方法文章

新城疫病毒血清学血凝抑制试验中抗原制备的优化

DOI：

10.3791/67256

⸱

2025年1月24日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Science and Technology, Suzhou Chien-shiung Institute of Technology, 2Jiangsu Province Engineering Research Center of Novel Tumor-targeting Drug Conjugates, 3Crown Bioscience Inc.

本文内容

摘要

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本文介绍了一种简化的新城疫病毒血清学检测用4血凝单位抗原的制备方法。通过准确定量抗原的血凝效价，结合更为严格的反向滴定法以及明确的调整流程，该方法可提高检测效率，减少假阳性结果，并改善家禽疫病的监测能力。

摘要

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准确评估新城疫病毒（NDV）抗体滴度对于有效控制和监测家禽疾病至关重要。本文介绍了一种优化的4血凝单位（4-HAU）抗原溶液制备方法，该溶液是用于NDV血清学检测的血凝抑制试验（HI）中的关键组分。与传统方法相比，传统方法需耗时且缺乏明确步骤的反向滴定和调整过程，本方法通过使用一系列初始稀释度（1:3、1:5、1:7和1:9）精确测定HA滴度，从而简化了该流程。我们还提供了一种基于反向滴定结果进行调整或重新配制的具体方法，减少了重复反向滴定的需求。此外，我们评估了4-HAU抗原溶液准确性对血清HI滴度的影响，发现当4-HAU抗原滴度低于3时，会导致假阳性HI样本的出现。通过提供一种精确的方法并最小化计算任务，该方法提高了检测的效率和可靠性，有助于加强家禽群体中的疾病监测与控制。

引言

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新城疫（Newcastle Disease, ND）是一种在全球范围内广泛传播且严重的家禽疾病1,2,3。其临床症状多样，包括高热、呼吸困难、痢疾、神经系统紊乱以及黏膜出血4。该病由新城疫病毒（Newcastle Disease Virus, NDV）引起，该病毒已存在近一个世纪，可感染超过200种鸟类，包括鸡、鸭、鹅和鸽子5。病毒主要通过与感染禽类的直接或间接接触传播，家禽、鸽子以及野生鸟类均可成为潜在的病毒储存宿主6。尽管NDV仅有一个血清型，但其遗传多样性给疾病的管理和防控带来了重大挑战3,7。

疫苗接种是控制新城疫的主要策略，辅以严格的生物安全措施5,8。目前全球已有多种商用禽类疫苗，免疫后可诱导产生强烈的血清抗体反应9。这些抗体在接触强毒株时对减轻临床症状严重程....

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方案

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本方案已获得当地机构动物照护与使用委员会的批准。所有涉及活病毒抗原和临床血清样本的操作均在生物安全二级实验室中进行，并严格遵守既定的安全规程。

1. 1% 鸡红细胞悬液的制备

  1. 向一个无菌的15 mL锥形离心管中加入3 mL Alserver's溶液（抗凝剂）。
  2. 从三只非免疫鸡（无新城疫病毒抗体）的翅静脉各采集1 mL血液，立即转移至含有抗凝剂的离心管中，并轻轻混匀。
  3. 用无菌的1×磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2–7.4）将离心管加满至总体积12 mL，并轻轻混匀。使用水平转子在500 × g 条件下离心10分钟。
  4. 小心移除上清液及白细胞层。重复步骤1.3和1.4两次，以获得红细胞沉淀（RBC pellet）。
  5. 用移液器反复吹打1 mL红细胞沉淀，加入99 mL无菌PBS中，制备成1%红细胞悬液。
    注意：每块板所需的1%鸡红细胞悬液量估计为3 mL（25 µL/孔 × 96孔 × 1.25 = 3.0 mL；其中1.25为考虑移液损耗而增加的余量，以确保足够体积）。

2. 冻干抗原或血清的重悬

  1. 向含有冻干抗原或血清的小瓶中加入 2 mL 无菌 PBS。轻轻振荡小瓶，静置 2–3 分钟，以....

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结果

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使用优化方法配制的4-HAU抗原溶液滴度的验证
本研究采用抗原储备溶液的不同稀释度，准确测定血凝（HA）滴度，从而便于计算配制4-HAU抗原溶液所需的稀释倍数。结果表明，该优化方法兼具高效性与精确性，显著减少了重复回滴和调整步骤的次数。在第一种情况下，初始HA滴度约为512，最终滴度为768，符合4-HAU抗原溶液的要求（图6）。同样，在第二种情况下，初始滴度约为256，最终滴度保持不变，确保所配制的4-HAU抗原溶液满足实验标准（图7）。最后，当初始滴度约为128时，测得精确滴度为144，仍与实验要求相兼容（图8）。该简化流程显著缩短了操作时间，仅需1–2小时，远少于传统方法。总体而言，这些结果凸显了该优化方法在配制4-HAU抗原溶液方面的有效性与高效性。

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讨论

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本文提出的优化方法为准确配制4-HAU抗原溶液提供了一种可行方案。尽管OIE和欧盟指南建议了血凝（HA）滴定的初始稀释比例，但并未详细说明应采用的具体稀释倍数，也未提供明确的方法学细节11,12。此外，虽然联合国粮农组织（FAO）和OIE推荐通过反向滴定（back-titration）提高4-HAU的准确性，但缺乏清晰的操作流程11,13。本文通过在抗原的HA滴定中采用精确的稀释比例（1:3、1:5、1:7、1:9），并选取最大值用于4-HAU的制备，弥补了上述不足。此外，该方案在反向滴定过程中引入了1:2、1:3、1:4、1:5、1:6和1:7的稀释梯度。同时，本文还提供了一套完整的调整或重新配制方法，以增强该检测方法的可行性。

血凝滴定中初始稀释的原理
初始稀释的意义
抗原储备液的血凝（HA）滴度记为

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披露

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作者声明无任何利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C.C. 受太仓市科技计划（TC2021JC16）以及苏州健雄职业技术学院创新团队基金（2023JXKYTD01）资助。H.Y. 受太仓市科技计划（TC2021JC11）资助。两人均受到苏州健雄职业技术学院新进博士科研启动基金的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
 无菌离心管（15 mL） Labshark130201030
气冷式低速台式离心机 TitanLDC-5
Alserve溶液生工生物E607058
离心机DLAB9032002121
一次性巴斯德吸管TitanSWXG-004
一次性无菌注射器（1 mL）碧云天FS801-30PCS
一次性V型底微量滴定板（96孔）Labshark130207001
微孔板振荡器江苏新康医疗设备有限公司XK96-3
新城疫病毒HI阴性血清青岛瑞智诊断发展中心
新城疫病毒HI阳性血清青岛瑞智诊断发展中心
新城疫病毒HI检测试剂抗原青岛瑞智诊断发展中心
PBS溶液（1×） Adamas LifeC8020
无菌离心管（1.5 mL）Labshark130201012

参考文献

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  1. Ayllon, J., García-Sastre, A., Martínez-Sobrido, L. Rescue of recombinant Newcastle disease virus from cDNA. J Vis Exp. (80), e50830(2013).
  2. Chen, Y., et al. The HN protein of Newcastle disease virus induces cell apoptosis through the induction of l....

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HI 4 HAU

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