本方案详细描述了一种单侧输尿管梗阻的逐步、可重复的模型。
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摘要
摘要
单侧输尿管梗阻（UUO）是导致慢性肾脏病（CKD）的常见原因，可促进肾间质纤维化的进展，最终导致不可逆的肾脏损伤。缓解单侧输尿管梗阻至关重要。已有文献建立了多种可逆性单侧输尿管梗阻（RUUO）的动物模型，这些模型不仅可用于观察结构变化和功能损伤，还能模拟输尿管梗阻解除后发生的生理及病理生理变化。本研究采用硅胶管在小鼠单侧输尿管建立了一种可逆性梗阻模型。在解除梗阻前观察到明显的肾损伤，解除后则出现部分恢复。与UUO不同，该模型可防止进行性肾积水的发生，从而产生不同的病理结果。这一简单的手术方法成功率高，有望成为研究可逆性梗阻性肾病及肾间质纤维化潜在治疗方法的经典模型。此外，该模型还为研究梗阻性肾病恢复机制、肾细胞再生以及组织重塑提供了实用的实验平台。
引言
尿道梗阻显著促进肾间质纤维化和慢性肾脏病（CKD），可能导致肾脏不可逆的结构损伤和功能障碍1。尽管单侧输尿管梗阻（UUO）被广泛用于研究肾脏损伤和慢性肾脏病，但它并不能准确模拟梗阻解除后发生的自发性恢复机制。UUO模型通过结扎左侧输尿管造成永久性梗阻，导致输尿管扩张、肾积水、肾实质受压以及皮质变薄。组织学检查通常显示肾小管扩张、肾小管上皮细胞坏死以及进行性间质炎症和纤维化2。该模型主要用于研究因持续梗阻所致的肾间质纤维化及不可逆的肾功能丧失。
然而，临床实践中遇到的许多肾脏疾病，例如输尿管结石或肿瘤引起的梗阻，是可逆的。可逆性单侧输尿管梗阻（RUUO）模型能够实现肾脏结构和尿路功能的部分恢复，最终缓解肾积水。可通过影像学技术、组织学检查和生物标志物分析来评估恢复情况，以量化肾脏损伤和纤维化的减轻程度3。该模型 closely 模拟了临床环境中梗阻性肾病的恢复阶段，在研究炎症、免疫反应、细胞再生和组织重塑等关键过程方面，比 UUO 模型更为适用4,5,6,7,8。
RUUO 模型使研究人员能够在解除梗阻后分析肾脏修复与再生过程，弥补了 UUO 模型在动态研究中的局限性。通过比较梗阻前后不同时间点的变化，研究人员可以探究与损伤和修复相关的分子通路，包括炎症、细胞凋亡、纤维化以及再生过程。该方法有助于深入理解肾脏恢复机制，并识别潜在的治疗靶点2,3,4,5,8,9,10。尽管肾纤维化通常被认为是不可逆的，但临床观察表明，在纤维化早期阶段及时解除梗阻可能阻止甚至逆转疾病进展。RUUO 模型为研究这一现象提供了重要的实验平台11。
此外，RUUO 模型有助于研究梗阻解除后纤维化的逆转过程，为揭示肾脏恢复机制及潜在的抗纤维化治疗策略提供重要见解3,4。因此，该模型在转化医学研究中具有很高的实用性。本实验模型的主要目的是通过输尿管插管诱导梗阻性肾病，随后在预设的时间点进行标准化的梗阻解除，以确保实验的一致性。该模型在设计上优化了操作的简便性、可重复性和安全性，是开展实验研究的有效工具。
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方案
本动物研究遵循《赫尔辛基宣言》的指导原则，并经重庆医科大学附属儿童医院研究伦理委员会批准。共购入27只雄性Sprague Dawley（SD）大鼠，饲养于重庆医科大学附属儿童医院实验动物中心（SPF级，许可证号：SYXK（重庆）2007-0016）。大鼠饲养环境保持恒温，光照/黑暗周期为12小时交替，并自由获取 随意摄取 食物和水的获取
本实验方案适用于所有年龄且具有双侧输尿管的雄性SD大鼠，实验对象为6至8周龄的雄性SD大鼠。在本研究中，将15只6周龄雄性SD大鼠随机分为三组：对照组（n = 5）、单侧输尿管梗阻组（UUO组，n = 5）和单侧输尿管再通组（RUUO组，n = 5）。此外，另设5只8周龄SD大鼠（n = 5）作为额外的对照组。为建立RUUO模型，共使用12只大鼠，并额外采购7只大鼠以应对可能的风险，包括术中及术后死亡、手术失败、梗阻不完全以及再通不成功等情况。由此确保后续分析中每组至少有5只大鼠。
所有手术操作均严格遵循机构和国家关于实验动物护理与使用的指南。手术人员遵守个人防护装备（PPE）规范，包括佩戴外科口罩、手套和穿著防护服。每次手术均使用无菌手术器械，并在使用前后进行高压灭菌，以维持无菌状态。废弃物（包括锐器和生物样本）均按照危险废物管理规程进行处理，以降低污染风险并确保安全。
1. 动物与仪器准备
- 使用无菌（经高压灭菌）的器械和耗材进行所有操作。将灭菌后的硅胶管（内径：1.5 mm，外径：2.5 mm）切成约1 cm长的段。沿管壁一侧做纵向切口，以备后续使用。
- 麻醉大鼠 通过 腹腔注射戊巴比妥钠（40 mg/kg）（遵循机构批准的实验方案）。通过夹捏脚趾检查屈肢回缩反射等反射反应是否消失，以确认麻醉深度。在眼部涂抹兽用眼膏，防止麻醉期间角膜干燥。术前30分钟皮下注射盐酸丁丙诺啡（0.05 mg/kg）作为预先镇痛措施。
- 从剑突至耻骨联合处去除大鼠腹部的毛发，并向两侧延伸至腹中线。
- 将大鼠仰卧位放置在加热的手术垫上，并用橡胶绳固定其四肢。
- 以腹中线（脐部）为中心开始进行腹部皮肤消毒，使用无菌纱布交替涂抹70%乙醇（待其自然干燥）、5%聚维酮碘（接触时间≥1分钟）和70%乙醇（待其自然干燥），共完成三个完整循环，随后在切口前15分钟内涂抹最后一层聚维酮碘并使其自然干燥。然后覆盖无菌带孔巾以维持无菌区域。沿腹部正中线做皮肤切口，从剑突下区域延伸至脐部稍下方，以充分暴露肾脏及上段输尿管。
- 沿中线使用手术剪切开皮下组织和筋膜。使用组织镊仔细逐层分离皮肤及皮下组织，充分暴露腹膜后间隙。
2. 可逆性单侧输尿管梗阻的阻塞性手术
- 使用无菌棉签将肠管向腹腔右侧牵拉，以直接暴露左侧输尿管。用浸有生理盐水的纱布覆盖输尿管，防止其干燥。
- 使用显微镊子分离并游离左侧输尿管，使其从周围组织中松解约 1.5 cm。
- 在游离的输尿管下方放置一段长 1 cm 的硅胶管（内径：1.5 mm，外径：2.5 mm）。使用镊子确保输尿管完全被硅胶管包裹。
- 使用 3-0 丝线结扎硅胶管及输尿管中段，以诱导输尿管梗阻。避免结扎过紧。沿输尿管纵轴缓慢拉动硅胶管，确保结扎牢固但不滑脱。
- 小心地将肠管复位至腹膜腔内，确保其位置正常，无张力或梗阻。
- 使用带弧形切割针的 3-0 非吸收缝线连续缝合腹肌和筋膜层，以提供足够的抗张强度。用连续的 4-0 非吸收缝线缝合皮肤，确保解剖对位和张力均匀，以促进愈合并降低伤口裂开的风险。
- 将大鼠置于恒温控制条件下恢复 7 天。
注：术后镇痛通过术后 48–72 小时内每 8–12 小时皮下注射布托啡诺（0.05 mg/kg）维持。镇痛药物使用不超过 72 小时。
3. 可逆性单侧输尿管梗阻的解除手术
- 准备好所需的动物和器械，确保无菌条件下重新打开腹腔并充分暴露腹腔。
- 使用手术刀片小心分离硅胶管的结扎结，取出导管，并用生理盐水冲洗腹腔，以最大限度减少粘连和感染风险。
- 复位肠道，并使用4-0不可吸收缝线逐层缝合腹壁切口。 将大鼠置于温度可控的环境中，进行为期7天的术后恢复。
- 术后第14天，对大鼠实施麻醉（参照步骤1.2所述方法），并通过横向将肾脏切成两半的方式采集肾组织样本9。
- 将其中一半组织置于4%多聚甲醛中固定，用于组织病理学检查；另一半迅速浸入液氮中冷冻，随后于−80 °C保存，用于后续分子生物学分析。同时采集血液样本用于生化分析。
- 在终末麻醉后，使用手术剪进行双侧开胸术，直视下确认心脏停搏，以实施安乐死。
4. 随访评估
- 在解除单侧输尿管梗阻（RUUO）后监测体重变化，以评估整体恢复情况，并与对照组和单侧输尿管梗阻（UUO）组进行比较。
- 测量肾脏重量和肾脏体积，以评估肾功能的恢复情况。
- 检测血清肌酐（Scr）水平，作为肾功能改善的指标9。
- 向肾盂内注射亚甲蓝以确认输尿管通畅性，观察输尿管蠕动及染色情况，评估梗阻解除后的恢复状态。
- 进行苏木精-伊红（H&E）染色，以评估RUUO术后肾小管完整性和肾脏结构8,10。
- 进行Masson三色染色，评估肾间质纤维化的逆转情况8,10。
- 比较UUO组与RUUO组的肾损伤评分3,8，以量化组织恢复程度。
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结果
评估了单侧输尿管梗阻（UUO）及其后续解除梗阻（RUUO）对体重、肾脏重量、肾脏体积以及血清肌酐（Scr）水平的影响，结果总结于表1中。数据以均值±标准差（SD）表示，每组n=5。
6周时，对照组的平均体重为234 g ± 16 g，肾脏重量为0.9107 g ± 0.0475 g，肾脏体积为0.8962 cm³ ± 0.0502 cm³。至8周时，对照组的体重（291 g ± 20 g，P < 0.05）、肾脏重量（1.1443 g ± 0.0687 g，P < 0.05）和肾脏体积（1.1340 cm³ ± 0.0392 cm³，P > 0.05）均显著增加，血清肌酐（Scr）水平为18.07 µmol/L ± 2.17 µmol/L。
8周UUO组表现出显著的肾脏肿大，肾脏重量（2.5535 g ± 0.2587 g，P < 0.01）和肾脏体积（2.8533 cm³ ± 0.3870 cm³...
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讨论
该模型采用硅胶管包绕输尿管以提供结构支持，随后用丝线结扎，通过压迫诱导完全性输尿管梗阻。七天后，移除结扎线和硅胶管，以促进肾脏减压以及尿路完整性和功能的恢复。
硅胶管由硅橡胶弹性体制成，具有优异的柔韧性、生物相容性、耐化学性和热稳定性。医用级硅橡胶专为需要优异机械性能的应用而设计，包括长期植入；而普通硅胶管则涵盖一系列市售的变体，其在弹性、硬度和生物相容性方面可能存在差异13。鉴于本研究实验周期较短（7–14天）且无持续的机械应力，硅胶管因其足够的生物相容性、适宜的弹性和成本效益，被选用于建立大鼠输尿管梗阻模型。因此，这两种材料在本研究中具有功能上的等效性，可互换使用。
梗阻持续时间是决定单侧输尿管梗阻（RUUO）肾脏恢复的关键因素，研究表明，若在第7天解除梗阻，肾损伤可部分缓解；而若超过第14天，则未见显著恢复。7确定RUUO模型中输尿管阻塞的最佳持续时间为七天，以防止过度损伤，并确保结果不受长期阻塞的过度影响。通过比较阻塞14天...
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致谢
本工作由重庆医科大学未来医学青年创新计划（W0056）、重庆市科卫联合中医药技术创新与应用发展项目（2020ZY023877）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 镊子 | 上海医疗器械有限公司 | 20220032 | |
| 纱布 | 四川科伦有限公司 | 20172140152 | |
| 苏木精-伊红染色试剂盒 | Solarbio | G1120 | |
| 胰岛素注射针头 | KDL 医疗器械 | 20193140938 | |
| Masson’s 三色染色试剂盒 | Solarbio | G1340 | |
| 医用棉球 | 四川科伦有限公司 | 20170037 | |
| 医用棉签 | 四川科伦有限公司 | 20172140026 | |
| 亚甲蓝 | 天津登峰化学试剂厂 | 14038-43-8 | |
| 显微镊 | 宿迁市锋医疗器械有限公司 | S50985 | |
| 持针器 | 宿迁市锋医疗器械有限公司 | S7005 | |
| 聚维酮碘溶液 | 四川科伦有限公司 | 514001 | |
| 生理盐水 | 四川科伦有限公司 | 20220004 | |
| SD 大鼠 | SPF(北京)生物科技有限公司 | D025 | |
| 硅胶管 | 泰州春实新材料有限公司 | CS356 | |
| 丝线缝合线 | 强生医疗器械有限公司 | SA84G | |
| 手术刀片 | 华南云悦医疗器械有限公司 | CE0434 | |
| 手术剪 | 上海医疗器械有限公司 | J21130 | |
| 注射器 | 通迈医疗设备 | 20183140304 | |
| 组织镊 | 江西玉源医疗设备有限公司 | J36030 |
参考文献
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