方法文章

实时、高通量显微镜定量人中性粒细胞胞外陷阱释放并评估拮抗剂的药理学

DOI：

10.3791/67258

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2024年10月18日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Citryll B.V.

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该定义的方案描述了一种实时高通量显微镜方法，用于在 体外可视化和量化人中性粒细胞胞外陷阱 （NET） 的释放。可重复的方法允许研究用不同的 NETosis 诱导剂刺激后 NET 释放的特征和动力学，并能够评估 NETosis 拮抗剂的药理学。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

中性粒细胞通过使用多种策略在先天免疫防御中发挥重要作用，包括在称为 NETosis 的过程中释放中性粒细胞胞外陷阱 （NET）。然而，在过去的二十年里，很明显 NETs 在组织中的积累有助于多种炎症和自身免疫性疾病的病理生理学。因此，人们对 NETosis 拮抗剂的开发兴趣有所上升。检测和分析 NETosis 的可变和非标准化方法同时开发，每种方法都有自己的优点和局限性。在这里，我们描述了一种用于定量人类 NET 释放的实时显微镜方法，允许以高通量方式研究 NETosis 以及 NET 抑制。基于表面积的半自动分析可识别 NET，并将其与非 Netting 活化的中性粒细胞区分开来。我们证明非生理性 NETosis 诱导剂、钙离子载体和佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯 （PMA） 触发具有不同特性和动力学的 NETs 的释放。此外，我们表明这种方法允许研究响应疾病相关刺激的 NET 释放，包括免疫复合物、N-甲酰蛋氨酸-亮氨酰-苯丙氨酸 （fMLF）、尿酸单钠晶体和焦磷酸钙晶体。为了举例说明这种方法在研究 NETosis 拮抗剂方面的效用，我们使用了 CIT-013，一种一流的 NET 释放单克隆抗体抑制剂。CIT-013 靶向瓜氨酸组蛋白 H2A 和 H4 并有效抑制 NET 释放，IC50 为 4.6 nM。其他测试的抗组蛋白抗体缺乏这种 NETosis 抑制能力。总而言之，我们证明该方案能够对 NETs 进行特异性、可靠和可重复的高通量定量，从而加强了对 NETosis 拮抗剂的 NET 释放特性、动力学和药理学的研究。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

中性粒细胞大量存在于血液中，并在感染或炎症时迁移到组织中。它们通过使用广泛的武器来保护宿主免受微生物的侵害，从而在先天免疫防御中发挥重要作用。中性粒细胞通过吞噬作用、脱颗粒、活性氧 （ROS） 的产生以及通过称为 NETosis1 的过程释放称为中性粒细胞胞外陷阱 （NET） 的解浓缩染色质来杀死病原体。NET 是染色质的细胞外结构，饰有颗粒蛋白和钙卫蛋白 2,3，并在受到广谱分子的刺激后释放4。NETosis 大致可分为两个主要途径:NADPH 氧化酶依赖性或不依赖性 5,6,7。此外，肽基精氨酸脱亚胺酶 4 （PAD4） 对 N 末端组蛋白尾部的精氨酸瓜氨酸化与 NETosis 密切相关，并促进染色质解聚，最终导致解聚的染色质排出到细胞外环境中。

尽管 NET 释放与病原体的消除有关，但大量研究表明，异常和长时间的 NET 释放与各种炎症性疾病的发展有关，包括急性肺损伤8、类风湿性关节炎 （RA）9、血管炎10 和化脓性汗腺炎11。NETs 在疾病中的有害作用是多方面的，因为 NET 具有促炎性，是自身抗原的来源，对周围组织具有细胞毒性，触发免疫血栓形成，并促进破骨细胞分化和骨侵蚀 9,12,13。小分子 PAD4 抑制剂对 NETosis 通路的药理学抑制表明，靶向 NETosis 的治疗药物具有治疗 NET 积累是发病机制重要驱动因素的疾病的潜力14。我们没有靶向 PAD4 酶，而是使用了一流的 NETosis 抑制人源化抗瓜氨酸组蛋白单克隆抗体 CIT-013，该抗体特异性结合瓜氨酸组蛋白 H2A 和 H415。CIT-013 通过抑制 NET 释放和增强巨噬细胞介导的 NET 吞噬作用16 具有独特的双重作用机制。CIT-013 和前体分子已在 NET 相关炎症的多种小鼠模型中显示出治疗效果17。

为了研究 NET 释放，多年来开发了不同的方法，例如但不限于 1） 使用质膜不可渗透的 DNA 示踪剂结合免疫荧光读板器进行 DNA 检测，2） 基于酶联免疫吸附测定 （ELISA） 的 DNA 和与上清液中 NET 特异性蛋白复合的 DNA 检测，3） 通过免疫组织化学将 NET 相关分子与细胞外 DNA 共定位， 4） 流式细胞术检测网状中性粒细胞。所有这些方法都有自己的优点和局限性。我们开发了一种实时高通量方法，用于微观定量人 NET 释放，该方法使用质膜不可渗透的 DNA 染料16,18。所描述的方法允许以简单、可靠和可重复的方式研究 NETosis 动力学和特性，并能够评估 NETosis 拮抗剂（如 CIT-013）的药理学。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

所有献血者都根据赫尔辛基宣言给予了知情同意，并且该研究是根据 Citryll 人类研究伦理准则进行的。

注:使用人血和分离的中性粒细胞进行的所有活动都需要在无菌条件下在层流柜中进行。当方案中未提及离心的制动和加速度设置时，可以考虑将其设置为最大值。

1. 从血液中分离中性粒细胞

  1. 在锂肝素管中收集健康志愿者的外周血，并将血液转移到新鲜的 50 mL 试管中。
  2. 用 1x DPBS 冲洗肝素锂管，并转移到与血液相同的 50 mL 管中。确保最终血液与 DPBS 比率为 1:1。通过移液混合血液和 DPBS 以获得均匀的溶液。
  3. 将 13 mL 密度梯度溶液加入另一根新鲜的 50 mL 试管中，然后缓慢添加（使用 25 mL 移液管）密度梯度溶液上 1:1 稀释的血液，最高可达 50 mL。
  4. 在 400 x g 和室温 （RT） 下离心 40 分钟，同时尽量减少加速和制动。
    注意:层已形成。层数从上到下如下: 1. 等离子体;2. 外周血单核细胞 （PBMC）;3. 密度梯度溶液;4. 红细胞/中性粒细胞。
  5. 首先，用 10 mL 移液管丢弃血浆，然后用塑料巴斯德移液管尽可能多地丢弃 PBMC 和密度梯度溶液层，而不会干扰红细胞/中性粒细胞层。
  6. 通过摇动轻轻重悬红细胞/中性粒细胞层，然后用 25 mL 移液管在 15 mL 1x DPBS 中重悬。
  7. 加入 25 mL 的 6% 葡聚糖/0.9% NaCl 溶液，倒置试管 10 次混合，并在室温下将试管直立放置 25 分钟。
    注意:层已形成。层从上到下如下:1. 中性粒细胞;2 个红细胞。
  8. 用 10 mL 移液管将中性粒细胞层转移到新的 50 mL 试管中，并以 500 x g 和 RT 离心 10 分钟。
    注意:请小心，因为中性粒细胞沉淀仍含有一些红细胞，并且未牢固地附着在试管上。
  9. 倾析弃去上清液，用 10 mL 移液管将细胞沉淀重悬于 10 mL 氯化铵-钾 （ACK） 裂解缓冲液（155 mM NH4Cl、10 mM KHCO3 和 0.1 mM Na2EDTA;pH = 7.2）中，然后立即加入 40 mL ACK 裂解缓冲液。
  10. 在 RT 下孵育，同时不断倒置试管，直到溶液变为半透明（这需要 1-5 分钟，并且可能因供体而异），然后以 350 x g 和 RT 离心 10 分钟。
  11. 去除上清液，缓慢滴加 5 mL 含有 L-谷氨酰胺的培养基，其中补充有 10% （v/v） 热灭活胎牛血清 （FBS）、50 U/mL 青霉素和 50 μg/mL 链霉素（以下简称 10% 培养基）在中性粒细胞沉淀顶部，而不使中性粒细胞悬浮。这将有效地从中性粒细胞沉淀中去除大部分红细胞。
  12. 轻轻旋转 50 mL 试管，直到存在于中性粒细胞沉淀顶部的大多数红细胞重悬于培养基中 10%。随后，通过倾析试管去除上清液。
  13. 将中性粒细胞沉淀重悬于 10 mL 10% 的培养基中，完全重悬后，添加至 50 mL 10% 的培养基。以 350 x g 和 RT 离心 10 分钟。
  14. 去除上清液，将细胞沉淀重悬于 10 mL 10% 的培养基中。

2. 中性粒细胞染色，通过流式细胞术检查纯度

  1. 为了测定细胞浓度，在 0.4% 台盼蓝溶液（比例 1:1）中稀释中性粒细胞悬液，并用明场细胞计数器对中性粒细胞计数。
    注意:也可以使用其他计数方法。
  2. 将 1 x 105 个嗜中性粒细胞在 10% 培养基中转移到 V 形底 96 孔板的孔中，并以 400 x g 和 RT 离心 3 分钟。
  3. 弃去上清液，将细胞重悬于 50 μL 1x DPBS 中，补充有 1% （w/v） 牛血清白蛋白 （BSA） 和 0.1% （v/v） NaN3 （以下简称荧光激活细胞分选 （FACS） 缓冲液）含有 Fc 受体阻滞（50x 稀释）。
  4. 在 RT 中孵育 15 分钟，并加入 50 μL FACS 缓冲液，其中包含 50 倍稀释的 APC-Cy7 偶联小鼠抗人 CD45 抗体、600 倍稀释的 PerCP-Cy5.5 偶联小鼠抗人 CD16 抗体、133 倍稀释的 FITC 偶联小鼠抗人 CD66b 抗体和 500 倍稀释的可固定活性染料 eFluor 506。
    注意:CD45 在白细胞上表达。CD66b 仅在粒细胞中表达。CD16 在中性粒细胞中高表达，在嗜酸性粒细胞中低表达，在嗜碱性粒细胞中不表达。
  5. 在黑暗中在 RT 中孵育 30 分钟，然后以 400 x g 和 RT 离心 3 分钟。
  6. 弃去上清液，将中性粒细胞重悬于 175 μL FACS 缓冲液中，并以 400 x g 和 RT 离心 3 分钟。重复此步骤一次。
  7. 弃去上清液，将中性粒细胞沉淀重悬于 175 μL FACS 缓冲液中。使用流式细胞术系统和相关软件分析样品。

3. 使用流式细胞术分析软件进行中性粒细胞纯度分析

注:使用流式细胞术分析软件对流式细胞术数据进行分析，如 材料表所示。

  1. 根据以下分步过程执行门控。
    1. 在 FSC-A vs. Time 图中设置时间门，以选择具有适当细胞流速的区域。
    2. 在 SSC-A 与 FSC-A 图中设置细胞门，以选择细胞并排除碎片。
    3. 在 FSC-A vs. AmCyan-A 图中设置活细胞门以选择活细胞。
    4. 在 FSC-A 与 APC-Cy7 图中设置白细胞门，以选择 CD45 + 细胞。
    5. 在 FITC vs. PerCP-Cy5.5 图中设置一个中性粒细胞门，以区分 CD66b+CD16+（中性粒细胞）、CD66b-CD16+（嗜酸性粒细胞）和 CD66b-CD16-（嗜碱性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞）。
    6. 在 FSC-H vs. FSC-A 图中设置单个细胞门，以选择单个嗜中性粒细胞。
    7. 通过将单个中性粒细胞呈现为细胞的频率（在细胞门中）来确定中性粒细胞纯度。
      注意:要继续，中性粒细胞纯度需要超过 85%。

4. 实时成像显微镜

注意:该测定针对多个 96 孔成像板和各种 NETosis 刺激物和拮抗剂进行了优化。下面的协议描述了该方法的一般视图，可以使用包含的表格进行指定。

  1. 通过在无菌 H2O 中以 1:10 的比例稀释 0.01% 聚-L-赖氨酸来制备 0.001% 聚-L-赖氨酸溶液。
  2. 向每个孔中加入 0.001% 聚-L-赖氨酸溶液，并在 37 °C 下孵育至少 1 小时。
    注意:每孔的体积取决于 96 孔成像板（表 1）。
  3. 用 200 μL DPBS 洗涤孔 3 次，以去除多余的聚-L-赖氨酸。在层流柜中执行所有步骤。取下板盖，在层流柜中打开板直至干燥（约 1 小时），将孔风干。
  4. 计算实验所需的嗜中性粒细胞数量，并将多余的中性粒细胞转移到 15 mL 试管中。以 350 x g 和 RT 离心 10 分钟。
    注:每个孔中嗜中性粒细胞的数量因 96 孔成像板的类型而异（表 1）。细胞密度经过优化，可实现单个细胞的良好分离，这是正确分析所必需的。如果中性粒细胞密度过高，细胞和 NET 将与相邻细胞和 NETs 重叠，从而影响分析质量。
  5. 弃去上清液，将中性粒细胞重悬于不含酚红的培养基中，该培养基补充有 2% （v/v） FBS、50 U/mL 青霉素和 50 μg/mL 链霉素、10 mM HEPES 和 1 mM CaCl2 （以下简称 NET 测定缓冲液）。
  6. 准备以下工作解决方案。
    1. 在 NET 检测缓冲液中制备 80 nM DNA 染料。
    2. 在 NET 测定缓冲液中准备 NETosis 刺激。
    3. 在 NET 测定缓冲液中制备 NETosis 拮抗剂。
      注意:请注意，上述工作溶液的浓度是孔中所需最终浓度的 4 倍。NETosis 刺激物和 NETosis 拮抗剂的推荐浓度各不相同（表 2 和 表 3）。
  7. 向每个孔中加入 NET 测定缓冲液中的 4x 浓缩 DNA 染料。
  8. 在 NET 测定缓冲液中将 4x 浓缩的 NETosis 刺激物添加到相应的孔中，并仅将 NET 测定缓冲液添加到没有刺激的孔或含有包被免疫复合物的孔中（cIC;表 2 中的方案）。
  9. 将 NET 测定缓冲液中的 4x 浓缩 NETosis 拮抗剂添加到相应的孔中。仅将 NET 测定缓冲液添加到没有拮抗剂的孔中。
  10. 向每个孔中加入中性粒细胞悬液。
    注:4x 浓 DNA 染料的体积，NET 检测缓冲液中 4x 浓缩的 NETosis 刺激物，NET 检测缓冲液中 4x 浓缩的 NETosis 拮抗剂，中性粒细胞的数量和每孔中性粒细胞悬浮液的体积取决于 96 孔成像板（表 1）。避免在移液时形成气泡。
  11. 将板以 100 x g 和 RT 离心 2 分钟，然后将 96 孔成像板插入置于 37 °C 和 5% CO2 培养箱中的活细胞显微镜分析系统中。
    注:在孵育的第一分钟内，96 孔成像板底部可能会形成冷凝水。这应该用纸巾去除。

5. 设置用于采集的活细胞显微镜分析系统软件

注:相差和免疫荧光图像由其分析软件控制的活细胞显微镜分析系统获取。

  1. 打开活细胞显微镜分析系统软件，然后单击 Connect to device。输入用户名和密码。单击 Schedule 以获取，然后单击加号按钮 （Launch add vessel）。随后，选择 按计划扫描 ，然后单击 下一步。
  2. 要从头开始创建新船舶，请在 Create Vessel 部分选择 New，然后单击 Next。在 Scan Type （扫描类型） 部分中选择 Standard （标准），然后单击 Next （下一步）。
  3. 选择以下扫描设置，然后单击 下一步: 逐个单元格: 无; 图像通道:相差 和 绿色 （采集时间 100 毫秒）; 目标:20 倍。
  4. 在 Vessel Selection （容器选择 ） 部分中选择要扫描的适当容器类型，然后单击 Next（下一步）。
    1. 如果使用 96 孔板 #1，请选择 Corning，板，96，N/A，3603,96 孔 Corning（Blk/Wht），微孔板。
    2. 如果使用 96 孔板 #2，请选择 Nunc、板、96、N/A、152028、96 孔 Nunc opt 底部（Blk/Wht）、微孔板。
  5. 指定容器在 Drawer 中的位置，然后单击 Next。在 Scan Pattern 部分中，选择需要扫描的孔，选择每个孔的图像数量（每个孔扫描 4 张图像以获得代表性概述），然后单击 Next（下一步）。
    注意: 不要选择空井，因为它会影响自动对焦。
  6. 通过在容器笔记本部分插入板名称等来提供有关容器的信息，然后单击 Next。在 Analysis Setup 部分中选择 Defer analysis until later，然后单击 Next。
  7. 在 Scan Schedule （扫描计划 ） 部分中定义船舶的扫描计划。选择 Create new schedule with scans at intervals of （创建扫描间隔的新计划 ），然后选择 1 小时。选择 Stop scanning and 00:05 hours after the first scan（停止扫描和第一次扫描后的 00:05 小时）。单击 下一步 ，然后在扫描信息正确时单击 添加到计划 。
    1. 当需要编辑扫描计划时，双击屏幕顶部的 Scanning Schedule （扫描计划 ）。右键单击 扫描计划 并根据需要编辑和调整。单击 Floppy disk 图标以保存扫描计划。
      注:在同一实验中对多个容器（板）进行成像时，可以通过单击加号按钮（启动添加容器），选择 按计划扫描，然后单击 下一步，将其他容器添加到现有扫描计划中。从头开始创建新容器（参见本实验步骤的第 5.2 步），复制现有容器，或使用先前扫描的容器。这导致以与前一个印版相同的频率和设置进行顺序扫描。

6. 使用活细胞显微镜分析软件进行实时成像显微镜 NET 分析分析

注:活细胞显微镜分析软件用于分析相差和免疫荧光图像（材料表）。当不使用该系统时，可以使用公共域软件包 4,18,19,20 进行类似的 NET 分析。

  1. 打开活细胞显微镜分析软件，然后单击 Connect to device。输入用户名和密码，然后单击 View recent scans（查看最近的扫描）。双击实验的容器名称，打开所选实验进行分析。
  2. 单击 Launch analysis 并选择 Create new analysis definition （创建新的分析定义）。单击 Next。
  3. 从分析类型部分中选择 Basic Analyzer ，然后单击 Next。在 Image Channel 部分中，选择 Green，取消选择 Phase，然后单击 Next。
  4. 打开 Image Layers 窗口，选择 Green 并取消选择 Phase。关闭 Green （绿色） 部分中的 Autoscale （自动缩放），并手动为绿色通道设置 min 和 max （最小值），以区分 NET 和背景。
    注意:需要时可以打开和关闭相差。例如，确定 NET 是否在细胞外环境中被排出。
  5. 打开 Vessel Scan Times（容器扫描时间）窗口，并选择必须存在 NET 的适当容器扫描时间。选择一组代表实验中可变性的图像（来自带有 NET 的阳性对照孔的图像和来自没有 NET 的阴性对照孔的图像）。这些图像将用于预览和优化分析。单击 Next。
  6. 打开 Analysis Definition Settings（分析定义设置） 窗口并开始调整绿色通道的分析设置，以便勾勒出 NET 结构，而不会产生假阳性或假阴性 NET。使用以下设置，然后单击 Preview Current 或 Preview All 以分别将设置应用于当前或所有图像。
    1. 对于 object name （对象名称），选择 NETs。
    2. 对于分段，请选择 No Background Subtraction - Adaptive。
    3. 对于阈值 GCU，请选择 3 到 5 之间（取决于实验）。
    4. 对于 edge split（边分割），选择 ON（介于 -10 和 0 之间）。
    5. 要进行清理，请选择 Hole Fill: 100 μm2 和 Adjust size: -1 pixels。
    6. 对于滤光片，请根据实验进行选择，但建议的截止值为:面积: >200 μm2，平均强度: <24.6， 积分强度: >7000。
      注意: 根据使用的设置选择的结构用洋红色勾勒出来。将鼠标悬停在这些结构上将提供有关对象参数的更多信息（即面积、偏心率、积分强度和平均强度），这有助于优化与 NET 参数的包含或排除标准相关的分析。检查多个图像（来自阳性和阴性对照孔）以测试分析设置是否正确。
  7. 当 NET 分析的设置正确时，单击 Next。在 Scan times and wells （扫描时间和井） 部分中选择要分析的时间点和井，然后单击 Next（下一步）。在 save and apply analysis definition 部分中插入定义名称，然后单击 Next。单击 Finish （完成 ） 当分析信息得到验证和正确后。
    注:分析多个板或使用先前实验中的分析时，请启动分析并选择 复制现有分析定义 或使用 现有分析定义 ，然后单击 下一步。选择适当的现有分析定义，然后单击 Next。对于后续分析过程，如果选择了 Copy existing analysis definition ，请转至步骤 6.4，如果选择了 Use existing analysis definition ，则请转至步骤 6.7。
  8. 通过单击感兴趣容器中的分析来打开实验分析。打开 Graph Metrics （图形指标） 窗口。
  9. 单击 加号 按钮 （Create metric）。数据可以表示为 NET 汇合度百分比（标记为 NET 的图像区域的百分比）或嗜中性粒细胞净额百分比（NET 数除以细胞数）。
    1. 以百分比 NET 汇合度表示数据时，请在 Metric （指标） 部分中选择 Area （面积），然后在 Value （值） 部分中选择 Confluence。将数据显示为百分比净中性粒细胞时，请选择 Object Count 在 Metric 部分，然后选择 Per Image 在 Value 部分。
    2. 单击 OK。在 User Defined Metrics 部分中选择 NETs Area Confluence （%） 或 NETs object count per image （Per Image） （每个图像的 NETs 对象计数）。 在 Select Scans （选择扫描） 部分中选择所有需要分析的时间点。在 Select Wells （选择井） 部分中选择所有需要分析的井，然后单击 Export Data （导出数据）。
  10. 在 Graphing Export （绘图导出 ） 部分中选择以下设置。
    1. 选择 Show each scan as its own table （columns: 1， 2...行:A、B...）。
    2. 选择 Show row and column labels （显示行和列标签）。
    3. 选择 All scans in one file（一个文件中的所有扫描 内容），然后单击 Browse（浏览 ）以调整文件位置和名称。
    4. 选择 Include experiment details in header（在标题中包含实验详细信息）。
    5. 选择 Break data down into individual images.
  11. 单击 Export 将数据导出为 ".txt" 文件，该文件可以导入并在电子表格中进一步分析。
    注:要确定网状中性粒细胞的百分比，需要确定 t = 0 时的中性粒细胞数量。为此，请继续执行协议的以下步骤。
  12. 转到步骤 6.1 开始计算 t = 0 时图像的嗜中性粒细胞数量所需的额外分析。
    1. 在步骤 6.3 中，选择 Phase 并取消选择 Green 在图像通道部分。
    2. 在步骤 6.4 中，在 vessel scan times（容器扫描时间）部分选择 t = 0 。
    3. 在步骤 6.5 中，取消选择 Green，选择 Phase，并在需要时调整 Phase Channel Settings 。
    4. 在步骤 6.6 中，添加 Object Name，在 Segmentation 部分选择 Classic Confluence，并将分割调整设置为 0（背景），将 Hole Fill 调整为 100 μm2，并将 Area 调整为 50 μm2。
    5. 在步骤 6.7 中，选择 t = 0 在 select scans 部分。
    6. 在步骤 6.8 中，打开 Neutrophil Count Analysis。
    7. 在步骤 6.9 中，在 User Defined Metrics 部分中选择 Object Count Per Image （Per Image） （每个图像的对象计数）。
    8. 最后，使用以下计算生成网状中性粒细胞的百分比:（NET 数 / t = 0 时的中性粒细胞数）x 100%。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

实时高通量显微镜与不渗透性 DNA 染料相结合，可以研究 NETosis 的动力学、特征和潜在途径，并能够评估 NET 释放的潜在抑制剂。通过这种方法，NET 被定义为 DNA 染料阳性的结构，与健康中性粒细胞的表面积相比，其表面积明显更大（图 1A），表明染色质已被排出到细胞外环境中18。基于表面积的分析使我们能够区分 NET 和质膜完整性受损的活化中性粒细胞，显示出明亮的细胞内 DNA 染色（图 1A）。

钙离子载体 （A23187） 和 PMA 通常用于在体外诱导 NETosis。尽管是非生理刺激，但它们很有价值，因为它们激活不同的 NETosis 通路并确保一致的 NETosis 诱导，供体之间的变异性低。A23187 触发钙内流，导致 PAD4 激活并释放富含瓜氨酸组蛋白的 NET，而 PMA 激活 NADPH 氧化酶复合物，导致活性氧 （ROS） 产生，随后释放瓜氨酸化组蛋白水平低的NETs 5,16,21。NETosis 反应的速度和大小取决于每种刺激的浓度（图 1B、C），其中 A23187 诱导更快的 NETosis，而 PMA 导致更高比例的中性粒细胞释放 NETs（图 1D-F）。由 A23187 刺激产生的 NET（图 1D;红色箭头）与 PMA 诱导的 NET（图 1D;黄色箭头）不同，它们在中性粒细胞质膜之外更分散，而 PMA 诱导的 NETs 仍然更靠近中性粒细胞质膜。此外，A23187 刺激导致可渗透的非网状 DNA 染料阳性中性粒细胞（图 1D;蓝色箭头），它不会将其 DNA 排入细胞外间隙。可渗透性非网状 DNA 染料阳性中性粒细胞的检测取决于 A23187 的浓度（图 1G），并且几乎不存在，无论用于刺激 NETosis 的 PMA 浓度如何（图 1D，H）。除了使用非生理性 NETosis 刺激 A23187 和 PMA 外，该测定还适用于研究 NETosis 的疾病相关触发因素。例如，与无刺激相比，用可溶性免疫复合物 （sIC） 或焦磷酸钙处置病 （CPPD） 中存在的晶体激活的中性粒细胞显示出 NET 释放显着增加。当中性粒细胞被包被免疫复合物 （cIC）、fMLP 和尿酸单钠 （MSU） 晶体激活时，观察到 NET 水平升高的趋势（图 1I）;然而，对于这些刺激，我们观察到相当大的供体间差异。

NETosis 通路和 NETosis 相关酶的药理学抑制表明，NETosis 靶向疗法可能是治疗 NET 积累显着驱动病理的疾病的有效治疗方法 14,17,22,23,24。这种实时显微镜 NET 检测是一种以高通量方式研究 NETosis 拮抗剂的简单、可靠且可重现的方法。为了举例说明这一点，我们使用了一流的人源化单克隆抗体 CIT-013，它以高亲和力15,16 靶向瓜氨酸组蛋白 H2A 和 H4。A23187 激活 NETosis 通路，导致 NETs 含有瓜氨酸化组蛋白，随后被 CIT-013 靶向以执行其 NETosis 抑制功能16。事实上，响应 A23187 的 NET 释放被 CIT-013 完全抑制（图 2A 和补充视频 1），IC50 为 4.6 nM（图 2B）。CIT-013 的 NETosis抑制能力是独一无二的，因为其他针对不同（非）瓜氨酸组蛋白的商业抗体无法抑制 NET 释放（图 2C）。

以前，我们已经表明，CIT-013 的高度相似的前体分子（两个氨基酸不同，但以相同的亲和力结合相似的表位）响应于活化的血小板、痛风滑液以及 RA 滑液等生理刺激而阻断 NETosis17。在这里，我们表明 sIC 诱导的 NET 释放可以被 CIT-013 抑制（图 2D）。SLE、RA 和其他自身免疫性疾病强调了抑制这种刺激诱导的 NETosis 的治疗相关性，其中血清或滑液中的自身抗体支持 IC 的形成，从而触发 NETosis25,26。

总之，这些数据表明，这种实时高通量显微镜方法适用于研究 NET 释放的动力学和特征，并允许研究 NETosis 的抑制剂。尽管该方法已针对人中性粒细胞的使用进行了优化，但经过修改后，它也可能适用于研究其他物种的中性粒细胞。通过该测定生成的数据是 CIT-013 作为 NET 驱动疾病的有效疗法的基本原理的基石。

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图 1:用于研究 NET 释放的实时高通量显微镜。用 A23187 或 PMA 刺激从健康志愿者血液中分离的中性粒细胞以触发 NETosis 通路。使用质膜不可渗透的 DNA 染料通过实时高通量显微镜观察 NET 释放，并使用活细胞显微镜分析系统软件根据表面积进行定量。（A） 用细胞内 DNA 染色（绿色）分析未刺激的健康中性粒细胞（灰色）、细胞外 NET 和可渗透的非网状中性粒细胞的表面积。（B，C）用指定的 A23187 或 PMA 浓度刺激的中性粒细胞随时间释放的 NET 的定量 （n = 2）。（D） 响应 A23187（红色箭头）和 PMA（黄色箭头）的 NET 释放在不同时间点的代表性图像。可渗透的非网状嗜中性粒细胞的例子用蓝色箭头表示。（E） 随着时间的推移，NET 释放的量化表示为 NET 汇合度的百分比 （n = 5）。在 t = 240 分钟时进行统计。（F） NET 释放随时间变化的定量表示为 net 中性粒细胞的百分比 （n = 2）。（G、H）用指定的 A23187 或 PMA 浓度 （n = 2） 刺激的嗜中性粒细胞中随时间变化的可渗透性非网状中性粒细胞的定量。（I） 可溶性免疫复合物 （sIC）、包被 IC （cIC）、fMLP、单钠尿酸盐 （MSU） 晶体和焦磷酸钙处置病 （CPPD） 中存在的晶体诱导的 t = 240 min 时 NET 释放的定量 （n = 8-28）。结果以平均值±平均值的标准误差报告。**P < 0.01，****P < 0.0001，使用 Dunnett 多重比较检验 （B） 重复测量单向方差分析，使用 Dunn 多重比较检验 （I） 进行 Kruskal-Wallis 检验。面板 A-F 经 van der Linden 等人16 许可进行了修改。请单击此处查看此图的较大版本。

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图 2:CIT-013 抑制 NET 释放。 （A） 在不存在 （No Ab） 或存在 CIT-013 或同种型对照抗体 （cIgG） 的情况下，在 t = 240 分钟时定量分析 A23187 诱导的 NET 释放。（B） 在 t = 240 分钟 （n = 3） 时，CIT-013 对 A23187 诱导的 NET 释放的剂量依赖性抑制。将数据归一化为 cIgG （设置为 100% NET 释放）。（C） 在指定浓度的 CIT-013、抗组蛋白 H4 抗体、抗瓜氨酸组蛋白 H3 抗体 #1 或抗瓜氨酸组蛋白 H3 抗体 #2 （n = 6） 存在下，在 t = 240 分钟时定量 A23187 诱导的 NET 释放。（D） 在 CIT-013 或 cIgG 存在下，可溶性免疫复合物 （IC） 诱导的 t = 240 分钟时 NET 释放的定量。结果以平均值±平均值的标准误差报告。P < 0.0001，使用 Tukey 多重比较 （A） 或双尾 Wilcoxon 匹配对有符号秩检验 （D） 重复测量单向方差分析。图 A、 B 和 D 已经 van der Linden 等人16 许可修改。 请单击此处查看此图的较大版本。

96 孔板 #196 孔板 #2
体积 0.001% 聚-L-赖氨酸溶液/孔50 微升100 微升
每孔中性粒细胞悬液的体积50 微升87.5 微升
每孔的中性粒细胞数量2 x 104 格3.5 x 104 格
体积:每孔 4x 浓缩 （= 80 nM） DNA 染料，溶于 NET 检测缓冲液中50 微升87.5 微升
体积 4x 浓缩的 NETosis 刺激物，溶于 NET 检测缓冲液中，每孔50 微升87.5 微升
体积 4x 浓缩的 NETosis 拮抗剂，溶于 NET 测定缓冲液中/孔50 微升87.5 微升

表 1:针对不同 96 孔成像板优化的体积和细胞数量。

浓缩工作液（4x 浓缩）最终浓度
钙离子载体 （A23187）50 微米12.5 微 M
PMA16 纳米4 纳米
fMLP4 微米1 微米
尿酸单钠 （MSU） 晶体400 微克/毫升100 微克/毫升
焦磷酸钙处置病 （CPPD） 晶体400 微克/毫升100 微克/毫升
可溶性免疫复合物 （sIC）1. 将 5 μg/mL 人血清白蛋白 （HSA） 的 DPBS 添加到 DPBS 中的 282.5 μg/mL 多克隆兔抗 HSA 抗体中。
2. 在 37 °C 下孵育至少 90 分钟。
3. 涡旋匀浆，并向相应的孔中加入 50 μL sIC 溶液。
包被免疫复合物 （cIC）1. 在 96 孔板的相应孔中加入 10 μg/mL HSA 的 DPBS 溶液。
2. 在 4 °C 下孵育过夜。
3. 用 200 μL 0.05% Tween-20 的 DPBS 溶液（以下简称 PBS/0.05%Tween）洗涤孔 3 次。
4. 用 200 μL 1% （w/v） 牛血清白蛋白的 PBS/0.05% 吐温溶液（以下简称封闭缓冲液）封闭孔。
5. 在室温下孵育 120 分钟，并轻轻搅拌 （400 rpm）。
6. 用 200 μL PBS/0.05% 吐温洗涤孔 3 次。
7. 将 50 μL 多克隆兔抗 HSA 抗体添加到相应的孔中。
8. 在室温下孵育 60 分钟，然后轻轻搅拌 （400 rpm）。
9. 用 200 μL PBS/0.05% 吐温洗涤孔 3 次。
10. 最后，用 200 μL DPBS 洗涤孔 3 次。Wells 现在已准备好进行方案中的步骤 4.7。

表 2:NETosis 刺激的推荐浓度。

浓缩工作液（4x 浓缩）最终浓度
抗鸡蛋溶菌酶抗体（对照抗体;cIgG）80 纳米20 纳米
CIT-01380 纳米20 纳米

表 3:NETosis 拮抗剂的推荐浓度。

补充视频 1. 在 cIgG（左）或 CIT-013（右）存在下用 A23187 刺激中性粒细胞，并使用质膜不可渗透的 DNA 染料随时间观察 NET 释放。在 CIT-013 存在下 NET 释放受到抑制。该电影是 DNA 染料（绿色）和相差的叠加。该视频经 van der Linden 等人许可获得16。 请点击此处下载此视频。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

自 2004 年发现 NETs 以来，已经开发了许多策略来实验研究体外 NET 释放，其中免疫荧光显微复制是量化 NETosis 的最常用技术27,28。尽管显微镜可用于可视化 NET 释放，但它具有局限性，因为固定时间点图像的非自动显微镜量化相当不准确，并且可能会受到观察者偏差的影响。另一种用于研究 NET 释放的技术是多光谱成像流式细胞术29,30，它测量大量网状中性粒细胞并采用无偏倚分析，但侧重于 NETosis 早期阶段的中性粒细胞，不量化已释放 NET 的中性粒细胞。许多关于 NETosis 动力学的研究使用 DNA 染料结合荧光酶标仪31 来定量 NET 释放。该技术无法通过细胞内 DNA 染色区分 NETs 与活化或垂死的中性粒细胞，因此不适合定量 NET 释放和研究 NETosis 拮抗剂。以上强调了目前用于研究 NETosis 的方法很有价值，但也有其局限性。

本研究中描述的实时显微镜方法解决了以前报道的技术中发现的许多问题。它提供无偏差、半自动、高通量、可重现且准确的 NET 定量。事实上，这种方法最大限度地减少了移液伪影，如 NETs 的拉伸形态18，并且能够通过 DNA 释放的不同形态和动力学区分 NETosis 与坏死和细胞凋亡18,32。此外，这种方法为研究调节细胞死亡的不同生化途径提供了机会，例如坏死性凋亡性中性粒细胞中的 NET 形成，其产生的结构符合 NETs 的功能和表型标准33。

该协议中有几个关键步骤需要遵循才能成功定量 NET。首先，每孔的正确细胞数对于准确的 NET 定量很重要。当中性粒细胞密度过高时，细胞和 NET 会与相邻的细胞和 NETs 重叠，这使得它们难以区分，因此，定量将变得不准确。其次，当分泌到细胞外环境中时，使用低浓度的无毒质膜不渗透性 DNA 结合染料对 NETs 进行染色是先决条件。质膜可渗透性 DNA 结合染料可轻易诱导中性粒细胞活化或细胞死亡。第三，必须扫描每孔的多张图像，以获得异质性中性粒细胞群中 NET 释放的代表性概述。第四，t = 0 时嗜中性粒细胞的相差图像对于校正每个图像的嗜中性粒细胞数量并计算网状嗜中性粒细胞的百分比是必要的。

尽管这种实时、高通量显微镜方法与其他 NET 检测测定相比具有许多优势，但这种方法存在局限性，因为据我们所知，没有荧光染料可用于检测其他 NET 成分以确认 NETs 的释放。可以使用荧光标记抗体来检测其他 NET 成分，但可能会产生不良影响，因为抗体免疫复合物会影响中性粒细胞活化，并可能影响 NETosis。因此，我们不喜欢在此检测设置中使用额外的抗体，而是建议使用众所周知的 NETosis 诱导刺激。当使用尚未确定的 NETosis 刺激时，我们提倡在实时成像测定之前使用 ELISA 来检测与 NET 特异性蛋白质（如瓜氨酸化组蛋白）复合的 DNA。其次，测定内和测定间的差异可能是由供体间的变异引起的，由于健康人群内的异质性，来自健康供体的中性粒细胞对各种 NETosis 刺激的反应不同。为了尽量减少检测变化，必须在 1 小时内从新鲜抽取的血液中分离出嗜中性粒细胞并立即用于实验，因为嗜中性粒细胞寿命短且不能冷冻保存。此外，重要的是验证并采用中性粒细胞分离方案以最大限度地减少中性粒细胞活化。中性粒细胞是敏感细胞，由于机械和其他类型的压力，在纯化过程中会改变它们对刺激的反应。中性粒细胞活化状态和 NET 释放受针头类型、使用的采血管、孵育温度、离心速度以及从采血到中性粒细胞分离的时间的影响 34,35,36,37。Krémer 等人36 描述了另一种可以考虑的中性粒细胞分离方法，该方法使用阴性免疫磁性选择方法，无需红细胞裂解。该方法类似于全血中未接触的中性粒细胞，可能适用于在纯化过程中防止任何中性粒细胞活化。以上所有内容都应该提醒该领域，来自不同研究小组的数据需要非常小心地进行比较。

总体而言，所描述的实时高通量显微镜方法能够以可重现和有效的方式准确定量 NETs，可用于研究 NET 释放的特征、幅度和动力学，并能够研究 NETosis 拮抗剂的活性。作为后者的一个例子，我们使用了人源化抗瓜氨酸组蛋白 H2A 和 H4 单克隆抗体 CIT-013，目前正在临床开发中。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者是 Citryll 的员工，拥有经济利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者要感谢 Paul Vink 管理有关实时成像显微镜方法的部分项目。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
A-23187 游离酸（钙霉素）Thermo FisherA1493
氯化铵 （NH4Cl）Sigma AldrichA9434
抗鸡蛋溶菌酶（对照抗体;cIgG）CrownBioC0001
APC-Cy7 偶联小鼠抗人 CD45 抗体（克隆 2D1）Biolegend368515在 1 µ 使用;g/mL 终浓度
BD FACSCantoTM II 系统 + FACSDiva 软件（版本 8.0.1） BDn/a流式细胞术系统
血清白蛋白 （BSA） 馏分 V罗氏10735108001
CaCl2 （1 M）VWRE506
焦磷酸钙处置病 （CPPD） 晶体InvivoGenlrl-cppd
细胞光度计 Auto T4 明场细胞计数器 + 分析软件（版本 3.3.9.5）NexcelomBiosciencen/a明场细胞计数器
CIT-013Citryll BVn/a
Costar 黑色 96 孔板，透明底 康宁360396 孔板 #1
葡聚糖 T500Pharmacosmos551005009006
DPBS （1x）Gibco14190-144
胎牛血清 （FBS）SerenaS-FBS-SA-015
Ficoll GE Healthcare17-1440-02密度梯度溶液
FITC 偶联小鼠抗人 CD66b 抗体（克隆 G10F5）eBioscience17-0666-42在 1.5 µ 下使用;g/mL 终浓度
可固定活性染料 eFluor 506eBioscience65-0866-14
流式细胞术分析软件FLowJo版本 10.8.0
fMLPSigma Aldrich47729-10MG-F
HEPES （1M）Gibco15630-080
人血清白蛋白 （HSA）VWR31020
人TruStain FcX Biolegend422302Fc 受体阻滞
IBIDI 96 孔板，透明底 IBIDI8962696 孔板 #2
IncuCyte SX3 + 分析软件（2022B Rev1 版） Satoriusn/a活细胞显微镜分析系统
尿酸单钠晶体InvivoGentlrl-msu
小鼠抗组蛋白 H3（瓜氨酸 R2 + R8 + R17）抗体 开曼17939克隆 11D3;称为 #1
小鼠抗组蛋白 H4 （K8Ac + K12Ac + K16Ac） 抗体（克隆 KM-2）绝对抗体Ab01681-2.0
Na2EDTASigma AldrichE5134
NaCl （0.9%）B. Braun25900
青霉素 （5000 U/mL） - 链霉素 （5000 µg/mL）Gibco15070-063
PerCP-Cy5.5 偶联小鼠抗人 CD16 抗体（克隆 3G8）Biolegend302027在 0.33 µ 下使用;g/mL 终浓度
PMASigma AldrichP1585
多克隆兔抗 HSA 抗体Sigma AldrichA0433-2ml
聚-L-赖氨酸 （0.01%）Sigma AldrichP4832
碳酸氢钾 （KHCO<亚>3）Sigma Aldrich237205
兔抗组蛋白 H3（瓜氨酸 R2 + R8 + R17）抗体 Abcamab281584多克隆抗体;称为 #2
RPMI 1640 含 GlutaMAXTM 补充剂 Gibco61870-010L-谷氨酰胺
RPMI 1640 的培养基 Gibco11835-030不含酚红
叠氮化钠的培养基 （NaN3）Sigma AldrichS2002
无菌 H2OGibco15230204
Sytox Green 核酸染色剂 Thermo FisherS7020DNA 染料
盼蓝溶液 （0.4%）Gibco15250-061
吐温-20Sigma AldrichP1379
Vacutainer 血管 肝素 （17 IU/mL）BD367526
牛剂 群岛 含有不含酚红的 台

参考文献

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NETosis NET

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