蛋白质组学是一种高通量评估蛋白质相互作用、功能、组成、结构及其细胞活动的技术。本文介绍了一种用于评估血浆和组织等各类生物样本中全蛋白质组变化的实验方案。本方法适用于所有含有蛋白质的生物样本。
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蛋白质组学是一种高通量评估蛋白质相互作用、功能、组成、结构及其细胞活动的技术。本文介绍了一种用于评估血浆和组织等各类生物样本中全蛋白质组变化的实验方案。本方法适用于所有含有蛋白质的生物样本。
蛋白质组学是对生物系统中表达的蛋白质进行的大规模研究，重点关注蛋白质的结构、功能、相互作用、丰度以及翻译后修饰。例如，磷酸化蛋白质组学是全蛋白质组学的一个重要分支，专注于研究蛋白质上磷酸化位点的模式及其变化。本文所述方法展示了一种全蛋白质组学策略，用于解析从实验动物模型采集的血浆、脑、肺、脾和肝组织中整体蛋白质表达谱的变化，包括磷酸化模式的改变。 （例如雪貂和小鼠）。该技术适用于其他类型的组织以及几乎任何含有蛋白质的生物样本 （例如培养的细胞）。解剖后，目标组织迅速冷冻并储存在 -80 °C。随后在液氮中使用研钵和研杵对组织进行匀浆，以保持蛋白质完整性及磷酸化状态。使用含有通用核酸酶以及蛋白酶/磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液从组织匀浆中提取总蛋白。利用商用质谱仪样品制备试剂盒，通过受控的蛋白酶消化将组织和相应血浆中提取的蛋白质转化为总肽段。肽段直接采用超高效液相色谱/Orbitrap三合一串联质谱法进行分析。通过蛋白质组学生物信息学软件，将肽段质谱数据与物种特异性的氨基酸序列数据库比对，重建各组分蛋白质的身份。此后，分析应包含严格的截断标准，尤其仅使用高置信度的蛋白质鉴定结果。具有统计学意义的蛋白质组差异（>2倍变化；p < 在对照组和实验组之间可以确定显著性差异（p < 0.05）。
蛋白质组学结合了蛋白质组实验与数据分析，致力于在生理条件下鉴定和定量蛋白质，并基于其组成、相互作用、转录前及转录后修饰（如磷酸化）、亚细胞定位和结构等特征对其进行表征1。表达蛋白质组学关注在不同生物学条件下蛋白质的定量比较2。它在描绘复杂且相互关联的通路、网络和分子系统的图谱方面也具有重要意义，这些系统直接调控细胞增殖、分化、衰老以及细胞死亡机制等主要生物学功能。近年来，随着实验技术的显著进步，蛋白质组学方法已从传统技术——包括免疫组织化学和酶联免疫吸附测定——发展为高通量技术，例如液相色谱3,4。基于蛋白质组学的方法在确定独特疾病表型和亚型，以及发现治疗药物的新靶点相互作用（药物蛋白质组学）方面正日益受到重视。例如，患者分层主要依赖基因组学方法来定义同质性群体并指导治疗方案。然而，仅凭转录状态无法预测翻译后蛋白质的命运（如稳定性或修饰）；因此，非基因组机制在疾病的发生、发展、严重程度以及对治疗的耐药性中起着更重要的作用5,6,7。
在神经退行性疾病和创伤性脑损伤（TBI）领域，蛋....
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研究在获得IACUC批准的动物使用方案下进行，实验设施已通过国际实验动物评估和认可委员会（AAALAC International）认证，并持有公共卫生服务部动物福利保证，同时遵守《动物福利法》及其他与实验动物相关的联邦法规和规定。本实验所需的所有试剂和材料均列于材料表中。该实验步骤分为七个部分。
警告：使用液氮均质化组织时，务必遵守适当的安全操作规程。实验室人员在均质化冷冻组织期间佩戴了冷冻手套、冷冻围裙、外科口罩和面罩。该均质化技术适用于任何类型的组织，包括骨骼等极为坚韧的物质，只需相应调整研钵和研杵的尺寸即可。有关初始工作台设置，请参见图1A。均质化小鼠和雪貂组织时所用的尺寸信息，请参阅材料表。
1. 使用研钵和研杵进行组织的低温研磨
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通过可选的火山图处理方式可视化全蛋白质组结果
每个样本的全蛋白质组结果均可根据登录号（accession #）或蛋白描述信息，便捷地检索研究者感兴趣的特定蛋白，并对相关相对丰度进行平均，随后在处理组之间比较其显著差异（例如通过t检验得出的p值）。此外，探索整个蛋白质组范围内的全局性变化也具有重要价值，包括在构成实验处理组的各个样本间完全共有的所有磷酸化蛋白。该分析可通过将数据转换为可选的火山图实现，火山图本质上是蛋白质变化分布图。用于生成各样本蛋白质组结果的生物信息学软件可在处理原始质谱（MS）数据文件时，设置为自动进行处理组间的比较，并生成相应的火山图；然而，此类输出结果往往难以解释，因为软件程序并未公开显示用于计算组平均值的各个样本中的相对丰度数据。同样，程序也无法明确标记某蛋白在某个样本中是否未被检测到或存在可疑（例如缺乏唯一性肽段）。这可能导致出现误导性的显著差异，尤其是当某蛋白的“缺失”偏向于某一特定处理组时。因此，建议手动进行处理组分析，具体操作如下所述。
在用于生成过滤后总蛋白质组结果的生物信息学软件中，如前一节所述，打开每个.......
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上述方法使用液氮速冻组织，以立即终止所有生物活性，随后转移至 -80 °C 进行长期保存。在所有样本收集完成后，进行组织匀浆。匀浆过程中，必须始终保持所有组织和工具处于低温状态，以防止蛋白质的重新激活或降解。此外，在从匀浆组织中进行蛋白质的初始提取时，也需保持样本低温，以避免蛋白质活性丧失或发生降解。我们采用该方法研究了创伤性脑损伤（TBI）临床前动物模型（即暴露于模拟爆炸超压波的小鼠和雪貂）中脑、肺、脾、肝及血浆等组织的 蛋白质谱变化。该方法适用于分析组织整体水平的全蛋白质组变化。然而，后续实验可在此方案基础上进一步拓展，以聚焦于组织的特定区域。例如，未来的研究可专注于在速冻前分离出的脑部不同解剖区域中的磷酸化蛋白质组变化。本实验室此前已发表方法学论文，展示了小鼠脑组织的显微解剖技术，以获取功能和解剖上不同的脑区13。明确不同脑区中全蛋白质组变化及其翻译后修饰，将有助于更全面地理解疾病机制，并为开发新型或改进的治疗策略提供依据13。
当处理血浆样本时，无需进行上述第一步至第三.......
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作者无任何利益冲突需要披露。
本项目部分得到了国家科学院、工程院和医学院奖学金办公室管理的国家研究委员会研究员项目以及沃尔特·里德陆军研究所橡树岭科学与教育研究所项目的资助。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 660 nm 蛋白质测定试剂盒 | Pierce / Thermo Scientific | 22662 | 用于BCA法测定样品蛋白质浓度，包含Pierce 660 nm蛋白质检测试剂和预稀释蛋白质检测标准品 |
| 乙腈，Optima LC/MS 级 | 赛默飞世尔科技 | 047138.K2 | 用于液相色谱/质谱的超纯乙腈 |
| 铝箔板封膜 | 贝克曼库尔特 | 538619 | 蛋白质检测板开发过程中使用的封板膜 |
| BioTek Synergy Neo2 多功能酶标仪 / 紫外-可见分光光度计 | 安捷伦 | https://www.agilent.com/en/product/microplate-instrumentation/microplate-readers/multimode-microplate-readers/biotek-synergy-neo2-hybrid-multimode-reader-1623195 | 用于在660 nm波长下测定吸光度以确定蛋白质浓度的分光光度计/酶标仪 |
| ChromaCare LC-MS 仪器冲洗液 | 赛默飞世尔科技 | T111101000 | 含有25%乙腈、25%异丙醇、25%甲醇和25%水的溶液，用于样品运行后清洗液相色谱系统 |
| CK28 Precellys 管 | Bertin Corp / Technologies | P000911LYSK0A.0 | 均质化组织被放入这些管中，使用Precellys仪器进行组织裂解和蛋白质提取。这些管子即为本实验方案中提到的本实验室所使用的管子 "匀浆管" |
| 冷冻保存管 | Brooks / Azenta生命科学 | https://www.azenta.com/products/cryopod-carrier | 用于在组织匀浆过程中盛装液氮以冷却研钵的容器 |
| EasyPep Mini MS 样品制备试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | A40006 | 一个试剂盒可处理20个样本，内容物包括用于蛋白质提取的裂解液、添加在提取液中的通用核酸酶，以及步骤1.4和1.5所需的试剂 |
| EASY-Spray C18 LC色谱柱（15 cm长，50 µm 直径，以及 2 µm 粒径 | 赛默飞世尔科技 | ES901 | 用于质谱检测前肽段分离的电喷雾液相色谱柱 |
| FlexMix校准溶液 | Pierce / Thermo Scientific | A39239 | 用于样品运行前校准质谱仪检测器准确性和灵敏度的16种标准分子混合物 |
| 甲酸，LC/MS 级 | 赛默飞世尔科技 | 85178 | 用于将所有液相色谱溶液和样品酸化的超纯甲酸，终浓度为 0.1%（v/v） |
| 蛋白酶抑制剂 &磷酸酶单次使用抑制剂混合物（100倍浓缩液） | 赛默飞世尔科技 | 78442 | 在提取缓冲液中添加，以防止样品中蛋白质和磷酸化蛋白质的降解 |
| 甲醇，Optima LC/MS 级 | 赛默飞世尔科技 | 047192.K2 | 用于液相色谱/质谱的超纯甲醇 |
| 瓷研钵，150 mL | 赛默飞世尔科技 | FB961C | 150 mL 容量，用于匀浆较小的雪貂组织（如脑组织） |
| 瓷研钵，275 mL | 赛默飞世尔科技 | FB961D | 275 mL 容量，用于匀浆较大的雪貂组织（如肝脏） |
| 瓷研钵，50 mL | 赛默飞世尔科技 | FB961A | 50 mL 容量，用于匀浆小鼠组织 |
| 瓷质研钵，50 mL | 赛默飞世尔科技 | FB961K | 适用于50 mL研钵 |
| 瓷制研钵，150 mL | 赛默飞世尔科技 | FB961M | 适用于150 mL研钵 |
| 瓷研钵，275 mL | 赛默飞世尔科技 | FB961N | 适用于 275 mL 研钵 |
| Precellys | Bertin Corp / Technologies | https://www.bertin-technologies.com/product/sample-preparation-homogenizers/precellys-evolution-homogenizer/ | 用于均质化组织样本的仪器。使用以下设置：4500 RPM，每循环 2 次，每次 30 秒，暂停 30 秒。 |
| 蛋白测定试剂 | Pierce / 赛默飞世尔科技 | 22662 | 步骤 3.4 中使用的蛋白质检测试剂–3.8 |
| Proteome Discoverer | 赛默飞世尔科技 | CSW0064764 | 用于蛋白质组学/磷酸化蛋白质组学数据分析的生物信息学软件 |
| SureSTART MSCERT 螺口 LC 进样小瓶（0.02–1.5 mL 容量） | 赛默飞世尔科技 | 6PMCK39TR | 经高性能应用认证的螺口盖（聚四氟乙烯，预切隔垫）玻璃小瓶，用于盛装LC/MS仪器进样样品 |
| Ultimate 3000 UHPLC / Orbitrap Fusion Lumos Tribrid MS（LC/MS）系统 | 赛默飞世尔科技 | LC：已停用 / MS：FETD2-10002，应特殊要求 | 用于分离样品中肽段并根据分子量进行检测的超高效液相色谱/质谱联用仪（LC/MS） |
| 通用核酸酶用于细胞裂解，100kU，400 µL | Pierce / 赛默飞世尔科技 | 88702 | 额外的通用核酸酶已购得 |
| Vacufuge Plus | Eppendorf | https://www.eppendorf.com/us-en/Products/Centrifugation/Concentrator/Vacufuge-plus-p-PF-25748 | 使用真空离心浓缩仪在重组前干燥肽样品。 |
| 水，Optima LC/MS 级 | 赛默飞世尔科技 | 047146.K2 | 用于液相色谱/质谱的超纯水 |
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