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通过光遗传变构调控实现蛋白质活性的时空控制

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DOI：

10.3791/67261

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2024年10月4日

 ,  , 
1Department of Pharmacology and Regenerative Medicine, University of Illinois at Chicago

本文内容

摘要

本方案描述了一种工程化的蓝光激活变构开关（LightR）结构域，可用于可逆地进行时空控制蛋白质活性。以Src酪氨酸激酶为模型，本研究提供了开发和表征光调控Src（LightR-Src）的详细方案，并展示了该方法在不同酶类中的广泛适用性。

摘要

光遗传学技术有望实现对酶活性的复杂时空控制，其精度可达亚细胞水平。然而，大多数光遗传学方法在将多种功能整合到一种适用于多种靶蛋白的单一工具中时，常面临重大挑战。如何实现对“开启/关闭”动力学的精确控制、确保在黑暗条件下最小的渗漏活性，并在哺乳动物细胞中以亚细胞精度高效发挥作用，是该领域常见的难题。一个有前景的解决方案是利用理性设计的光敏结构域，通过别构效应来调控蛋白质活性。基于这一策略，我们开发出一种具备所有理想特性的光遗传学方法。该方法通过将光调控别构开关模块（LightR）插入靶蛋白中，利用蓝光（465 nm）调控酶活性。LightR结构域由两个Vivid（VVD）光感受结构域连接而成，形成一种光敏感夹子，可插入酶催化结构域内的一个小而灵活的环区。在黑暗状态下，LightR夹子处于开放状态，导致酶催化结构域构象畸变而失活；当暴露于蓝光时，LightR结构域闭合，恢复催化结构域的正常构象，从而恢复酶活性。本文中，我们讨论了构建光调控蛋白激酶的设计策略 ，并展示了其在蓝光控制下的可逆性、动力学特性以及在亚细胞水平上的精确调控能力，实现了高度精确的时空控制。以Src酪氨酸激酶为模型，我们展示了一种有效调控LightR-Src激酶活性的实验方案。此外，我们还证明了LightR系统适用于不同类型的酶，拓展了该工具在研究多种疾病相关信号通路机制问题中的应用价值。

引言

细胞在生理或病理条件下解读外部信号并将其转化为特定反应的能力，由特定的蛋白质群组所调控。任何蛋白质在这些复杂反应中的作用，通常由其亚细胞定位、表达水平以及瞬时、持续或振荡性激活的时间动态所决定。要解析这些独立参数在信号转导调控中的作用，需要能够模拟亚细胞水平上蛋白质活性复杂时空控制的方法。传统的技术手段，如基因操作和小分子抑制剂，在这方面存在局限性。相比之下，光遗传学技术有望通过操控或模拟生理与病理过程，实现对生物过程的精细解析。然而，现有的工具往往缺乏广泛的适用性或亚细胞水平的精确控制。一些已有策略能够实现对蛋白质定位和相互作用的严密调控，但无法直接控制酶活性1,2,3,4；另一些方法虽可调控酶活性，但可能缺乏亚细胞特异性，或在不同酶类之间适用性有限5,6,7,8,9。在本实验方案中，我们介绍一种新型的蛋白质工程技术，将光遗传学的优势集于一身：实现严密的时间调控、可调的动力学特性、亚细胞水平的控制以及广泛的酶类适用性10。我们设计了一种光调控（LightR）结构域，当其插入目标蛋白内部时，可作为别构开关发挥作用。该策略能够在活细胞中实现对目标蛋白激活与失活的严密时空控制。

本文讨论了光遗传学工具LightR在多种酶类中的设计与应用策略。本研究提供了光调控酪氨酸激酶Src（LightR-Src）的构建、表征及应用的逐步实验方案。研究进一步展示了LightR开关失活动力学的可调节性。具有慢失活特性的LightR开关可在减少光照频率的情况下维持酶活性，而快速循环版本FastLightR则需要更频繁的光照以维持激活状态，但在光照关闭后可迅速失活。在活细胞中对FastLightR-Src进行激活/失活可诱导细胞铺展与回缩的周期性变化。FastLightR-Src诱导的细胞铺展符合Src激酶的生理功能11,12。由于其快速失活的动力学特性，FastLightR-Src还可实现亚细胞水平的调控，从而诱导局部突起形成和细胞极化。为展示LightR工具在其他类型酶中的适用性，本文简要介绍了在工程化光调控激酶bRaf（LightR-bRaf、FastLightR-bRaf）以及位点特异性DNA重组酶Cre（LightR-Cre）中取得的类似成功。总体而言，该方法有望推动我们对调控多种疾病病理生理过程的复杂信号通路的理解。

方案

1. LightR 的设计与开发（图 1）

  1. 战略规划
    注意：LightR 结构域由来自粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）的两个串联连接的Vivid（VVD）光感受器结构域组成13,14,15,16在光照条件下，VVDs 会发生同源二聚化，这种二聚化涉及构象变化，使得一个 VVD 单体的 N 末端靠近另一个 VVD 单体的 C 末端（图1A）。将两个VVD结构域通过一个柔性连接肽相连，可形成一种类似夹钳的结构域，该结构域在黑暗中呈开放状态，而在蓝光照射下则关闭。将此夹钳结构整合到酶的催化结构域中，即可实现光介导的酶活性调控。在黑暗条件下，开放的夹钳结构会扭曲催化结构域，使酶失活；蓝光照射则促使夹钳闭合，恢复酶的活性（图1B）。这一概念可应用于来自不同家族的酶，包括蛋白激酶和DNA重组酶。10 (图1C).
    1. LightR的设计
      1. 使用一个由22个氨基酸组成的柔性连接肽（GGS）4G（GGS）3 连接两个VVD分子，位于每个单体之间。
        注意：该连接子提供了足够的灵活性和长度，以容纳VVD单体的结合与解离。
      2. 在LightR结构域的N端和C端分别添加GPGGSGG和GSGGPG连接肽。
        注意：连接子的长度和组成可能需要根据特定蛋白质进行调整。当需要更严格的调控时，通常使用较短的 GSG 或单个 Gly 连接子。插入环的大小及其与催化残基的接近程度也会影响调控的动态范围。较短的环更有可能实现对催化活性的更严格调控，但光照后可能导致活性较低。LightR 结构域的序列如下所示： 补充表1.
    2. 光敏蛋白LightR的插入
      注意：选择合适的 LightR 插入位点应能够紧密调控目标结构域的功能，同时不会因空间位阻阻碍其相互作用，或引发不可逆的结构改变而影响其生物学功能。目标蛋白的晶体结构是鉴定适合插入 LightR 的柔性环区的理想指导。如有必要，近源同源蛋白的晶体结构也可作为参考。以下提供一些需考虑的一般性标准。
      1. 确保插入环在结构上与酶的关键催化元件相偶联。所选插入环不应是该蛋白质的现有结合位点，且插入LightR不会因空间位阻效应而可能破坏任何功能性相互作用。
      2. 作为初步策略，在插入 LightR 时，替换插入环中的一个氨基酸。应靶向插入环的中部，选择位于溶剂暴露区域且不参与分子内相互作用的极性或小分子氨基酸（如 Glu、Arg、Lys、Gly）。
        注意：当单个氨基酸替换无法产生功能性蛋白时，LightR 构建体的优化将需要替换多个氨基酸或整个插入环。在已定义的环内评估多个 LightR 插入位点的功能性。
      3. 确保目标酶独立于内源性调控机制发挥作用。为此，可在插入模板中使用该酶的组成型活性突变体版本。
        注意：野生型酶也可用于构建 LightR 融合蛋白，但这可能产生一种与门控系统，其活性将同时受到内源性机制和光的调控。
      4. 阳性和阴性对照对于LightR酶活性分析至关重要。使用内源性蛋白的组成型活性突变体作为阳性对照，使用靶向LightR酶的催化失活突变体作为阴性对照。
        注意：在选择失活突变时，必须确保突变位点与LightR插入位点之间保持足够的距离，以避免干扰LightR-酶折叠的不可逆性。根据上述标准，Src激酶中LightR的插入位点被选定于一个柔性环区域，该区域通过一条β-链在结构上与ATP结合区的甘氨酸富集环（G-loop）中高度保守的GXGXXG基序相耦合。重要的是，该插入位点远离ATP结合口袋和底物结合区域。10,17 (图1C (i)).
        注意：由于激酶之间存在结构同源性，bRaf 中 LightR 的插入位点选择在与 Src 相同的结构环区域图1C (ii)).
        注意：根据第1.1.2节所述原则，LightR在Cre重组酶（一种非激酶蛋白）中的插入位点选择在远离催化核心（即DNA结合位点）的一个柔性环区域。然而，该插入环通过一段α-螺旋与DNA结合结构域内的关键催化残基在结构上相连，以确保LightR-Cre功能的实现图1C (iii)）。本方案中所述不同酶的阳性与阴性对照的所有插入位点详见于 补充表2.
    3. FastLightR 的开发
      注意：在 LightR 中将 I85V 突变引入两个 VVD 结构域可实现更快的激活-失活动力学，这是由于突变体能迅速转化为暗态所致。18,19FastLightR-Src 和 FastLightR-bRaf 的生成具有快速失活动力学特性，可实现对激活与失活过程的精确时间控制，从而在活细胞中实现对 LightR-Src 的亚细胞水平调控。
      注意：Cre 重组酶活性会导致不可逆的 DNA 重组，因此 LightR 的可逆性特性不适用。
      注意：为简化对LightR构建体的检测，可在目标蛋白的N端或C端连接荧光蛋白或其他合适的标签。本研究中，LightR-Src使用mCherry-myc，LightR-bRaf使用Venus，LightR-Cre重组酶使用miRFP670。
  2. 克隆策略
    注意：该克隆方法不同于传统方法，基于不依赖于特定限制性酶切位点的定点突变技术10,20.
    1. “巨引物”的制备
      1. 对 LightR 基因进行密码子优化，以确保来源于真菌的两个串联 VVD DNA 序列在哺乳动物细胞中稳定表达，并使序列间尽可能不同，以便通过 PCR 实现无错误克隆。进行密码子优化时，请遵循步骤 1.2.1.2–1.2.1.3。
      2. 将VVDs的氨基酸序列与所选连接肽的序列并列比对，以构建LightR的理论序列图谱。
      3. 将序列粘贴至任意在线密码子优化平台，该平台应采用先进的密码子优化算法，以确定复杂度最低的最佳序列方案。确保选择目标生物体，保持正确的阅读框，并对VVD序列进行优化选择。
      4. 获取 LightR DNA 作为定制合成片段（参见 补充表1）或来自先前发表的 LightR 构建体10.
      5. 扩增 LightR 基因以生成“Megaprimer”，使用先前描述的方法20 策略概述 图1D. 按照特定DNA聚合酶的生产商推荐方法，通过PCR合成LightR“Megaprimer”，PCR反应体系如下：
             5x DNA聚合酶兼容缓冲液： 10 µL
             100 µM 上游大引物： 0.5 µL
             100 µM 反向大引物： 0.5 µL
             10 nM dNTP 混合液： 2 µL
             DNA聚合酶（2000 单位/毫升）： 1 µl (0.02 U/µL)
             50 ng 模板 DNA： 1 µL
             PCR级水： 35 µL
        注意：此处使用具有通用引物退火温度的高保真热启动DNA聚合酶。
      6. 通过琼脂糖凝胶电泳分离所得的长引物。产物长度约为1000个核苷酸。从琼脂糖凝胶中切下长引物，并按照制造商的说明或采用类似方法，使用凝胶回收试剂盒进行纯化。
    2. 使用定点突变插入 LightR 基因：插入 LightR，以替换特定氨基酸或一段氨基酸序列。所用的模板质粒应为已插入 LightR 结构域的质粒。PCR 反应步骤按此前所述进行20 使用以下混合物。
           5x DNA聚合酶兼容缓冲液： 5 µL
           10 nM dNTP 混合液： 1 µL
           DNA聚合酶（2000 单位/毫升）： 1 µL (0.02 U/µL)
           50 ng 目标模板 DNA： 1 µL
           提取的巨引物（计算质量）： 10 µL
           DMSO： 2.5 µL
           PCR级水： 2.5 µL
      注意：大引物质量（ng）= 期望的插入片段/载体摩尔比 × 载体质量 × 插入片段与载体长度之比。所用的期望插入片段/载体摩尔比为 3/1。
    3. PCR反应完成后，添加 1 µL 加入 DpnI（2000 单位/毫升）酶，以选择性消化过量且甲基化的 DNA，并将混合物在 37 °C 1-1.5 小时。这将显著提高修饰后构建体的产量。
    4. 转化 1-2 µL 按照制造商说明书将PCR反应产物转入DH5α感受态细胞。
    5. 在含有适当抗生素的Luria Broth（LB）琼脂平板上涂布转化菌液，用于筛选。将平板置于 37 °C 过夜或室温（RT；25-30 °C 72 小时。
      注意：长有菌落的 LB 平板可保存于 4 °C 最长可保存1个月，且方案可暂停。
    6. 菌落筛选 PCR
      1. 针对基于PCR的菌落筛选，设计在LightR插入片段和目标DNA中退火的引物，以扩增出约400-700 bp的片段。
      2. 从LB平板上挑取少量菌落加入到下方提供的PCR混合液中，随后根据特定DNA聚合酶生产商的建议进行热循环。
             2x Taq RED预混液： 5 µL
             PCR级水 5 µL
             100 µM 上游引物： 0.5 µL
             100 ​µM 反向引物： 0.5 µL
      3. 通过琼脂糖凝胶电泳检测阳性菌落。
      4. 挑选产生预期PCR产物大小的菌落，分别接种到含有抗生素的3 mL LB液体培养基中，抗生素种类需与质粒骨架上的抗性标记一致。随后，在振荡条件下培养并摇菌 37 °C 过夜。
      5. 按照质粒纯化试剂盒说明书从液体培养物中提取质粒DNA，并通过测序验证插入片段的存在。
        注意：克隆引物汇总于 补充表 3.

2. LightR酶活性的细胞接种与生化分析（图2A）

  1. 用于 LightR-激酶（LightR Src、FastLightR Src、LightR bRaf）的生化分析，接种 1 × 10⁶ 个细胞6 每个实验组每3.5 cm细胞培养皿接种LinXE细胞。参见 补充表 4.
  2. 孵育细胞于 37 °C 和 5% CO2 16-18 小时。
  3. 次日，使用合适的转染试剂，按照制造商的建议将选定的DNA构建体转染至细胞中（补充表 4).
    注意：最佳转染试剂取决于所使用的质粒、载体和细胞类型。本研究采用 2 µg 使用转染试剂在3.5 cm培养皿中进行DNA转染。应通过经验性测试确定最佳转染试剂。由于转染的构建体会表达受蓝光调控的蛋白，因此所有后续处理转染细胞的步骤均须在红光条件下进行。将转染后的细胞培养皿用铝箔包裹后再放入培养箱，以防止意外光照。
  4. 转染后16-18小时，将细胞暴露于蓝光下10将一个465 nm发光二极管（LED）面板灯系统放置于组织培养孵箱中。在灯上方10 cm处放置一块带孔的有机玻璃板，以获得3 mW/cm²的目标照度2 (补充文件 1需要使用穿孔板以保持培养箱内空气流通不间断。将细胞照射所需的时间段。
  5. 为激活 LightR-Src 和 LightR-bRaf，使用持续光照。进行持续光照时，手动打开和关闭 LED 面板。
  6. 为维持 FastLightR Src 的激活/失活循环，请使用手动控制或微控制器控制的开启/关闭循环。
    注意：可使用多种提供集成开发环境（IDE）的软件工具包来编写和上传所需代码。这些工具包支持 C/C++ 编程，并提供通用输入/输出（GPIO）访问功能，这对于控制脉冲照明至关重要。用于这些目的的实验方案及代码的详细描述见于 补充文件 1.
  7. 在实验的各个相应时间点结束时（补充表4在安全红光条件下收集细胞，吸除培养基，并用冷的PBS洗涤细胞。
  8. 为分离蛋白质，使用裂解液裂解细胞 500 µL 加入含5% v/v 2-巯基乙醇的2x Laemmli上样缓冲液。将裂解液在 100 °C 5 分钟。通过蛋白质凝胶电泳和蛋白质印迹法分析细胞裂解物21.
    注意：2x Laemmli缓冲液的成分为：500 mL体系中含Tris-HCL 5.18 g、甘油131.5 mL、20% SDS 52.5 mL、溴酚蓝0.5 g，终pH值为6.8。
  9. 通过评估内源性 p130cas 在 Tyr249 位点以及 paxillin 在 Tyr118 位点的磷酸化水平来检测 LightR-Src 活性22,23(图2通过评估 MEK1 在 Ser217/221 位点以及 ERK1/2 在 Tyr202/204 位点的磷酸化水平来检测 LightR-bRaf 的活性24,25.

3. LightR-Cre 活性的功能分析

  1. 为进行 LightR-Cre 活性的功能分析，将 1 × 106 个 LinXE 细胞接种至每孔 3.5 cm 的细胞培养皿中。在 37 °C、5% CO2 条件下培养 16–18 小时。
  2. 按照第 2 节、图 2A 及 补充表 5 中所述方案进行细胞转染。共转染总量为 2 µg 的 DNA，其中 LightR-Cre-iRFP670 与报告基因质粒 Floxed-STOP-mCherry2 的比例为 1:9。
  3. 转染后 16–18 小时开始对细胞进行光照。有效的 LightR-Cre 激活需要长时间光照。因此，为避免光毒性，应使用微控制器调控的 465 nm LED 面板灯系统，以 2 秒开启、20 秒关闭的脉冲模式持续光照 8 小时，具体设置详见第 2 节及 补充文件 1。
  4. 使用配备 20 倍空气物镜的落射荧光显微镜进行成像。为观察 LightR-Cre-iRFP670，使用 Cy5 滤光片组；为观察 Floxed-STOP-mCherry 表达产生的 mCherry，使用 RFP 滤光片组。
    注：成像时使用配备 Cy5/RFP 光学滤块的落射荧光显微镜。

4. 活细胞成像样品的制备

  1. 将每35 mm组织培养皿中接种2 × 105个HeLa细胞，加入细胞培养基，在37 °C、5% CO2条件下孵育2小时。
  2. 待细胞贴壁且融合度达到约60%–70%时，使用以下任一混合质粒共转染HeLa细胞：(i) 0.85 µg FastLightR-Src-mCherry-myc 与 0.15 µg Stargazin-iRFP，或 (ii) 0.75 µg FastLightR-bRaf-Venus 与 0.25 µg mCherry-ERK2
    注意：在FastLightR-Src实验中，Stargazin-iRFP用于标记质膜，以便进行细胞铺展分析。若需提高FastLightR-Src的表达水平，可省略Stargazin-iRFP，改用1 µg FastLightR-Src；在此情况下，应使用膜染料以可视化细胞。质膜染色剂常规用于标记细胞膜。
  3. 用铝箔覆盖培养皿，避免细胞意外暴露于光照，并在37 °C、5% CO2条件下继续孵育16–18小时。
  4. 后续所有操作均需在红光照明下完成，以避免构建体被意外激活。暴露于白光将诱导LightR激酶的激活，可能影响后续实验结果。
  5. 同一天，将3个圆形玻璃盖玻片（直径25 mm，厚度0.17 mm）在PBS中用5 mg/L纤连蛋白（fibronectin）包被，37 °C过夜孵育。
  6. 转染后16–18小时，用PBS冲洗盖玻片两次，并将约1 × 105个转染后的HeLa细胞接种至每个盖玻片上。在细胞培养基中，37 °C、5% CO2条件下孵育2小时。
    注意：较低的接种密度对于确保视野中细胞彼此不接触至关重要。
  7. 通过向Leibovitz's L-15成像培养基中添加胎牛血清（FBS），配制终浓度为5%的成像培养基。使用0.22 µm滤器过滤溶液，并将其预热至37 °C。
  8. 将矿物油预热至37 °C。
  9. 用PBS洗涤含细胞的盖玻片两次。若使用膜染料，应在洗涤盖玻片前按照制造商说明书对细胞进行染色。
  10. 小心将盖玻片放入活细胞成像室中，并向成像室内加入1 mL L-15成像培养基。
  11. 在培养基上方加入1 mL矿物油，以防止成像过程中液体蒸发。
  12. 将成像室避光保存于37 °C环境中，直至开始成像。

5. FastLightR-Src 的全局激活与成像（图3）

  1. 将蓝色LED显微镜环形光源连接至显微镜聚光镜，并将其置于样品 holder 上方约1.5 cm处。将环形光源的AC/DC控制继电器连接至显微镜计算机。
    注意：在本研究的实验中，照明通过成像软件的晶体管-晶体管逻辑（TTL）接口进行控制。如果无外部照明光源，也可使用落射荧光照明对LightR构建体进行全局激活。GFP激发波长（如490/20 nm激发滤光片）可有效激活LightR。
  2. 将样品室置于预热至37 °C的显微镜载物台上，选择表达FastLightR-Src-mCherry和Stargazin-iRFP（图3B）或FastLightR-bRaf-Venus和mCherry ERK-2（图5B）的细胞。
  3. 对于全局照明与成像实验的研究，使用与显微镜兼容的高性能物镜（40倍），具备复消色差校正、平场校正和高数值孔径。
    1. 对于Src激酶的全局照明研究，使用561/10 nm激发滤光片和595/40 nm发射滤光片观察FastLightR-Src-mCherry，使用640/20 nm激发滤光片和655LP发射滤光片观察stargazin-iRFP。
    2. 对于bRaf激酶的全局照明研究，使用514/10 nm激发滤光片和540/21 nm发射滤光片观察FastLightR-bRaf-Venus，使用561/10 nm激发滤光片和595/40 nm发射滤光片观察mCherry-ERK-2。
    3. 在所有荧光成像通道中使用多波段分色镜。
  4. 根据实验条件，考虑以下建议。
    1. 在照明前至少对细胞成像10分钟，以建立细胞的基础活性。
      注意：该基础活性用于判断照明激活FastLightR激酶是否引起细胞行为或蛋白定位的变化。也可进行更长时间的基础成像，以获得更高的统计显著性。
    2. 由于FastLightR的快速失活动力学特性，同时成像过多细胞可能导致在载物台移动过程中Src/bRaf的失活，从而削弱其响应。为避免此类误差，在本方案中分析FastLightR-激酶活性时，建议以每分钟成像4个细胞的速率进行，并对每个选定细胞每分钟成像一次，持续共110分钟（补充文件2）。
    3. 采用脉冲式照明而非连续照明，以减少蓝光可能引起的光毒性效应。每分钟对4个细胞各照明12秒是有效的（补充文件2，图3A）。
      注意：不同构建体和照明光源类型的照明周期应通过实验确定。
    4. 在细胞成像期间关闭照明，以避免荧光通道间的串扰。
      注意：同时成像过多细胞将减少样品可获得的总照明时间，导致因激活不足而响应减弱。
  5. 成像完成后，将视频保存为.TIF堆栈文件格式用于后续分析。
    注意：由于GFP落射荧光照明的均匀性较差，与环形光源相比，使用GFP落射荧光的实验需要更频繁的照明，导致每次实验可成像的细胞数量减少。

6. FastLightR-Src 的亚细胞激活与成像（图4）

  1. 将培养室置于预热至 37 °C 的显微镜载物台上，选择一个同时表达 FastLightR-Src-mCherry 和 Stargazin-iRFP 的单个细胞。
  2. 选择细胞内需要照射的特定区域（ROI）。本研究选择目标细胞边缘的一个小区域。
    注意：对于局部照射，可使用成像软件通过 TTL 接口控制的 TIRF 模块聚焦的 445 nm 激光，或微镜装置进行照射。任何可实现图案化照射的系统均可用于本实验。若使用基于扫描的系统，需确定激光强度和照射均匀性，以确保充分激活的同时不损伤细胞。
  3. 在照射前，以每分钟一次的频率连续成像 20 分钟（基础状态）；局部照射期间连续成像 50 分钟；激活后继续成像 20 分钟，总计 90 分钟（补充文件 2）。
  4. 在激活与去激活过程中，需提供足够的时间，以确保目标蛋白完全去激活。对于 FastLightR-Src，建议至少留出 10 分钟去激活时间以消除残余活性；在本实验所展示的局部照射设置中，建议去激活时间为 20 分钟。
  5. 成像结束后，将视频保存为 .TIF 堆栈文件格式以供分析。

7. 细胞铺展分析

  1. 为数据处理和分析准备图像。确保图像为 .TIF 堆栈格式。可直接从成像软件中保存，或使用开源程序进行转换。
  2. 从补充数据的压缩文件中下载 CellGeo 脚本包26。
    注意：CellGeo 软件包包含多个不同的脚本。根据第 7–9 节协议中所述的分析类型，从列表中选择所需的软件包。
  3. 打开并运行名为 MovThresh 的脚本，以创建细胞的掩膜。
    1. 选择 文件 > 导入 (.tif) ，并选择细胞的 Stargazin-iRFP 图像。
    2. 使用左下角的滚动条浏览各帧图像。如果建议的阈值合适，则进入步骤 7.4。
    3. 如果建议的阈值与细胞行为不符，请在 曲线选择 下方选择平滑或自定义曲线。通过滚动浏览各帧图像，并在窗口右侧调整阈值，创建自定义曲线。
    4. 点击 重新设定阈值。
    5. 点击 文件 > 另存为掩膜，更改文件名，并使用 另存为 选项保存。
  4. 在开源图像分析程序中打开新创建的堆栈文件。
  5. 选择 图像 > 调整 > 阈值 > 应用。
  6. 选择 分析 > 分析颗粒 > 勾选显示结果 -> 确定。
  7. 通过将任意时刻的细胞面积除以蓝光照射前同一细胞的平均面积，计算每个细胞的面积变化。
  8. 以折线图或柱状图形式绘制面积变化。
  9. 计算在相同条件下处理的所有细胞在每个时间点的平均值及 90% 置信区间。

8. 细胞边缘动力学分析

  1. 使用第7节协议中描述的步骤准备堆栈文件。
  2. 打开并运行名为 ProActive 的脚本。
    1. 选择 文件 > 导入 > 掩膜 (.tif)，并选择通过 MovThresh 脚本生成的掩膜。
    2. 在右下角选择要分析的活动类型（突出、回缩 或 总计）。
    3. 选择归一化类型。通常，此类分析使用面积归一化。
    4. 使用左侧的滑块选择参考起始帧。右侧的延迟滑块将决定用于测量细胞获得和丢失面积的两个时间点之间的时间间隔。
    5. 如果所选帧数与延迟数值之和大于视频中的总帧数，则预览图像将不会显示。请重置这些值，使其总和小于总帧数。
  3. 在 结果 部分下的 平滑曲线 复选框中打勾，以修改突出或回缩的阈值。此操作将在特定窗口内对阈值进行平均，有助于解决将微小波动误判为活动的问题。
  4. 选择 运行范围 ，以计算由帧和延迟滑块指定时间范围内的活动量。
  5. 通过选择 文件 > 另存为 > 结果(.mat) 保存数值数据，并用于确定平均突出或回缩活动水平。
  6. 计算每个时间点的90%置信区间。
    注意：这将保存一个包含多个不同数值的数组。随脚本提供的“如何使用ProActive”文本文件详细说明了每个数值的含义及其计算方法26。
  7. 通过选择 文件 > 另存为 > 图像 (.tif) 保存活动的可视化结果。

9. 质心偏移分析

  1. 进行质心位移分析时，可使用任何能够确定质心坐标的软件。
  2. 在分析软件中，打开如第7节实验步骤所述的目标细胞的掩膜图像序列。
  3. 选择“测量”>“整合形态学分析”，然后点击“首选项”>“绘制质心标记”>“勾选”，再选择“测量”。
    1. 记录运动前的质心坐标（A）。
    2. 记录实验结束时的质心坐标（B）。
    3. 记录照明图案中心的坐标（C）。
  4. 在获取上述三个点的坐标后，确定角Angle measurement; mathematical symbol; geometric concepts; educational diagram; static equilibrium.BAC8。其中θ1对应角Angle measurement; mathematical symbol; geometric concepts; educational diagram; static equilibrium.ABC，θ2对应角Angle measurement; mathematical symbol; geometric concepts; educational diagram; static equilibrium.CBA（图4Cii）。使用以下公式进行计算：
    cosθ = cos(θ1 - θ2) = cosθ1cosθ2 + sinθ1sinθ2
    注：为方便起见，可使用计算器直接根据坐标计算角度和距离。
  5. 通过将细胞质心移动的像素距离乘以转换因子（1像素等于0.4 µm）来确定质心位移。像素与距离之间的具体转换因子取决于系统的放大倍数和相机设置。
  6. 在确定质心位移角度和距离后，打开能够生成极坐标图像的绘图软件。
  7. 将质心位移角度作为θ测量值，移动距离作为半径。使用方差分析（ANOVA）检验95%置信区间。
  8. 绘制结果并保存图像。

结果

LightR-Src 的设计与构建遵循 图 1A、B 中所述策略。生化分析表明，在持续蓝光照射 60 分钟后，LightR-Src 可激活已知的内源性 Src 底物 p130Cas (Y249)22 和 paxillin (Y118)23 的磷酸化（图 2B）。值得注意的是，当 LightR-Src 仅在转染后 16–18 小时的黑暗条件下表达时，未观察到 Src 激酶的背景激活。此外，催化失活突变体 LightR-Src（D388R 突变）不能诱导 Src 底物的磷酸化，表明磷酸化由有活性的 LightR-Src 所介导，而非蓝光照射的非特异性效应所致（图 2B）。鉴于已有文献报道 Src27 激酶在活细胞中存在振荡性活性，我们进一步探究了 LightR-Src 是否可被调控以实现周期性激活。原始的 LightR-Src 表现出较慢的去激活动力学（图 2C），因此我们构建了一个新的变体 Fast-LightR-Src，其两个 VVD 结构域均携带 I85V 突变。如 图 2D 所示，Fast-LightR-Src 的去激活动力学显著加快，在关闭光照后 10 分钟内完全失活，而原始 LightR-Src 的去激活则需超过一小时。利用 Fast-LightR-Src，我们还实现了多次重复的激活/失活循环（图 2E）。综上结果表明，LightR 工具能够在活细胞中实现对 Src 活性的特异性且精确调控。

FastLightR-Src 的应用还可用于评估短暂性 Src 激活对细胞形态动力学的影响。在 HeLa 细胞中激活 FastLightR-Src 可诱导细胞铺展，而一旦 FastLightR-Src 被失活，该过程即停止。激活后，我们观察到 FastLightR-Src 从核周区转位至黏着斑和细胞膜，这一行为与野生型 Src 激酶的表现一致11,12. 表达无催化活性突变体 D388RLightR-Src 的细胞在光照下未表现出此类铺展效应（图3B,C）。这进一步证实了FastLightR-Src的功能与其野生型类似。对细胞某一区域进行局部光照，可导致FastLightR-Src在该区域被局部激活，表现为LightR Src在黏着斑中的局部聚集，并伴随局部细胞膜突起的形成。图4B （i），（ii）以及细胞中心点位移（图4C (i)、(ii)，导致细胞向光移动。在确立了LightR工具对Src激酶的调控应用后，我们进一步展示了LightR在调控bRaf激酶和DNA重组酶Cre方面的广泛适用性。对LightR-bRaf的分析显示，其可诱导内源性底物MEK1的光依赖性磷酸化，并进一步引起下游ERK1/2激酶的磷酸化24,25 与组成型激活的bRaf突变体（V600E）水平相当（图5A）。相反，催化失活的 D575RLightR-bRaf 未引起 MEK1 和 ERK1/2 的磷酸化，其结果与未受光照的 LightR-bRaf 样本相当，从而证实了 LightR-bRaf 调控的特异性。活细胞成像显示，反复进行 FastLightR-bRaf 的激活与失活循环可诱导 ERK2 多次在细胞核内外的转运，这与已知的 bRaf 激活效应一致。28 (图 5B). LightR-Cre 的激活成功实现了报告基因 mCherry 的重组，表明 LightR 可适用于不同类别的酶图 5C).

光激活DNA定点突变中蛋白质相互作用示意图与大引物合成方法。
图1：LightR方法的开发策略。（A）Vivid蛋白在暗态下的两个单体晶体结构（PDB: 2PD7）以及光照状态下二聚体的晶体结构（PDB: 3RH8）。（B）LightR设计的示意图。两个串联连接的VVD光感受器插入到催化结构域中，在黑暗条件下破坏蛋白的催化活性；蓝光诱导VVD发生二聚化，从而恢复蛋白活性。（C）（i）Src（PDB 1Y57）和（ii）bRaf（PDB 4MNF）催化结构域的晶体结构；（ii）Cre重组酶（PDB 1MA7）的结构。黄色箭头指示LightR插入位点及被替换的氨基酸残基。（D）将LightR结构域插入目标酶序列的克隆策略示意图19。第一步，使用特异性设计的引物通过PCR扩增获得两端含有与目标基因插入位点上下游互补序列的LightR片段；第二步，将上述方法获得的LightR片段作为“大引物”，用于通过快速定点突变法将LightR插入目标酶基因中。图A–C经Shaaya等10许可改编并修改。请点击此处查看此图的放大版本。

光遗传学Src激活与分析；示意图、Western blot结果；蛋白质磷酸化。
图2：工程化LightR-蛋白质的生化表征。（A）LightR Src生化表征实验方案的示意图。（B）瞬时表达C末端带有mCherry和myc标签的LightR Src构建体的LinXE细胞，使用465 nm LED装置持续蓝光照射60分钟。细胞裂解物用于检测Src底物paxillin和p130Cas的磷酸化水平。Western blot结果显示，在活细胞中激活LightR-Src后，内源性paxillin和p130Cas发生磷酸化。（C、D）瞬时表达C末端带有串联mCherry-myc标签的指定LightR-Src构建体的LinXE细胞，分别持续暴露于蓝光下指定时间（0分钟和30分钟），随后置于黑暗中指定时间段。收集细胞裂解物并检测Src底物的磷酸化水平，以比较（C）LightR-Src与（D）FastLightR-Src的激活与失活动力学。（E）瞬时表达C末端带有串联mCherry-myc标签的指定LightR-Src构建体的LinXE细胞，先持续蓝光照射20分钟，随后反复进行黑暗孵育10分钟和光照20分钟的循环。收集细胞裂解物并检测Src底物的磷酸化水平，以评估Src激酶在激活与失活状态之间循环的效率。所有实验均至少重复三次，结果相似。Western blot图B-E中每个条带旁标注的数字代表蛋白质的分子量，单位为千道尔顿（kDa）。图B-E经Shaaya等10许可并修改。 请点击此处查看此图的放大版本。

蓝光下的细胞行为；显微镜图像与统计图；光激活分析装置。
图 3：全局与时间控制的光照及其对 FastLightR-Src 活性的影响。 （A）全局与时间循环光照实验方案及后续数据分析的示意图。（B、C）通过宽场荧光显微镜获取的 HeLa 细胞延时成像代表性图像，展示了蓝光对细胞形态和 FastLightR-Src 定位的调控作用。这些细胞瞬时共表达 FastLightR-Src-mCherry-myc（N = 10 个细胞）或催化失活型 D388RLightR-Src-mCherry-myc（N = 9 个细胞），以及 Stargazin-iRFP670（质膜标记物）。在全局蓝光照射期间（蓝色轮廓），每分钟进行一次活细胞成像。（B）黄色箭头突出显示 FastLightR-Src 在类似黏着斑结构上的定位。图像来自使用宽场荧光显微镜拍摄的 HeLa 细胞延时序列。（C）各图中显示了 FastLightR-Src 与 D388RLightR-Src 激活所诱导的细胞面积变化的量化结果。光照时间段以蓝色矩形表示。图表表示均值 ± 90% 置信区间。图 B 和图 C 经 Shaaya 等人10许可改编并修改。请点击此处查看该图的放大版本。

使用蓝光进行细胞迁移的亚细胞照明方法；含分析结果的示意图。
图 4：局部亚细胞照明控制及其对 FastLightR-Src 活性的影响。（A）局部亚细胞照明控制实验方案的示意图。（B）（i）时间序列图像，展示表达 FastLightR-Src-mCherry 的 HeLa 细胞在蓝光局部照射下的情况（以蓝色圆圈表示）。使用全内反射荧光显微镜（60 倍物镜）每分钟采集一次图像。图像以指定时间间隔获取的反差图像形式呈现。（ii）细胞投影图像，显示在指定时间间隔内形成的细胞突起。通过对实验时间轴上的细胞形态进行阈值化和掩膜处理，构建用于分析细胞铺展和细胞边缘动态的平台。细胞中指定的照射区域由蓝色圆圈标出。（C）（i）细胞极坐标图，表示细胞质心迁移距离（d）及相对于局部蓝光照射方向的偏转角度（θ）。黑点代表表达催化失活型 D388RLightR-Src 的单个 HeLa 细胞（N = 6 个细胞）或表达 FastLightR-Src 的细胞（N = 10 个细胞）。（ii）示意图，展示细胞质心从局部蓝光刺激开始（1）到结束（2）所移动的质心位移距离（d）。偏转角度（θ）表示细胞质心移动方向偏离蓝光照射位置的程度。浅灰色阴影区域表示细胞在局部 FastLightR-Src 刺激下突出的范围。细胞中指定的照射区域由实线蓝色圆圈标出。图 B 和图 C 已根据 Shaaya 等人10 的研究进行改编和修改。请点击此处查看此图的放大版本。

蓝光诱导的mCherry-ERK2激活；Western blot、显微镜观察及随时间变化的细胞反应。
图5：LightR方法的广泛适用性。（A）LightR-bRaf的调控。瞬时表达LightR-bRaf-Venus、催化失活型D575R LightR-bRaf-Venus或组成型活性bRaf（V600E）-Venus的LinXE细胞接受指定时长的持续蓝光照射。使用细胞裂解物检测所示蛋白的磷酸化水平。（B）通过宽场荧光显微镜进行活细胞延时成像所获得的代表性图像，展示了瞬时共表达FastLightR-bRaf-Venus和mCherry-ERK2的LinXE细胞中全局蓝光反应的调控情况。这些细胞接受全局蓝光照射（每秒一次50毫秒脉冲，每分钟50次脉冲），照射时长如蓝色标注所示。每分钟对mCherry-ERK2进行一次活细胞成像。黄色箭头标示了工程化bRaf经蓝光激活后诱导的ERK2核内定位阶段。（C）LinXE细胞被瞬时共转染Flox-stop-mCherry报告基因和LightR-Cre-iRFP670。细胞分别处于黑暗条件或接受脉冲式蓝光照射（开2秒，关10秒），最长持续8小时。使用宽场荧光显微镜（10倍物镜）在相同设置下采集各时间点每个通道的图像，并调整至一致的亮度和对比度水平，以便比较不同样本间的蛋白表达水平。该实验至少重复三次，结果一致。本图改编自Shaaya等人的研究10。请点击此处查看此图的放大版本。

补充表 1：LightR 序列。 请点击此处下载该文件。

补充表2：LightR插入位点的描述及LightR-蛋白设计的检查清单。 请点击此处下载该文件。

补充表 3：用于 LightR 克隆的引物。 请点击此处下载该文件。

补充表4：LightR-蛋白活性生化分析的转染条件。 请点击此处下载该文件。

补充表 5：基于成像分析 LightR-蛋白活性的转染条件。 请点击此处下载该文件。

补充文件1：使用集成开发环境（IDE）进行脉冲光照。 请点击此处下载该文件。

补充文件 2：显微镜照明设置。 请点击此处下载该文件。

讨论

本研究提出了一种用于研究多种信号通路的光遗传学方法，并展示了其在解决不同生物学问题中的广泛应用性。LightR 工具系统具备多项关键优势：（1）对蛋白质活性的变构调控；（2）对活性进行严密的时间控制，且可调节以实现不同的激活与失活动力学；（3）在亚细胞水平上实现活性的空间分辨；（4）信号调控和生物学效应的高度特异性；（5）适用于多种靶蛋白的广泛适用性。值得注意的是，LightR 独特地将所有这些优势整合于单一工具之中，从而实现了重要的技术进步。

将LightR设计为别构开关具有多项优势。LightR能够插入蛋白质中较小的柔性环内并调控其活性，这一特性使其在结构和功能多样的各类蛋白质中均具有广泛的应用灵活性。作为一种别构开关，LightR仅调控目标蛋白的特定结构域，而不影响蛋白的其他结构域。因此，该方法可在不损害蛋白质重要功能（例如与结合伴侣的相互作用或在细胞内的天然定位）的前提下，实现对蛋白活性的特异性调控。双组分光遗传学系统已成功用于调控蛋白质定位、相互作用或其他关键功能，其机制依赖于光控同源或异源二聚化29,30,31,32,33,34,35。然而，这些系统通常需要两种蛋白以优化的等摩尔比例表达，从而增加了实际应用的难度。而利用LightR系统实现的别构调控仅需单一蛋白即可完成，因此为细胞信号通路的研究提供了更为灵活和便捷的策略。

LightR开关在不同蛋白质类别中的广泛应用性，部分归功于对LightR结构域内不同模块的优化。连接LightR与目标蛋白的接头，以及LightR内部两个VVD结构域之间的接头（VVD间接头），均可能影响调控效率。选用的VVD间柔性接头(GGS)4G(GGS)3具有足够的灵活性和长度，可确保LightR结构域内VVD单体的有效结合与解离。该接头迄今已成功实现了对所有目标蛋白的调控。然而，当LightR结构域在黑暗条件下无法充分抑制目标蛋白活性时，可引入更刚性的接头，使VVD结构域彼此间距更大，从而增强LightR夹子的打开程度，以维持酶的失活状态。但该接头仍需保留足够的灵活性，以支持VVD的二聚化及目标蛋白的激活。为连接LightR与目标蛋白，我们在LightR结构域的N端和C端分别使用短柔性接头GPGGSGG和GSGGPG。这些接头提供了足够的连接灵活性，从而防止目标蛋白发生不可逆的结构破坏；同时其长度较短，可在黑暗条件下诱导目标蛋白构象扭曲，而在光照条件下促进蛋白功能的恢复。这些接头已支持LightR在多种蛋白应用中的有效调控。然而，在某些情况下，若这些接头在黑暗中无法实现充分的蛋白失活，则缩短接头长度可能更有利。接头缩短可降低灵活性，增强黑暗状态下开放型LightR夹子所引起的构象扭曲，从而减少任何渗漏活性。但这种调整可能因光照状态下潜在的结构畸变而影响酶的最大活性。此外，在构象稳定性并非主要问题的情况下，也可通过替换插入环中的多个氨基酸，达到类似的灵活性平衡效果。

许多关键的信号传导过程以瞬时方式被激活，或以振荡方式进行调控36,37,38,39,40,41,42,43。LightR 工具的可调性使我们能够模拟复杂的信号模式，从而为研究时间上受控的生物学过程提供了一种强大的方法。我们通过在两个 VVD 结构域中引入 I85V 突变来调节 LightR 的关闭动力学，实现这一目标。该突变将 VVD 二聚体在暗态下的半衰期从 18,000 秒缩短至 780 秒19，从而促进 FastLightR-酶的快速失活。

快速失活动力学特性还能够实现对蛋白质活性的亚细胞分辨率调控。由于LightR酶具有较慢的关闭动力学特性，激活后的构建物在细胞内扩散可能导致难以观察到亚细胞激活的效果。而具备快速关闭动力学特性的FastLightR-酶，一旦扩散出局部照明区域，将迅速失活。通过选择性地激活特定的亚细胞区域，研究人员可以深入了解蛋白质的局部功能，从而更好地理解其在复杂细胞通路和信号网络中的作用。

尽管FastLightRs在细胞内对蛋白质活性进行时空受限的光学控制方面具有重要价值，但在某些应用中，缓慢的关闭动力学可能更受青睐。具有缓慢关闭动力学的LightR可用于需要持续且增强的蓝光诱导活性的研究中。这类应用仅需不频繁的光照脉冲即可维持连续的光遗传学活性，从而也能最大限度地减少光毒性等问题。针对不同实验场景，可单独或组合实施多种动力学改造10,18，为调节LightR性能以优化其在特定实验中的应用提供了一种有前景的解决方案。

LightR-酶的适用性取决于其模拟内源性对应蛋白生物学功能的能力。因此，评估其底物特异性、下游信号传导以及亚细胞定位至关重要。LightR-Src活性的特异性可通过其对Src底物（包括paxillin和p130Cas22,23）的磷酸化作用加以验证。在循环光照条件下，FastLightR-Src在核周区域与黏着斑之间穿梭，导致细胞铺展。这一现象成功重现了先前使用天然Src激酶所观察到的结果，进一步证实了该工具在研究Src生物学功能方面的有效性11,12,44,45,46,47。LightR-bRaf也表现出对MEK和ERK激酶等信号复合物靶向作用的特异性24,25。此外，FastLightR-bRaf在蓝光刺激下可引发ERK核转运蛋白的周期性振荡，这是bRaf激活的已知后果之一28。LightR-酶能够高度模拟内源性蛋白功能，为深入探究其生物学功能提供了极为宝贵的工具。

上述讨论描述了LightR激酶在特定细胞区室中复制精确细胞信号通路的能力。与激酶的成功应用相一致，LightR-Cre提供了一个典型范例，展示了源自P1噬菌体的原始Cre重组酶的功能特性。Cre重组酶属于位点特异性重组酶中的整合酶家族，其作用机制是介导靶DNA上两个称为loxP的识别位点之间的重组反应。此类重组通过交换事件导致DNA重排。根据loxP位点在靶DNA上的方向性排列，该交换事件可引起染色体元件的缺失、重复或易位48。Cre重组酶已被广泛用于构建可诱导基因调控的体内模型49,50。然而，其他自发性、化学诱导性或光遗传学诱导性Cre重组酶系统在动物模型中对DNA重组发生的时间和空间控制能力有限。LightR-Cre通过实现对DNA重组时间与空间的高度精确控制，克服了这些局限性。此外，LightR的可调节性使我们能够消除不必要的渗漏活性，确保Cre活性的高精度调控。这些能力为疾病病理建模以及新疗法的开发开辟了新的机遇。

对激酶和DNA重组酶中LightR的精确调控进一步证明，该工具可采用相同策略应用于多种蛋白质。除了激活各类酶之外，LightR还有望连接到其他类型的蛋白质上，通过变构调节实现蛋白质在特定亚细胞区域的定位、诱导蛋白质-蛋白质相互作用、构建蓝光诱导型生物传感器等。由于特异性结构域靶向具有变构调控的优势，LightR还可与同一蛋白质中的其他化学遗传学和光遗传学方法联用，从而实现更高程度的可调控性，以研究复杂的生物学过程。

我们已成功将LightR应用于多种其他蛋白质（相关论文正在撰写中）。尽管取得了这些成功，功能性LightR蛋白的开发仍可能面临一些潜在挑战，尤其是在选择合适的插入位点以及准确模拟目标蛋白生物学功能方面。当缺乏晶体结构时，研究人员必须依赖预测的结构或氨基酸序列信息，这需要进行更多的排查工作，以构建具有多个插入位点或氨基酸替换的工程化蛋白。此外，工程化蛋白的活性必须经过精细调控，以准确再现其在细胞内的生物学功能。这些实验的成功取决于工程化蛋白对其内源同源蛋白功能的精确模拟，而这通常需要严格的优化过程，并可能因细胞类型、目标蛋白类别与种类，以及蓝光激活的强度和持续时间不同而有所差异。

综上所述，LightR 系统是一种实现对蛋白质功能进行精确时空调控的强大工具。其稳定性、可调节性和多功能性使其在研究复杂细胞过程、解析信号通路以及阐明基因调控机制方面具有重要价值。通过为研究人员提供前所未有的蛋白质活性控制能力，LightR 系统有望推动我们对基本生物学过程的理解，并为创新性治疗干预开辟新途径。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢 Mark Shaaya 博士在 LightR 酶及其相关实验方案开发中的贡献。pCAG-iCre 由 Wilson Wong 惠赠（Addgene 质粒 #89573），pcDNA3.1 Floxed-STOP mCherry 由 Mositoshi Sato 惠赠（Addgene 质粒 #122963），携带 V600E 突变的 bRaf-Venus 质粒由 John O'Bryan 博士（MUSC）惠赠；ERK2 基因来自 pCEFL-ERK2（由北卡罗来纳大学 Channing Der 实验室惠赠），将其克隆至 mCherry-C1 载体骨架中，获得 mCherry-ERK2 质粒。; pmiRFP670-N1由Vladislav Verkhusha惠赠（Addgene质粒# 79987）。本研究获得美国国立卫生研究院（NIH）基金R33CA258012、R35GM145318和P01HL151327（资助对象：AK）的支持。NL获得了T32 VBST培训基金T32HL144459的进一步资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
#1.5 玻璃盖玻片 25 mm 圆形Warner Instruments 64-0715 
1.5 mL 离心管 USA Scientific cc7682-3394
2x Laemmli缓冲液500 mL：5.18 g  Tris-HCl，131.5 mL 甘油，52.5 mL 20% SDS，0.5 g 溴酚蓝，终末 pH 6.8
4-20% Mini-PROTEAN TGX 预制胶伯乐（Biorad）4561096
5x Phusion Plus 缓冲液 赛默飞世尔科技 F538L
60 LED 显微镜环形灯Boli OpticsML46241324蓝色LED，60 mm直径，5 W
琼脂糖 GoldBiotechA-201
抗 Erk 1/2 抗体细胞信号传导9102
抗GAPDH抗体invitrogenAM4300
抗GFPClontech632380
抗mCherry抗体invitrogenM11217
抗MEK细胞信号传导9122
抗p130CasBD 生物科学610271
抗paxillin细胞信号传导2542
抗磷酸化 Erk 1/2 T202/Y204 抗体细胞信号传导9101
抗磷酸化-pY249 p130Cas细胞信号传导4014
抗磷酸化-Y118 脱节蛋白细胞信号转导2541
抗磷酸化S217/221 MEK细胞信号传导9121
Arduino 兼容电源企业计算机LJH -186
Arduino Uno Rev3Arduino‎A000066
Attofluor 细胞培养皿invitrogenA7816
标准胎牛血清（FBS） 健美生物制品100-106热灭活三重 0.1 µm 经无菌过滤 
bRaf-V600E-Venus约翰·奥布莱恩博士（Dr. John O'Bryan）惠赠，南卡罗来纳医科大学（MUSC）
BSA GoldBiotechA-420 
羧苄青霉素（二钠）Gold BiotechnologyC-103-25
CellMask 深红色细胞膜染料invitrogenc10046
菌落筛选主混合液 杰内西42-138
DH5α 感受态细胞 NEB C2987H
DMEM 康宁 15-013-CV
DNA Ladder GoldBio D010-500
dNTPs NEBN04475
DpnI 酶 NEBR01765
DTTGoldBioDTT10DL-二硫苏糖醇，克莱兰德试剂 
EGTA阿克罗斯 409910250
FastLightR-bRaf-mVenusAddgene#162155
牛血浆来源的纤连蛋白 Sigma F1141
FuGENE(R) 6 转染试剂 PromegaE2692转染试剂
Gel Green 核酸染料 GoldBioG-740-500
6× 紫色上样缓冲液 NEBB7024A
GeneJET 胶回收试剂盒 赛默飞世尔科技 K0692凝胶回收试剂盒 
GeneJET 质粒小提试剂盒赛默飞世尔科技 K0502
GlutamaxGibco35050-061GlutaMAX-l（100倍浓度）100 mL 
HEK 293T细胞 ATCC CRL-11268
HeLa 细胞 ATCC CRM-CCL-2
HEPESFischer BP310-500
Iot 继电器数字记录仪DLI 705020645490用于照明的交直流控制继电器
卡那霉素单硫酸盐Gold BiotechnologyK-120-25
KClSigma P-4504
L-15 1x康宁 10-045-CV 
LB 琼脂 FisherBP1425-2
LED植物生长灯系统HQRP884667106091218LED面板灯系统 
LightR-bRaf-mVenusAddgene#162154
LightR-iCre-miRFP670Addgene#162158
MATLABMathworksR2024a运行 CellGEO 脚本的软件
美塔莫夫Molecular Devices成像分析软件
MgCl₂2 Fisher ChemicalM33-500
矿物油Sigma M5310
MiniPrep 试剂盒 基因选择 96-308
Mini-PROTEAN TGX 预制胶，12 孔Bio-Rad4561085
分子生物学级水 康宁 46-000-CV 
多波段多色镜89903BSChroma
NaCl Fisher ChemicalS271-3 
不含钙和镁的 PBS 康宁 21-031-CV
pCAG-iCreAddgene#89573
pcDNA3.1_Floxed-STOP mCherryAddgene#122963
pCEFL-ERK2来自北卡罗来纳大学Channing Der博士实验室的馈赠
PCR管 labForce1149Z650.2 mL 8联管及盖子，刚性条带，单独连接的圆顶盖 
Phusion Plus DNA聚合酶赛默飞世尔科技 F630S
pmiRFP670-N1Addgene#79987
Polygon 400 图案化照明器MightexDSI-G-00C
引物 IDT
PVDF 膜伯乐（BioRad）1620219免疫印迹 PVDF 膜/滤纸夹心结构 
0.25% 胰蛋白酶，2.21 mM EDTA，1x，无钠康宁 25-053-CI
Tris-乙酸盐-EDTA (TAE) 50倍浓缩液 Fischer BP1332-1 用于电泳 
UPlanSApo 40倍物镜Olympus1-U2B828
USB TTL 盒国家仪器公司6501用于TTL接口
β-巯基乙醇Fisher Chemical O3446I-100

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