方法文章

新城疫病毒血清学血凝抑制试验中抗原制备的优化

DOI：

10.3791/67256

⸱

2025年1月24日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Science and Technology, Suzhou Chien-shiung Institute of Technology, 2Jiangsu Province Engineering Research Center of Novel Tumor-targeting Drug Conjugates, 3Crown Bioscience Inc.

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了一种简化的新城疫病毒血清学检测用4血凝单位抗原的制备方法。通过准确定量抗原的血凝效价，结合更为严格的反向滴定法以及明确的调整流程，该方法可提高检测效率，减少假阳性结果，并改善家禽疫病的监测能力。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

准确评估新城疫病毒（NDV）抗体滴度对于有效控制和监测家禽疾病至关重要。本文介绍了一种优化的4血凝单位（4-HAU）抗原溶液制备方法，该溶液是用于NDV血清学检测的血凝抑制试验（HI）中的关键组分。与传统方法相比，传统方法需耗时且缺乏明确步骤的反向滴定和调整过程，本方法通过使用一系列初始稀释度（1:3、1:5、1:7和1:9）精确测定HA滴度，从而简化了该流程。我们还提供了一种基于反向滴定结果进行调整或重新配制的具体方法，减少了重复反向滴定的需求。此外，我们评估了4-HAU抗原溶液准确性对血清HI滴度的影响，发现当4-HAU抗原滴度低于3时，会导致假阳性HI样本的出现。通过提供一种精确的方法并最小化计算任务，该方法提高了检测的效率和可靠性，有助于加强家禽群体中的疾病监测与控制。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

新城疫（Newcastle Disease, ND）是一种在全球范围内广泛传播且严重的家禽疾病1,2,3。其临床症状多样，包括高热、呼吸困难、痢疾、神经系统紊乱以及黏膜出血4。该病由新城疫病毒（Newcastle Disease Virus, NDV）引起，该病毒已存在近一个世纪，可感染超过200种鸟类，包括鸡、鸭、鹅和鸽子5。病毒主要通过与感染禽类的直接或间接接触传播，家禽、鸽子以及野生鸟类均可成为潜在的病毒储存宿主6。尽管NDV仅有一个血清型，但其遗传多样性给疾病的管理和防控带来了重大挑战3,7。

疫苗接种是控制新城疫的主要策略，辅以严格的生物安全措施5,8。目前全球已有多种商用禽类疫苗，免疫后可诱导产生强烈的血清抗体反应9。这些抗体在接触强毒株时对减轻临床症状严重程度以及抑制禽群间传播具有关键作用10。在新城疫流行地区，通常每6至12周使用活弱毒疫苗进行加强免疫，已成为常规做法9。对商用禽群在免疫后定期监测抗体滴度，对于评估疫苗效力至关重要11,12,13。免疫后抗体滴度偏低可能提示疫苗失效，需及时采取补救措施，例如补充免疫或调查可能影响免疫应答的免疫抑制因素14。

检测针对NDV的血清抗体有多种技术，包括酶联免疫吸附试验、血凝抑制（HI）试验和中和试验9,13,15,16。每种方法在灵敏度、特异性和成本效益方面各有其独特的优缺点。

本文基于世界动物卫生组织（OIE）的实验方案，详细阐述了一步一步进行血凝抑制（HI）试验的操作流程，用于定量检测血清中针对新城疫病毒（NDV）的特异性抗体滴度11。血凝（HA）现象是由某些包膜病毒（如NDV）引起的红细胞（RBCs）聚集反应9。NDV表面的血凝素-神经氨酸酶（HN）蛋白与红细胞相互作用，导致细胞聚集并形成晶格结构2。由于HI试验能够评估血清抗体对NDV HN蛋白的特异性，因此被优选为一种血清学检测方法8,9。此外，该方法成本低廉，且无需依赖特殊仪器，因而适用于常规检测，具有良好的可及性和实用性。

为提高检测效率，我们优化了OIE规程11的工作流程，重点在于获得更准确的血凝抗原滴度，并针对4个血凝单位（4-HAU）抗原溶液提供了详细的调整方案。此外，通过比较分析，我们评估了4-HAU准确性对血凝抑制（HI）结果的影响，为现场操作人员提供了有价值的参考依据。该方法不仅适用于新城疫病毒（NDV）抗体检测，还可拓展至麻疹病毒、多瘤病毒、腮腺炎病毒和风疹病毒等其他血凝病毒及其亚型的检测。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案已获得当地机构动物照护与使用委员会的批准。所有涉及活病毒抗原和临床血清样本的操作均在生物安全二级实验室中进行，并严格遵守既定的安全规程。

1. 1% 鸡红细胞悬液的制备

  1. 向一个无菌的15 mL锥形离心管中加入3 mL Alserver's溶液（抗凝剂）。
  2. 从三只非免疫鸡（无新城疫病毒抗体）的翅静脉各采集1 mL血液，立即转移至含有抗凝剂的离心管中，并轻轻混匀。
  3. 用无菌的1×磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2–7.4）将离心管加满至总体积12 mL，并轻轻混匀。使用水平转子在500 × g 条件下离心10分钟。
  4. 小心移除上清液及白细胞层。重复步骤1.3和1.4两次，以获得红细胞沉淀（RBC pellet）。
  5. 用移液器反复吹打1 mL红细胞沉淀，加入99 mL无菌PBS中，制备成1%红细胞悬液。
    注意：每块板所需的1%鸡红细胞悬液量估计为3 mL（25 µL/孔 × 96孔 × 1.25 = 3.0 mL；其中1.25为考虑移液损耗而增加的余量，以确保足够体积）。

2. 冻干抗原或血清的重悬

  1. 向含有冻干抗原或血清的小瓶中加入 2 mL 无菌 PBS。轻轻振荡小瓶，静置 2–3 分钟，以减少气泡并确保完全溶解。
    注意：请遵循特定生产商的说明，本研究未比较不同类型的冻干材料。
  2. 将重悬后的溶液分装至 1.5 mL 离心管中，于 -20 °C 冷冻保存，直至使用。
    注意：每次抗原解冻使用时，或每次制备新的红细胞悬液时，均需重新测定血凝（HA）滴度。

3. 抗原的HA滴定

  1. 分别将 40、80、120 和 160 µL 的 PBS 加入一次性 96 孔 V 型底微孔板中相邻的四个孔内，然后向每孔加入 20 µL 抗原，通过上下吹打 10 次混匀，分别获得 1:3、1:5、1:7 和 1:9 的稀释度。稀释操作的示意图见图 1。

PBS-抗原稀释操作步骤；移液体积；示意图；实验技术；混匀孔板。
图1：血凝试验中抗原溶液稀释步骤的示意图。 抗原溶液分别以1:3、1:5、1:7和1:9的比例用PBS进行稀释。图中蓝色代表孔板或离心管中的PBS，绿色代表抗原。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 标记一个新的微孔板。向第1至第5行的每个孔中加入25 µL PBS。
  2. 使用多通道移液器将25 µL稀释后的抗原溶液加入第1至第5行的第一个孔中，并通过上下吹打至少5次进行混匀。
  3. 从每行的第一个孔中转移25 µL至第二个孔，并充分混匀。依次将液体从一个孔转移至下一个孔，直至第11列，以制备两倍系列稀释液（1:2 至 1:2048）。在完成第11列后，弃去25 µL液体。
  4. 向每个孔中加入25 µL PBS，从含有最低抗原浓度的孔开始。
  5. 向每个孔中加入25 µL 1% 鸡红细胞悬液，同样从含有最低抗原浓度的孔开始。
  6. 将板置于微孔板振荡器上振荡约20秒，以充分混匀。
  7. 将板静置于室温（20–25 °C）台面上约30分钟，直至第12列的红细胞完全沉降。板的布局请参见 图2。

二倍系列稀释图；抗原稀释；免疫学检测中的数据可视化。
图 2：血凝试验中所用微孔板的示意图。 第 1 至第 5 行的第一列包含未稀释及不同初始稀释度的抗原溶液，随后从左至右进行二倍系列稀释，直至第 11 列。PBS 对照置于最后一列。颜色由深至浅的梯度表示抗原浓度逐渐降低。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 读取并记录结果。通过将培养板倾斜90°约25秒，观察红细胞是否呈泪滴状流动，以判断是否存在血凝现象。完全发生血凝（无流动）的最高稀释度即为1个血凝单位（HA Unit）。第12列孔用作红细胞（阴性）对照。
  2. 使用表1计算每行的血凝滴度，取其中最大值用于制备4-HAU抗原溶液。例如，若a、b、c、d和e分别为9、8、7、6、6，则最大值为3 × 28 = 768，此值即为抗原储备液的血凝滴度。
抗原完全血凝（HA）的最高稀释倍数列未稀释原液的HA滴度
未稀释原液a2a
3倍稀释b3 × 2b
5倍稀释c5 × 2c
7倍稀释d7 × 2d
9倍稀释e9 × 2e

表1：血凝试验结果及原液血凝滴度的计算。

4. 4-HAU 抗原溶液的制备

  1. 计算制备 4-HAU 抗原溶液的稀释倍数：方程 D=HATiter/4；与病毒学或免疫学研究相关的公式，以文本形式显示。。确定所需的总 4-HAU 体积：V = 3 mL × 微孔板数量。然后计算所需抗原储备液的体积：静态平衡公式 Va=V/D，用于分析的数学方程。，以及 PBS 体积：Vp = V - Va。
    注意：体积单位为毫升。每块微量滴定板按 3 mL 估算（25 µL/孔 × 96 孔 × 1.25 = 3 mL）。
  2. 用移液器将计算好的 PBS 体积加入容器中，然后加入相应体积的抗原储备液并充分混匀，得到 4-HAU 抗原溶液。
    注意：4-HAU 抗原溶液应尽快使用。

5. 4-HAU 抗原溶液的返滴定

  1. 将 PBS 分别取 25、50、75、100、125 和 150 µL 加入微孔板中相邻的六个孔内，然后向每孔加入 25 µL 的 4-HAU 抗原溶液，用移液器吹打混匀 10 次。
    注意：用 PBS 将 4-HAU 抗原溶液按 1:2、1:3、1:4、1:5、1:6 和 1:7 的比例进行稀释。稀释操作的示意图见图3。

移液过程示意图；PBS和4-HAU溶液的添加、多孔板设置、混合步骤。
图3：反向滴定中4血凝单位溶液稀释步骤的示意图。 4-HAU工作溶液用PBS按1:2、1:3、1:4、1:5、1:6和1:7的比例进行稀释。PBS以蓝色表示，抗原以绿色表示。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 使用多通道移液器将每种稀释后的抗原溶液各25 µL转移至另一排的孔中。额外的一个孔中加入25 µL PBS作为阴性对照。
  2. 向每个孔中加入25 µL PBS，然后向每个孔中加入25 µL 1% 鸡红细胞（RBC）。
  3. 将板置于微量板振荡器上振荡约20秒以混匀。
  4. 在室温（20–25 °C）下静置约30分钟，直至阴性对照孔中的红细胞完全沉降。
  5. 读取并记录结果。
    注意：阴性对照孔应无血凝现象。理想情况下，1:4稀释度应恰好是呈现完全血凝的最高稀释度。若4-HAU溶液的滴度高于4，则最高稀释度可能为1:5、1:6或1:7；若低于4，则可能为1:2或1:3。回滴定实验的示意图及代表性结果见图4。

血凝试验结果；稀释倍数，4-HAU 抗原；病毒滴度测定；实验。
图 4：返滴定实验的孔板布局示意图及代表性结果。 将稀释后的 4-HAU 工作液转移至新排孔板，并增设 PBS 对照。由深至浅的绿色梯度表示抗原浓度从高到低。代表性结果显示，1:4 稀释度是仍能显示完全血凝现象的最高稀释倍数。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 如有必要，调整或重新配制 4-HAU 抗原溶液。
    注意：如果返滴定中使用的 4-HAU 抗原溶液体积小于或等于总体积的 1%（即 4-HAU 抗原溶液体积 ≥ 15 mL），请参考表 2进行具体调整。例如，若完全血凝的最高稀释度为 1:2，则 4-HAU 抗原溶液的滴度现为 2，应加入与之前配制 4-HAU 抗原溶液时等量的抗原。相反，若完全血凝的最高稀释度为 1:6，则滴度现为 6，应补充一半体积的 PBS。
    如果返滴定中使用的体积超过总体积的 1%（即 4-HAU 抗原溶液体积< 15 mL），则应使用校正后的稀释倍数重新配制 4-HAU 抗原溶液。具体校正方法请参考表 3。例如，若完全血凝的最高稀释度为 1:2，则 4-HAU 抗原溶液的滴度现为 2，稀释倍数应调整为原来的 1/2。相反，若完全血凝的最高稀释度为 1:6，则 4-HAU 抗原溶液的滴度现为 6，稀释倍数应调整为原来的 3/2。
返滴定的 HA 滴度抗原或 PBS 的补充量
1:2Va
1:3Va/3
1:5Vp/4
1:6Vp/2
1:73Vp/4

表2：根据反向滴定结果调整4-HAU浓度的参考表。 Va 和 Vp 分别代表配制4-HAU抗原溶液时所用抗原和PBS的体积。

返滴定的 HA 滴度稀释因子校正
1:2D/2
1:33D/4
1:55D/4
1:63D/2
1:77D/4

表3：重新配制4-HAU抗原时稀释因子校正的参考表。 D代表先前在4-HAU抗原配制中使用的稀释倍数。

6. 血清的制备

  1. 从鸡翅中采集约 1 mL 血液，不使用抗凝剂。
  2. 将血液转移至 1.5 mL 离心管中，在 37 °C 下孵育约 2 小时。在 3,000 × g 条件下离心 10 分钟，小心将上清液吸出至新管中。

7. 血凝抑制试验

  1. 根据检测布局标记微孔板。使用多通道移液器向第1至第11列的每个孔中加入25 µL PBS，向第12列的每个孔中加入50 µL PBS。
  2. 向每行的第一孔（包括阳性血清对照和阴性血清对照行）加入25 µL血清。通过上下吹打至少5次，充分混匀。
  3. 将每行第一孔中的25 µL液体转移至第二孔，并充分混匀。继续从第二孔转移25 µL至第三孔并混匀，依此类推，直至第10列。混匀后，弃去第10列孔中的25 µL液体。
  4. 按照血清浓度由低到高的方向，向第1至第11列的每个孔中加入25 µL 4-HAU抗原。
  5. 将微孔板置于微孔板振荡器上振荡约20秒，随后在室温下静置约30分钟。
  6. 按照血清浓度由低到高的方向，向每个孔中加入25 µL 1%鸡红细胞（RBC）悬液。
  7. 将微孔板置于微孔板振荡器上振荡约20秒，充分混匀。随后在室温下静置约30分钟，直至PBS对照孔中的红细胞完全沉降。
  8. 读取并记录结果。
    注意：血凝抑制（HI）滴度是指能够完全抑制4-HAU抗原血凝反应的最高血清稀释倍数。通过将微孔板倾斜90°持续25秒，可在每行最后一列观察到泪滴状的红细胞流线。在每行倒数第二个孔中可观察到完全的血凝反应（无流线现象）。有效检测结果需满足以下条件：阳性血清对照的HI滴度与已知HI滴度相差不超过一个稀释度；阴性血清对照的HI滴度≤ 2 log₂；红细胞对照无自凝现象。有关血凝试验操作流程的示意图，请参见图5。

显示血清稀释、抗原添加以及在微量板振荡器上孵育的ELISA示意图。
图5：血凝试验操作流程示意图。 PBS用蓝色表示，血清用黄色表示，4-HAU抗原溶液用绿色表示，1%鸡红细胞悬液用红色表示。箭头指示液体加样的顺序。 请点击此处查看该图的放大版本。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

使用优化方法配制的4-HAU抗原溶液滴度的验证
本研究采用抗原储备溶液的不同稀释度，准确测定血凝（HA）滴度，从而便于计算配制4-HAU抗原溶液所需的稀释倍数。结果表明，该优化方法兼具高效性与精确性，显著减少了重复回滴和调整步骤的次数。在第一种情况下，初始HA滴度约为512，最终滴度为768，符合4-HAU抗原溶液的要求（图6）。同样，在第二种情况下，初始滴度约为256，最终滴度保持不变，确保所配制的4-HAU抗原溶液满足实验标准（图7）。最后，当初始滴度约为128时，测得精确滴度为144，仍与实验要求相兼容（图8）。该简化流程显著缩短了操作时间，仅需1–2小时，远少于传统方法。总体而言，这些结果凸显了该优化方法在配制4-HAU抗原溶液方面的有效性与高效性。

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文提出的优化方法为准确配制4-HAU抗原溶液提供了一种可行方案。尽管OIE和欧盟指南建议了血凝（HA）滴定的初始稀释比例，但并未详细说明应采用的具体稀释倍数，也未提供明确的方法学细节11,12。此外，虽然联合国粮农组织（FAO）和OIE推荐通过反向滴定（back-titration）提高4-HAU的准确性，但缺乏清晰的操作流程11,13。本文通过在抗原的HA滴定中采用精确的稀释比例（1:3、1:5、1:7、1:9），并选取最大值用于4-HAU的制备，弥补了上述不足。此外，该方案在反向滴定过程中引入了1:2、1:3、1:4、1:5、1:6和1:7的稀释梯度。同时，本文还提供了一套完整的调整或重新配制方法，以增强该检测方法的可行性。

血凝滴定中初始稀释的原理
初始稀释的意义
抗原储备液的血凝（HA）滴度记为

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明无任何利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C.C. 受太仓市科技计划（TC2021JC16）以及苏州健雄职业技术学院创新团队基金（2023JXKYTD01）资助。H.Y. 受太仓市科技计划（TC2021JC11）资助。两人均受到苏州健雄职业技术学院新进博士科研启动基金的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
 无菌离心管（15 mL） Labshark130201030
气冷式低速台式离心机 TitanLDC-5
Alserve溶液生工生物E607058
离心机DLAB9032002121
一次性巴斯德吸管TitanSWXG-004
一次性无菌注射器（1 mL）碧云天FS801-30PCS
一次性V型底微量滴定板（96孔）Labshark130207001
微孔板振荡器江苏新康医疗设备有限公司XK96-3
新城疫病毒HI阴性血清青岛瑞智诊断发展中心
新城疫病毒HI阳性血清青岛瑞智诊断发展中心
新城疫病毒HI检测试剂抗原青岛瑞智诊断发展中心
PBS溶液（1×） Adamas LifeC8020
无菌离心管（1.5 mL）Labshark130201012

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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标签

HI 4 HAU

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