本文介绍了一种简化的新城疫病毒血清学检测用4血凝单位抗原的制备方法。通过准确定量抗原的血凝效价，结合更为严格的反向滴定法以及明确的调整流程，该方法可提高检测效率，减少假阳性结果，并改善家禽疫病的监测能力。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
准确评估新城疫病毒（NDV）抗体滴度对于有效控制和监测家禽疾病至关重要。本文介绍了一种优化的4血凝单位（4-HAU）抗原溶液制备方法，该溶液是用于NDV血清学检测的血凝抑制试验（HI）中的关键组分。与传统方法相比，传统方法需耗时且缺乏明确步骤的反向滴定和调整过程，本方法通过使用一系列初始稀释度（1:3、1:5、1:7和1:9）精确测定HA滴度，从而简化了该流程。我们还提供了一种基于反向滴定结果进行调整或重新配制的具体方法，减少了重复反向滴定的需求。此外，我们评估了4-HAU抗原溶液准确性对血清HI滴度的影响，发现当4-HAU抗原滴度低于3时，会导致假阳性HI样本的出现。通过提供一种精确的方法并最小化计算任务，该方法提高了检测的效率和可靠性，有助于加强家禽群体中的疾病监测与控制。
引言
新城疫（Newcastle Disease, ND）是一种在全球范围内广泛传播且严重的家禽疾病1,2,3。其临床症状多样，包括高热、呼吸困难、痢疾、神经系统紊乱以及黏膜出血4。该病由新城疫病毒（Newcastle Disease Virus, NDV）引起，该病毒已存在近一个世纪，可感染超过200种鸟类，包括鸡、鸭、鹅和鸽子5。病毒主要通过与感染禽类的直接或间接接触传播，家禽、鸽子以及野生鸟类均可成为潜在的病毒储存宿主6。尽管NDV仅有一个血清型，但其遗传多样性给疾病的管理和防控带来了重大挑战3,7。
疫苗接种是控制新城疫的主要策略，辅以严格的生物安全措施5,8。目前全球已有多种商用禽类疫苗，免疫后可诱导产生强烈的血清抗体反应9。这些抗体在接触强毒株时对减轻临床症状严重程度以及抑制禽群间传播具有关键作用10。在新城疫流行地区，通常每6至12周使用活弱毒疫苗进行加强免疫，已成为常规做法9。对商用禽群在免疫后定期监测抗体滴度，对于评估疫苗效力至关重要11,12,13。免疫后抗体滴度偏低可能提示疫苗失效，需及时采取补救措施，例如补充免疫或调查可能影响免疫应答的免疫抑制因素14。
检测针对NDV的血清抗体有多种技术，包括酶联免疫吸附试验、血凝抑制（HI）试验和中和试验9,13,15,16。每种方法在灵敏度、特异性和成本效益方面各有其独特的优缺点。
本文基于世界动物卫生组织（OIE）的实验方案，详细阐述了一步一步进行血凝抑制（HI）试验的操作流程，用于定量检测血清中针对新城疫病毒（NDV）的特异性抗体滴度11。血凝（HA）现象是由某些包膜病毒（如NDV）引起的红细胞（RBCs）聚集反应9。NDV表面的血凝素-神经氨酸酶（HN）蛋白与红细胞相互作用，导致细胞聚集并形成晶格结构2。由于HI试验能够评估血清抗体对NDV HN蛋白的特异性，因此被优选为一种血清学检测方法8,9。此外，该方法成本低廉，且无需依赖特殊仪器，因而适用于常规检测，具有良好的可及性和实用性。
为提高检测效率，我们优化了OIE规程11的工作流程，重点在于获得更准确的血凝抗原滴度，并针对4个血凝单位（4-HAU）抗原溶液提供了详细的调整方案。此外，通过比较分析，我们评估了4-HAU准确性对血凝抑制（HI）结果的影响，为现场操作人员提供了有价值的参考依据。该方法不仅适用于新城疫病毒（NDV）抗体检测，还可拓展至麻疹病毒、多瘤病毒、腮腺炎病毒和风疹病毒等其他血凝病毒及其亚型的检测。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
本方案已获得当地机构动物护理和使用委员会的批准。所有涉及活病毒抗原和临床血清样本的操作均在生物安全二级实验室中进行，符合既定的安全规程。
1. 1% 鸡红细胞悬液的制备
- 向一个无菌的 15 mL 圆锥形离心管中加入 3 mL Alserver 溶液（抗凝剂）。
- 从三只非免疫鸡（无 NDV 抗体）的翼静脉各采集 1 mL 血液，立即转移至含有抗凝剂的离心管中，并轻轻混匀。
- 用无菌的 1×磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2–7.4）将离心管加满至总体积 12 mL，并轻轻混匀。使用水平转子在 500 × g 条件下离心 10 分钟。
- 小心移除上清液和白细胞层。重复步骤 1.3 和 1.4 两次，以获得红细胞沉淀（RBC pellet）。
- 用移液器反复吹打将 1 mL 红细胞沉淀重悬于 99 mL 无菌 PBS 中，制备成 1% 的红细胞悬液。
注意：每块板所需的 1% 鸡红细胞悬液体积约为 3 mL（25 µL/孔 × 96 孔 × 1.25 = 3.0 mL；其中 1.25 为移液损耗系数，以确保足够体积）。
2. 冻干抗原或血清的重悬
- 向含有冻干抗原或血清的小瓶中加入 2 mL 无菌 PBS。轻轻振荡小瓶，并静置 2–3 分钟，以减少气泡并确保完全溶解。
注意：请遵循特定生产商的说明，因为本研究未比较不同类型的冻干材料。 - 将重悬后的溶液分装至 1.5 mL 离心管中，并于 -20 °C 冷冻保存，直至使用。
注意：每次抗原解冻使用时，或每次制备新的红细胞悬液时，均需重新测定血凝效价（HA titer）。
3. 抗原的HA滴定
- 将 PBS 分别吸取 40、80、120 和 160 µL 加入一次性 96 孔 V 型底微孔板中相邻的四个孔内，然后向每孔加入 20 µL 抗原，通过上下吹打 10 次混匀，得到 1:3、1:5、1:7 和 1:9 的稀释度。稀释操作的示意图见图 1。
图1：血凝试验中抗原溶液稀释步骤的示意图。 抗原溶液分别以1:3、1:5、1:7和1:9的比例在PBS中进行稀释。图中蓝色部分代表孔板或离心管中的PBS，绿色部分代表抗原。请点击此处查看该图的放大版本。
- 标记一个新的微孔板。向第1至第5行的每个孔中加入25 µL PBS。
- 使用多通道移液器将25 µL稀释后的抗原溶液加入第1至第5行的第一个孔中，并通过上下吹打至少5次进行混匀。
- 将每行第一个孔中的25 µL液体转移至第二个孔，并充分混匀。依次逐孔转移至第11列，以制备两倍系列稀释液（稀释比例为1:2至1:2048）。在完成第11列后的转移后，弃去25 µL液体。
- 从抗原浓度最低的孔开始，向每个孔中加入25 µL PBS。
- 再次从抗原浓度最低的孔开始，向每个孔中加入25 µL 1% 鸡红细胞悬液。
- 将微孔板置于微孔板振荡器上，振荡约20秒以充分混匀。
- 将板置于室温（20–25 °C）台面上静置约30分钟，直至第12列的红细胞完全沉降。板的布局请参见图2。
图2：血凝试验中所用微孔板的示意图布局。 第1至第5行的第一列包含未稀释及不同初始稀释度的抗原溶液，随后从左到右进行两倍连续稀释，直至第11列。PBS对照置于最后一列。由深至浅的梯度表示抗原浓度逐渐降低。请点击此处查看该图的放大版本。
- 读取并记录结果。通过将板倾斜90°约25秒，观察红细胞是否呈泪滴状流动，以判断血凝情况。完全发生血凝（无流动）的最高稀释度即为1个血凝单位（HA Unit）。第12列孔用作红细胞（阴性）对照。
- 使用表1计算每行的血凝滴度，取其中最大值用于制备4-HAU抗原溶液。例如，若a、b、c、d和e分别为9、8、7、6、6，则最大值为3 × 28 = 768，此值即为抗原储备液的血凝滴度。
| 抗原 | 完全血凝（HA）的最高稀释倍数列 | 未稀释原液的HA滴度 |
| 未稀释原液 | a | 2a |
| 3倍稀释 | b | 3 x 2b |
| 5倍稀释 | c | 5 x 2c |
| 7倍稀释 | d | 7 x 2d |
| 9倍稀释 | e | 9 x 2e |
表1：血凝试验结果及原液血凝滴度的计算。
4. 4-HAU 抗原溶液的制备
- 计算制备 4-HAU 抗原溶液的稀释倍数：
。确定所需的总 4-HAU 体积：V = 3 mL × 微孔板数量。然后计算所需抗原储备液的体积：
，以及 PBS 的体积：Vp = V - Va。
注意：体积单位为毫升。每块微孔板按 3 mL 估算（25 µL/孔 × 96 孔 × 1.25 = 3 mL）。 - 用移液器将计算好的 PBS 体积加入容器中，然后加入相应体积的抗原储备液，充分混匀，得到 4-HAU 抗原溶液。
注意：4-HAU 抗原溶液应尽快使用。
5. 4-HAU 抗原溶液的返滴定
- 将 PBS 分别取 25、50、75、100、125 和 150 µL 加入微孔板中相邻的六个孔内，然后向每孔加入 25 µL 的 4-HAU 抗原溶液，并用移液器吹吸混匀 10 次。
注意：用 PBS 将 4-HAU 抗原溶液按 1:2、1:3、1:4、1:5、1:6 和 1:7 的比例进行稀释。稀释操作的示意图见图3。
图 3：反向滴定中 4 个血凝单位溶液稀释步骤的示意图。 4-HAU 工作溶液用 PBS 按 1:2、1:3、1:4、1:5、1:6 和 1:7 的比例进行稀释。PBS 以蓝色表示，抗原以绿色表示。 请点击此处查看该图的放大版本。
- 使用多通道移液器将每种稀释后的抗原溶液各25 µL转移至另一排的孔中。另取一个孔加入25 µL PBS作为阴性对照。
- 向每个孔中加入25 µL PBS，然后向每个孔中加入25 µL 1% 鸡红细胞（RBC）。
- 将板置于微孔板振荡器上振荡约20秒以混匀。
- 将板静置于室温（20–25 °C）台面上约30分钟，直至阴性对照孔中的红细胞完全沉降。
- 读取并记录结果。
注意：阴性对照孔应无血凝现象。理想情况下，1:4稀释度应恰好为出现完全血凝的最高稀释度。若4-HAU溶液的滴度高于4，则最高稀释度可能为1:5、1:6或1:7；若低于4，则可能为1:2或1:3。回滴定实验的示意图及代表性结果见图4。
图4：返滴定实验的孔板布局及代表性结果。 稀释后的4-HAU工作液转移至新一行，另设PBS对照。由深至浅的绿色梯度表示抗原浓度从高到低。代表性结果表明，1:4稀释是显示完全血凝现象的最高稀释倍数。 请点击此处查看该图的放大版本。
- 必要时调整或重新配制 4-HAU 抗原溶液。
注意：如果返滴定中使用的 4-HAU 抗原溶液体积 ≤ 总体积的 1%（即 4-HAU 抗原溶液体积 ≥ 15 mL），请参考表 2进行具体调整。例如，若完全血凝的最高稀释度为 1:2，则 4-HAU 抗原溶液的滴度现为 2，应加入与先前配制 4-HAU 抗原溶液时等量的抗原。相反，若完全血凝的最高稀释度为 1:6，则滴度现为 6，应补充一半体积的 PBS。
如果返滴定中使用的体积超过总体积的 1%（即 4-HAU 抗原溶液体积<15 mL），则应使用校正后的稀释因子重新配制 4-HAU 抗原溶液。具体校正方法请参见表 3。例如，若完全血凝的最高稀释度为 1:2，则 4-HAU 抗原溶液的滴度现为 2，稀释因子应调整为原始值的 1/2。相反，若完全血凝的最高稀释度为 1:6，则 4-HAU 抗原溶液的滴度现为 6，稀释因子应调整为原始值的 3/2。
| 回滴定的 HA 滴度 | 抗原或 PBS 的补充量 |
| 1:2 | Va |
| 1:3 | Va/3 |
| 1:5 | Vp/4 |
| 1:6 | Vp/2 |
| 1:7 | 3Vp/4 |
表2：根据反向滴定结果调整4-HAU浓度的参考表。 Va 和 Vp 分别代表配制4-HAU抗原溶液时所用抗原和PBS的体积。
| 返滴定的 HA 滴度 | 稀释因子校正 |
| 1:2 | D/2 |
| 1:3 | 3D/4 |
| 1:5 | 5D/4 |
| 1:6 | 3D/2 |
| 1:7 | 7D/4 |
表3：重新配制4-HAU抗原时稀释因子校正的参考表。 D代表先前在4-HAU抗原配制中使用的稀释倍数。
6. 血清的制备
- 从鸡翅中采集约 1 mL 血液，不使用抗凝剂。
- 将血液转移至 1.5 mL 离心管中，在 37 °C 下孵育约 2 小时。在 3,000 × g 条件下离心 10 分钟，小心吸取上清液至新管中。
7. 血凝抑制试验
- 根据检测方案设计标记微孔板。使用多通道移液器向第1至第11列的每个孔中加入25 µL PBS，向第12列的每个孔中加入50 µL。
- 向每行的第一个孔（包括阳性与阴性血清对照行）加入25 µL血清。通过上下吹打至少5次，充分混匀。
- 将每行第一个孔中的25 µL液体转移至第二个孔，并充分混匀。继续从第二孔向第三孔依次进行转移与混匀操作，直至第10列。混匀后，弃去第10列孔中的25 µL液体。
- 按照血清浓度由低到高的方向，向第1至第11列的每个孔中加入25 µL 4-HAU抗原。
- 将板置于微孔板振荡器上振荡约20秒，随后在室温下静置约30分钟。
- 按照血清浓度由低到高的方向，向每个孔中加入25 µL 1%鸡红细胞（RBC）。
- 将板置于微孔板振荡器上振荡约20秒以充分混匀，随后在室温下静置约30分钟，直至PBS对照孔中的红细胞完全沉降。
- 读取并记录结果。
注意：HI效价是指能够完全抑制4-HAU抗原血凝作用的最高血清稀释度。通过将板倾斜90°持续25秒，可在每行最后一列观察到泪滴状红细胞流线。在每行倒数第二个孔中可观察到完全血凝（无流线现象）。有效检测结果需满足以下条件：阳性血清对照的HI效价与已知HI效价相差不超过一个稀释度；阴性血清对照的HI效价≤ 2 log2；红细胞对照无自凝现象。有关HA检测流程的示意图，请参见图5。
图 5：血凝试验工作流程示意图。 PBS 以蓝色表示，血清为黄色，4-HAU 抗原溶液为绿色，1% 鸡红细胞悬液为红色。箭头指示液体加样顺序。 请点击此处查看该图的放大版本。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
使用优化方法配制的4-HAU抗原溶液效价的验证
本研究采用抗原储备液的不同稀释度，精确定量血凝（HA）效价，从而计算配制4-HAU抗原溶液所需的稀释倍数。结果表明，该优化方法兼具高效性与精确性，显著减少了重复回滴定和调整步骤的次数。在第一种情况下，初始HA效价约为512，最终效价为768，符合4-HAU抗原溶液的配制要求（图6）。同样，在第二种情况下，初始效价约为256，最终未发生变化，确保所配制的4-HAU抗原溶液满足实验标准（图7）。最后，当初始效价约为128时，测定的精确效价为144，仍符合实验规范要求（图8）。该简化流程显著缩短了操作时间，仅需1–2小时，远少于传统方法。总体而言，这些结果凸显了优化方法在配制4-HAU抗原溶液中的高效性与便捷性。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本文提出的优化方法为准确配制4-HAU抗原溶液提供了一种可行方案。尽管OIE和欧盟指南建议了血凝（HA）滴定的初始稀释倍数，但并未详细说明应采用的具体稀释比例或提供明确的操作方法11,12。此外，虽然联合国粮农组织（FAO）和OIE推荐采用反向滴定法以提高4-HAU的准确性，但缺乏清晰的操作流程11,13。本文通过在抗原的HA滴定过程中采用精确的稀释比例（1:3、1:5、1:7、1:9），并选取最大值用于4-HAU的配制，弥补了上述不足。此外，该方案在反向滴定过程中引入了1:2、1:3、1:4、1:5、1:6和1:7的稀释梯度。同时，本文还提供了一套完整的调整或重新配制方法，以增强该检测方法的可行性。
血凝滴定中初始稀释的原理
初始稀释的重要性
抗原储备液的HA滴度表示为
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无任何利益冲突。
致谢
C.C. 受太仓市科技计划（TC2021JC16）以及苏州健雄职业技术学院创新团队基金（2023JXKYTD01）资助。H.Y. 受太仓市科技计划（TC2021JC11）资助。两人均受到苏州健雄职业技术学院新进博士科研启动基金的资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 无菌离心管（15 mL） | Labshark | 130201030 | |
| 气冷式低速台式离心机 | Titan | LDC-5 | |
| Alserve溶液 | 生工生物 | E607058 | |
| 离心机 | DLAB | 9032002121 | |
| 一次性巴斯德吸管 | Titan | SWXG-004 | |
| 一次性无菌注射器（1 mL） | 碧云天 | FS801-30PCS | |
| 一次性V型底微量滴定板（96孔） | Labshark | 130207001 | |
| 微孔板振荡器 | 江苏新康医疗设备有限公司 | XK96-3 | |
| 新城疫病毒HI阴性血清 | 青岛瑞智诊断发展中心 | ||
| 新城疫病毒HI阳性血清 | 青岛瑞智诊断发展中心 | ||
| 新城疫病毒HI检测试剂抗原 | 青岛瑞智诊断发展中心 | ||
| PBS溶液（1×） | Adamas Life | C8020 | |
| 无菌离心管（1.5 mL） | Labshark | 130201012 |
参考文献
- Ayllon, J., García-Sastre, A., Martínez-Sobrido, L. Rescue of recombinant Newcastle disease virus from cDNA. J Vis Exp. (80), e50830(2013).
- Chen, Y., et al. The HN protein of Newcastle disease virus induces cell apoptosis through the induction of lysosomal membrane permeabilization. PLoS Pathog. 20 (2), e1011981(2024).
- Miller, P. J., Decanini, E. L., Afonso, C. L. Newcastle disease: evolution of genotypes and the related diagnostic challenges. Infect Genet Evol. 10 (1), 26-35 (2010).
- Terregino, C., Capua, I. Clinical traits and pathology of Newcastle disease infection and guidelines for farm visit and differential diagnosis. Avian Influenza and Newcastle Disease: A Field and Laboratory. , 113-122 (2009).
- Dimitrov, K. M., Afonso, C. L., Yu, Q., Miller, P. J. Newcastle disease vaccines—A solved problem or a continuous challenge. Vet Microbiol. 206, 126-136 (2017).
- Sheng, W., et al. Molecular characteristics and phylogenetic analysis of pigeon paramyxovirus type 1 isolates from pigeon meat farms in Shanghai (2009-2012). Sci Rep. 14 (1), 10741(2024).
- Yates, J. G. E., et al. Production of high-titer recombinant Newcastle disease virus from allantoic fluid. J of Vis Exp. (183), e63817(2022).
- van Boven, M., et al. Herd immunity to Newcastle disease virus in poultry by vaccination. Avian Pathol. 37 (1), 1-5 (2008).
- Oberländer, B., et al. Evaluation of Newcastle disease antibody titers in backyard poultry in Germany with a vaccination interval of twelve weeks. PloS One. 15 (8), e0238068(2020).
- Bhattacharya, S., et al. Spillover of Newcastle disease virus to Himalayan Griffon vulture: a possible food-based transmission. Virus Genes. 60 (4), 385-392 (2024).
- World Organisation for Animal Health (OIE). Newcastle disease (Infection with Newcastle disease virus). Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals. , (2024).
- Council of European Union. Council Directive 92/66/EEC of 14 July 1992 Introducing Community measures for the control of Newcastle disease. Document 31992L0066. L260, 1-20 (1992).
- Grimes, S. E. A basic laboratory manual for the small-scale production and testing of I-2 Newcastle disease vaccine. 2002/22, RAP Publication. 1-129 (2002).
- Dortmans, J. C. F. M., Peeters, B. P. H., Koch, G. Newcastle disease virus outbreaks: Vaccine mismatch or inadequate application. Vet Microbiol. 160 (1-2), 17-22 (2012).
- De Sousa, R. L. M., Montassier, H. J., Pinto, A. A. Detection and quantification of antibodies to Newcastle disease virus in ostrich and Rhea sera using a liquid phase blocking enzyme-linked immunosorbent assay. Clin Diagn Lab Immunol. 7 (6), 940-944 (2000).
- Chumbe, A., Izquierdo-Lara, R., Calderón, K., Fernández-Díaz, M., Vakharia, V. N. Development of a novel Newcastle disease virus (NDV) neutralization test based on recombinant NDV expressing enhanced green fluorescent protein. Virol J. 14 (1), 232(2017).
- Webster, R., Cox, N., Stöhr, K. WHO animal influenza manual. WHO/CDS/CSR/NCS. 2002.5, 1-99 (2002).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
