方法文章

IDH1突变型弥漫性低级别胶质瘤的组织块培养方案

DOI：

10.3791/67260

⸱

2025年5月9日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institut de Génomique Fonctionnelle, Université de Montpellier, CNRS, INSERM, 2Department of Neurosurgery, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University of Chongqing, 3Department of Neurosurgery, Gui de Chauliac Hospital, Montpellier University Medical Center, 4Jingfeng laboratories of Chongqing

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

携带IDH1突变的弥漫性低级别胶质瘤是一种罕见肿瘤，难以进行培养。我们介绍一种简单的非酶解组织块培养法，可维持IDH1突变蛋白的表达，并使培养物持续存活数月。重要的是，该技术适用于冻存肿瘤组织，为胶质瘤研究提供了宝贵的资源。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

弥散性胶质瘤是最常见的原发性脑肿瘤，根据组织病理学标准和基因突变分为低级别和高级别。弥散性低级别胶质瘤是其中的一个亚型，主要影响年轻成人，并易进展为高级别胶质瘤。弥散性低级别胶质瘤主要有两种类型：星形细胞瘤和少突胶质细胞瘤，每种类型均具有独特的遗传和组织学特征。这类肿瘤通常表现出代谢酶IDH1的突变形式，从而干扰细胞分化。肿瘤具有异质性，包含增殖性干细胞以及更成熟的静止态胶质细胞。

患者特异性的 体外 肿瘤模型在揭示致癌机制和为个体化治疗定制药物选择方面具有重要意义。然而，目前缺乏可靠的 体外 针对IDH1突变型低级别胶质瘤的模型匮乏，阻碍了基础与转化研究。本文介绍一种简单的方法，可在无需酶解离的情况下，于特定培养基中培养IDH1突变型肿瘤组织外植体。这些外植体可长期维持，保留IDH1突变蛋白的表达，以及少突胶质前体细胞标志物（如ASCL1（MASH1）、OLIG1和OLIG2）和星形胶质细胞标志物（GFAP、SOX9）。此外，这些外植体亦可由DMSO冷冻保存的肿瘤组织建立。此类培养体系可作为药物筛选、活细胞显微成像和基因研究的宝贵平台，有助于推动对这类难治性肿瘤的理解与治疗进展，并具备获得IDH1突变型细胞系的潜力。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

弥漫性胶质瘤是最常见的原发性脑肿瘤。尽管接受高强度治疗（手术、放疗和化疗），这些肿瘤目前仍无法治愈1。越来越多的证据支持胶质瘤的发生起源于大脑中固有的成体干细胞或胶质前体细胞2。尽管胶质母细胞瘤是最具侵袭性的类型，但弥漫性低级别胶质瘤（DLGG，2级肿瘤） 也较为常见（占弥漫性胶质瘤的15%）1,3。DLGG生长缓慢，并沿白质纤维束迁移，这是此类“弥漫性”肿瘤的典型特征4。这些DLGG即使经过治疗也常常复发，最终进展为高级别恶性肿瘤（3级和4级）5。

弥漫性低级别胶质瘤（DLGG）的特征是异柠檬酸脱氢酶1或2基因（IDH1或IDH2）发生错义突变，导致致癌代谢物2-羟基戊二酸（2HG）异常生成。这会通过表观遗传失调干扰细胞分化6。IDH1突变型胶质瘤可进一步分为不同亚型：星形细胞瘤通常伴有ATRX和P53基因突变，而少突胶质细胞瘤则以1p/19q共缺失为特征7。这些肿瘤具有肿瘤细胞的异质性。单细胞RNA测序和免疫表型分析表明，此类肿瘤内存在多种类型的肿瘤细胞，表现出类....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本方案中使用的肿瘤组织片段来自一个经过充分表征且获得伦理批准的样本库，并已取得患者的知情同意。本研究在题为Gliomacult: Characterization and Primary Cultures of Low-Grade Gliomas（项目编号：RECH/P722/1-5）的项目下开展，并已于2023年8月28日获得肿瘤生物样本库科学委员会的批准。

1. 培养平板的制备

注意：这些步骤应在无菌的组织培养超净工作台内进行。

  1. 培养前至少1小时，准备多聚-D-赖氨酸（PDL）和层粘连蛋白包被的24孔板。
    1. 将10 mg PDL粉末溶于100 mL硼酸盐缓冲液（pH 8.4）中，终浓度为100 µg/mL。完全溶解后，用0.22 µm滤器过滤以保证无菌。PDL溶液可立即使用；分装成3 mL每份，于-20 °C保存。
    2. 在4 °C下解冻1–2 mg/mL的层粘连蛋白管，以避免形成凝胶。分装成50 µL每份，于-20 °C保存。
      注：应避免反复冻融。
    3. 包被操作
      1. 可选步骤：将适用于细胞培养皿的无菌盖玻片（直径13 mm）放入24孔板中，每孔一片。
        注：此步骤用于后续胶质瘤组织块的免疫染色。
      2. 进行孔板包被时，将....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

几天后，部分肿瘤碎片会附着在培养孔表面，开始从组织块中外移出细胞。初次接种至肿瘤细胞开始生长所需的时间因样本而异。初始培养物中常含有大量细胞碎片，使得难以判断是否有活细胞存在。因此，培养时间应至少维持4周。一旦细胞开始生长，便可观察到呈 bipolar 或 multipolar 形态的长形细胞（图 2B、C）。

解冻冷冻保存的切碎肿瘤组织时，外植体培养的成功率可能会略有下降。尽管我们尚未准确量化冷冻保存的影响，但成功率的降低似乎并不显著。如图2D所示的三个案例中所示，我们未观察到新鲜肿瘤来源细胞与冷冻保存肿瘤来源细胞在细胞形态上存在明显差异。使用冷冻保存样本时，通常也能观察到细胞从肿瘤外植体中显著且广泛的迁移现象。如图2E所示，即使在外植体仅传代一次后，仍可观察到具有双极形态的肿瘤来源细胞形成复杂而广泛的网络结构。这些外植体培养物可用于视频显微观察，从而详细记录细胞从外植.......

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

由于IDH1突变型低级别胶质瘤生长缓慢，且IDH突变导致广泛的基因组和表观基因组改变，因此建立此类肿瘤的体外和临床前模型尤为困难。此外，这些浸润性肿瘤细胞会与周围的免疫细胞、内皮细胞、胶质细胞以及神经元细胞等发生主动相互作用，甚至可能依赖这些细胞存活。这种复杂的相互作用在实验室环境中难以模拟。

为了揭示 IDH1 突变型低级别胶质瘤的新生物学机制，并推动创新疗法的开发，建立能够真实再现人类疾病复杂性的模型至关重要。与胶质母细胞瘤等高级别胶质瘤相比，目前针对低级别胶质瘤的 体外 可用于IDH突变型胶质瘤的模型有限。大多数IDH1突变型细胞系来源于高级别胶质瘤，例如间变性少突胶质细胞瘤（如BT260和BT237），这些细胞系携带额外的突变，仅能部分模拟伴有IDH1突变的弥漫性低级别胶质瘤的特征。

该方法有一些关键步骤需要考虑。首先，切除的肿瘤通常体积较大且具有显著异质性，包含肿瘤组织、浸润组织以及非肿瘤成分。区分这些不同部分可能存在困难，从而增加培养取材时的选择难度（图1.......

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明无利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究所用的肿瘤组织碎片来自蒙彼利埃大学医院生物资源中心（CRB@chu-montpellier.fr）保存的神经学类新鲜组织样本库（NEUROLOGY 收集样本）。本研究在名为“"Gliomacult：低级别胶质瘤的表征与原代培养"”的项目下开展，项目负责人为 J. P. Hugnot 教授（项目编号：RECH/P722/1-5）。本工作获得法国抗癌联盟（La ligue contre le cancer）、癌症研究协会（ARC）、ARTC、ARTC SUD、Les Etoiles dans la mer、EMBALL'ISO、奥克西塔尼大区（Région Occitanie）以及法国国家癌症研究所（INCA）的支持。K.A.C 受墨西哥国家人文科学与技术委员会（CONAHCYT）和法国脑肿瘤研究协会（ARTC）资助。

....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗ASCL1BD Pharmingen™556604稀释比例 1:500
抗ATRXSigma-AldrichHPA001906稀释比例 1:100
抗CD68AgilentM081401-2稀释比例 1:500
抗GFAPAves LabsAB_2313547稀释比例 1:500
抗IBA1Fujifilm Wako Antibodies019-19741稀释比例 1:1000
抗IDH1 (R132H) 小鼠单克隆抗体DianovaDIA-H09
抗Ki67BD Pharmingen™556003稀释比例 1:1000
抗OLIG1R&D Systems®AF2417稀释比例 1:300
抗OLIG2Sigma-AldrichMABN50稀释比例 1:250
抗SOX9Abcam®EPR14335-78稀释比例 1:100
B-27添加剂（50倍浓度），不含维生素AThermo Fisher Scientific12587010
牛血清白蛋白（BSA）CiteAbA-421-100
盐酸环丙沙星Sigma-AldrichPHR1044-1G
CoolCellCorning®432000细胞冷冻容器，适用于12个1 mL或2 mL冻存管
盖玻片 Ø，13 mmKarl Hecht™ Assistent™328017
二甲基亚砜（DMSO）Sigma-AldrichD8418
DMEM/F-12，不含谷氨酰胺Thermo Fisher Scientific21331020
脱氧核糖核酸酶I（DNAse I）Sigma-Aldrich10104159001
Dulbecco′s磷酸盐缓冲液（PBS）1xSigma-AldrichD8537
Falcon 100 mm TC处理细胞培养皿Corning®353003
Falcon 24孔透明平底板Corning®353047TC处理多孔细胞培养板，带盖，无菌 
真菌抑制剂（Fungin）InvivoGenant-fn-1
庆大霉素Thermo Fisher Scientific15750-037
肝素Sigma-AldrichH3149-100KU
HEPESSigma-AldrichH-3375
人EGFPeproTechAF-100-15-1MG
人碱性FGFPeproTech100-18B-1MG
层粘连蛋白Sigma-AldrichL2020
L-谷氨酰胺Thermo Fisher Scientific25030-024
N-2添加剂（100倍浓度）Thermo Fisher Scientific17502-048
多聚赖氨酸（PDL）Sigma-AldrichP7886
带GF/0.2 µm Supor膜的37 mm血清级针头滤器PALL Corporation4525
胰蛋白酶抑制剂Thermo Fisher Scientific17075-029
胰蛋白酶-EDTA（0.05%），含酚红Thermo Fisher Scientific25300054
Zeiss Z1 Apotome 3显微镜Zeiss直立式宽场落射荧光显微镜

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dasgupta, P., Balasubramanyian, V., De Groot, J. F., Majd, N. K. Preclinical models of low-grade gliomas. Cancers (Basel). 15 (3), 596(2023).
  2. Tirosh, I., et al. Single-cell RNA-seq supports a developmental hierarchy in human oligodendroglioma. Nature. 539 (....

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

IDH1

相关文章