本方案展示了如何利用单分子磁镊技术研究端粒DNA结合蛋白（端粒重复序列结合因子1 [TRF1] 和 TRF2）与从人类细胞中提取的长端粒之间的相互作用。文中描述了端粒和端粒重复序列结合因子的制备步骤、单分子实验的操作流程，以及数据采集与分析方法。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
染色体末端的保护性结构——端粒，对于维持细胞寿命和基因组稳定性至关重要。其正常功能依赖于复制、延伸和损伤应答等高度调控的过程。 Shelterin 复合物，尤其是端粒重复序列结合因子 1（TRF1）和 TRF2，在端粒保护中发挥关键作用，并已成为药物研发中潜在的抗癌靶点。这些蛋白质可结合于端粒 DNA 的重复序列 TTAGGG，促进保护性结构的形成，并招募其他端粒相关蛋白。结构生物学方法和先进成像技术已揭示了端粒蛋白与 DNA 相互作用的机制，但要研究其动态过程仍需依赖单分子技术。磁镊、光镊和原子力显微镜（AFM）等工具已被用于研究端粒蛋白-DNA 相互作用，揭示了诸如 TRF2 依赖性的 DNA 变形以及端粒酶催化过程等重要细节。然而，构建含有端粒重复序列的单分子体系仍是一项具有挑战性的任务，可能限制了单分子力学方法在该领域的广泛应用。为解决这一问题，我们开发了一种利用全长人端粒 DNA 结合磁镊技术研究相互作用的方法。本实验方案详细描述了 TRF2 的表达与纯化、端粒 DNA 的制备、单分子力学实验的建立以及数据分析流程。该详尽指南将有助于从事端粒生物学及靶向端粒药物研发的研究人员。
引言
端粒是位于染色体末端的保护性结构1,2,3。细胞分裂过程中端粒的缩短会导致细胞衰老和机体老化，而端粒的异常延长则与癌症的发生相关4,5。为了确保端粒正常发挥功能，其复制、延长以及对损伤的响应必须受到高度调控6,7,8。由六个亚基组成的端粒保护蛋白复合物（Shelterin）在端粒保护中起核心作用9,10,11。对端粒更深入的理解将为端粒生物学提供宝贵的见解。
TRF1 和 TRF2 是端粒保护蛋白复合物 shelterin 的核心亚基，属于端粒 DNA 结合蛋白12,13。TRF1 和 TR....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 通用材料与方法
- 请参阅 材料表 本方案所用盐类、化学品、抗生素、酶、抗体及树脂材料的文件。
- 制备LB（Luria-Bertani）液体培养基、LB琼脂平板、HEPES缓冲液、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）、磷酸盐缓冲液（PBS）以及Tris-EDTA（TE）缓冲液，具体配方参照《冷泉港实验方案》。45,46,47,48,49,50,51,52,53.
- 通过商业渠道获取 pET28a 载体（Addgene）、原核及真核细胞系（ATCC），随后在实验室中进行持续培养与传代。
- 对于大量液体，在120℃下进行高压灭菌 ˚C 下孵育 20 分钟。对于小体积样品，使....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
图1A展示了TRF1和TRF2的示意图结构域和结构，其分别由439和542个氨基酸组成，可在原核细胞中表达。TRF1的制备方法已在文献中先前报道41。本文中，我们提供了TRF2制备的详细描述及代表性结果。图1B显示了用于在E. coli中表达TRF2的质粒图谱。我们评估了E. coli中诱导前后TRF2的表达情况，如图1B所示。纯化及标签切割过程也通过SDS-PAGE进行了分析（图1C）。按照本方案，两种端粒结合蛋白TRF1和TRF2均在E. coli中成功表达。
使用四种限制性内切酶联合消化人类基因组，可获得以末端限制性片段（TRF）形式存在的端粒DNA。按照图2A所示流程图，我们从人类细胞中.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本方案采用磁镊技术在单分子水平上对TRF进行操控57,58,59。我们利用磁珠将TRF从基因组DNA片段中分离出来。在完成限制性酶切后，TRF会结合到磁珠上，从而易于与基因组DNA片段分离。该方法可利用磁镊对样品进行操控，磁镊能够有效捕获磁珠，而光镊则受限于透明度问题。此外，虽然原子力显微镜（AFM）也可用于单分子操控，但需要额外步骤将TRF从磁珠上解离，并将其固定在云母表面与悬臂针尖之间。相比之下，磁镊为TRF的单分子操控提供了更直接且高效的方法，无需这些额外操作步骤41。
保持基因组DNA和端粒重复序列片段（TRFs）的完整性至关重要，因为单分子操作依赖于完整的TRFs。利用磁镊技术，我们通过固定TRFs的两端来拉伸和松弛这些片段，以研究蛋白质-DNA相互作用。对磁珠施加的力进行精确测量是单分子力学实验的基础5.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明不存在竞争性财务利益或其他利益冲突。
致谢
本工作得到中国国家自然科学基金［资助号 32071227 至 Z.Y.］、中国天津市自然科学基金（22JCYBJC01070 至 Z.Y.）以及精密测试技术及仪器国家重点实验室（天津大学）［资助号 pilab2210 至 Z.Y.］的支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 抗地高辛 | Roche | 11214667001 | |
| BfaI | 新英格兰生物实验室 (NEB) | R0568S | |
| BSA | Sigma-Aldrich | V900933 | |
| CMOS 相机 | Mikrotron | MC1362 | |
| CviAII | 新英格兰生物实验室 (NEB) | R0640S | |
| DIG-11-dUTP | Jena Bioscience | NU-803-DIGXL | |
| DNA 提取液 | G-CLONE | EX0108 | |
| DNase I，无 RNase，Hc Ea | 赛默飞世尔科技 | EN0523 | |
| dNTP 混合物 | 南京诺唯赞生物科技股份有限公司 (Vazyme) | P032-02 | |
| DTT | Solarbio | D1070 | |
| Dynabeads M-270 磁珠 | 赛默飞世尔科技 | 65305 | 链霉亲和素磁珠 |
| Dynabeads MyOne 磁珠 | 赛默飞世尔科技 | 65001 | 链霉亲和素磁珠 |
| 乙醇 | 天津第六化学试剂厂 | 1083 | |
| 甘油 | 北京华威锐科化工有限公司 | SMG66258-1 | |
| 咪唑 | Solarbio | II0070 | |
| IPTG | Solarbio | I8070 | |
| 异丙醇 | 天津第六化学试剂厂 | A1079 | |
| 卡那霉素 | 赛默飞世尔科技 | EN0523 | |
| Klenow 片段 (3′-5′ 外切酶缺陷型) | 新英格兰生物实验室 (NEB) | M0212S | |
| LabView | 国家仪器公司 | https://www.ni.com/en-us/shop/product/labview.html | 图形化编程软件 |
| LiCl | 毕得医药科技有限公司 (bidepharm) | BD136449 | |
| 溶菌酶 | Solarbio | L8120-5 | |
| MseI | 新英格兰生物实验室 (NEB) | R0525S | |
| NaCl | 上海阿拉丁 | C111533 | |
| NanoDrop | 赛默飞世尔科技 | 分光光度计 | |
| NdeI | 新英格兰生物实验室 (NEB) | R0111S | |
| Ni NTA Beads 6FF | 常州智晟生命科技有限公司 | SA005025 | |
| 硝酸纤维素膜 | ABclonal | RM02801 | |
| PMSF | Solarbio | P8340 | |
| 蛋白酶 K | 碧云天生物技术有限公司 (beyotime) | ST535-500mg | |
| rCutSmart 缓冲液 | 新英格兰生物实验室 (NEB) | B6004S | |
| RNase A | Sigma-Aldrich | R4875 | |
| 乙酸钠 | SERVA Electrophoresis GmbH | 2124902 | |
| Sumo 蛋白酶 | 碧云天生物技术有限公司 (beyotime) | P2312M |
参考文献
- Blackburn, E. H., Epel, E. S., Lin, J. Human telomere biology: A contributory and interactive factor in aging, disease risks, and protection. Science. 350 (6265), 1193-1198 (2015).
- Li, N., et al. The dynamics of form....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
