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方法文章

使用单分子磁镊分析端粒蛋白- DNA 相互作用

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DOI：

10.3791/67251

⸱

2024年8月30日

 ,  , 
1State Key Laboratory of Medicinal Chemical Biology, College of Pharmacy, Nankai University

本文内容

摘要

本方案展示了如何利用单分子磁镊技术研究端粒DNA结合蛋白（端粒重复序列结合因子1 [TRF1] 和 TRF2）与从人类细胞中提取的长端粒之间的相互作用。文中描述了端粒和端粒重复序列结合因子的制备步骤、单分子实验的操作流程，以及数据采集与分析方法。

摘要

染色体末端的保护性结构——端粒，对于维持细胞寿命和基因组稳定性至关重要。其正常功能依赖于复制、延伸和损伤应答等高度调控的过程。 Shelterin 复合物，尤其是端粒重复序列结合因子 1（TRF1）和 TRF2，在端粒保护中发挥关键作用，并已成为药物研发中潜在的抗癌靶点。这些蛋白质可结合于端粒 DNA 的重复序列 TTAGGG，促进保护性结构的形成，并招募其他端粒相关蛋白。结构生物学方法和先进成像技术已揭示了端粒蛋白与 DNA 相互作用的机制，但要研究其动态过程仍需依赖单分子技术。磁镊、光镊和原子力显微镜（AFM）等工具已被用于研究端粒蛋白-DNA 相互作用，揭示了诸如 TRF2 依赖性的 DNA 变形以及端粒酶催化过程等重要细节。然而，构建含有端粒重复序列的单分子体系仍是一项具有挑战性的任务，可能限制了单分子力学方法在该领域的广泛应用。为解决这一问题，我们开发了一种利用全长人端粒 DNA 结合磁镊技术研究相互作用的方法。本实验方案详细描述了 TRF2 的表达与纯化、端粒 DNA 的制备、单分子力学实验的建立以及数据分析流程。该详尽指南将有助于从事端粒生物学及靶向端粒药物研发的研究人员。

引言

端粒是位于染色体末端的保护性结构1,2,3。细胞分裂过程中端粒的缩短会导致细胞衰老和机体老化，而端粒的异常延长则与癌症的发生相关4,5。为了确保端粒正常发挥功能，其复制、延长以及对损伤的响应必须受到高度调控6,7,8。由六个亚基组成的端粒保护蛋白复合物（Shelterin）在端粒保护中起核心作用9,10,11。对端粒更深入的理解将为端粒生物学提供宝贵的见解。

TRF1 和 TRF2 是端粒保护蛋白复合物 shelterin 的核心亚基，属于端粒 DNA 结合蛋白12,13。TRF1 和 TRF2 均通过其 Myb 结构域与端粒中的重复 DNA 序列 TTAGGG 结合14。它们通过共有的 TRFH 结构域形成二聚体，从而能够环绕端粒双链 DNA 并招募其他端粒相关蛋白15,16,17,18,19。TRF2 在端粒 D-loop 和 T-loop 的形成中尤其关键20,21。由于 TRF1 和 TRF2 在端粒保护中发挥至关重要的作用，它们已成为潜在的抗癌药物靶点22,23,24,25。

研究人员已投入大量努力来探究端粒处的蛋白质-DNA相互作用。已采用电泳迁移率变动分析（EMSA）和表面等离子共振（SPR）等生物化学方法来检测结合亲和力20,26。利用冷冻电子显微镜（cryo-EM）、X射线晶体学和核磁共振（NMR）已解析出大量端粒结合蛋白与DNA形成的复合物结构27,28,29。超分辨率成像技术，如随机光学重建显微镜（STORM），揭示了TRF2依赖性的T环形成过程21。最近，纳米孔测序技术已被开发用于分析端粒序列特征4,30,31。这些结构研究极大地增进了我们对端粒蛋白-DNA相互作用的理解。为进一步探索端粒蛋白-DNA相互作用的动态过程，开发新技术至关重要。

单分子技术是研究端粒上蛋白质-DNA相互作用的有力手段32,33,34。单分子力学方法，如磁镊、光镊和原子力显微镜（AFM），已被用于研究TRF2依赖性的DNA形变、揭示TRF2介导的人类端粒染色质的柱状堆叠结构，以及观察端粒酶的持续性催化过程等应用35,36,37,38,39,40。这些方法在探究拓扑构象以及蛋白质-DNA结合与解离动力学方面尤为有效。

然而，制备含有端粒重复序列的单分子结构仍存在挑战，这限制了单分子力学方法在相关研究中的应用。为克服这一局限，我们开发了一种单分子力学方法，用于研究全长人端粒上的全局蛋白质-DNA相互作用41。该方法直接从人细胞中提取端粒DNA，避免了人工合成端粒DNA的繁琐制备过程，有助于在跨越数千碱基对的长片段天然端粒上开展动力学过程的研究。

在本实验方案中，我们详细描述了使用磁力镊子（一种常用的单分子力学工具）探测端粒蛋白-DNA相互作用的各个步骤42,43,44。我们以TRF2为例，展示了端粒蛋白的表达与纯化方法，以及如何从人源细胞中制备端粒DNA。此外，我们还介绍了如何在磁力镊子系统上建立单分子实验以研究端粒蛋白-DNA相互作用，并涵盖了后续的单分子实验数据分析。本方案将有助于端粒生物学及靶向端粒药物研发领域的研究人员。

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方案

1. 通用材料与方法

  1. 请参阅 材料表 本方案所用盐类、化学品、抗生素、酶、抗体及树脂材料的文件。
  2. 制备LB（Luria-Bertani）液体培养基、LB琼脂平板、HEPES缓冲液、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、磷酸盐缓冲液（PBS）以及Tris-EDTA（TE）缓冲液，具体配方参照《冷泉港实验方案》。45,46,47,48,49,50,51,52,53.
  3. 通过商业渠道获取 pET28a 载体（Addgene）、原核及真核细胞系（ATCC），随后在实验室中进行持续培养与传代。
  4. 对于大量液体，在120℃下进行高压灭菌 ˚C 下孵育 20 分钟。对于小体积样品，使用孔径为 0.22 的无菌滤器 µm 孔径
  5. 使用 HCl 或 NaOH 将溶液的 pH 值调节至所需水平，然后再定容至最终体积。
    注意：磁力镊子为定制装置，运行环境为 LabVIEW 2017，而单分子数据分析在 MATLAB 2017 中进行2,54,55.
  6. 出于安全考虑，应穿着长袖实验服，佩戴腈类手套（或由对相关物质不渗透且具有抗性的材料制成的手套）、护目镜或安全眼镜，以及防砸防滑的封闭式鞋。

2. 端粒DNA结合蛋白的表达与纯化

  1. 进行细胞培养并诱导蛋白表达。
    1. 插入端粒DNA结合蛋白的编码序列（图1A），以 TRF2 为例，通过酶切和连接将目的片段插入 pET28a 载体中，使用 SUMO 作为融合标签。将插入片段置于 BamHI 和 HindIII 限制性酶切位点之间，构建 pET28a-SUMO-TRF2 质粒（图1B).
    2. 将 pET28a-SUMO-TRF2 质粒转化至 BL21(DE3) 感受态细胞中。
      1. 解冻一份50 µ将感受态BL21(DE3)细胞置于冰上。
      2. 加入1 µ将含有50 ng DNA的pET28a-SUMO-TRF2质粒的L DNA加入感受态细胞中，轻轻混匀，避免上下吹打。
        注意：请勿涡旋震荡。
      3. 将混合物在冰上孵育30分钟。
      4. 热激时，将细胞混合物在42℃加热 °在水浴中精确孵育45秒。立即将细胞放回冰上静置2分钟，以稳定转化后的细胞。
      5. 加入950 µ向细胞中加入室温（RT）LB 培养基 L，以促进细胞恢复。
      6. 将转化后的细胞在 37 ℃ 培养 °220 rpm 摇床中 37 °C 孵育 1 小时。
      7. 铺板100 µL转化混合物于含50的LB琼脂平板上 µg/mL 卡那霉素（85.8 µM)
      8. 将接种的细胞在37℃下孵育过夜 °C. 孵育后，挑选 distinct 菌落用于接种起始培养物。
        注意：平板上的菌落可在 4 ℃ 保存 °C，最长可保存2周。
    3. 挑取一个转化后的BL21(DE3)细胞菌落，接种于5 mL添加了50 µg/mL 卡那霉素（85.8 µM）在 37 ℃ 下孵育 18 小时 °220 rpm 振荡培养。
    4. 为扩大培养，将2 mL过夜培养物转移至含有50 µg/mL 卡那霉素（85.8 µM）。继续在 37 ℃ 下孵育 °在220 rpm振荡条件下培养至600 nm处的光密度（OD 600）达到0.6–0.8。
    5. 取1 mL培养物作为未诱导的对照样品。
    6. 用异丙基诱导剩余的培养物 β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）至终浓度为 1 mM，并在 20 ℃ 下孵育 °4 ℃孵育17 h以促进蛋白表达。
    7. 使用5%浓缩胶和10%分离胶进行SDS-PAGE。加入SDS-PAGE上样缓冲液后上样，在Tris-甘氨酸缓冲液中先以100 V电泳30分钟，随后以120 V电泳50分钟。用考马斯亮蓝染色以观察蛋白质表达（见配方在 补充表1) (图1C).
      注意：若未观察到表达，请参见讨论部分以进行故障排除。
  2. 纯化该蛋白。
    1. 通过离心（4 ℃）收集细胞 °C，8500 × g 离心10分钟。弃去上清液，用200 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤沉淀。再次离心，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于25 mL裂解缓冲液（20 mM HEPES，300 mM NaCl，20 mM 咪唑，10%甘油，0.5 mM DTT，1 mM苯甲基磺酰氟[PMSF]）中。
      警告：PMSF 具有腐蚀性和毒性，可引起灼伤。请穿戴适当的防护服、手套以及眼睛/面部防护装备。
      ​注意：在 -80 冻存 °如不立即进行，请置于冰上。
    2. 加入 5 µ100 mg/mL 溶菌酶的 L，5 µL，1 U/µL DNase I，和 5 µ加入10 mg/mL RNase A溶液1 L至重悬的细胞中。
    3. 在冰上进行超声处理，以250 W功率脉冲1秒，暂停2秒，总计30分钟。
    4. 38,000 × g 离心 g, 4 °C 下孵育 40 分钟（30–60 分钟均可接受），并通过 0.22 μm 滤膜过滤上清液 µm 注射器滤器
    5. 通过将 8.76 g NaCl（终浓度 300 mM）和 0.68 g 咪唑（终浓度 20 mM）溶解于 20 mM HEPES（pH 8.0）中，配制 500 mL 镍柱结合缓冲液。使用 0.22 μm 滤膜过滤该溶液。 µm 滤膜
      警告：咪唑具有危险性，可引起皮肤和眼睛刺激，还可能对未出生胎儿造成伤害。避免与眼睛、皮肤和衣物接触。切勿摄入或吸入。佩戴个人防护装备，包括面部防护用品。
    6. 配制用于梯度洗脱的镍柱洗脱缓冲液（20 mM HEPES (pH 8.0)，300 mM NaCl），其中分别加入浓度递增的咪唑（100 mM、200 mM、300 mM 和 500 mM），确保所有缓冲液均经过适当过滤。
    7. 将过滤后的上清液加入预先用结合缓冲液（20 mM HEPES (pH 8.0)，300 mM NaCl，20 mM 咪唑）平衡的镍柱中。用结合缓冲液洗涤，然后用预先配制的咪唑梯度洗脱蛋白，共收集12个组分，每管1 mL（图1C)。合并含有 >95% 纯度。
    8. 通过 A 测定洗脱的 6xHis-sumo-TRF2 融合蛋白的浓度280 在分光光度计中。
    9. 对于单分子实验中使用的蛋白质，根据制造商的说明加入SUMO蛋白酶（通常每2 mg蛋白加入0.125 U蛋白酶） µg 融合蛋白），于 4℃ 过夜消化 °C.
    10. 经SUMO蛋白酶处理后，将混合物重新上样至Ni柱，以结合未消化的融合蛋白和带His标签的SUMO，使去标签的TRF2蛋白流穿。收集流穿组分。
  3. 测定蛋白浓度并保存蛋白。
    1. 使用截留分子量为30 kDa的离心过滤装置浓缩纯化的TRF2蛋白，并将其置换至含有20 mM HEPES（pH 8.0）、150 mM NaCl、0.5 mM DTT的储存缓冲液中，以将咪唑浓度降低至150 mM以下。
    2. 重复浓缩过程，直至体积减少至不足 1 mL。
    3. 通过 SDS-PAGE 分析各纯化步骤的样品，以评估蛋白质的纯度和完整性（图1C).
      注意：采用亲和层析法纯化蛋白质，收集并洗涤洗脱组分，同时进行SDS-PAGE以评估蛋白质完整性并确保质量控制。当仅使用亲和层析无法达到所需纯度时，可采用尺寸排阻层析进一步提高蛋白质纯度。紫外吸收曲线用于评估洗脱组分，SDS-PAGE用于验证蛋白质完整性，从而在整个过程中实现严格的质控。
    4. 将甘油加入浓缩并置换缓冲液后的蛋白质中，使其终浓度为50%，用于储存。
    5. 将蛋白质于 -80 ℃ 保存 °C.

3. 人端粒限制性片段的制备

  1. 提取基因组DNA。
    1. 按照流程图（图2A），离心 1 × 107 细胞在1000倍镜下 g 3 分钟，弃去上清液。洗涤时，将细胞重悬于 200 µL PBS，再次于1000 x g 3 分钟后，弃去上清液。
    2. 加入 760 µ含有 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)、100 mM NaCl、100 mM EDTA 和 1% SDS 的缓冲液 L 加入含有 1 x 10 的试管中7 细胞，并用移液器轻轻重悬以避免产生气泡。
      ​注意：请勿涡旋震荡。
    3. 为了消化蛋白质并消除样本中的DNase和RNase，加入蛋白酶K至终浓度为0.5 mg/mL，相当于40 µ10 mg/mL 储备溶液的 L。轻弹管底以混匀（切勿涡旋）。
    4. 在37℃下孵育过夜 °C.
    5. 加入265 µ5.4 M NaCl 溶液。通过每分钟倒置试管五次，共混匀 5 分钟，然后置于冰上 20 分钟。
    6. 以最大速度离心（例如，16,900 x g在室温下孵育10分钟。
    7. 将上清液转移至离心管中，加入等体积的异丙醇（约750 μL） µL），避免漂浮的脂质或沉淀。DNA 位于上清液中。
    8. 将离心管颠倒五次以混匀。肉眼观察确认离心管中出现DNA沉淀颗粒。
    9. 在室温下以最大速度离心10分钟。
    10. 弃去上清液。用500 μL 70%乙醇洗涤DNA沉淀。 µ通过倒置离心管五次，加入70%乙醇L。
      注意：沉淀物为DNA。
    11. 在室温下以最大速度（例如，16,900 x g10 分钟
    12. 小心移除所有上清液，留下DNA沉淀。将沉淀在室温下晾干5分钟。
      注意：避免过度干燥，因为基因组DNA可能难以溶解。
    13. 将DNA沉淀重悬于475 µL TE缓冲液（10 mM Tris-HCl [pH 8.0]，1 mM EDTA）。通过轻弹管底轻轻混匀。在DNA制备过程中如需消化RNA，加入25 µ加入10 mg/mL的RNase A溶液1 L（终浓度为0.5 mg/mL），轻轻弹击管壁混匀，直至DNA沉淀完全溶解。
      注意：避免涡旋，以防DNA剪切。
    14. 将 DNA 样本在 4 ℃ 下孵育 °C 过夜。
    15. 进行等体积的Tris饱和酚抽提：加入500 µL 酚加入离心管中，用移液器轻轻混匀，于 4 ℃ 以最大转速离心 10 分钟 °C.
      警告：接触苯酚可能引起皮肤、眼睛、鼻腔、咽喉及神经系统的刺激。避免与眼睛、皮肤和衣物接触。切勿吞食或吸入。佩戴个人防护装备，包括面部防护用品。
      注意：DNA 位于上层水相，蛋白质位于中间相，有机相位于底部。
    16. 重复三次。取DNA上清液（约280 µL)
    17. 根据DNA样本的体积，加入1/10体积（28 µL) 的 3 M 醋酸钠（终浓度 0.3 M，pH 5.2）和 2 体积（616 µL）冷的100%乙醇。将离心管置于-80 °C，2-3 小时。
    18. 在 4 °C 下以最大速度（例如 16,900 × g）离心 10 分钟 °C. 若溶液在离心前已冻结，请在冰上解冻。
    19. 弃去上清液，通过倒置离心管用70%乙醇洗涤3–4次。在4℃下以最大转速离心5分钟。 °C.
    20. 去除乙醇，将沉淀物在室温下晾干5分钟。
    21. 加入100 µL TE 缓冲液，轻弹管壁混匀，置于 4℃ 静置 °C 下孵育 2 小时以充分溶解。
      注意：在1%琼脂糖凝胶上检测基因组DNA的完整性（图2B).
    22. 将 DNA 储存于 -20 °在冷冻条件下可稳定保存至少1年。
  2. 进行基因组DNA的消化与修饰。
    1. 取4 µ克基因组DNA并将其与1 µCviAII（10 U）2 μL µL 的 10x 消化缓冲液（参见 补充表1 用于配制溶液），加水至总体积为 20 µL. 将混合物在25℃下孵育 °12 小时，4°C
      注意：FatI 可替代 CviAII，后者现已被 NEB 停止供应。
    2. 加入1 µNdeI（20 U）的 L µMseI（10 U）的 L，并且 1 µBfaI（10 U）1 μL 加入含有前述混合物的同一离心管中（20） µL）。同时，加入 2 µ10x 消化缓冲液 L 和 15 µ升水以达到总体积为40 µL. 37 ℃孵育 °C 下孵育 12 小时，然后在 80 ℃ 加热灭活所有酶 °C，20 分钟。
      ​注意：基因组DNA的消化情况可通过末端限制性片段（TRF）方法进行检测（图2C使用四种限制性内切酶（CviAII、NdeI、MseI 和 BfaI）组合消化基因组 DNA，可将其切割为约 800 bp 的片段，并获得端粒重复序列片段（TRFs），且端粒旁区 DNA 污染最少。
    3. 用于地高辛标记，取 40 µ消化后的基因组 DNA 的 L，并加入 4 µ1 mM dATP 溶液 4 L（终浓度 0.08 mM） µ1 mM 地高辛-11-dUTP 溶液 L（终浓度 0.08 mM），1 µL Klenow片段（5 U），0.5 µ1 升 100 毫摩尔/升 DTT（终浓度 1 毫摩尔/升）和 1 µ升10倍浓度消化缓冲液。37℃孵育 °C 12小时，随后在75 °C 反应 20 分钟以灭活 Klenow 片段。
    4. 用于生物素标记，取 12.5 µ地高辛修饰的基因组DNA的L片段（1 µg）并加入1 µ1 升 µM生物素标记的端粒探针（即1 pmol），该探针与端粒单链突出端互补。加入611.5 µL TE Li缓冲液（10 mM Tris-HCl (pH 8.0)，1 mM EDTA，50 mM LiCl）稀释50 mM K离子至1 mM，总体积为625 µL，可分装为16管，每管39 µL 每份。
    5. 75℃加热 °C，持续3分钟，然后以每步0.1 °每30秒一次，直至达到25次 °C.
    6. 将 DNA 样本储存于 -20 °至少一年。

4. 在磁镊上为端粒DNA样本设置流动池

  1. 制作用于单分子实验的流动池。
    1. 使用电动研磨机在顶部盖玻片（#2 盖玻片，厚度为 0.2 mm）上钻孔，作为进样口和出样口。
    2. 将盖玻片置于洗涤剂中，超声清洗 30 分钟。
    3. 用超纯水清洗盖玻片 3 次。
    4. 将盖玻片置于异丙醇中，超声清洗 30 分钟。
    5. 用超纯水清洗盖玻片 3 次。
    6. 将盖玻片置于超纯水中，超声清洗 15–30 分钟。
    7. 用氮气吹干盖玻片。
      注：本步骤完成后可暂停实验流程，清洗后的盖玻片可储存以备后续使用。
    8. 在底部盖玻片（无孔）上加入 20 µL 0.1% 硝酸纤维素溶液，并加入参考微球（稀释 20 倍，直径 3 µm）。在 100 °C 下烘烤 4 分钟。
    9. 使用手术刀按照金属模具切割双层 Parafilm 间隔层。该模具为一块与盖玻片尺寸相同的矩形铝合金片，中心镂空，便于通道切割。
    10. 组装流动池夹心结构（图 3A）。在 85 °C 下加热，并用两根棉签轻轻按压，直至 Parafilm 完全密封通道。
    11. 用抗体包被流动池。将 70 µL 抗地高辛抗体（0.1 mg/mL）直接注入流动池中，在室温下孵育 1 小时。
    12. 对流动池进行钝化处理。注入 70 µL 10 mg/mL 牛血清白蛋白（BSA）溶液，以置换未结合的抗地高辛抗体。室温孵育 12 小时。未结合的抗地高辛抗体将在后续步骤中通过充分冲洗被清除。
      注：流动池可在 4 °C 下保存 1–2 周。
    13. 通过向流动池中注入 5 µL 未结合 DNA 的洗涤后 MyOne 微球（10 mg/mL）或 5 µL 洗涤后的 M270 微球（10 mg/mL），检测非特异性结合。孵育 10 分钟后，使用工作缓冲液（20 mM HEPES（pH 7.5），100 mM NaCl，1 mM EDTA）冲洗去除微球。统计一个视野中粘附在表面的微球数量。处理良好的表面应无或仅有极少数微球残留。
  2. 在流动池中分离并固定端粒 DNA 分子。
    1. 取 10 µL M270 微球（10 mg/mL）或 5 µL 10 mg/mL MyOne 微球，使用磁铁分离，以 50 µL 工作缓冲液（20 mM HEPES [pH 7.5]，100 mM NaCl，1 mM EDTA）洗涤 5 次。
    2. 取 500 ng 消化后的基因组 DNA，置于 1.5 mL 离心管中。将全部微球（50 µL）加入 DNA 样品上方。
    3. 不要使用移液器吹打，轻轻弹动离心管数次以混匀微球与 DNA 样品。冰上孵育 1 小时。使用磁铁分离微球，以 500 µL 工作缓冲液洗涤 3 次，每次间隔 10 分钟。
    4. 用 30 µL 工作缓冲液重悬样品，并将混合液加载至流动池中。孵育 30 分钟后，冲洗去除未结合的磁性微球。
      注：端粒 DNA 通过地高辛-抗体与生物素-链霉亲和素介导的亲和相互作用，在底部盖玻片与磁性微球之间形成连接（图 3B）。
  3. 在磁镊系统上安装流动池。
    1. 用 70% 乙醇清洁流动池，并用镜头纸擦干表面。将清洁后的流动池放置在下部样品托上，使用螺丝刀小心安装上部样品架。
    2. 在流动池底面（与物镜对齐的位置）滴加一滴镜头油。然后将样品托放置在物镜上方，并用螺丝刀固定。
    3. 选择一对 5 mm 的立方磁铁，将其垂直排列。将磁铁支架与磁镊系统的光路 X 轴对齐。
      ​注：此步骤至关重要。磁场方向由磁铁支架的取向决定。
    4. 启动图形化编程软件，并连接磁镊控制器。调节视野，定位流动池底部的参考微球，并微调物镜，使参考微球呈现清晰的衍射环。
    5. 将磁铁缓慢下移至流动池顶部。
      注：此步骤至关重要。微球衍射图样的突然变化表明磁铁刚刚接触流动池表面，该位置即为测量零点的偏移位置。
      注：应小心降低磁铁，初始使用较大步长，逐渐转为较小步长。接近流动池时以 0.1 mm 为增量移动，避免损坏流动池。
    6. 将磁铁升至最高位置，并取下磁铁支架。
    7. 开启连接废液瓶的蠕动泵，排出液体。向进样口加入 100 µL 工作缓冲液，并将蠕动泵流速设为 100 µL/min，以缓冲液充满流动池。

使用单分子磁镊测量端粒

  1. 安装摄像头。
    1. 将互补金属氧化物半导体（CMOS）相机的灰度通过亮度调节设置为150级。
    2. 定义感兴趣区域（ROI）的大小。
    3. 将帧率设置为 200 Hz，曝光时间为 5000 µs.
      注意：此为关键步骤。务必确保快门死区时间设置为零。
    4. 将磁铁位置移动至 3 cm（约 8 pN），并调节物镜焦点至微珠。
  2. 建立查找表（LUT）。
    1. 将磁铁移动至对应 8 pN 的位置，以充分拉伸连接 DNA 的磁珠。
    2. 将LUT设置为200步，步长为0.05 µm
    3. 使用CMOS相机捕获磁珠在不同位置的轮廓，以建立查找表（LUT）。
      ​注意：此步骤至关重要。固定在流动池中的聚苯乙烯珠用作参考珠，以消除目标珠的漂移。
  3. 设计单分子力学实验。
    1. 编写一个 MATLAB 脚本来控制力斜坡或力跃迁实验中的电机运动。
      注意：这是关键步骤。该脚本编码了磁体移动的指令。在此步骤中设定力 ramp 实验的力加载速率，同时也确定 force jump 实验的力水平和持续时间（图4, 补充文件1，补充文件2 和 补充文件 3).
    2. 将脚本导入图形化编程软件以测试单分子实验。
    3. 检查单分子实验所需的总帧数，并确保可用内存超过此需求。
      注意：如果分配的内存小于所需容量，由于保存数据需要时间，数据将会丢失。
    4. 验证最大成像速度，以确定可同时监测的磁珠最大数量。
      注意：如果超过成像速度限制，实验将被终止。
    5. 以力跃实验为例，进行单分子力学实验。将力突然施加于磁珠，磁珠将力传递至DNA分子，使其立即向上伸展。

使用磁镊测量端粒上的TRF1/2

  1. 力斜坡实验
    1. 以 TRF1 为例，在较低流速（例如 30 µL/min）下将 200 µL 的 10 nM TRF1 加入流动池中。孵育 30 分钟，使 TRF1 与端粒 DNA 结合。
    2. 选择一个力斜坡实验的程序，设定力加载速率为 ±1 pN/s。
    3. 正确命名数据文件并运行实验。数据将保存至指定位置以供分析（图 5）。
      注意：在本实验中，力在 0 pN 到 17 pN 之间线性增加和减少，从而拉伸和松弛端粒 DNA，并破坏由 TRF1/2 介导的 DNA 环结构。
  2. 力跃实验
    1. 选择一个用于运行力跃实验的程序。
      注意：施加不同大小的力以拉伸端粒 DNA，例如，“静止力”（Frest）在 0 pN 下持续 40 秒，“测试力”（Ftest）在 2–8 pN 范围内持续 60 秒，“高力”（Fhigh）在 10 pN 下持续 30 秒，以及“最大力”（Fmax）在 20 pN 下持续 30 秒。
    2. 正确命名数据文件并运行实验。数据将保存至指定位置以供分析（图 5）。

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结果

图1A展示了TRF1和TRF2的示意图结构域和结构，其分别由439和542个氨基酸组成，可在原核细胞中表达。TRF1的制备方法已在文献中先前报道41。本文中，我们提供了TRF2制备的详细描述及代表性结果。图1B显示了用于在E. coli中表达TRF2的质粒图谱。我们评估了E. coli中诱导前后TRF2的表达情况，如图1B所示。纯化及标签切割过程也通过SDS-PAGE进行了分析（图1C）。按照本方案，两种端粒结合蛋白TRF1和TRF2均在E. coli中成功表达。

使用四种限制性内切酶联合消化人类基因组，可获得以末端限制性片段（TRF）形式存在的端粒DNA。按照图2A所示流程图，我们从人类细胞中...

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讨论

本方案采用磁镊技术在单分子水平上对TRF进行操控57,58,59。我们利用磁珠将TRF从基因组DNA片段中分离出来。在完成限制性酶切后，TRF会结合到磁珠上，从而易于与基因组DNA片段分离。该方法可利用磁镊对样品进行操控，磁镊能够有效捕获磁珠，而光镊则受限于透明度问题。此外，虽然原子力显微镜（AFM）也可用于单分子操控，但需要额外步骤将TRF从磁珠上解离，并将其固定在云母表面与悬臂针尖之间。相比之下，磁镊为TRF的单分子操控提供了更直接且高效的方法，无需这些额外操作步骤41。

保持基因组DNA和端粒重复序列片段（TRFs）的完整性至关重要，因为单分子操作依赖于完整的TRFs。利用磁镊技术，我们通过固定TRFs的两端来拉伸和松弛这些片段，以研究蛋白质-DNA相互作用。对磁珠施加的力进行精确测量是单分子力学实验的基础5...

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益或其他利益冲突。

致谢

本工作得到中国国家自然科学基金［资助号 32071227 至 Z.Y.］、中国天津市自然科学基金（22JCYBJC01070 至 Z.Y.）以及精密测试技术及仪器国家重点实验室（天津大学）［资助号 pilab2210 至 Z.Y.］的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗地高辛Roche11214667001
BfaI新英格兰生物实验室 (NEB)R0568S
BSASigma-AldrichV900933
CMOS 相机 MikrotronMC1362
CviAII新英格兰生物实验室 (NEB)R0640S
DIG-11-dUTPJena BioscienceNU-803-DIGXL
DNA 提取液G-CLONEEX0108
DNase I，无 RNase，Hc Ea赛默飞世尔科技EN0523
dNTP 混合物南京诺唯赞生物科技股份有限公司 (Vazyme)P032-02
DTTSolarbioD1070
Dynabeads M-270  磁珠赛默飞世尔科技65305链霉亲和素磁珠
Dynabeads MyOne 磁珠赛默飞世尔科技65001链霉亲和素磁珠
乙醇天津第六化学试剂厂1083
甘油北京华威锐科化工有限公司SMG66258-1
咪唑SolarbioII0070
IPTGSolarbioI8070
异丙醇天津第六化学试剂厂A1079
卡那霉素赛默飞世尔科技EN0523
Klenow 片段 (3′-5′ 外切酶缺陷型)新英格兰生物实验室 (NEB)M0212S
LabView国家仪器公司https://www.ni.com/en-us/shop/product/labview.html图形化编程软件 
LiCl毕得医药科技有限公司 (bidepharm)BD136449
溶菌酶SolarbioL8120-5
MseI新英格兰生物实验室 (NEB)R0525S
NaCl上海阿拉丁C111533
NanoDrop赛默飞世尔科技分光光度计
NdeI新英格兰生物实验室 (NEB)R0111S
Ni NTA Beads 6FF常州智晟生命科技有限公司SA005025
硝酸纤维素膜ABclonalRM02801
PMSFSolarbioP8340
蛋白酶 K碧云天生物技术有限公司 (beyotime)ST535-500mg
rCutSmart 缓冲液新英格兰生物实验室 (NEB)B6004S
RNase ASigma-AldrichR4875
乙酸钠SERVA Electrophoresis GmbH2124902
Sumo 蛋白酶碧云天生物技术有限公司 (beyotime)P2312M

参考文献

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