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方法文章

阐明健康与疾病状态下组织和血浆特异性蛋白质组学改变

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DOI：

10.3791/67240

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2025年9月23日

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1NRC Fellow, 2Medical Readiness Systems Biology, Walter Reed Army Institute of Research, 3ORISE Fellow, 4The Geneva Foundation, 5AEOP Fellow, 6Culmen International, LLC

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

蛋白质组学是一种高通量评估蛋白质相互作用、功能、组成、结构及其细胞活动的技术。本文介绍了一种用于评估血浆和组织等各类生物样本中全蛋白质组变化的实验方案。本方法适用于所有含有蛋白质的生物样本。

摘要

蛋白质组学是对生物系统中表达的蛋白质进行的大规模研究，重点关注蛋白质的结构、功能、相互作用、丰度以及翻译后修饰。例如，磷酸化蛋白质组学是全蛋白质组学的一个重要分支，专注于研究蛋白质上磷酸化位点的模式及其变化。本文所述方法展示了一种全蛋白质组学策略，用于解析从实验动物模型采集的血浆、脑、肺、脾和肝组织中整体蛋白质表达谱的变化，包括磷酸化模式的改变。 （例如雪貂和小鼠）。该技术适用于其他类型的组织以及几乎任何含有蛋白质的生物样本 （例如培养的细胞）。解剖后，目标组织迅速冷冻并储存在 -80 °C。随后在液氮中使用研钵和研杵对组织进行匀浆，以保持蛋白质完整性及磷酸化状态。使用含有通用核酸酶以及蛋白酶/磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液从组织匀浆中提取总蛋白。利用商用质谱仪样品制备试剂盒，通过受控的蛋白酶消化将组织和相应血浆中提取的蛋白质转化为总肽段。肽段直接采用超高效液相色谱/Orbitrap三合一串联质谱法进行分析。通过蛋白质组学生物信息学软件，将肽段质谱数据与物种特异性的氨基酸序列数据库比对，重建各组分蛋白质的身份。此后，分析应包含严格的截断标准，尤其仅使用高置信度的蛋白质鉴定结果。具有统计学意义的蛋白质组差异（>2倍变化；p < 在对照组和实验组之间可以确定显著性差异（p < 0.05）。

引言

蛋白质组学结合了蛋白质组实验与数据分析，致力于在生理条件下鉴定和定量蛋白质，并基于其组成、相互作用、转录前及转录后修饰（如磷酸化）、亚细胞定位和结构等特征对其进行表征1。表达蛋白质组学关注在不同生物学条件下蛋白质的定量比较2。它在描绘复杂且相互关联的通路、网络和分子系统的图谱方面也具有重要意义，这些系统直接调控细胞增殖、分化、衰老以及细胞死亡机制等主要生物学功能。近年来，随着实验技术的显著进步，蛋白质组学方法已从传统技术——包括免疫组织化学和酶联免疫吸附测定——发展为高通量技术，例如液相色谱3,4。基于蛋白质组学的方法在确定独特疾病表型和亚型，以及发现治疗药物的新靶点相互作用（药物蛋白质组学）方面正日益受到重视。例如，患者分层主要依赖基因组学方法来定义同质性群体并指导治疗方案。然而，仅凭转录状态无法预测翻译后蛋白质的命运（如稳定性或修饰）；因此，非基因组机制在疾病的发生、发展、严重程度以及对治疗的耐药性中起着更重要的作用5,6,7。

在神经退行性疾病和创伤性脑损伤（TBI）领域，蛋白质表达与活性的定量比较已显著推动了生物标志物的发现。生物标志物研究的基础在于开发有助于早期检测及干预靶点的诊断技术。基于液相色谱-串联质谱（LC/MS-MS）的定量蛋白质组学结合生物信息学分析，已成功助力发现若干关键蛋白生物标志物，包括胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和泛素羧基末端水解酶同工酶L1（UCH-L1），这些标志物在重度或穿透性TBI中具有显著影响8,9。例如，军事人员在执行任务期间常因暴露于爆炸冲击（即冲击波-TBI）而遭受TBI。然而，由冲击波引起的轻度TBI所导致的神经功能缺损的潜在病理生物学机制仍不明确。因此，要理解冲击波所致脑损伤的分子与超微结构机制，亟需更准确地识别特异性生物标志物替代指标。通过对蛋白质组变化的观察，研究已揭示冲击波引发的脑内氧化应激可能与线粒体功能障碍相关，具体表现为裂变-融合动态失衡、氧化磷酸化能力下降以及呼吸相关酶活性的代偿性改变10。此外，关于冲击波引起翻译后修饰失调（如乙酰化、亚硝基化、脱氨基化和磷酸化）早期发病机制的深入认识，也有助于进一步阐明其对轴突损伤、炎症反应及血脑屏障破坏等相关蛋白功能的影响11,12。随着系统生物学方法的进步，绘制不同动物物种（包括啮齿类和雪貂）脑组织及外周组织的全蛋白质组图谱，已成为冲击伤研究中的关键步骤。

本文重点介绍从组织或血浆样本出发，对表达蛋白质组及其翻译后修饰进行定量分析的方法学流程，该方法已广泛用于监测生理现象和病理状态。采用以下方法可确保样本制备和数据采集的一致性与可靠性。通过这一标准化方法，可比较不同组织类型间保守的蛋白质组表达模式，以及特定组织独有的磷酸化模式。此外，还可对多种临床前动物模型和人类临床样本进行分析，以鉴定保守的磷酸化模式，这些模式有望作为生物标志物，并用于优化药物治疗方案。

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方案

研究在获得IACUC批准的动物使用方案下进行，实验设施已通过国际实验动物评估和认可委员会（AAALAC International）认证，并持有公共卫生服务部动物福利保证，同时遵守《动物福利法》及其他与实验动物相关的联邦法规和规定。本实验所需的所有试剂和材料均列于材料表中。该实验步骤分为七个部分。

警告：使用液氮均质化组织时，务必遵守适当的安全操作规程。实验室人员在均质化冷冻组织期间佩戴了冷冻手套、冷冻围裙、外科口罩和面罩。该均质化技术适用于任何类型的组织，包括骨骼等极为坚韧的物质，只需相应调整研钵和研杵的尺寸即可。有关初始工作台设置，请参见图1A。均质化小鼠和雪貂组织时所用的尺寸信息，请参阅材料表。

1. 使用研钵和研杵进行组织的低温研磨

  1. 称取一个空收集管的重量并记录。将组织放入该收集管中，使用分析天平称量组织重量，并在实验记录本中记录数值。用组织加管的总重量减去空管重量，得到所用组织的毫克数。
    注意：用于蛋白质组学研究的组织包括脑、肺、肝和脾。整个组织使用预冷的研钵和研杵在液氮中冷冻研磨成粉末状。
  2. 将液氮倒入冷冻研磨罐中，但确保液氮量不超过容器的一半。
  3. 将含有样品的管子以及预先灭菌的空的1.5 mL微量离心管转移至位于冷冻研磨罐内的管架上。此步骤可确保样品在冷却研钵和研杵的过程中保持冻结状态，防止在将匀浆组织转移至空的1.5 mL微量离心管时样品解冻。
  4. 将液氮倒在研钵和研杵上，以在使用前对其进行冷却。研钵和研杵置于冷冻研磨罐外（图1A，B）。
  5. 将组织转移至含有液氮的已冷却研钵中（图1B）。
  6. 用研杵反复施加压力，并在组织上做旋转研磨动作，直至组织被研磨成细粉（图1C）。
    1. 确保不要施加过大的力量，以免样品从研钵中溅出。操作时应牢固控制研杵。
    2. 在研磨较大组织时，可向研钵中补充液氮，以降低样品在研磨过程中解冻的风险。
    3. 研磨过程中应检查组织是否开始解冻。若发现解冻迹象，应立即向研钵中添加更多液氮。
  7. 将金属刮勺的末端浸入液氮中进行冷却。这有助于将匀浆后的组织顺利转移至1.5 mL离心管中，防止组织在转移过程中解冻或粘附在刮勺上。
  8. 当组织已被研磨成细粉且金属刮勺已冷却后，小心地将匀浆组织粉末转移至新的1.5 mL离心管中。
    1. 根据后续需进行的检测项目数量，将样品分装成若干等份。
      注意：例如，本研究中每个样本需进行四项检测，因此将匀浆组织均等地分装至四个1.5 mL离心管中。
    2. 将多余的匀浆组织储存于已灭菌的5 mL带盖收集管中。
  9. 将分装好的组织样品保存于-80 °C超低温冰箱中，建议在1年内使用，以尽量减少蛋白质因暴露于空气和光照而发生的氧化。
  10. 称量空收集管的重量。
  11. 从初始测量值（收集管加样品）中减去空管重量，以获得组织样品的净重。

2. 蛋白质分离的组织裂解

  1. 将干冰舀入冰盘容器中。
  2. 将试管架放入干冰中，使其冷却。
  3. 从 -80 °C 冰箱中取出匀浆组织样本，并放入已冷却的试管架中。此步骤可防止样本解冻，避免在称重过程中发生蛋白质降解和/或磷酸化状态改变。
    1. 确保含有样本的 1.5 mL 管始终保持在干冰中的试管架上并处于冷冻状态。
  4. 将一个新的 50 mL 标准管放入干冰中。
  5. 取下 50 mL 标准管的管盖，并将一次性塑料刮勺放入该管中以保持低温。这可以防止样本在转移至匀浆管时粘附在刮勺上。
  6. 用于组织裂解和蛋白质分离时，使用含有五个 2.8 mm 陶瓷珠的 2 mL 管（本方案中称为匀浆管）。
  7. 使用永久性记号笔在匀浆管的管盖和管壁上标记样本编号。
  8. 将已标记的匀浆管放入干冰中的试管架内，以保持低温并防止样本解冻。
  9. 将一根匀浆管放在分析天平上，并对天平进行去皮归零。
  10. 将匀浆管放回干冰中的试管架。
  11. 打开含有陶瓷珠的匀浆管管盖，使用一支已冷却的塑料刮勺，将 5 mg 至 10 mg 的粉末状组织样本转移至对应的匀浆管中。
  12. 将管盖重新盖回匀浆管上。
  13. 将匀浆管放回分析天平上称重，并记录管内样本的重量。
    1. 利用该重量确定有效提取总蛋白所需的裂解缓冲液体积。
  14. 记录重量后，将含有样本的匀浆管放回干冰中的试管架，保持低温。
  15. 丢弃使用过的塑料刮勺。
  16. 每个样本转移和称重时均应使用新的洁净塑料刮勺，以防止交叉污染。对所有样本重复步骤 2.9 至 2.15。
  17. 在将所有样本转移至各自的匀浆管后，计算所需蛋白裂解主混合液的总量。
    1. 根据需要处理的样本数量及每个粉末样本的重量，计算所需蛋白裂解主混合液的总体积。每 5 mg 组织样本向每管中加入 100 µL 蛋白裂解主混合液。
    2. 参考厂家指南中的试剂用量配制蛋白裂解主混合液（参见 材料表）。
  18. 将含有匀浆后粉末样本的匀浆管放入 4 °C 预冷金属块中。此时匀浆管不能再置于干冰上，以免裂解液冻结。
  19. 打开匀浆管管盖，使用合适量程的移液器将计算好的蛋白裂解主混合液加入对应的匀浆管中。
    1. 重新盖上匀浆管管盖，并旋转直至拧紧。
  20. 将样本管放入匀浆仪中，在 4 °C 条件下设置为软组织程序（转速 4500 RPM，每次循环 2 × 30 秒，暂停 30 秒），进行匀浆处理。
  21. 匀浆循环完成后，从仪器中取出试管，并放回 4 °C 预冷金属块中。
    1. 目视检查样本管，确保无可见粉末残留。若在蛋白裂解主混合液中仍可见未完全裂解的样本，需再次在仪器上进行组织裂解。
    2. 根据所用组织类型优化仪器参数。例如，来源于纤维性器官（如心脏）的粉末组织可能需要增加循环次数或提高转速。
  22. 将匀浆管转移至离心机中，设置离心条件为：16,000 g，4 °C 离心 10 分钟，然后按下离心机上的 启动 按钮。
  23. 离心完成后，小心地将匀浆管重新放回 4 °C 预冷金属块中。
  24. 在新 1.5 mL 管的管盖和管壁上标记样本编号及其他相关信息。标记完成后，将这些 1.5 mL 管放入 4 °C 预冷金属块中。
    注意：试管至少应标注以下信息：动物编号、研究时间点、动物类型和组织类型。
  25. 将匀浆管中对应的蛋白裂解液转移至放置在 4 °C 预冷金属块中的已标记 1.5 mL 管中。
  26. 将样本储存于 -80 °C 冰箱中以备后续分析。此为安全的暂停点。

3. 总蛋白定量

  1. 从 -80 °C 冰箱中取出样品，并在冰桶中的湿冰上解冻。
  2. 解冻后，对蛋白定量试剂盒中的所有样品和标准品进行涡旋振荡，时间不少于 3 秒。
  3. 根据示意图布局（图 2A），将每份标准品、样品及适当空白样的 10 µL 重复样加入 96 孔微孔板中。
    注意：对于每个组织样品，在蛋白测定分析中，建议将蛋白裂解液以 1:100 的比例稀释至磷酸盐缓冲液中。示意图布局可根据蛋白测定中使用的样品数量进行调整。为评估蛋白浓度的准确性，样品、标准品和适当的空白样需在 96 孔板中设置三个重复；但如果样品较多需共用一块板，设置两个重复亦可。
    1. 对于起始组织量较少的样品（即少于 5 mg），在蛋白测定中仅使用单个重复或两个重复，以最大化保留可用于后续蛋白消化的蛋白裂解液量。
    2. 确保使用经过校准的移液器并准确操作。
  4. 反复倒置蛋白测定试剂瓶数次以充分混匀，然后将其倒入 10 mL 试剂储液槽中。
  5. 使用最大容量为 200 µL 的多通道移液器，向第 1 列各孔中加入 150 µL 蛋白测定试剂。
  6. 上下吹打数次，使蛋白测定试剂与孔中已有的 10 µL 内容物充分混合，以减少孔内沉淀的形成。
  7. 丢弃移液器吸头，并为最大容量 200 µL 的多通道移液器装上新的吸头。
  8. 重复步骤 3.5–3.7，直至所有 96 孔板的各孔均加入蛋白测定试剂。
    1. 每处理一列孔均需使用新的移液器吸头，以防止交叉污染。
    2. 确保至少留出一个孔不加任何试剂或样品，作为空白对照用于蛋白定量的吸光度测定。
  9. 在所有必要孔中加入蛋白测定试剂后，用铝箔封板膜覆盖 96 孔板。
  10. 将 96 孔板置于涡旋振荡仪上，以中等速度振荡 1 分钟，随后在室温（RT）下孵育 5 分钟，再进行读板。
  11. 检查 96 孔板及铝箔封板膜。若试剂仍粘附在铝箔封膜上，将其放入离心机中，并配以适当平衡。
    1. 按住快速离心按钮，直至离心力达到约 200 g。
    2. 取出 96 孔板，目视检查铝箔封膜，确保无液体残留在箔膜上。
  12. 缓慢移除铝箔封板膜，并将透明盖重新盖回 96 孔板上（图 2B）。
  13. 在比色反应显色 5 分钟后，于分光光度计上在 660 nm 波长处读取 96 孔板。
    注意：使用紫外/可见光分光光度计测定时，吸光度读数在室温下进行。660 nm 蛋白测定基于专有染料-金属复合物在酸性条件下与蛋白结合，导致染料最大吸收峰发生偏移，该偏移在 660 nm 处测定。
  14. 利用已知标准品的吸光度读数，使用绘图软件绘制标准曲线（图 2C–E），并据此计算所有样品的蛋白浓度。

4. 蛋白质消化

警告：使用本方案中涉及的危险化学品时，务必遵守适当的安全操作规程。实验室人员佩戴了个人防护装备（PPE），并在化学通风橱中完成这些步骤。在使用这些化学品前，请查阅所有安全数据表。

  1. 使用永久性墨水在新的 1.5 mL 微量离心管的管盖和管壁上标记样品编号。包括任何其他相关信息。
    1. 根据标准曲线方程、样品吸光度读数和稀释倍数，计算每个样品的蛋白质浓度（单位为微克每微升，µg/µL）。利用该数值计算含有 100 µg 蛋白质的样品裂解液体积（图 2C-E）。将计算所得体积的样品裂解液转移至 1.5 mL 微量离心管中。
  2. 用裂解缓冲液补足终体积至 100 µL；此为消化步骤所需的起始体积。
    注意：蛋白质样品与裂解缓冲液的总体积应为 100 µL。
  3. 根据已发表的文献，使用 1.5 µL 血浆进行消化，其蛋白质含量约为 100 µg。
  4. 向每个 1.5 mL 微量离心管中加入 50 µL 还原溶液（10 mM 二硫苏糖醇），盖紧管盖，短暂涡旋 3 秒。然后向每个样品中加入 50 µL 烷基化溶液（30 mM 碘乙酰胺），盖紧管盖，涡旋 3 秒。
  5. 将样品置于 95 °C 的金属浴中孵育 11 分钟，分别实现蛋白质样品的还原和烷基化。此步骤可断裂所有二硫键，并以乙酰胺基团进行封闭，防止其重新形成，从而使蛋白质完全变性并充分展开，最大限度地暴露肽段消化位点。
  6. 孵育结束后，从金属浴中取出样品，使其冷却至室温。
  7. 在等待样品冷却期间，用酶复溶液将冻干的胰蛋白酶/赖氨酰内肽酶混合物（1:1 比例，各 50 µg）复溶，即向 1 支固体试剂瓶中加入 515 µL 液体，得到每种酶浓度为 0.1 µg/µL 的溶液。避免皮肤直接接触蛋白酶溶液及后续所有操作，因为胰蛋白酶可能引起严重刺激和过敏反应。
  8. 待样品冷却至室温后，向已还原和烷基化的蛋白质样品溶液中加入 50 µL 复溶后的胰蛋白酶/赖氨酰内肽酶混合物（每种酶 2.5 µg），短暂涡旋。
  9. 将样品置于恒温混匀仪中，37 °C、1000 rpm 条件下孵育 3 小时，以完成蛋白质样品的消化。
    注意：添加赖氨酰内肽酶有助于切割因蛋白质折叠或氨基酸序列（如 Lys-Pro 键）而难以被胰蛋白酶消化的位点。这不仅可将每种蛋白质切割成多个大小适中、总电荷明确的小肽段，而且若严格遵循相同的消化条件，结果具有高度可重复性。3 小时的孵育时间是我们推荐的确保所有蛋白质完全切割的最短时间。
  10. 3 小时孵育结束后，使用镊子从恒温混匀仪中取出样品，避免手指烫伤。
  11. 向样品中加入 50 µL 消化终止液（6% 三氟乙酸或甲酸水溶液），短暂涡旋。
    注意：由于这两种蛋白酶在中性 pH 7–8 时活性最高，加入酸性终止液可抑制酶活性，从而终止反应。
  12. 将样品储存于 -80 °C 超低温冰箱中，这也能进一步抑制任何残留的蛋白酶活性。此步骤为安全的暂停点。

5. 肽段纯化、干燥与重悬

注意：该步骤主要用于去除消化试剂，特别是非挥发性盐类，因为这些物质容易损坏液相色谱-串联质谱（LC/MS-MS）仪器，同时也有助于分离和浓缩生成的肽段。肽段纯化使用试剂盒提供的脱盐离心柱完成，该柱预装有尺寸排阻（凝胶过滤）树脂，可首先捕获肽段，随后使盐类等小分子被洗脱去除。所有试剂盒试剂的转移操作均需在化学通风橱中进行，因其含有有毒有机溶剂。

警告：使用以下方案中的危险化学品时，必须遵守适当的安全操作规程，包括佩戴个人防护装备（PPE）并遵守危险废物处理规定。所有步骤均须在化学通风橱中进行，并在使用这些化学品前查阅全部安全数据表。

  1. 从 -80 °C 冰箱中取出样品，并让其升至室温。
  2. 取下肽纯化柱底部的白色盖帽，松开绿色顶部盖帽，并将其放入一个 2 mL 收集管中。
  3. 将这些放入离心机中，关闭盖子，按下启动按钮，在 3000 g 条件下离心 2 分钟，以去除所有出厂前的预装柱保存液。
  4. 将穿流液弃入有害废物容器中，并将肽纯化柱转移至一个新的 2 mL 收集管中。
  5. 使用永久性记号笔在肽纯化柱的绿色盖子上标记样品编号。
  6. 使用 200 µL 移液器（例如分两次，每次 150 µL）将体积约为 300 µL 的蛋白质消化产物轻柔地转移至干燥的肽纯化柱中。
    1. 确保离心柱树脂顶部无气泡。若观察到气泡，请通过轻敲柱体或使用洁净的 10 µL 移液器吸头将气泡分散。
      注意：滞留的气泡会阻碍样品顺利进入树脂，从而对肽纯化的效率和得率产生负面影响。
  7. 将这些放入离心机中，关闭盖子，按下 启动 按钮，在 1,500 g 条件下离心 2 分钟。
  8. 将穿流液弃入有害废物容器中，并将肽纯化柱转移至一个新的 2 mL 收集管中。
  9. 再次使用 200 µL 移液器，将 300 µL 洗涤液 A（水，0.1% 三氟乙酸 / TFA）加至柱树脂顶部。
    1. 确保离心柱树脂顶部无气泡。若观察到气泡，请通过轻敲柱体或使用洁净的 10 µL 移液器吸头将气泡分散。
  10. 将这些放入离心机中，关闭盖子，按下 启动 按钮，在 1,500 g 条件下离心 2 分钟。
  11. 将穿流液弃入有害废物容器中，并将肽纯化柱转移至一个新的 2 mL 收集管中。
  12. 再次使用 200 µL 移液器，将 300 µL 洗涤液 B（5% 甲醇，0.1% TFA）加至柱树脂顶部。
    1. 确保离心柱树脂顶部无气泡。若观察到气泡，请通过轻敲柱体或使用洁净的 10 µL 移液器吸头将气泡分散。
  13. 将这些放入离心机中，关闭盖子，按下 启动 按钮，在 1,500 g 条件下离心 2 分钟。
  14. 将穿流液弃入有害废物容器中，并将肽纯化柱转移至一个新的 2 mL 收集管中。
  15. 重复步骤 5.12–5.14 一次，使柱子用洗涤液 B 洗涤两次。
  16. 将肽纯化柱转移至一个新的 2 mL 微量离心管中。
    1. 确保本步骤中使用的 2 mL 微量离心管为试剂盒提供的低蛋白吸附收集管。
    2. 为节约低蛋白吸附收集管的使用量，前几步洗涤可使用常规实验室离心管。
  17. 再次使用 200 µL 移液器，将 300 µL 洗脱液（50% 乙腈，0.1% TFA）加至柱树脂顶部。
    1. 确保离心柱树脂顶部无气泡。若观察到气泡，请通过轻敲柱体或使用洁净的 10 µL 移液器吸头将气泡分散。
  18. 将这些放入离心机中，关闭盖子，按下 启动 按钮，在 1,500 g 条件下离心 3 分钟，以在新的低蛋白吸附 2 mL 收集管中收集纯化的肽样品。
    1. 如有需要，可使用 200 µL 移液器将约 125 µL（约一半体积）洗脱后的纯化肽溶液转移至 1 mL 玻璃小瓶中，并于 -80 °C 保存。
      注意：此分装样品可用于后续分析，例如使用市售试剂盒对肽段进行串联质谱标签（TMT）标记，以实现样品间更精确的定量，尤其适用于独立制备的样品组。
  19. 将剩余样品（约 175 µL）在低蛋白吸附 2 mL 管中于 -30 °C 保存，直至准备进行干燥和重悬。此为安全的暂停点。
  20. 为干燥样品，将肽样品从 -30 °C 解冻至室温。若在肽纯化后立即进行干燥和重悬，则跳过此步骤。
  21. 打开 2 mL 微量离心管，将其放入真空离心浓缩仪中。
    1. 若同时处理的样品数量为奇数，务必对真空离心浓缩仪进行平衡。
    2. 关闭真空离心浓缩仪盖子，按下 启动 按钮。
    3. 在不加热的条件下，让样品在真空离心浓缩仪中运行 3 小时。
    4. 定期检查离心管，确保管内无残留液体，因为残留液体会干扰肽段在 LC/MS-MS 仪器分离柱上的结合。
    5. 若仍观察到液体，继续离心更长时间。
    6. 每间隔 30 分钟至 1 小时检查一次管内是否仍有液体。
      注意：在此过程中，肽段在真空条件下非常稳定，不会因短暂干燥或真空离心浓缩仪运行产生的适度热量而降解。
  22. 干燥完成后，立即用 50 µL 质谱级水中的 0.1% 甲酸溶液（例如，将 5 µL 100% 甲酸加入 5 mL 水中）重悬样品。
    1. 使用 200 µL 移液器将 50 µL 0.1% 甲酸溶液加入含有干燥肽样品的 2 mL 低蛋白吸附管底部。
  23. 盖紧管盖，涡旋振荡 15 秒。
  24. 使用 200 µL 移液器将重悬后的样品转移至相应的 1 mL 玻璃小瓶中。
  25. 将含有重悬样品的玻璃小瓶于 -30 °C 保存，并尽快采用基于 LC-MS/MS 的方法进行分析。
    注意：冷冻的肽样品在 -30 °C 下可短期稳定保存，在 -80 °C 下可长期稳定保存。

6. 在超高效液相色谱-串联质谱仪上采集肽样品数据

警告：使用超高效液相色谱/Orbitrap三合一串联质谱系统时，必须遵守适当的安全规程。实验室人员穿戴了个人防护装备（PPE），并接受了液相色谱-质谱联用仪制造商提供的正式、实操性仪器培训。主要注意事项包括正确处理超高效液相色谱所用的酸性和有机溶剂流动相，以及质谱电离源的高电压操作。

  1. 使用超高效液相色谱（UHPLC）系统进行肽段分离。色谱柱为可兼容电喷雾的C18反相快速分离（RSLC）设计，规格为2 µm、100 Å、50 µm × 15 cm，安装在由相同材料制成的保护预柱之后。
  2. 使用以下UHPLC流动相：含0.1%甲酸的水溶液（溶剂A）、含0.1%甲酸的乙腈溶液（溶剂B），以及含0.1%甲酸的90%水和10%甲醇混合溶液（溶剂C）。
    注意：所有用于配制流动相的溶剂及甲酸均为经认证的LC/MS级试剂，仅按需配制。UHPLC系统在泵前配有过滤和脱气装置，因此流动相无需手动过滤或脱气处理。
  3. 设定血浆和组织样品总肽段的程序化进样量为3 µL起始，相当于根据起始蛋白用量测定的约3 µg肽段物质。
    注意：此进样量应能产生理想的质谱信号强度，以实现最大数量的蛋白质鉴定。若信号过载，可将进样量减少至1 µL；若需进一步增强信号输出，可增加至最高15 µL。
  4. 将色谱柱和自动进样器分别维持在40 °C和10 °C。
  5. 使用UHPLC纳流泵，以恒定流速0.3 µL/min进行蛋白质组学数据采集，并采用水（A）与乙腈（B）流动相的线性梯度分离。
  6. 使用水-甲醇流动相（C）清洗进样针和样品环（容量20 µL），UHPLC加载泵初始流速设为5 µL/min。
  7. 在总共80分钟的样品分离过程中，设定液相色谱梯度（线性曲线）如下：初始—5% B；0–60分钟—32% B；60–61分钟—95% B；61–65分钟—95% B；65–66分钟—2% B；66–80分钟—2% B。同时，加载泵保持100% A流动相，但流速线性调整如下：初始—5 µL/min；0–5分钟—1 µL/min；5–61分钟—5 µL/min；61–80分钟—5 µL/min（图3A）。
  8. 将未知肽段样品以连续重复进样的方式运行。
  9. 为防止交叉污染，在样品之间使用截短的液相色谱梯度（线性曲线），在水中含0.1%甲酸的空白溶液中至少连续进行两次空白进样，总时长35分钟，梯度设置如下：初始—5% B；0–23分钟—32% B；23–24分钟—95% B；24–30分钟—95% B；30–31分钟—2% B；31–35分钟—2% B（图3B）。
    1. 确保加载泵的液相色谱梯度设置保持不变。
    2. 对于内源性污染物含量较高的肽段样品（如肝脏样品中的胆汁酸），每3至5个样品以及运行结束时增加一次额外空白清洗，以帮助清除液相色谱柱中的残留物。该步骤包括注入1至2 µL含有25%乙腈、25%异丙醇、25%甲醇和25%水的混合溶液。
    3. 或者，结合上述步骤，采用增强型百分比变化液相色谱梯度（即“锯齿式”梯度）进行系统冲洗，总时长35分钟，设置如下：初始—2% B；0–3分钟—2% B；3–4分钟—95% B；4–10分钟—95% B；10–11分钟—2% B；11–15分钟—2% B；15–16分钟—95% B；16–20分钟—95% B；20–21分钟—2% B；21–25分钟—2% B；25–26分钟—95% B；26–30分钟—95% B；30–31分钟—2% B；31–35分钟—2% B（图3C）。
  10. 使用Orbitrap与离子阱组合的串联四极杆质谱仪（MS-MS）系统，对经液相色谱柱分离并洗脱出的肽段（即相应的分子质量）进行检测。
    1. 在开始样品运行前，将液相色谱柱直接插入质谱仪左上前方可更换的纳米喷雾电离（NSI）源接口。
      注意：此举可暴露液相色谱柱内置的电喷雾针头，使肽段以带电微滴形式悬浮于流动相溶剂中，并进入检测器离子传输管的入口。
    2. 此外，为提高电喷雾挥发效率，开启NSI源内置加热单元，并将其设定为40 °C。
  11. 在样品运行前，还需检查质谱仪是否有稳定充足的压缩氮气和氦气外部输入。使用超高纯度等级、300规格的钢瓶分别储存两种气体，并将减压阀压力分别设定为静态流速60 psi和40 psi。
  12. 若质谱仪提示氮气输入不稳定，则可将压力上调至最高100 psi。确保气瓶剩余容量至少为10–20%，即阀门压力表读数约为250–500 psi；若低于此范围，应及时更换新气瓶。当气瓶容量低于10%时，存在将底部杂质吸入质谱仪的风险。
  13. 使用控制软件提供的模板预先设置质谱方法，该模板专为肽段及其翻译后修饰的最优检测而设计（图3D–H），并输入以下标准条件：
    1. 将总检测时间设为80分钟。
    2. 将通用检测模式设为肽段。
    3. 将NSI源设为正离子模式（即肽段离子的电荷状态）。
    4. 将纳米喷雾针电压设为2000 V，并保持为静态。
    5. 将氮气输入设为NSI源和检测器的静态模式。
    6. 将离子传输管温度设为275 °C。
    7. 通过设定扫描范围为350–2000 m/z，RF透镜为30%，最大注入时间为自动，以及Orbitrap质量分析器分辨率为120,000，来检测完整肽段（即母离子；MS1）的质量。
      注意：此处不使用仪器的替代离子阱功能来筛选肽段质量，因其对该类分子的监测灵敏度低于Orbitrap。
    8. 设定离子过滤器以区分电荷态在2–7范围内的多电荷肽段。这使得仪器在记录数据时，能自动将检测到的质荷比（m/z）转换为精确质量。同样，单电荷态肽段（m/z = 1）无需任何换算即可获得其精确质量。
    9. 设定离子的动态排斥门限为60秒持续时间、1次通过、±10 ppm质量容差，并排除含有天然同位素原子（如14C）的分子。
    10. 通过将仪器设为数据依赖采集（DDA模式），检测用于肽段身份确认的碎片离子质量（即子离子；MS2）。
    11. 通过四极杆隔离捕获完整肽段（即母离子），质量容差窗口设为m/z = 1.6。
    12. 通过设定电子轰击模式为HCD（即使用氮气和氦气作为电子转移介质的高能碰撞解离），碰撞能量为30%，扫描范围为自动，最大注入时间为自动，以及Orbitrap质量分析器分辨率为30,000，对捕获的肽段进行碎裂。
    13. 通过将信号峰形设为质心模式，采集最终数据（MS1和MS2离子）。
  14. 为确保检测到的肽段质量测定准确，需定期校准仪器，通常在每批样品运行前进行，具体步骤如下：
    1. 通过控制软件将质谱仪置于离子源断电状态，并将NSI源更换为设备的另一种内置加热电喷雾电离（HESI）源。该源适用于需要大体积进样和高流速（1–2500 µL/min）的液相泵应用，例如代谢组学和药物药代动力学实验。
    2. 在控制软件中选择完整校准检查选项。
    3. 用市售的质谱标准溶液填充一支500 µL玻璃注射器（带聚四氟乙烯涂层活塞和不锈钢钝头针），然后将PTFE毛细管连接至HESI源（断电状态下）。
      注意：此处使用的标准品包含天然与合成分子的混合物（共16种，如咖啡因），质量范围覆盖m/z = 50–2800，涵盖多种可能的化学键类型，尤其是与肽段相关的键型（如酰胺基团）。
    4. 使用注射泵以3–5 µL/min的流速，向HESI源（通电后）持续注入质谱标准品。当控制软件实时视图窗口中观察到稳定的标品峰型后，启动自动校准检查。
      注意：若标品的质量测定灵敏度和准确性无异常，一次成功的完整校准通常耗时<40分钟。只有当仪器通过所有硬件参数检测后，才被视为可靠，可用于样品分析。
    5. 通过重新安装NSI源和液相色谱柱，并运行人源[Glu 1]-纤维蛋白肽B（Glu-Fib）标准溶液（总进样量为1–10 ng，例如1、2、6和10 ng），验证校准成功。使用与未知样品相同的液相分离和质谱检测方法。
    6. 检查Glu-Fib标准品的液相保留时间是否合适（约20分钟）、是否存在MS1和MS2离子（m/z = 1285.54、813.39、785.84、445.12、333.19和175.12），以及峰面积随进样量增加是否呈线性关系。
    7. 随后，使用控制软件和数据采集软件生成样品运行序列表格，包含未知肽段和空白样品的信息列，如样品类型、文件名、样品编号、数据路径、液相/质谱仪器方法、进样瓶位置和进样体积（图3D–E）。
    8. 将生成的质谱数据文件（扩展名：RAW；每个500–800 GB）保存至仪器计算机硬盘的指定路径文件夹中，然后转移至具备足够计算能力的工作站计算机，以便后续使用生物信息学软件处理这些庞大且复杂的肽段质谱数据（即MS1和MS2信号），将其转化为相应的总蛋白质组成谱图。

7. 将原始质谱数据转换为代表性的全蛋白质组结果

注意：使用生物信息学软件将肽样品获得的原始质谱数据处理为总蛋白质组成谱（蛋白质组）。简而言之，生物信息学软件通过将原始质谱数据与基于网络的物种特异性蛋白质组参考文库中已知的肽段MS1和MS2谱图进行匹配，并覆盖蛋白质氨基酸序列的广泛且独特的区域，从而重建样品中的原始蛋白质。程序通过已匹配的独特肽段的MS1信号强度来确定每种已鉴定蛋白质的相对丰度。所确定的丰度可在样品间进行可靠比较，但前提是这些样品必须在同一制备批次中处理，并使用相同的液相色谱（LC）和质谱（MS）参数。否则，必须采用前述基于内标/报告离子回收率的绝对定量技术，例如对每个样品中的肽段进行选择性TMT标记。

  1. 从网络数据库下载蛋白质组参考文件至工作站计算机的硬盘。
    1. 通过在 Uniprot 网站上查找目标样本物种（例如，雪貂 / Mustela furo）。这称为FASTA文件。使用 蛋白质组 搜索工具和 表格 查看以定位并下载蛋白质组参考文件。
    2. 为最大限度地增加可获得的蛋白质鉴定数量，在创建FASTA文件时应同时选择UniProt数据库中经专家审阅的（Swiss-Prot）和未经审阅的（TrEMBL）条目。同样，应选择包含所有经审阅的蛋白质异构体的选项。
  2. 打开生物信息学软件，即 Proteome Discoverer，至 起始页 标签，然后选择 管理 表。
  3. 前往 维护 FASTA 文件 子标签，然后将为您的实验生成的上述物种特异性FASTA文件下载到程序中。
  4. 返回到 起始页 标签，然后单击 新研究/分析，在对话框中输入研究名称 研究名称 字段中选择一个文件夹以保存该研究 研究根目录 领域
  5. 留下 处理流程 和 共识工作流程 字段暂留空，稍后将进行选择。
  6. 点击 好的 保存并退出对话框，随后将弹出 研究定义 页
  7. 前往 研究定义 标签页并输入项目的详细信息 研究描述 位于左中部的盒子。
  8. 前往 输入文件 标签并点击 添加文件.
    1. 这将弹出一个对话框，可在其中选择并下载计算机硬盘中需要处理为总蛋白质组成谱（蛋白质组）结果的原始数据文件。
  9. 点击现在列在下方的原始质谱数据文件 输入文件 标签，可单独或一次性全部选择并高亮。
  10. 将它们拖动并放入 用于分析的文件 部分 分析 位于中右侧的盒子，作为其中一部分 处理步骤 子盒
  11. 前往 工作流程 标签，然后单击 编辑，即 位于旁边 处理步骤 标题部分 分析 位于中右方的盒子
  12. 点击 开放共享 以及来自 ProcessingWF_Tribrid 文件夹中，选择专用于磷酸化蛋白亚型鉴定的处理工作流程文件，该文件基于 HCD 碎裂模式的质谱检测获得（图 4A).
    注意：随后将出现一个包含可编辑节点的处理步骤示意图 工作流程树 盒子中将出现两个节点，如下所述，这些节点标有感叹号，表示需要用户输入特定于实验的信息。
  13. 在处理工作流程树状图中，单击并打开 光谱文件 RC 节点
    1. 在 光谱文件RC的参数 类别，，在下方查找并选择 蛋白质数据库 参数为 FASTA 文件，该文件先前通过 Uniprot 网站生成，用于物种特异性的肽段质谱参考数据库，以搜索并鉴定实验关注的蛋白质。
  14. 点击并打开 Sequest HT 节点并进行以下三项更改：
    1. 在……之下 蛋白质数据库 参数，选择与上述相同的FASTA文件。
    2. 在……之下 酶名称 参数，选择 胰蛋白酶（完整） 或者，作为替代方案 Lys-C，这是制备原始肽段消化物所使用的主要和备用蛋白酶。
    3. 在……之下 动态修饰 参数，请确保至少 磷酸化 / +79.966 Da（S, T, Y） 已选定。
      1. 使用后一种设置，通过查找相应质谱中磷酸基团（m/z = 79.97）的丢失峰，来鉴定与经翻译后磷酸化修饰的蛋白质相关的肽段。
      2. 通过其MS2碎片模式的预期变化来确定被磷酸化占据的氨基酸位点（即丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸）。
      3. 以相同方式将其他常规关注的蛋白质翻译后修饰添加到 Sequest HT 此时可分析该位点的修饰类型，例如甲基化、乙酰化、豆蔻酰化，前提是相关基团的精确质量损失已知。同样，可将磷酸化位点的搜索范围扩展至其他报道较少的氨基酸，例如组氨酸。
        注意： 光谱文件 RC 和 Sequest HT 工作流程树中用于处理步骤的节点是唯一需要调整参数的两个节点。
    4. 其余设置保持默认，因为这些参数已由制造商优化，以获得最高认定数量的目标蛋白质鉴定结果。同样，此原则适用于工作流程树中的所有其他节点。
    5. 确保 Percolator 和 IMP-ptmRS 工作流树的末尾包含了节点。
      注意：Percolator 采用迭代拟合方法，可显著优化最终结果。IMP-ptmRS 对于准确报告所有蛋白质翻译后修饰（包括磷酸化）的鉴定及修饰位点定位至关重要。
  15. 返回到 工作流程 标签，然后点击其旁边的“编辑” 共识步骤 标题部分 分析 位于右上角的框。这将显示共识步骤的工作流程树状图。
  16. 点击 开放通用 以及来自 ConsensusWF 文件夹中选择将生成目标输出格式的共识工作流程文件，以获得蛋白质组成谱（蛋白质组）结果（图4B).
    注意：包含可编辑节点的共识步骤图将在 工作流程树 盒。用于处理数据的示意图是通过修改基本共识工作流程生成的，其中内联 特征图谱绘制器 和 前体离子定量器 节点作为初始分支被添加 MSF 文件 节点，以促进蛋白质相对丰度的量化。尽管工作流程中的所有节点均已包含制造商预设的优化参数，但仍有一些节点包含极为重要的设置项，需仔细核对以确保正确选择，具体如下所述。
  17. 在工作流程树状图中，单击并打开 前体离子定量器 节点。这是用于量化每种已鉴定蛋白质相对丰度的关键节点。
    1. 在……之下 常规定量设置 在类别中查找并选择 可用的肽段 参数 独特 + 剃刀 选项
      注意：唯一性肽段是指包含仅存在于单一蛋白质中的氨基酸序列的肽段，因此可根据质谱信号强度特异性地确定该蛋白质的含量；而 razor 肽段是指在一组蛋白质之间共享的肽段，因此用于整合计算所得的相对丰度，使其保持一致。
    2. 在……之下 归一化与缩放 类别更改两者 归一化模式 和 缩放模式 参数到 无 选项，因为这种调整方式在整个蛋白质组中的可靠应用范围过于受限。
      注意：这些设置仅在需要将所选目标蛋白的计算相对丰度相对于细胞内稳定存在的蛋白（例如看家基因）进行归一化，并将所得结果表示为缩放比例时才会激活。
    3. 接下来，单击并打开 多肽与蛋白质过滤器 节点及下方 多肽过滤器 类别变更 肽段置信度至少 和 保留较低置信度的肽谱匹配（PSM） 参数到 高 和 错误 选项分别将用于蛋白质鉴定的肽段匹配设定为最高拟合显著性水平（即 ≥ 95%）。
      注意：或者，可将第一个参数设置为 培养基 放宽肽段匹配的严格性，从而大幅增加蛋白质鉴定数量；但这反过来会极大增加产生大量错误鉴定的风险。同样，绝不应出现以下情况： "低" 该值可作为两个参数的可接受选项。
    4. 这些是共识步骤中唯一需要调整参数的节点，其余节点均保持默认设置。
      注意：总体而言，共识步骤工作流程可处理所有事后分析，即蛋白质相对丰度的确定、鉴定置信度（如错误发现率和肽段谱图匹配得分）以及比对的肽段覆盖度。结果统计信息和数据分布也以最终表格形式提供。
  18. 完成上述处理和共识步骤的工作流程后，保存整个研究，然后单击 运行 位于顶部的图标（齿轮） 分析 框。如果同时处理多个原始质谱数据文件，则在开始处理运行之前，单击并选中附近的 按文件 图标（方形）
    注意：将一个质谱原始数据文件处理为完整的蛋白质组结果文件通常需要20至40分钟，但可生成包含数千种蛋白质鉴定结果的动态列表，这些鉴定结果涵盖低、中到高置信度匹配（即以高置信度匹配为主），并包括各蛋白质实体中存在的磷酸化修饰信息图4C主要的已鉴定蛋白质结果输出参数包括FDR（置信度）、主条目（若FASTA文件/数据库条目经过审阅）、登录号、描述、覆盖率（%）、序列覆盖范围、肽段谱图匹配数（例如，唯一肽段数量）、物理特性（例如，分子量以kDa为单位）、相对丰度以及修饰（如磷酸化基团）。
    1. 列可对总蛋白质组结果进行升序或降序排列，或进行完全筛选，使用 漏斗 工具栏上的图标（图4C），根据研究兴趣筛选，例如仅显示高置信度鉴定结果（蛋白质错误发现率，protein FDR）或高肽段匹配程度（例如通过覆盖百分比%和/或唯一肽段数量）。
    2. 若需特定的翻译后修饰信息，可筛选出已鉴定出含有磷酸化的蛋白质进行进一步分析。
    3. 保存过滤后的结果，无需更改文件名，因为只需移除应用的过滤条件并刷新窗口，即可恢复为原始输出。

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结果

通过可选的火山图处理方式可视化全蛋白质组结果
每个样本的全蛋白质组结果均可根据登录号（accession #）或蛋白描述信息，便捷地检索研究者感兴趣的特定蛋白，并对相关相对丰度进行平均，随后在处理组之间比较其显著差异（例如通过t检验得出的p值）。此外，探索整个蛋白质组范围内的全局性变化也具有重要价值，包括在构成实验处理组的各个样本间完全共有的所有磷酸化蛋白。该分析可通过将数据转换为可选的火山图实现，火山图本质上是蛋白质变化分布图。用于生成各样本蛋白质组结果的生物信息学软件可在处理原始质谱（MS）数据文件时，设置为自动进行处理组间的比较，并生成相应的火山图；然而，此类输出结果往往难以解释，因为软件程序并未公开显示用于计算组平均值的各个样本中的相对丰度数据。同样，程序也无法明确标记某蛋白在某个样本中是否未被检测到或存在可疑（例如缺乏唯一性肽段）。这可能导致出现误导性的显著差异，尤其是当某蛋白的“缺失”偏向于某一特定处理组时。因此，建议手动进行处理组分析，具体操作如下所述。

在用于生成过滤后总蛋白质组结果的生物信息学软件中，如前一节所述，打开每个...

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讨论

上述方法使用液氮速冻组织，以立即终止所有生物活性，随后转移至 -80 °C 进行长期保存。在所有样本收集完成后，进行组织匀浆。匀浆过程中，必须始终保持所有组织和工具处于低温状态，以防止蛋白质的重新激活或降解。此外，在从匀浆组织中进行蛋白质的初始提取时，也需保持样本低温，以避免蛋白质活性丧失或发生降解。我们采用该方法研究了创伤性脑损伤（TBI）临床前动物模型（即暴露于模拟爆炸超压波的小鼠和雪貂）中脑、肺、脾、肝及血浆等组织的 蛋白质谱变化。该方法适用于分析组织整体水平的全蛋白质组变化。然而，后续实验可在此方案基础上进一步拓展，以聚焦于组织的特定区域。例如，未来的研究可专注于在速冻前分离出的脑部不同解剖区域中的磷酸化蛋白质组变化。本实验室此前已发表方法学论文，展示了小鼠脑组织的显微解剖技术，以获取功能和解剖上不同的脑区13。明确不同脑区中全蛋白质组变化及其翻译后修饰，将有助于更全面地理解疾病机制，并为开发新型或改进的治疗策略提供依据13。

当处理血浆样本时，无需进行上述第一步至第三...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本项目部分得到了国家科学院、工程院和医学院奖学金办公室管理的国家研究委员会研究员项目以及沃尔特·里德陆军研究所橡树岭科学与教育研究所项目的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
660 nm 蛋白质测定试剂盒Pierce / Thermo Scientific22662用于BCA法测定样品蛋白质浓度，包含Pierce 660 nm蛋白质检测试剂和预稀释蛋白质检测标准品
乙腈，Optima LC/MS 级赛默飞世尔科技047138.K2用于液相色谱/质谱的超纯乙腈
铝箔板封膜贝克曼库尔特538619蛋白质检测板开发过程中使用的封板膜
BioTek Synergy Neo2 多功能酶标仪 / 紫外-可见分光光度计安捷伦https://www.agilent.com/en/product/microplate-instrumentation/microplate-readers/multimode-microplate-readers/biotek-synergy-neo2-hybrid-multimode-reader-1623195用于在660 nm波长下测定吸光度以确定蛋白质浓度的分光光度计/酶标仪 
ChromaCare LC-MS 仪器冲洗液赛默飞世尔科技T111101000含有25%乙腈、25%异丙醇、25%甲醇和25%水的溶液，用于样品运行后清洗液相色谱系统
CK28 Precellys 管Bertin Corp / TechnologiesP000911LYSK0A.0均质化组织被放入这些管中，使用Precellys仪器进行组织裂解和蛋白质提取。这些管子即为本实验方案中提到的本实验室所使用的管子 "匀浆管"
冷冻保存管Brooks / Azenta生命科学https://www.azenta.com/products/cryopod-carrier用于在组织匀浆过程中盛装液氮以冷却研钵的容器
EasyPep Mini MS 样品制备试剂盒赛默飞世尔科技A40006一个试剂盒可处理20个样本，内容物包括用于蛋白质提取的裂解液、添加在提取液中的通用核酸酶，以及步骤1.4和1.5所需的试剂
EASY-Spray C18 LC色谱柱（15 cm长，50 µm 直径，以及 2 µm 粒径赛默飞世尔科技ES901用于质谱检测前肽段分离的电喷雾液相色谱柱
FlexMix校准溶液Pierce / Thermo ScientificA39239用于样品运行前校准质谱仪检测器准确性和灵敏度的16种标准分子混合物
甲酸，LC/MS 级赛默飞世尔科技85178用于将所有液相色谱溶液和样品酸化的超纯甲酸，终浓度为 0.1%（v/v）
蛋白酶抑制剂 &磷酸酶单次使用抑制剂混合物（100倍浓缩液）赛默飞世尔科技78442在提取缓冲液中添加，以防止样品中蛋白质和磷酸化蛋白质的降解
甲醇，Optima LC/MS 级赛默飞世尔科技047192.K2用于液相色谱/质谱的超纯甲醇
瓷研钵，150 mL赛默飞世尔科技FB961C150 mL 容量，用于匀浆较小的雪貂组织（如脑组织）
瓷研钵，275 mL赛默飞世尔科技FB961D275 mL 容量，用于匀浆较大的雪貂组织（如肝脏）
瓷研钵，50 mL赛默飞世尔科技FB961A50 mL 容量，用于匀浆小鼠组织
瓷质研钵，50 mL赛默飞世尔科技FB961K适用于50 mL研钵
瓷制研钵，150 mL赛默飞世尔科技FB961M适用于150 mL研钵
瓷研钵，275 mL赛默飞世尔科技FB961N适用于 275 mL 研钵
PrecellysBertin Corp / Technologieshttps://www.bertin-technologies.com/product/sample-preparation-homogenizers/precellys-evolution-homogenizer/用于均质化组织样本的仪器。使用以下设置：4500 RPM，每循环 2 次，每次 30 秒，暂停 30 秒。 
蛋白测定试剂Pierce / 赛默飞世尔科技22662步骤 3.4 中使用的蛋白质检测试剂–3.8
Proteome Discoverer赛默飞世尔科技CSW0064764用于蛋白质组学/磷酸化蛋白质组学数据分析的生物信息学软件
SureSTART MSCERT 螺口 LC 进样小瓶（0.02–1.5 mL 容量）赛默飞世尔科技6PMCK39TR经高性能应用认证的螺口盖（聚四氟乙烯，预切隔垫）玻璃小瓶，用于盛装LC/MS仪器进样样品   
Ultimate 3000 UHPLC / Orbitrap Fusion Lumos Tribrid MS（LC/MS）系统赛默飞世尔科技LC：已停用 / MS：FETD2-10002，应特殊要求用于分离样品中肽段并根据分子量进行检测的超高效液相色谱/质谱联用仪（LC/MS）
通用核酸酶用于细胞裂解，100kU，400 µLPierce / 赛默飞世尔科技88702额外的通用核酸酶已购得 
Vacufuge PlusEppendorfhttps://www.eppendorf.com/us-en/Products/Centrifugation/Concentrator/Vacufuge-plus-p-PF-25748使用真空离心浓缩仪在重组前干燥肽样品。 
水，Optima LC/MS 级赛默飞世尔科技047146.K2用于液相色谱/质谱的超纯水

参考文献

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