显微光谱分析在用于 qBEI 的同一试样上进行，需先快速进行表面研磨和抛光，以去除导电碳层。在拉曼显微光谱分析中，每个像素位置都会采集光谱。未经处理和经过处理的拉曼光谱示例见图4。每条光谱均包含所分析像素的成分信息，其中包括包埋树脂（本例中为 pMMA）、矿物相（v1PO4 和 v1CO3 峰）以及有机相（Pro、Hyp、CML、Amide III、PG、CH2、Pen 和 Amide I 峰）的相关峰。在图4的示例中，未经处理的光谱显示了包埋树脂在约 812 cm^-1 处的贡献，以及由于荧光导致的非零弯曲基线，尽管使用的是近红外激光。光谱处理是确保准确计算各种拉曼参数的前提，特别是消除背景荧光。在采集数据时，用户应确保准确定位并避免探测器饱和，以确认位于约 960 cm^-1 处的 v1PO4 峰的存在。经过后处理后，根据特征振动模式的位置计算峰强度比。

然而，材料成分的变化是否导致了生物力学响应的改变仍存在疑问。为了获取新形成骨组织生物力学方面的信息，我们对用于拉曼微光谱分析的同一样本系统地进行了纳米压痕研究。组织的力学信息来源于纳米压痕曲线，即载荷-深度曲线（图5）。值得注意的是，在测试结束时，压入深度并未完全回零，这反映了材料产生的塑性变形及其永久性损伤。压痕蠕变速率则由深度-时间曲线推导得出。

最后，通过组织学染色在细胞水平上评估组织对生物材料的反应（图6）。所采用的组织学染色方法不仅可确定类骨组织的存在，还可识别细胞类型（如巨噬细胞、多核巨细胞、破骨细胞、成骨细胞），以及在生物材料界面处是否存在纤维囊。这对于理解生物材料的生物相容性至关重要，同时也可评估当生物材料降解后新生骨组织的持续存在情况。

总体而言，这种多方法联合策略能够深入研究骨形成过程、新生骨的质量以及细胞组成。按照建议的顺序依次进行时，所有检测均可在同一样本上完成，从而降低检测成本和处理时间。

图1：图形摘要。此处提供了本实验方案步骤的概要。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：显微CT与深度学习分析。（A）显微CT图像的三维重建。（B）骨组织与骨水泥的分割：手动分割与深度学习分割的比较。比例尺 = 5 cm。请点击此处查看该图的放大版本。

图 3：通过定量背散射电子成像测定钙含量。（A）在扫描电子显微镜（SEM）中获得的灰度级背散射图像，经图像分析软件转换为（B）显示骨样本钙富集区域的钙分布图。（C）绘制钙含量在骨面积中的分布图，并计算三个主要的qBEI参数：Camean、Capeak 和 Ca_width。请点击此处查看此图的放大版本。

图 4：拉曼光谱示例。（A）在 800 - 1800 cm^-1 光谱范围内获得的原始未处理拉曼光谱。荧光背景清晰可见，表现为光谱并非从 0 开始。树脂成分（pMMA）在约 ~812 cm^-1 处明显可见。（B）处理后的光谱。谱图上标出了不同感兴趣振动模式的位置。请点击此处查看该图的高清版本。

图5：通过纳米压痕法研究组织的力学性能。（A）纳米压痕装置包含一个光学部分，用于确定样品块表面感兴趣区域的位置，随后将样品块移至压痕部分下方。（B）在压痕测试过程中绘制载荷-时间曲线和深度-时间曲线，并用于生成（C）载荷-深度曲线。本示例中选定的压入深度固定为 400 nm。最大载荷（L_m）、加载结束时的深度（h_l）、保载阶段结束后的深度（h_m）、卸载段的斜率（S）以及加载-卸载阶段测试曲线下的面积（W_plast）均从载荷-深度曲线中提取，并用于计算不同的纳米压痕参数。请点击此处查看该图的放大版本。

图6：骨软骨外植体经骨水泥处理后培养28天的组织学分析。（A）Movat染色显示组织结构，包括骨组织及填充缺损的骨水泥。（B）HES染色展示骨水泥周围组织的整合情况及细胞反应。比例尺：2.5 mm。（C）B图中高亮区域的放大图像，详细显示骨水泥与周围组织的界面，可见细胞侵入骨水泥内部。比例尺：500 µm。请点击此处查看该图的高清版本。

讨论

修复骨缺损是再生医学中面临的一项重大挑战，旨在恢复患者的活动能力、减轻疼痛并提高其生活质量。与传统方法相比，使用外植体模型具有多项优势 体内 用于骨缺损修复研究的动物模型。除了伦理方面的考量外，该模型有利于严格控制实验条件并减少生物学变异，从而获得更准确且可重复的实验结果。此外，与其他动物相比，绵羊骨骼的力学和生物学特性与人类骨骼更为接近^23,24这使得羊类组织外植模型成为临床前研究中尤为相关的选择，并能代表人类的临床状况。

随着成像技术和材料科学方法的发展，本文所述的组织块模型为在受控环境中研究再生医学对骨骼组织的影响提供了一个良好的模型，可减少实验偏差。该组织块的尺寸和形态非常适合对新生骨形成及材料特性进行详细分析，从而实现全面的评估与表征²⁵。这些发现凸显了该模型在临床转化方面的潜力，为评估骨移植替代物提供了坚实的框架，有助于提高骨再生治疗中临床成功的可能性。此外，该模型还可精确评价骨整合效果和生物材料性能，这两者是开发有效骨修复策略的关键因素。

为确保研究成功，必须严格遵循方案中的关键步骤。其中最重要的环节之一是在包埋过程中确保样品完全脱水。任何残留的水分都可能阻碍树脂的正常渗透，导致树脂浑浊不透明，从而影响结果的清晰度和准确性，并可能在组织学切片过程中产生孔洞。这种对细节的仔细把控对于获得可靠且可重复的结果至关重要。为了确保将灰度值准确转换为钙含量分布图，在进行扫描电镜（SEM）分析时，必须使用法拉第杯以及碳（C）、铝（Al）和硅（Si）标准样品进行校准。所有样品应使用同一台扫描电镜进行检测，以保证一致性，因为不同的背散射电子探测器可能导致结果出现差异。在拉曼光谱分析中，波数的校准和彻底的基线校正至关重要，以消除荧光背景干扰，并区分来自包埋树脂与样品本身的峰信号。对于纳米压痕测试，由于压头的位移范围有限，获得一个完全平整的表面极为关键；同时，必须使用已知标准材料（如熔融石英）进行校准，以确保测量结果的可靠性。

这些技术的改进与故障排除经常涉及骨材料的各向异性特性，这种特性可能影响测量的一致性。例如，在拉曼光谱分析中，入射激光的偏振状态可能对记录的信号强度产生显著影响。使用数值孔径较低的20倍物镜有助于缓解这一问题。确保所有样本在一致的校准和测量条件下进行检测，对于保持数据完整性也至关重要。骨组织固有的各向异性是这些方法学的一项局限性，因为它可能影响测量的均匀性，尤其是在拉曼光谱等技术中。此外，若不能严格控制校准精度和环境条件，其广泛应用性可能会受到限制。

这些方法的潜在应用价值显著扩展到新型生物材料和骨修复治疗策略的评估。该模型能够紧密模拟人类骨生理特性，为临床前测试提供了一个可靠的平台，可在受控环境中对新疗法的安全性和有效性进行充分评估。该模型的应用价值尤其体现在加速从实验室研究向临床实践的转化进程，有助于早期识别具有前景的骨再生治疗候选方案。通过为骨修复材料的评估提供一种可靠且可重复的方法，该技术推动了再生医学的进步以及临床可行解决方案的开发。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.20 滤膜	VWR	28145-501
18 G 针头（1.2×40 mm）	Sterican	4665120
3 mL 注射器	HENKE-JECT	8300005762
37% 盐酸	VWR	1.00317.1000
冰醋酸	Sigma	A6283
丙酮	VWR	20063-365
阿利新蓝 8GX	VWR	361186
氢氧化铵	VWR	318612
类羟基磷灰石三钙磷酸盐	生物医学与健康工程中心（法国圣艾蒂安高等矿业学院）	TV26U
偶氮品红	Sigma	210633
过氧化苯甲酰	Sigma	8.01641.0250
BMP2	Medtronic	InductOs 1.5 mg/mL
亮红克罗星	Aldrich	2107507
CTVox	Bruker	-
DataViewer	Skyscan	-
金刚石刀片	Struers	MOD13
金刚石切割锯	Struers	Accutom-50
DiaPro Mol B3 金刚石溶液	Struers	40600379
DiaPro Nap B1 金刚石溶液	Struers	40600373
磷酸氢二钠（Na2HPO4）	Sigma	102404598
邻苯二甲酸二丁酯	Chimie-Plus Laboratoires	28656
DragonFly 软件	ORS	2022.1.0.1231.
高糖 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM），含 GlutaMAX(TM) 和丙酮酸	ThermoFisher Scientific	31966-021
伊红 Y - Surgipath	Sigma	1002830105
赤藓红 B	Sigma	102141057
无水乙醇	VWR	20820362
Eukitt	Dutscher	6.00.01.0003.06.01.01
Falcon 50 mL	Sarstedt	62.547.254
六水合三氯化铁（FeCl3, 6H2O)	Merck	1.03943.0250
胎牛血清（FBS）	Eurobio	CVFSVF00
酸性品红	Merck	1.05231.0025
Hank's 平衡盐溶液（HBSS）	Biosera	MS01NG100J
苏木精	Sigma	86.118.9
等静压机	Nova Suisse	Pmax 1500 bars
激光衍射粒度分析仪	Malvern	Mastersizer 3000
亮绿	Prolabo	28947135
碳酸锂	Sigma	A13149
MD-Mol 抛光布	Struers	40500077
甲基环己烷	VWR	8.06147.1000
甲基环己烷	VWR	8.06147.1000
甲基环己烷	VWR	8.06147.1000
甲基丙烯酸甲酯	Sigma	8.00590.2500
微型计算机断层扫描仪（micro-CT），微型扫描仪	Bruker	Skyscan 1272
磷酸二氢钠（NaH2PO4）	Sigma	71496
研钵	Fritsch	Pulverisette 6
N,N-二甲基苯胺	Sigma	803060
纳米压痕仪	Anton Paar	NHT2
ND-Nap 抛光布	Struers	40500080
OATS 骨软骨自体移植系统套装，4.75 mm	Arthrex	AR-1981-04S
OATS 骨软骨自体移植系统套装，8 mm	Arthrex	AR-1981-08S
橙黄 G	Ral	M15
多聚甲醛（PFA）	Sigma	P6148
Peel-a-way 一次性包埋模具	Polysciences, Inc	18646C-1
青霉素/链霉素（P/S）	ThermoFisher Scientific	15140122
磷酸盐缓冲液（PBS）	ThermoFisher Scientific	10010023
磷钼酸	Sigma	221856-100 g
磷钨酸	Aldrich	12863-5
抛光机	Struers	Dap V
普潘炉（Poupinel）	MEMMERT	TV26U
拉曼显微光谱仪	Renishaw	InVia Qontor
加蒂奈藏红（Safran du Gâtinais）	Labonord	11507737
扫描电子显微镜	Carl Zeiss	Evo LS 10
SEM	Zeiss	Carl Zeiss Evo LS10
碳化硅箔/研磨纸	Struers	40400008 (#320), 40400011 (#1000), 40400122 (#2000), 40400182 (#4000)
导电银漆	Electron microscopy sciences	12686-15
标准样品台，含法拉第杯，以及碳、铝和硅标准样品	Micro-Analysis Consultants Ltd	8602
T25 培养瓶	Corning	430639
二甲苯	VWR	28975.325
二甲苯胺蓝 Ponceau	Aldrich	19.976-1