监测电穿孔诱导的基因工程 Tet-On 加标 HEK 细胞中动作电位产生的变化

Summary

为了研究 体外可兴奋细胞的反应，该方案描述了在基因工程 tet-on 加标 HEK 细胞的简单可兴奋细胞模型上由于电穿孔而产生的动作电位产生的变化的光学监测，以及跨膜电压的变化，并自动提取相关参数。

Abstract

神经元和肌肉细胞等可兴奋细胞可以成为快速出现的基于电穿孔的治疗的主要靶标。然而，即使在它们不是主要靶点的治疗中，它们也会受到电脉冲的影响，这可能会导致不良副作用。因此，为了优化基于电穿孔的可兴奋和非可兴奋组织的处理，需要研究电脉冲对可兴奋细胞、其离子通道和 体外兴奋性的影响。为此，开发了一种方案，用于光学监测由于基因工程 tet-on 尖峰 HEK 细胞的简单可兴奋细胞模型上的电穿孔引起的动作电位产生的变化。使用荧光电位染料，在荧光显微镜下监测跨膜电压的变化，并使用 MATLAB 应用程序自动提取细胞反应的相关参数。通过这种方式，可以有效地评估可激发细胞对不同电脉冲的反应以及激发和电穿孔之间的相互作用。

Introduction

在电穿孔中，高压电脉冲导致通透性差的分子的质膜通透性增加¹。基于电穿孔的技术如今广泛用于医学² （medicine）、生物技术³ （biotechnology） 和食品技术⁴ （food technology） 中的应用。

神经元和肌肉细胞等兴奋细胞是心脏、大脑和骨骼肌中迅速出现的基于电穿孔的治疗的主要靶标之一⁵。此外，即使在它们不是主要目标的治疗中，它们也会受到电脉冲的影响，这可能会导致不良副作用，例如疼痛、肌肉抽搐和神经损伤⁶。也就是说，电脉冲可以引起对可兴奋细胞的电刺激:它们激活电压门控离子通道并触发动作电位 （AP）。然而，在更高的电场下，细胞的质膜变得透化，并通过孔/缺陷产生额外的离子电流⁷。这种额外的离子电流在激发和电穿孔之间的复杂相互作用中影响细胞兴奋性。因此，为了优化基于电穿孔的可兴奋和非可兴奋组织的处理，需要研究电脉冲对可兴奋细胞、其离子通道和 体外兴奋性的影响。

在最近的一项研究⁸ 中，我们探索了 Cohen 等人开发的基因工程人胚胎肾 （HEK） 细胞^9,10，作为研究可兴奋细胞电穿孔的宝贵工具。在这些其他方面不可兴奋的细胞中，表达兴奋性所需的钠和钾通道（Na_V1.5 和 K_ir2.1）的最小补体。这些细胞中 K_ir2.1 的表达受多西环素诱导的 tet-on 系统控制，该系统允许建立两种细胞变体:可激发的刺突 S-HEK（包含 Na_V1.5 和 K_ir2.1）和非可激发的非刺突 NS-HEK 细胞（仅包含 Na_V1.5 通道）。这使我们能够比较电脉冲对相同类型细胞的可兴奋和非可兴奋变体的影响。与分离的原代可兴奋细胞、从胚胎或诱导多能干细胞分化的可兴奋细胞以及源自可兴奋组织的细胞系相比，S-HEK 细胞具有几个优点:它们易于处理、培养和繁殖，具有明确的钠和钾通道，并产生强大的 AP⁸。

我们设计了一种方案，用于使用荧光电位染料监测由不同振幅的电脉冲触发的跨膜电压 （TMV） 的变化。通过这种方式，我们可以研究电穿孔如何影响 S-HEK 细胞中 AP 的产生以及 S-HEK 和 NS-HEK 细胞中 TMV 的其他变化。简而言之，将 S-HEK 或 NS-HEK 细胞每 2 分钟暴露于单个 100 μs 电脉冲，并在每次脉冲应用周围记录大约 3 秒的荧光相对变化。施加的脉冲电压增加，首先触发电池中的 AP，然后在更高的电场下触发电穿孔。选择脉冲应用之间的 2 分钟间隔以最大限度地减少连续脉冲可能产生的累积效应，同时保持实验时间足够短，以免使细胞恶化。图像处理使用定制的 MATLAB 应用程序自动进行，以提取电位染料荧光响应的相关参数，从而评估 S-HEK 和 NS-HEK 细胞中 TMV（AP 和电穿孔引起的持续去极化）的变化。

Protocol

1. 试剂和细胞培养的制备

1. 通过在 Dulbecco 改良 Eagle 中高葡萄糖中补充 10% 胎牛血清、2 mM 谷氨酰胺、青霉素-链霉素（青霉素 100 U/mL、链霉素 100 μg/mL）、2 μg/mL 嘌呤霉素、5 μg/mL 杀稻瘟菌素和 200 μg/mL 遗传霉素来制备细胞培养基。
2. 用 137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na₂HPO₄ 和 1.8 mM KH₂PO_4，pH 7.4 制备磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 溶液。通过孔径为 0.22 μm 的除菌膜过滤器过滤。
3. 用 2 mM KCl、125 mM NaCl、2 mM CaCl₂、1 mM MgCl₂、10 mM HEPES、30 mM 葡萄糖（pH 7.3）制备 Tyrode 溶液。用 0.5 mM KCl、126.5 mM NaCl、2 mM CaCl₂、1 mM MgCl₂、10 mM HEPES、30 mM 葡萄糖（pH 7.3）制备低钾 Tyrode 溶液。通过孔径为 0.22 μm 的除菌膜过滤器过滤两种溶液。
4. 在含有 5 mg 聚-L-赖氨酸的小瓶中加入 5 mL PBS，制备 1 mg/mL 聚-L-赖氨酸储备液。
5. 在蒸馏水中制备 2 mg/mL 多西环素储备溶液，并通过孔径为 0.22 μm 的除菌膜过滤器过滤。
6. 在纯乙醇中制备 4 mM 电位染料 ElectroFluor630 储备液（将 25 μL 纯乙醇添加到含有 100 nM - 73 μg 染料的试管中）。
7. 如前所述，在 6 mL 细胞培养基的 T25 培养瓶中培养基因工程 HEK 细胞⁸.培养基的成分对光敏感;因此，保持培养基避光（将培养基培养瓶包裹在铝箔中）并在弱光条件下进行传代。
8. 将 3 x 10⁵ 或 5 x 10⁵ 个细胞接种到新鲜的 T25 培养瓶中，每 3-4 天传代一次细胞。使用血细胞计数器计数细胞。将细胞维持在主培养瓶中，作为不可兴奋的 NS-HEK 细胞，无需添加多西环素，因为它们不耐受持续的 K_ir2.1 表达。在实验中使用来自低于 14 次传代的细胞。

2. 样品制备

1. 盖玻片室载玻片的聚-L-赖氨酸涂层
   1. 将 1 mL PBS 移液到 2 孔盖玻璃室载玻片的一个孔中，加入 10 μL 无菌 1 mg/mL 聚-L-赖氨酸溶液，并用移液管充分混合。
   2. 在室温下在无菌条件下在层流罩中孵育 1.5 小时。去除带有聚-L-赖氨酸的 PBS，无需进一步洗涤。
2. 接种细胞
   1. 在 1.5 mL 试管中的培养基中制备 1:10 稀释的多西环素储备液。对于每个孔，需要 30 μL 1:10 多西环素稀释液（3 μL 多西环素储备溶液和 27 μL 培养基），根据实验孔的总数准备最终体积。
   2. 从 T25 培养瓶中取出培养基，并在 37 °C 的 CO₂ 培养箱中用 2.5 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液胰蛋白酶消化细胞 2 分钟。
   3. 加入 2.5 mL 新鲜培养基，轻轻移液，将细胞从表面分离。充分混合细胞悬液。
   4. 用血细胞计数器计数细胞并确定悬浮细胞的密度。
   5. 计算建立培养物所需的胰蛋白酶消化细胞悬液的体积。对于 2 天的培养，接种 2.5 x 10⁵ 个细胞，对于 3 天的培养，每孔接种 1 x 10⁵ 个细胞。如果需要，请调整确切的单元格数。
   6. 通过从 1470 μL 中减去先前计算的细胞悬液体积来计算培养基的体积。剩余的 30 μL 代表 1:10 多西环素稀释的体积。每个孔中的总体积为 1500 μL（细胞、多西环素和培养基）。
   7. 对于使用可激发的 S-HEK 细胞制备样品，将计算体积的培养基和胰蛋白酶消化的细胞悬液移液到一个孔中，并加入 30 μL 1:10 多西环素稀释液。仅使用两孔室中的一个孔，因为实验需要很长时间（约 40 分钟）。在将腔室放入 CO₂ 培养箱之前，通过轻轻移液充分混合。
   8. 对于使用不可激发的 NS-HEK 细胞制备样品，将计算体积的培养基移液到孔中，并加入不含多西环素的 S-HEK 细胞计算体积的 90%。NS-HEK 细胞的生长速度略快于 S-HEK 细胞。
   9. 实验前，将腔室在 5% CO₂ 培养箱中于 37 °C 孵育 2-3 天。对于含有多西环素的样品，该孵育时间足以使细胞兴奋。
3. 标记细胞
   1. 实验前，将 3 μL 电位染料储备液移液到 1.5 mL 试管中，并将打开的试管在室温下放在层流罩中，让乙醇蒸发，电位染料干燥（约 15 分钟）。向试管中加入 997 μL 冷培养基（来自 4 °C 的冰箱），并将染料溶解至终浓度为 12 μM。
   2. 从孔中取出培养基，向细胞中加入 1 mL 电位染料溶液。将它们在 4 °C 下冷藏并孵育 20 分钟。
   3. 取出电位染料溶液并将其保存在试管中以备进一步重复使用（1 天内最多 6 次连续实验）。
   4. 用 Tyrode 溶液轻轻洗涤细胞 3 次，最后一次洗涤后，将 1 mL 低钾 Tyrode 溶液移液到孔中。

3. 电刺激和电穿孔

1. 使用来自触发脉冲发生器的显微镜系统的 TTL 信号配置脉冲传输与图像采集的同步。为了产生高压脉冲，请使用定制的脉冲发生器¹¹ 或任何可以通过 TTL 信号从外部触发的脉冲发生器。
   注意:在提出的实验配置中，LAS X 软件用于图像采集，可以配置为在延时采集期间在预选时间发送 TTL 信号。
2. 将两个直径为 0.8 毫米、内边缘间距为 5 毫米的平行 Pt/Ir 线电极放在腔室底部，并将腔室固定在显微镜下。
3. 将电极连接到脉冲发生器。使用电压和电流探头将脉冲发生器的输出连接到示波器，以验证脉冲在实验过程中是否正确传递。
4. 将细胞聚焦在明场中。对大致位于电极之间中间的细胞进行成像。
5. 使用 40 倍物镜在延时模式下开始首次采集荧光图像，记录整个视场中的荧光信号。相机的速度应足够快，以便获取动作电位的清晰时间进程（理想情况下高于 25 帧/秒）。
   1. 在延时模式下采集 80 张图像，至少 25 帧/秒，以解析动作电位的实时过程。图像采集的总持续时间约为 3 s。在图像采集过程中，用 635 nm 的激发波长、10 ms 的曝光时间照射细胞，并在 700 nm 左右检测发射。在第一次采集中，不要应用任何脉冲 - 此采集将用于校正染料光漂白的后续采集。采集后，等待 2 分钟。
      注意:本实验使用 27.8 帧/秒，即 36 毫秒周期，这是延时录制中从第一次图像采集开始到下一次图像采集开始的时间）。
6. 每 2 分钟，以与步骤 3.5 相同的方式录制一次延时摄影。对于这些采集，在采集第 10 张图像时（324 毫秒）应用单个 100 μs 脉冲。使用以下脉冲电压采集图像:63 V、75 V、88 V、100 V、125 V、150 V、175 V 和 200 V。估计电池暴露的电场作为施加的电压与电极距离比（E = 126、150、176、200、250、300、350 和 400 V/cm）。
   注意:在较低的电场下，脉冲将触发动作电位;在更高的电场下，它们会触发电穿孔，表现为长时间的去极化。每个细胞样品的实验持续时间约为 40 分钟（标记 20 分钟，显微镜观察 20 分钟）。

4. 数据分析

1. 将延时录像导出为 tiff 格式。
2. 将单个实验期间所有施加电压的延时记录（一个细胞样本）放入一个文件夹中。以 MATLAB 应用程序可以识别电场 E 的形式重命名延时记录:Vcm（例如，126Vcm 表示 126 V/cm）。名称的其余部分可以是任意的。对于实验开始时未应用脉冲的采集，请使用短语 000Vcm 重命名。延时录制名称示例:2022_1_20 1DOX 000Vcm、2022_1_20 1DOX 126Vcm、2022_1_20 1DOX 150Vcm 等。
3. 打开应用程序，可从
   https://github.com/bor-kos/fluorescenceActionPotential。单击 Select Data Folder 以选择包含某个实验的延时录像的文件夹。
4. 选择要用于进一步数据分析的像素。为此，请使用两个滑块来确定膜清晰图像的低阈值（紫色）和从分析中消除碎片（高荧光的大斑点）的高阈值（绿色）。
5. 选择 Analyze Data （分析数据）。 在 Analysis （分析） 选项卡中，将显示一个包含提取参数的表。在表格的右侧，显示了使用的每个 E 的相对荧光时间图。从表格上方左侧的下拉菜单中选择给定 E 的图形。
6. 检查所有图形，并在检测到假峰的情况下执行手动校正。在 Analysis （分析） 选项卡的底部选择 Clear AUTO Peaks （清除自动峰 ），自动检测到的峰将被清除。单击 Graph （ 图表 ） 以手动确定新的峰值时间点。
7. 在 Analysis （分析） 选项卡的底部选择 Rerun AUTO Peak Detection （重新运行 AUTO 峰值检测 ） 以再次执行自动峰值检测。提取的参数现在将调整为新的峰值。
8. 选择 Analysis 选项卡右下角的 Export Data ，以 .mat 文件、电子表格文件和 PNG 图像的形式将数据导出到同一文件夹。

Results

可以使用该方案对电脉冲触发的 体外 兴奋细胞中 TMV 的变化进行光学监测，并且可以分析荧光信号以提取其相关参数。

实验设置如图 1A 所示。实验中使用的 100 μs 电脉冲的典型信号如图 1B 所示。放置在显微镜下的腔室中的细胞通常类似于 图 1C （明场图像）和 图 1D （荧光图像）中的细胞。我们进行了一项实验，其中每 2 分钟向相同的电池施加一个电压增加的电脉冲。请注意，2 分钟的脉冲间歇时间可能不够长，无法完全重新密封和恢复细胞膜，尤其是在使用最高振幅的脉冲时，这与突出的电穿孔有关。因此，可以预期脉冲的一些累积效应。为了避免这些累积效应，可以延长脉冲间延迟，但代价是减少测试脉冲幅度的数量，并避免将细胞在显微镜上放置太长时间。

在实验中捕获荧光图像后，使用自定义 MATLAB 应用程序对其进行分析。首先，确定像素阈值（图 2A）;通过调整 Low Threshold（低阈值），我们可以获得细胞周围膜的清晰图像（紫色），通过调整 High Threshold（高阈值），我们去除了碎片的信号（绿色）。然后，该应用程序确定每个交付的连续脉冲的所有阈值像素的平均荧光强度，以获得荧光 F/F0 相对变化的时间依赖性信号。通过减去从未应用脉冲的控制延时记录中确定的 F 线性降低的斜率，该信号可以校正染料光漂白（图 2B）。校正信号后，以应用程序内表格和校正后的荧光信号图的形式提取响应参数（图 2C）。在极少数情况下，该算法不会检测到明显的峰值，也不会将杂散噪声信号检测为假阳性。对于这些情况，用户可以选择手动选择荧光信号中的相应点作为峰或去除检测到的假峰（图 2D - 去除在施加电脉冲之前异常检测到的小峰）。

通过使用 MATLAB 应用程序，我们可以获得可激发的 S-HEK（图 3A）和非可激发的 NS-HEK 细胞（图 3B）中 TMV 对电脉冲的反应图像。提取以下响应参数（表 1）:峰数 （NoPeaks）、平均峰峰值时间（检测到多个峰时，MPPT）、最大响应 （MR）、达到第一个峰的时间 （TtFP） 以及从峰到 25%、50%、75% 和 90% 恢复的时间（分别为 T25、T50、T75、T90）。这些参数能够评估对不同电脉冲的响应（例如，确定由不同 E 的电脉冲触发的峰值数量， 图 3C）以及激发和电穿孔之间的相互作用。

图 1:设置、波形和 S-HEK 单元。 （A） 显微镜载物台上腔室的图像。（B） 研究中使用的脉冲波形示例（电压 （U） 随时间的变化）。（C、D）S-HEK 细胞的图像 （（C）:明场，（D）:荧光），比例尺:100 μm。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2:数据分析应用程序。 （A） 应用程序界面的图像 - 阈值。（B） 荧光变化的原始信号和校正信号的图表。（C） 应用程序界面的图像 - 提取的数据。（D） 手动校正峰检测（去除在施加电脉冲之前异常检测到的小峰，用红色箭头标记）。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3:代表性结果。 （A、B） 用 100 μs 不同振幅的电脉冲触发 （A） 可激发 S-HEK 和 （B） 非可激发 NS-HEK 中 TMV 的变化，来自代表性实验的结果。为清楚起见，仅显示对所应用脉冲序列中所选脉冲的响应。（C） 由不同幅度的 100 μs 脉冲触发的 TMV 响应参数:示例显示了峰值的数量。结果表示为平均 ± SE，实验次数:N = 13。 请单击此处查看此图的较大版本。

指数	E 强度 （垂直/厘米）	无峰 (-)	MPPT （毫秒）	先生 (-)	TTFP （毫秒）	T25 （毫秒）	T50 （毫秒）	T75 （毫秒）	T90 系列 （毫秒）
1	0
2	126	9	224	0.104	360	72	108	144	180
3	150	6	354	0.097	108	72	108	144	180
4	176	2	144	0.089	36	72	108	144	180
5	200	1		0.075	0	108	144	180	252
6	250	2	396	0.064	0	108	216	432	2052
7	300	1		0.059	0	180	1188	2448
8	350	1		0.053	0	1008	2340
9	400	1		0.047	0	1512

表 1:由不同幅度的 100 μs 脉冲触发的 TMV 响应参数。

Discussion

S-HEK 细胞是一种简单的可兴奋细胞模型，具有明确的钠和钾通道，Na_V1.5 和 K_ir2.1⁹。这使我们能够深入研究可激发细胞如何响应施加的电脉冲，并将实验数据与基于 S-HEK 细胞中表达的通道的众所周知的理论特性的数学模型联系起来。在我们之前的研究⁸ 中，我们从实验和理论上描述了这些细胞对 100 μs 增加 E 脉冲的响应。在较低的 E 下，S-HEK 细胞以单个或多个动作电位响应，而在较高的 E 下，AP 延长并转化为持续的去极化。由于在这些细胞的非可激发版本 （NS-HEK） 中也清晰可见持续去极化，因此它归因于电穿孔和相关的非选择性离子电流的增加。

使用荧光电位染料被证明是研究可激发细胞中 AP 和电穿孔的非常有效的方法。与膜片钳等经典电生理学方法相比，光学测量更加方便、省时，并且不需要特殊的技术技能。此外，使用高压电脉冲不会干扰测量，这在膜片钳测量中可能成为一个问题¹²。然而，该方案的主要缺点与染料的性质有关。由于其光漂白，捕获的荧光信号需要校正。染料自发扩散到细胞中，因此来自膜的信号会随着时间的推移而减弱。因此，该染料适用于监测 TMV 中的动作电位和其他短期变化（在这些实验中为 ~3 秒）。由于染料能够实现比率成像¹³，因此这种成像可以避免染料扩散的一些问题，但代价是可达到的成像速度较低。在这种实验配置中，比率成像速度太慢，无法正确捕捉动作电位的形状。此外，测得的染料荧光变化提供了有关 TMV 变化的定性信息;尽管如此，染料可以进行校准以实现定量测量。

使用自定义 MATLAB 应用程序的自动图像分析使我们能够分析大量数据，并在短时间内有效地提取 TMV 响应的宝贵特征。该应用程序配置为捕获来自视野中所有细胞膜的荧光信号。这提高了信噪比，但代价是丢失了有关 TMV 在单个细胞水平上如何变化的信息。在给定的实验配置中，来自单个细胞的信号太嘈杂，无法进行有用的测量。此外，相邻细胞的膜很难区分。然而，HEK 细胞内源性地表达间隙连接，它们通过间隙连接进行电连接。在前面的研究⁸ 中提出的数学建模表明，由于它们的电连接，视野内的细胞足够接近，可以同时触发 AP。此外，AP 沿细胞单层高速传播（大约 34 mm/s，根据 5 倍物镜放大倍率成像估计）^8,9。考虑到视场的边长 （~0.33 mm），AP 将在大约 10 毫秒内移动这个长度，这比我们的图像采集周期要短。因此，在这种放大倍率和记录速度下看不到 AP 传播效果。然而，AP 从电极传播到视场会导致施加的脉冲和捕获的 AP⁸ 之间出现延迟。

在之前的研究⁸ 以及本出版物中，描述了持续时间为 100 μs 的脉冲对兴奋性和电穿孔之间相互作用的影响。然而，该协议可以适用于研究具有其他参数（不同持续时间、电压、数量、重复率或形状）或其他可激发细胞的电脉冲。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL 试管	Ratiolab	5615000
2孔 Nunc Lab-Tek II 腔室 #1.5 德国盖玻片系统	Thermo Fisher Scientific
ADP305 差分电压探头	Teledyne LeCroy
AP015 电流探头	Teledyne LeCroy
杀稻瘟菌素	Thermo Fisher Scientific
CO2 培养箱	PHCbi	MCO -230AICUV
多西环素	Sigma-Aldrich/Merck	D9891
Dulbecco's Modifed Eagle's 中等高葡萄糖生长培养基	Sigma-Aldrich/Merck	D5671
ElectroFluor630 （Di-4-ANEQ（F）PTEA）	电位探针	31795
胎牛血清	Sigma-Aldrich/Merck	F2442
Geneticin	Thermo Fisher Scientific
氨酰胺	Sigma-Aldrich/Merck	G7513
层流罩	Iskra Pio	MC 15-2
MATLAB	Mathworks
青霉素–链霉素	Sigma-Aldrich/Merck	P07681
聚-L-赖氨酸氢溴酸盐	Sigma-Aldrich/Merck	P9155-5MG
脉冲发生器	定制参见		参考11
普罗霉素	Thermo Fisher Scientific
T25 25cm²组织培养瓶	TPP	90026
Tet-on 加标 HEK 细胞	美国典型培养物保藏中心 ATCC	CRL-3479
用于荧光显微镜的 Thunder Imager 活细胞系统	徕卡显微系统
胰蛋白酶-EDTA 溶液	Sigma-Aldrich/Merck	T3924
WavePro 7300A 示波器	Teledyne LeCroy