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在三维流体芯片中模拟肺叶切除术后血管内皮糖萼——一种基于血管的器官芯片系统的构建方法

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DOI：

10.3791/67246

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2025年9月16日

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1Biomedical Engineering Department, Worcester Polytechnic Institute

本文内容

摘要

本文介绍了一种用于构建模拟肺切除术的器官芯片（OOC）系统的实验方案。该系统旨在研究糖萼损伤与肺切除术后并发症之间可能存在的关联。

摘要

内皮糖萼（GCX）是一种富含碳水化合物的结构，覆盖于内皮细胞管腔表面，在调控细胞对刺激的反应中发挥关键作用。GCX由跨膜蛋白组成，可作为细胞响应的机械转导器。在稳态条件下，GCX可自然维持其结构与稳定性，但在高剪切应力暴露下可能发生损伤，并引发多种后果。尽管已有研究探讨剪切应力对内皮细胞的一般性影响，但其对血管系统——特别是肺切除术后——的影响程度与作用尚不明确。为深入探究此问题，本研究采用综合方法，构建了肺血管系统在肺切除术前与术后的计算机辅助设计（CAD）模型。通过计算流体模拟，识别出剪切应力与压力升高的关键区域，并在器官芯片（OOC）系统中重现这些区域的流体环境。将人肺微血管内皮细胞（HLMVECs）接种至与选定血管段形状一致的模具中，以表征升高剪切应力的影响。 关键词：内皮糖萼，剪切应力，肺切除术，器官芯片，计算流体动力学，人肺微血管内皮细胞 体外实验结束后，对人肺微血管内皮细胞（HLMVECs）进行免疫染色，以定性评估在肺切除术诱导的正常及增高的应力条件下糖萼层（GCX）的健康状况。通过结合计算建模与实验分析，加深了我们对剪切应力变化如何影响GCX的理解，并阐明了其对血管功能及术后并发症的作用机制。

引言

肺切除术是一种侵入性高风险外科手术，用于摘除右肺或左肺1。该手术通常作为治疗多种严重疾病（如肺癌、肺结核和创伤性肺损伤）的一种选择2。尽管该手术具有潜在疗效，但仍存在显著风险，术后并发症发生率较高，包括心律失常和肺水肿等1。

肺切除术通过将心脏的全部心输出量导向剩余肺组织，对心血管动力学产生深远影响3。这种血流重定向已知会增加剩余肺血管系统内的压力和剪切应力4。在血流模式发生巨大改变的情况下，血管内皮糖萼（GCX）在感知这些血流变化中发挥关键作用5。

糖萼（GCX）是一种凝胶状层，能够根据环境变化调节生化活动6,7。研究表明，与静态培养相比，持续暴露于均匀流动时其表达增加，而暴露于紊乱血流时则减少8,9。GCX在整个血管系统中厚度可变，范围为0.1–1 µm，作为覆盖血管内皮细胞的关键力传导层发挥作用10。该网络由密集的糖类、脂质和蛋白质层构成，如图1所示。这些糖类可结合形成聚糖，可游离存在于血液中，或与蛋白质或脂质结合，从而形成蛋白聚糖、糖蛋白或糖脂7,11。蛋白聚糖由糖胺聚糖（GAG）链组成，通过血浆蛋白或受体与细胞膜结合。这些GAG包括硫酸乙酰肝素（HS）、透明质酸（HA）、硫酸软骨素（CS）、硫酸皮肤素和硫酸角质素12。其中硫酸乙酰肝素是主要的GAG，占GCX中总GAG的50%以上。这些侧链可连接到嵌入的核心蛋白上，核心蛋白包括通过糖基磷脂酰肌醇锚定的Glypican家族蛋白（glypicans）、具有跨膜结构域的Syndecan家族蛋白（syndecans），以及表面黏附受体CD44。上述复合物在调控生长因子、抗炎反应、促进血管舒张以及调节血管通透性方面发挥关键作用13。

内皮细胞示意图；磷脂双分子层、整合素受体、糖蛋白相互作用。
图1：糖萼成分示意图。 内皮糖萼结构成分的示意图。该示意图展示了位于血管管腔侧的顶端糖萼，显示其膜结合的蛋白聚糖和糖蛋白。由 BioRender.com 制作 请点击此处查看此图的放大版本。

尽管肺切除术与糖萼（GCX）损伤之间的确切关联尚未得到充分研究，但肺切除术引起的血流模式改变与GCX完整性之间存在合理的相关性。已知血管系统中紊乱的血流会损害GCX6。我们假设，肺切除术后残余血管中紊乱血流增加以及剪切应力的变化可能随时间推移对GCX造成损伤。这种加速的退化过程可能促进术后并发症和疾病的发生，从而增加患者整体健康状况的固有风险13。

本方案旨在模拟肺切除术后的肺血管系统，遵循下述概述的一般操作流程 图2. 在计算机辅助设计模型上进行了流体模拟，该模型复制了有人类肺血管系统在有和没有肺切除术情况下的结构。肺切除术模型是通过在三维建模软件中设计三维肺血管系统而创建的，其尺寸依据来自CT扫描和文献数据，并进一步简化以适用于计算流体动力学（CFD）软件中的流动模拟。模拟确定了若干感兴趣区域，这些区域的选择依据是在肺切除术模型中相较于对照组剪切应力升高的部位。这些感兴趣区域被选中用于复制并构建 体外 模型。该 体外 该模型采用流体腔室设计，模拟具有正常几何结构和肺切除术后几何结构的多段血管，以重现不同的血流条件。

将人肺微血管内皮细胞（HLMVECs）培养于经纤维连接蛋白包被的聚二甲基硅氧烷（PDMS）基底上，该基底形状模拟选定的分叉区域。使用蠕动泵将微血管内皮细胞培养基持续灌注通过系统。最后，对细胞及糖萼（GCX）进行固定，用特异性识别GCX的抗体进行免疫荧光染色，并通过荧光显微镜观察，以评估其在流体剪切力作用后的状态。本实验方案的总体时间线见表1。

CT scan to COMSOL flow simulation to Organ-on-Chip setup; PDMS molds in fluid dynamics experiment.
图2器官芯片开发流程 开发新型器官芯片系统以研究肺部肺切除术影响的步骤1) 生成的人类肺血管系统CT扫描图像。2) 用于确定三维CAD模型感兴趣区域的CT扫描几何结构。3) 用于确定感兴趣几何结构的流体流动模拟 体外 模型。（4) 基于模拟结果中感兴趣区域构建的PDMS模具5将模具插入亚克力外壳中以固定模具进行灌注6) 流动腔室组装完成装置（7将完整的流动室装置转移至培养箱中（8) 经剪切应力处理后拍摄的明场和荧光图像。使用 BioRender.com 制作 请点击此处以查看此图的放大版本。

表1：通用实验方案时间线。 实验方案中各操作步骤的通用顺序及每个步骤的平均持续时间（小时）。请点击此处下载该表格。

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方案

本研究采用了先前文献中收集的计算机断层扫描（CT）成像数据14，数据收集过程符合机构和联邦伦理标准。所引用的所有成像数据均已获得参与者的知情同意，并经机构审查委员会（IRB）批准，以确保保护参与者的权利和隐私。

1. 在CAD软件中建立肺血管系统模型

  1. 研究待建模主要血管的生理几何结构。
  2. 使用待建模血管的患者 CT 图像，选择需复制的具体几何形态，如图2所示。
    注：本方案采用先前文献中的临床肺部 CT 扫描数据14。本方案也允许使用任何 CT 扫描数据生成体外（in vitro）模型。
    1. 打开 DICOM 图像查看软件，导入 CT 图像。浏览各切片以识别目标血管。保存相关图像用于进一步分析。
      注：本方案所复制的血管为肺部血管系统，因为本方案的应用旨在建模健康状态及肺切除术后状态下的血管内皮糖萼。其他部位可用于不同应用。
  3. 使用 ImageJ FIJI v1.54f15，从 CT 图像或文献数值中测量血管直径。
    1. 打开 ImageJ FIJI 并导入已保存的 CT 图像：选择 文件 > 打开。
    2. 从工具栏中选择直线工具，在 CT 图像的标尺上绘制一条跨越其长度的直线。
    3. 然后选择 分析 > 设定标尺。输入已知距离（例如，若图像中标尺为 10 mm，则输入 10 作为已知距离）。输入长度单位（例如，mm）。点击 确定。
  4. 使用直线工具测量直径。操作方法为：从工具栏中选择直线工具，在血管直径上绘制一条直线，然后选择 分析 > 测量，以获得直径数值。
  5. 对所有目标血管重复步骤 1.3 和 1.4，并记录测量结果。
  6. 将血管测量数据按段类型归类，以便于建模。
    1. 创建电子表格，对血管测量数据进行分类，并在每一行中标注血管名称、测量值和段类型（例如，动脉、静脉）。
  7. 基于文献和放射影像测量结果，建立血管段长度和直径的参考表。
  8. 使用三维建模软件生成三维模型，以复制 CT 图像的几何形态和尺寸。
    1. 打开软件并创建新的零件文件：选择 文件 > 新建 > 零件，然后选择 草图 > 创建草图，并根据 ImageJ 提供的尺寸绘制轮廓。
    2. 使用扫描曲面和放样功能构建三维几何结构：对于扫描，选择 特征 > 扫描凸台/基体；对于放样，选择 特征 > 放样凸台/基体。
    3. 优化模型以匹配精确的测量尺寸。
  9. 确定需开发的模型变体，例如对照模型和肺切除模型。
    1. 列出不同条件（例如，正常状态与肺切除状态），并列出每种变体所需的结构变化。
  10. 复制原始模型并进行修改，以根据设定参数创建实验模型（例如，右侧和左侧肺切除模型）。
    1. 保存原始模型，然后选择 文件 > 另存为副本，为每种实验条件创建副本。
    2. 根据定义的参数修改每个副本（例如，右侧和左侧肺切除）。
  11. 将模型从零件文件转换为 Parasolid 文件，用于计算流体动力学（CFD）模拟。
    1. 选择 文件 > 另存为。从文件类型下拉菜单中选择 Parasolid (*.x_t)，然后将文件保存至目标目录。

2. 流体流动模拟

注意：此步骤有助于在肺切除术后定位发生剪切应力改变的区域，从而选择需复制的血管几何结构 体外 系统。此外, 软件许可必须支持导入模块。

  1. 建立一个新的稳态层流研究。
    1. 选择 模型向导 > 3D （空间维度）> 流体流动 > 单相流 > 层流 (spf) > 选择 添加 以添加层流物理场接口 > 选择 研究 > 在 通用研究 下选择 稳态 > 选择 完成。
  2. 从CAD模型导入几何结构。
    1. 导入Parasolid文件。选择 封口面，在图形窗口中选择每个开放入口和出口处的管壁内侧周长。这些将作为封口面的边界边。选择 形成联合体 并选择 全部构建。
    2. 选择 移除细节，并确保在 要移除的细节 下所有选项均被选中，然后选择 全部构建 以移除不必要的几何结构。
  3. 创建网格1（带网格的管壁 + 带网格的流体域）。
    1. 将 尺寸 设置为预定义：超精细，针对流体动力学进行校准。
    2. 将 尺寸1 设置为预定义：超精细，针对流体动力学进行校准；在 几何实体选择 中指定 边界 并选择 手动。在图形窗口中，选择管壁域所有可见的外表面，包括围绕封口面的环形面。不要选择入口和出口处的封口面。
      注：对于肺叶切除模型左右两侧被移除部分末端的封口面也应选择，因为在肺叶切除后这些被视为几何边界。
    3. 在 角点细化 下，选择 域 并选择 手动。在图形窗口中选择 [域] 1（管壁） 和 [域] 2（流体）。
    4. 在 边界选择 下，确保边界与“尺寸1”中的“几何实体选择”所指定的相同。
    5. 在 自由四面体1 下，在 域选择 的 几何实体层级 中选择 剩余部分。
    6. 在 边界层1 和 几何实体选择 下，指定 域，选择 手动，在图形窗口中选择 [域] 1 和 [域] 2。边界层属性 将与 尺寸1 中指定的选择保持一致。
    7. 通过选择网格1下的 全部构建 来生成网格。
  4. 创建网格2（仅带网格的流体域）。
    1. 右键单击 网格1，选择 导入 以创建“网格2”，并删除 导入2。
    2. 在导入1下，选择 网格序列 以自动选择 网格1。确保勾选 自动构建源网格、导入域元素 和 导入未划分网格的域，然后选择 导入。网格1中定义的所有设置都将继承到网格2中。
    3. 右键单击 网格2 并选择 删除实体。对于 删除实体1，在 几何实体选择 下选择 域，选择 手动，在图形窗口中选择 [域] 1（管壁），然后选择 全部构建，仅保留流体几何结构，因为流体域网格的表面将位于流体流动与管内壁之间的界面上。
  5. 添加流体材料：使用文献中血液的物性参数创建新材料。右键单击 材料 并选择 空白材料。在几何实体层级选择中选择 域，选择 所有域。将材料类型设为 非固体，并输入血液的材料属性，包括粘度和密度。
  6. 设置层流研究的边界条件和参数。
    1. 选择 层流 (spf)，在 域选择 下选择 所有域。仅会列出[域]1。此处的域1是流体几何结构，而非管壁。流体属性1将自动从第5步中定义的材料填充。
    2. 将 初始值1 的压力设为生理血压。将壁面1的边界条件设为无滑移。
    3. 在图形窗口中选择 入口1，并将边界条件设为充分发展流。确保勾选 对每个独立选择分别应用条件。
    4. 在 充分发展流 下，选择 流速 并输入速度。
    5. 对于 出口1，在图形窗口中选择所有 出口，并确保 边界条件 设置为 压力。
    6. 在 压力条件 下，选择 总压力 并输入压力值。选择 平均 并启用 抑制回流。
  7. 设置并运行研究。
    1. 在 研究 下的 步骤1：稳态 中，确保 物理场和变量 部分与预期研究一致，并将 网格选择 组件1设置为 网格2。选择 计算。
  8. 分析剪切应力结果。
    1. 右键单击 压力 (spf) 并选择 复制。将其重命名为 剪切应力。
    2. 在 剪切应力 下，选择 表面 并将数据集更改为 研究1/解1 (sol1)。
    3. 在 表达式 下输入 spf.sr*spf.mu 并将 单位设为Pa。
      注：这表示“单相流剪切速率 * 单相流粘度”。
    4. 接着选择 绘图，右键单击 透明度1 并选择 禁用。
    5. 右键单击 剪切应力 并选择 体积 以将数据集更改为 研究1/解1 (sol1)。
    6. 在 表达式 下输入 spf.sr*spf.mu 并将 单位设为Pa。
    7. 选择 绘图，右键单击 表面，并选择 禁用，以可视化分析“体积1”，从而确定OOC模型中感兴趣的血管区域。

3. PDMS 模具的制备

  1. 根据流体模拟结果，通过选择在对照模型与肺切除模型之间剪切应力存在显著差异的区域，确定对照组和肺切除组的几何结构，并在计算机辅助设计（CAD）中将其复制为负模。对照组和肺切除组血管结构的CAD模型尺寸见图3 和图4。
  2. 此外，设计用于模具进出口的密封塞，以防止细胞接种过程中发生泄漏。
  3. 使用3D打印机，采用PLA线材打印模具及密封塞。
  4. 获取已通过3D打印制备的聚乳酸（PLA）模具（对照组 + 肺切除组）（图5A）。
  5. 称取10份硅橡胶基础液和1份硅橡胶固化剂，配制成总量为30 mL的混合液（质量比10:1），用于填充模具至3 mm厚度（图5B）。
    注：称量过程中不要预先混合储备液。每种试剂应使用独立的称量器具。
  6. 将硅橡胶基础液与固化剂一同倒入并充分混合。
    注：可在称量皿中进行此操作。
  7. 将充分混合的溶液倒入模具中（每半个模具约15 mL）（图5C）。
  8. 将聚二甲基硅氧烷（PDMS）置于真空腔中脱气30–60分钟，直至无气泡残留（图5D）。
  9. 从真空腔中取出PDMS，在室温下固化48小时。
    ​注：由于PLA模具的耐热能力有限，未使用烘箱进行固化。
  10. 从PLA模具中取出固化的PDMS。
  11. 用去离子水充分冲洗PLA模具，确保其表面无任何杂质残留，以便重复使用。

血管控制模块示意图、工程设计图、流体动力学设计、精确测量。
图3：对照血管系统的3D CAD设计图。对照血管系统模型的俯视图和侧视图尺寸（单位：mm）。请点击此处查看此图的放大版本。

肺切除术血管示意图；带尺寸和规格的详细技术图纸。
图4：肺切除术血管系统的3D CAD示意图。 肺切除术血管模型的尺寸（单位：mm），显示顶视图和侧视图。 请点击此处查看该图的放大版本。

包含称重、混合和真空干燥步骤的实验装置流程图。
图 5：制备 PDMS 模具。制备 PDMS 模具。（A）用于对照（橙色）和肺切除术（绿色）实验的 3D 打印 PLA 模具。（B）装有 PDMS 制备材料的电子天平。（C）将 PDMS 混合物（10:1 的基础剂与固化剂）倒入 3D 打印模具中。（D）在真空腔中对 PDMS 进行脱气处理。图片由 BioRender.com 生成。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 细胞培养与接种

  1. 根据本地实验室规程，采用适当的无菌技术。
  2. 用70%乙醇喷洒，并将所有必要材料和组件移入生物安全柜（BSC）（图6A），包括PDMS部件和四段双面胶带。
  3. 在每个细胞培养皿中放置两段双面胶带（图6B）。
  4. 将每块PDMS血管结构半片分别置于涂有双面胶带的细胞培养皿中（图6C）。
  5. 在BSC中通过紫外线照射20分钟，进一步对所有组件进行灭菌。
  6. 必要时，在37 °C下解冻胰蛋白酶、HLMVEC培养基和20 µg/mL纤连蛋白。
  7. 使用移液器沿PDMS血管结构滴加数滴30 µL的20 µg/mL纤连蛋白。必要时倾斜PDMS，用移液枪头均匀涂布整个PDMS表面（图7A）。
  8. 将PDMS部件在BSC中孵育30分钟。
  9. 孵育后，吸除纤连蛋白溶液，让PDMS部件在BSC中自然干燥（图7B）。
  10. 从培养箱（37 °C，5% CO2）中取出一 flask 已长满的HLMVEC细胞，移入BSC中。
  11. 吸除细胞培养瓶中的HLMVEC培养基，用胰蛋白酶或无菌PBS短暂冲洗。
  12. 吸除冲洗液，向培养瓶中加入3 mL胰蛋白酶，于37 °C、5% CO2条件下孵育5分钟。在显微镜下观察细胞，确认所有细胞已从瓶壁脱落。
  13. 加入9 mL HLMVEC完全培养基以终止胰蛋白酶作用。
  14. 将细胞悬液转移至50 mL锥形管中，再用10 mL HLMVEC培养基冲洗培养瓶，收集残留细胞，并转移至同一50 mL管中。
  15. 将细胞悬液转移至50 mL管中，在220 x g条件下离心5分钟。
  16. 离心完成后，目视确认管底的细胞沉淀。用70%乙醇喷洒管外表面，并将其移入生物安全柜。吸除上清液，保留细胞沉淀。
  17. 用1 mL新鲜HLMVEC培养基轻柔重悬细胞，使用血细胞计数板进行细胞计数。根据以下公式计算总细胞数，其中A-H为每个血细胞计数板方格中计数的细胞数。将细胞置于冰上保存。
    血细胞计数板细胞计数公式；平均细胞数、总细胞数计算；示意图。
  18. 用HLMVEC培养基将细胞浓度调整至2 x 106 cells/mL。
  19. 如 图5 所示，在每段血管结构半片的两端放置3D打印的堵头，防止细胞悬液从PDMS模具中泄漏（共4个堵头，每个PDMS部件2个）（图7C）。
  20. 使用移液器将300 µL HLMVEC细胞悬液（600 k个细胞）接种至每个PDMS部件中（图7D）。
  21. 将含有HLMVEC细胞的PDMS部件轻柔转移至培养箱（37 °C，5% CO2）中孵育1–2小时，使细胞贴壁（图7E）。
  22. 在显微镜下检查，目视确认HLMVEC细胞成功贴附于PDMS基质表面。
  23. 将PDMS血管结构半片重新移回BSC中。
  24. 移除四个堵头，加入足量HLMVEC培养基以完全浸没PDMS血管结构半片，并将含有PDMS血管结构的培养皿放回培养箱中（图7F）。
  25. 接种后6–10小时，手动用移液器将PDMS周围的HLMVEC培养基吹打至血管腔内，以更新最靠近细胞区域的培养基。

细胞培养装置示意图：培养板中带微通道的PDMS血管结构及胶带粘贴步骤。
图6：将PDMS模具固定于培养板。 将PDMS血管结构固定至细胞培养板的基本步骤。（A）将PDMS血管半片放入培养板所需的材料。（B）在每个无菌培养板内对角位置贴上两段双面胶带。（C）将PDMS血管半片置于双面胶带上。图片由BioRender.com生成 请点击此处查看该图的高清版本。

带有纤连蛋白包被、细胞接种、培养箱和培养基的PDMS细胞培养制备示意图。
图7：将HLMVEC接种至PDMS模具中。在PDMS血管结构中接种HLMVEC的步骤。（A）向血管结构中加入150–300 µL含20 µg/mL纤连蛋白的溶液。（B）采用倾斜引流法吸除多余的纤连蛋白。（C）使用3D打印的塞子封闭PDMS血管半结构的两端。（D）向每个PDMS血管半结构中加入300 µL培养基，接种500,000–600,000个细胞。（E）将PDMS半结构置于培养箱中孵育1–2小时，以促进细胞贴壁。（F）用培养基覆盖PDMS半结构并移除塞子。图示由BioRender.com制作。请点击此处查看该图的放大版本。

5. 组装并运行流动系统

  1. 在显微镜下观察确认PDMS血管结构两半部分的细胞已完全汇合后，开始进行灌流操作。
  2. 在开展实验前，根据制造商的说明校准蠕动泵。
  3. 对所有可高压灭菌的组件进行高压灭菌处理，包括灌流管路、管路连接器、注射器储液罐和橡胶塞。
  4. 将丙烯酸块、螺丝、堵头、1英寸长的Masterflex L/S 16管路段以及15 mm培养皿盖浸入70%乙醇中15分钟，随后在生物安全柜（BSC）中进行UV照射处理20分钟，中途翻转一次。
  5. 在所有其他设备和材料完成灭菌后，将PDMS血管结构的两半部分移入生物安全柜中。
  6. 吸除含有血管结构两半部分的培养皿中的HLMVEC培养基（图8A，B）。
  7. 将PDMS两半部分放入两个聚碳酸酯块中，确保其对齐（图8C）。
  8. 在血管结构的两端（即管路将连接至PDMS两半部分的位置）涂抹硅胶密封剂，并将1英寸长的管路插入底部血管结构的两端（图8D）。
  9. 将顶部丙烯酸块（含PDMS血管结构的上半部分）翻转并放置在底部丙烯酸块（含PDMS血管结构的下半部分）上（图8E）。
  10. 使用底部的螺纹块将两个丙烯酸块用螺栓固定，并用3D打印的堵头封住1英寸长管路的自由端（图8F）。
  11. 取下其中一个堵头，轻轻向血管结构内注入500 µL HLMVEC培养基，倾斜装置以防止产生气泡，然后重新装回堵头。
  12. 将组装完整的芯片放入培养箱中，使硅胶固化1–2小时。
  13. 将组装好的芯片及所有其他无菌材料移入生物安全柜中，并按照图9连接建立灌流系统。确保从蠕动泵通向血管结构入口的管路连接至注射器储液罐的底部。这将利用重力供液，减少系统中的气泡。
  14. 用HLMVEC培养基轻轻预灌流系统。使用50 mL移液管，向注射器储液罐顶部加入30 mL培养基（图10B）。以低流速运行蠕动泵以填充管路。持续向储液罐中添加培养基，直至系统完全预灌且所有气泡被清除。
    注意：气泡可能在灌流实验过程中对细胞造成剪切损伤。
  15. 使用安装在储液罐顶部橡胶塞上的接头，将管路连接至储液罐入口（来自血管模具出口）（图10C）。
  16. 将灌流系统从蠕动泵上拆下并放置于金属托盘上。小心地将整个装置从生物安全柜转移至培养箱（37 °C，5% CO2）。将管路从培养箱后部引至蠕动泵。
  17. 重新连接蠕动泵，并设置为所需的流速，以模拟血液在血管模型中的流动速率。
  18. 启动泵，确保系统无泄漏。让系统运行24小时或所需时长，并定期检查是否存在泄漏。

细胞培养装置示意图；微流控芯片制备、移液、键合、密封过程。
图8：构建流动芯片。 构建流动芯片。（A）从细胞培养板中吸出培养基。（B）吸出培养基后的PDMS两半部分。（C）将PDMS两半部分从培养板中取出，并准备构建芯片所需的其他材料（堵头、注射器滤器、½英寸管段、硅酮密封胶、10x螺丝和丙烯酸块）。（D）将PDMS两半部分放入丙烯酸块中，并在标记为红色的部位涂抹硅酮密封胶。（E）将管路插入相应的切口位置。（F）连接流动室的两半部分，并安装堵头和注射器滤器。图片由BioRender.com生成。请点击此处查看该图的放大版本。

蠕动泵系统示意图；用于流体输送研究的流动室、管路、注射器储液器。
图9：流动系统装置示意图。流动系统的装置。完整的流动系统由管路、管路连接件、蠕动泵、注射器储液器、支撑架和流动芯片构成。使用 BioRender.com 制作。请点击此处查看此图的放大版本。

细胞培养中培养基循环和储液器准备的生物反应器系统设置示意图。
图10：流体系统的预充。 使用培养基对流体系统进行预充。（A）未加入培养基时流体系统的简单设置。（B）从注射器储液器中移除橡胶塞，并持续加入培养基，直至管路充满且储液器中留有20–30 mL过量培养基。（C）已用HLMVEC培养基预充的流体系统。图片由BioRender.com制作。请点击此处查看该图的放大版本。

6. 固定与染色

  1. 用 PBS 清洗每个 PDMS 血管半部分，持续 5 分钟。加入足量 PBS 以完全浸没整个血管段。
  2. 通过倾斜培养板使 PBS 流出，吸除血管结构中的 PBS，然后用真空泵吸除流出液。
  3. 向每个血管半部分加入 600 µL 含 4% 多聚甲醛（PFA）的 PBS 溶液，在室温（RT）下孵育 20 分钟。
  4. 采用步骤 2 的方法将 PFA 溶液吸入适当的废液容器中。
  5. 使用步骤 2 的操作，用 PBS 对固定后的细胞清洗 3 次，每次 5 分钟。
    注意：每次清洗液均需倒入适用于甲醛的废液容器中处理。
  6. 使用洁净的 3D 打印塞子封闭 PDMS 血管半部分的两端。
  7. 在 PBS 中配制 3% 牛血清白蛋白（BSA）溶液用于封闭。
  8. 向血管半部分加入 600 µL 封闭液，在室温下孵育 30 分钟。
  9. 移除塞子，并吸除封闭液。
  10. 在 3% BSA 溶液中配制 1:200 稀释的麦芽凝集素（WGA）-生物素偶联物（一抗）溶液，用于染色糖萼（GCX）9。
  11. 重新插入塞子以封闭血管两端，并向每个血管半部分加入 500 µL 一抗溶液。
  12. 在室温下孵育样品 1 小时。
  13. 按照之前使用的方法轻柔吸除一抗溶液。
  14. 用 PBS 清洗 3 次，每次 5 分钟。
  15. 在 3% BSA 溶液中配制 1:500 稀释的 WGA-链霉亲和素偶联物（二抗）溶液。
  16. 重新插入塞子以封闭血管两端，并向每个血管半部分加入 500 µL 二抗溶液。
  17. 重复步骤 6.12–6.14。
  18. 通过间隔滴加 30 µL DAPI 封片剂，覆盖血管表面，直至完全填充血管结构。
  19. 将玻璃盖玻片放置在 PDMS 表面，覆盖血管通道。
  20. 使用透明指甲油密封盖玻片边缘。
  21. 用锡箔纸包裹培养板，并在 4 °C 下避光保存，直至成像。

7. 成像

  1. 打开显微镜，并在连接的计算机上启动观察软件。
  2. 打开显微镜并升起光源。安装合适的样品平台（通用培养皿支架）。
  3. 将样品放置于显微镜内的培养皿支架上，使待观察区域位于物镜正上方中心位置。
  4. 降下光源并关闭显微镜盖。
  5. 在显微镜软件中选择捕获静态图像选项。
  6. 选择样本类型，使用通用模式。
  7. 在镜头部分选择合适的物镜以获得最佳观察效果。
  8. 在显微镜软件中调整物镜位置，使其对准感兴趣区域（ROI）。
  9. 选择自动对焦，细胞将大致进入焦平面。
  10. 手动调节对焦以完全清晰化图像。
  11. 调节亮度和曝光，以更清晰地观察细胞。
  12. 在软件中开启多色和彩色模式。
  13. 在通道（CH）设置中，开启CH1 Floor DAPI和CH2 Floor GFP。
  14. 分别调节每个通道的亮度，以清晰显示图像。
  15. 在显微镜软件中选择Z-Stack模式。
  16. 将对焦调整至最高成像平面，并点击“设置”以设定上限。
  17. 将对焦调整至最低成像平面，并点击“设置”以设定下限。
  18. 根据需要选择切片厚度，然后按下开始捕获以获取图像。
    注意：这些图像还将输出至显微镜分析软件，用于进一步处理。

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结果

流体模拟层流稳态研究的结果显示，与对照模型相比，肺切除模型的某些分叉处剪切应力有所增加，如图11所示。在实验步骤2.8中可视化显示，红色区域表示高剪切应力区域，而蓝色区域表示低剪切应力区域。

主动脉的三维流体动力学模拟、压力分布图分析、血流动力学研究结果。
图11：模拟的兴趣区域。流体模拟可视化肺切除模型上的兴趣区域。（A）对照模型中较浅的蓝色区域显示较高的剪切应力区域。（B）左肺切除模型中的红色区域表示较高的剪切应力区域。两个模型...

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讨论

血管建模是一个重要的新兴探索领域。成功构建精确的血管模型，对于推动组织工程和药物开发领域的发展具有重要意义。本文介绍了一种生成器官芯片（OOC）血管系统的新方法，可用于模拟肺叶切除术或任何其他血管系统或几何结构，以研究糖萼（GCX）损伤与肺叶切除术后并发症之间的潜在关联。从更广泛的角度来看，通过调整几何结构或其他疾病状态（如动脉粥样硬化或动脉瘤），该方法也可适用于模拟其他血管系统。

本文所述的器官芯片（OOC）系统相较于市场上其他OOC系统具有多项优势。该系统采用简单的制造工艺，成本低廉，相较于其他OOC方案更具经济性。这使得系统易于进行适应性改造，从而为模拟和评估多种不同血管区域提供了可能。这些应用可涵盖肺血管系统的生理与病理状态，包括肺动脉高压、血管重塑，以及内皮细胞对机械应力、炎症和缺氧的响应。此外，该系统还为药物测试、癌症转移研究、再生医学策略以及微血管通透性研究提供了平台。与其他多数OOC系统相比，该系统运行所需的设备成本更低，其中主要开支仅为一台蠕动泵。

标准器官芯片系统常见的问题是其脆弱性以及操作困难。这些系统需...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者谨向伍斯特理工学院生物医学工程系致以最诚挚的感谢，感谢他们提供的支持与指导。特别感谢 Megan Ouellette、John Martel 和 Sudish Vengat 在合作研究中提出的创新性想法，这些贡献极大地提升了本研究的质量与可行性。此外，我们还要感谢 Samantha Cocchiaro 和 Udaya Rattan 在实验室中的工作，以及他们所提供的关键支持与协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
#8-32 x 3/4 英寸 组合圆头镀锌机械螺钉（8 件装）Everbilt204274613-
0.25% EDTA-胰蛋白酶ThermoFisher Scientific25200056 -
15 mL 圆锥形无菌聚丙烯离心管Thermo Scientific12-565-269-
35×10 mm 培养皿，Nunclon DeltaThermo Scientific153066-
50 mL 圆锥形无菌聚丙烯离心管Thermo Scientific12-565-271-
各种橡胶塞Fisherbrand14-132
BioLite 细胞培养处理培养瓶（25 cm²）Thermo Scientific12-556-009-
BioLite 细胞培养处理培养瓶（75 cm²）Thermo Scientific12-556-010-
COMSOL MultiphysicsCOMSOLN/A-
双面胶带 3M16758005-
Epredia Richard-Allan Scientific 盖玻片 Thermo Scientific22-050-218-
胎牛血清ThermoFisher Scientific A5256701 -
纤连蛋白ThermoFisher Scientific 33016015 20 μg/mL 稀释液
Fisherbrand Isotemp 数控水浴锅：型号 210Fisherbrand15-462-10Q-
Fisherbrand 无菌注射器（60 mL）Fisherbrand14-955-461-
人肺微血管内皮细胞Sigma Aldrich540-05A -
Keyence BZX810 荧光显微镜KeyenceN/A-
Krayden Dow Sylgard 184 硅橡胶弹性体试剂盒，透明（1.1 磅）Dow4019862-
Marga Cipta 铸造亚克力板，1/2 英寸厚，48×96 英寸Marga CiptaN/A-
Masterflex L/S Easy-Load II 泵头MasterFlex77200-50
Masterflex L/S 精密泵管，铂固化硅胶，L/S 16；25 英尺MasterFlex96410-16-
Masterflex L/S 标准蠕动泵Masterflex07522-20
微量移液器 0.2 至 2 μLFisherbrandFBE00002-
微量移液器 10 至 100 μLFisherbrandFBE00100-
微量移液器 100 至 1000 μLFisherbrandFBE01000-
微量移液器 5 至 50 μLFisherbrandFBE00050-
微血管内皮细胞生长培养基（500 mL）Sigma - Aldrich111-500-
Nalgene 无菌注射器滤器Thermo Scientific725-2520-
Nikon Eclipse TS-100 荧光显微镜NikonNI-TS100
磷酸盐缓冲液（DPBS，10X），Dulbecco 配方Thermo ScientificJ61917.K3-
Prusament PLA Prusa Galaxy 黑色 1 kgPrusaPRM-PLA-GLX-1000-
Rebel Hybrid 显微镜，正置与倒置一体，Discover EchoECHO76376-746-
硅酮密封胶 Loctite908570-
SolidWorksDassault SystemesN/A
带放大刻度条的无菌聚苯乙烯一次性移液管（10 mL）Fisherbrand13-678-11E-
带放大刻度条的无菌聚苯乙烯一次性移液管（25 mL）Fisherbrand13-678-11-
带放大刻度条的无菌聚苯乙烯一次性移液管（50 mL）Fisherbrand13-678-11F-
带放大刻度条的无菌聚苯乙烯一次性移液管（5 mL）Fisherbrand13-678-11D-
链霉亲和素，Alexa Fluor 488 标记物Invitrogen S32354
链霉亲和素，Alexa Fluor 488 标记物InvitrogenS32354-
注射器储液器 BD300865
Thermo Scientific Alfa Aesar 1 升 牛血清白蛋白，第五组分，35% 溶液，试剂级，无脂肪酸，含叠氮化物作为防腐剂Thermo ScientificN12H004-
管路连接器Fisherbrand01-000-161-
含 DAPI 的 VECTASHIELD 抗荧光淬灭封片剂 VectashieldH-1200-10-
VWR 水套式 CO2 培养箱Avantar 10810-744 -
WGA 生物素化抗体VectorB-1025-

参考文献

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