通过光遗传变构调控对蛋白质活性进行时空调控

摘要

该协议描述了工程蓝光激活变构开关 （LightR） 结构域的应用，用于蛋白质活性的可逆时空控制。利用 Src 酪氨酸激酶作为模型，本研究为开发和表征光调节 Src （LightR-Src） 提供了一种详细的方案。它证明了这种方法跨酶类别的多功能性。

摘要

光遗传学提供了模拟酶活性的复杂时空控制直至亚细胞分辨率的潜力。然而，大多数光遗传学方法在将多种功能集成到适用于各种靶蛋白的单个工具中时通常面临重大挑战。实现对 ON/OFF 动力学的精确控制，确保在黑暗中将泄漏降至最低，并以亚细胞精度在哺乳动物细胞中展示高效性能，是该领域面临的一些最常见挑战。一个有前途的解决方案在于应用合理设计的光敏结构域来变构控制蛋白质活性。使用该策略，我们生成了一种结合了所有所需特征的光遗传学方法。该方法涉及将光调节变构开关模块 （LightR） 掺入靶蛋白中，以使用蓝光 （465 nm） 光调节酶活性。LightR 结构域是通过连接两个 Vivid （VVD） 感光结构域产生的，从而形成一个光敏夹，该夹可以掺入酶催化结构域内的一个小柔性环中。在黑暗状态下，LightR 夹是打开的，从而扭曲了酶的催化结构域并将其灭活。暴露在蓝光下时，LightR 结构域关闭并恢复催化结构域的结构和酶活性。在这份手稿中，我们讨论了产生光调节蛋白激酶的设计策略，并证明了其通过蓝光、可逆性、动力学和亚细胞水平的精确调节来控制，从而实现严格的时空精度。利用 Src 酪氨酸激酶作为模型，我们展示了一种有效调节 LightR-Src 激酶活性的方案。我们还证明了 LightR 在不同酶类别中的适用性，扩展了该工具系统在解决不同疾病中信号通路的机制问题方面的效用。

引言

细胞解释外部信号并将其转化为生理或病理环境中特定反应的能力由专门的蛋白质组指导。任何蛋白质对此类复杂反应的贡献通常由其亚细胞位置、表达水平以及瞬时、持续或振荡激活的时间定义。剖析这些单个参数在信号调控中的作用需要能够在亚细胞水平上复制蛋白质活性的复杂时空控制的方法。基因作和小分子抑制剂等传统技术在这方面存在不足。相比之下，光遗传学技术有望通过纵或模拟生理和病理过程来解剖生物过程。然而，当前的工具通常缺乏广泛的适用性或亚细胞控制。几种现有的策略实现了对蛋白质定位和相互作用的严格调节;但缺乏对酶活性的直接控制 1,2,3,4。其他酶能够调节酶活性，但可能缺乏亚细胞控制或对不同酶类别的适用性有限 ^5,6,7,8,9。在这篇协议论文中，我们描述了一种新的蛋白质工程方法，该方法将光遗传学的优势结合到一个工具中:严格的时间调节、可调动力学、亚细胞控制和广泛的酶适用性¹⁰。我们设计了一个光调节 （LightR） 结构域，当插入目标靶蛋白时，该结构域起变构开关的作用。该策略能够对活细胞中目标蛋白质的激活和失活进行严格的时空控制。

本文讨论了跨多种酶类别的 LightR 光遗传学工具的设计和应用策略。本研究为光调节酪氨酸激酶 Src （LightR-Src） 的开发、表征和应用提供了分步方案。该研究进一步证明了 LightR 开关失活动力学的可调性。慢速灭活 LightR 开关可以在降低照明频率的情况下保持酶活性，而快速循环版本 FastLightR 需要更频繁的照明才能激活，但在关闭照明时会显示快速灭活。FastLightR-Src 在活细胞中的激活/失活会诱导细胞扩散和回缩的循环。FastLightR-Src 诱导的细胞扩散与 Src 激酶的生理作用一致^11,12。由于快速灭活动力学，FastLightR-Src 还可以在亚细胞水平上进行调节，从而刺激局部突起和细胞极化。为了证明 LightR 工具对其他类型酶的适用性，我们简要地向读者介绍了工程光调节激酶 bRaf （LightR-bRaf， FastLightR-bRaf） 和位点特异性 DNA 重组酶 Cre （LightR-Cre） 的类似成功。总体而言，这种方法有可能促进我们对塑造各种疾病病理生理学的复杂信号通路的理解。

方案

1. LightR 的设计与开发（图 1）

1. 战略规划
   注意:LightR 结构域由来自 Neurospora crassa 的两个串联连接的 Vivid （VVD） 光感受器结构域组成^13,14,15,16.VVD 在光存在下同源二聚化，这种二聚化涉及构象变化，使一个 VVD 单体的 N 端紧挨着另一个 VVD 单体的 C 端 （图 1A).用柔性接头连接两个 VVD 结构域可创建一个钳状结构域，该结构域在黑暗中打开，在蓝光照射时关闭。将这种夹子整合到酶的催化结构域中可实现光介导的活性调节。在黑暗中，开放的夹子会扭曲结构域，使酶失活;蓝光照射会导致夹具闭合，恢复酶的活性 （图 1B).这个概念可以应用于各种家族的酶，包括蛋白激酶和 DNA 重组酶¹⁰ (图 1C).
   1. LightR 的设计
      1. 要连接两个 VVD 分子，请在每个单体之间使用灵活的 22 个氨基酸接头 （GGS）4G（GGS）3。
         注:接头提供了足够的柔韧性和长度，以适应 VVD 单体的结合和解离。
      2. 将 GPGGSGG 和 GSGGPG 连接子分别添加到 LightR 结构域的 N 端和 C 端。
         注:连接子的长度和组成可能需要针对特定蛋白质进行调整。当需要更严格的监管时，通常使用较短的 GSG 和单 Gly 接头。插入环的大小及其与催化残基的接近程度也会影响调节的动态范围。较短的回路更有可能提供更严格的催化活性调节，但可能导致照明后活性降低。LightR 结构域的序列在 补充表 1 中提供。
   2. 插入 LightR
      注意:合适的 LightR 插入位点将能够对目标结构域功能进行严格调节，而不会空间阻断其相互作用或导致影响其生物学作用的不可逆结构变化。靶蛋白的晶体结构是识别用于插入 LightR 的柔性环区域的理想指南。如有必要，紧密同源物的晶体结构就足够了。下面提供了一些需要考虑的一般标准。
      1. 确保插入环在结构上与酶的关键催化元件偶联。确保所选插入环不是蛋白质的现有结合位点，并且 LightR 的插入不会因空间效应而潜在地破坏任何功能相互作用。
      2. 作为初始策略，在插入 LightR 时更换插入环中的一个氨基酸。靶向插入环的中间，该插入环含有暴露于溶剂且不参与分子内相互作用的极性或小氨基酸（例如，Glu、Arg、Lys、Gly）。
         注:当一种氨基酸替换不产生功能性蛋白时，优化 LightR 构建体将需要替换多个氨基酸或整个插入环。评估定义循环中 LightR 的多个插入位点的功能。
      3. 确保目标酶独立于内源性调节运行。通过使用酶的组成型活性突变版本作为插入模板来实现这一点。
         注:野生型酶也可用于生成 LightR 构建体，但这可能会导致 AND 门控系统受内源性机制和光的调节。
      4. 阳性和阴性对照对于 LightR 酶活性分析至关重要。使用内源性蛋白的组成型活性突变体作为阳性对照，使用靶向 LightR 酶的催化失活突变体版本作为阴性对照。
         注意:选择失活突变时，确保突变与 LightR 插入位点有足够的间隔至关重要，以避免破坏 LightR 酶折叠的不可逆性。基于上述标准，Src 激酶中的 LightR 插入位点被选择在一个灵活的环区域中，该区域在结构上通过 β 链与 ATP 结合 G 环/富含甘氨酸的环区域中高度保守的 GXGXXG 基序偶联。重要的是，它位于 ATP 结合口袋和底物结合区 ^10,17 的位置（图 1C （i））。
         注意:由于激酶之间的结构同源性，bRaf 中的 LightR 插入位点被选择在与 Src 中的插入位点相同的结构环中（图 1C （ii））。
         注:根据第 1.1.2 节中所述的原理，Cre 重组酶（一种非激酶）中的 LightR 插入位点在远离催化核心的柔性环之一中被挑选，即 DNA 结合位点。然而，插入环仍然通过 α 螺旋结构与 DNA 结合域内的关键催化残基偶联，以确保 LightR-Cre 功能的成功（图 1C （iii））。 补充表 2 中详细说明了当前方案中描述的不同酶的阳性和阴性对照的所有插入位点。
   3. FastLightR 的开发。
      注意:在 LightR 中将 I85V 突变引入两个 VVD 可实现更快的激活 - 失活动态，这归因于突变体快速转化为暗态^18,19。具有快速灭活动力学的 FastLightR-Src 和 FastLightR-bRaf 的产生能够对活化和失活进行严格的时间控制。它允许在活细胞中实现 LightR-Src 的亚细胞调节。
      注:Cre 重组酶活性导致不可逆的 DNA 重组;因此，LightR 的可逆性属性不适用。
      注:为了简化 LightR 构建体的检测，可以将荧光蛋白或任何其他合适的标签连接到靶蛋白的 N 端或 C 端。本研究使用 mCherry-myc 进行 LightR-Src，使用 Venus 进行 LightR-bRaf，使用 miRFP670 进行 LightR-Cre 重组酶。
2. 克隆策略
   注意:与传统方法不同，克隆方法基于定点诱变，不依赖于特定的限制性位点^10,20.
   1. 生成"Megaprimer"
      1. 密码子优化 LightR 基因，以确保真菌来源的两个串联 VVD DNA 序列在哺乳动物细胞中的稳定表达，并使序列尽可能不同，以便使用 PCR 进行无错误克隆。要执行密码子优化，请按照以下步骤作 1.2.1.2-1.2.1.3。
      2. 将 VVD 的氨基酸序列和选定的接头并排排列，以创建 LightR 的理论序列图。
      3. 将序列粘贴到任何在线密码子优化平台中，该平台利用先进的密码子优化算法来确定复杂度最低的最佳序列选项。确保选择目标生物体，保持阅读框，并选择 VVD 序列进行优化。
      4. 以定制合成片段（参见 补充表 1）或先前发表的 LightR 构建体¹⁰ 的形式获取 LightR DNA。
      5. 使用图 1D 中概述的先前描述的²⁰ 策略扩增 LightR 基因以生成"Megaprimer"。按照制造商对特定 DNA 聚合酶的建议，使用以下 PCR 反应混合物，通过 PCR 合成 LightR"Mega引物":
         5x DNA 聚合酶兼容缓冲液:10 μL
         100 μM 正向巨引物:0.5 μL
         100 μM 反向巨引物:0.5 μL
         10 nM dNTP 混合物:2 μL
         DNA 聚合酶 （2000 单位/mL）:1 μl （0.02 U/μL）
         50 ng 模板 DNA:1 μL
         PCR 级水:35 μL
         注:此处使用具有通用引物退火温度的高保真热启动 DNA 聚合酶。
      6. 通过琼脂糖凝胶电泳分离所得的巨引物。产物长度约为 1000 个核苷酸。从琼脂糖凝胶中切除 megaprimer，并按照制造商的建议或使用类似技术使用凝胶提取试剂盒进行纯化。
   2. 使用定点诱变插入 LightR 基因:插入 LightR，替换所需的氨基酸或一段氨基酸。模板质粒将是插入 LightR 结构域的质粒。如前所述²⁰ 使用以下混合物进行 PCR 反应。
      5x DNA 聚合酶兼容缓冲液:5 μL
      10 nM dNTP 混合物:1 μL
      DNA 聚合酶 （2000 单位/mL）:1 μL （0.02 U/μL）
      50 ng 目标模板 DNA:1 μL
      提取的 Megaprimer（计算质量）:10 μL
      DMSO:2.5 μL
      PCR 级水:2.5 μL
      注:大引物质量 （ng） = 所需的插入片段/载体摩尔比 x 载体质量 x 插入片段与载体长度的比值。所需的插入物/载体摩尔比为 3/1。
   3. PCR 反应完成后，加入 1 μL DpnI （2000 单位/mL） 酶，仅选择性消化过量和甲基化 DNA，并将混合物在 37 °C 下孵育 1-1.5 小时。这将显著提高修饰构建体的产量。
   4. 按照制造商的方案将 1-2 μL 的 PCR 反应物转化到 DH5α 感受态细胞中。
   5. 用适当的抗生素在 Luria Broth （LB） - 琼脂平板上接种转化的细菌以进行选择。将板在 37 °C 下孵育过夜或在室温 （RT; 25-30 °C） 下孵育 72 小时。
      注意:生长有菌落的 LB 板可以在 4 °C 下储存长达 1 个月，并且可以暂停方案。
   6. 菌落筛选 PCR
      1. 对于基于 PCR 的菌落筛选，设计在 LightR 插入片段中退火的引物并靶向 DNA，以产生大约 400-700 bp 的片段。
      2. 将 LB 板中的少量菌落添加到下面提供的 PCR 混合物中，然后按照制造商对特定 DNA 聚合酶的建议进行热循环。
         2x Taq RED 预混液:5 μL
         PCR 级水 : 5 μL
         100 μM 正向引物:0.5 μL
         100 μM 反向引物:0.5 μL
      3. 通过琼脂糖凝胶电泳检查阳性菌落。
      4. 挑选产生所需 PCR 产物大小的菌落，并将它们单独接种到 3 mL 含有抗生素的 LB 肉汤中，与质粒骨架中的抗生素耐药性相匹配。然后，在 37 °C 下孵育并摇动过夜。
      5. 按照质粒纯化试剂盒的制造商说明从液体培养物中提取质粒 DNA，用于质粒 DNA 提取，并通过测序验证插入片段的存在。
         注:克隆引物总结在 补充表 3 中。

2. LightR 酶活性的细胞接种和生化分析（图 2A）

1. 对于 LightR 激酶（LightR Src、FastLightR Src、LightR bRaf）的生化分析，每个实验组每 3.5 cm 细胞培养皿接种 1 x 10⁶ 个 LinXE 细胞。见 补充表 4。
2. 将细胞在 37 °C 和 5 % CO₂ 下孵育 16-18 小时。
3. 第二天，按照制造商的建议，使用合适的转染试剂，用选定的 DNA 构建体转染细胞（补充表 4）。
   注:最佳转染试剂取决于所用细胞的构建体、载体和类型。本研究使用转染试剂在 3.5 cm 培养皿中使用 2 μg DNA。应进行实证测试以确定最佳转染试剂。由于转染的构建体将表达受蓝光调节的蛋白质，因此处理转染细胞的所有后续步骤都必须在红光下进行。在将转染细胞放入培养箱之前，用铝箔包裹带有转染细胞的板，以防止意外照明。
4. 转染 16-18 小时后，将细胞暴露在蓝光下¹⁰。为此，在组织培养箱中放置一个 465 nm 发光二极管 （LED） 面板灯系统。在灯上方 10 cm 处放置一个穿孔有机玻璃面板，以获得 3 mW/cm² 的所需照明（补充文件 1）。需要一个多孔面板来保持培养箱中不间断的空气流通。将细胞照亮所需的时间。
5. 要激活 LightR-Src 和 LightR-bRaf，请使用连续照明。要连续照明，请手动打开和关闭 LED 面板。
6. 为了保持 FastLightR Src 的激活/停用周期，请使用手动控制或由微控制器控制的开/关周期。
   注意:可以使用多个软件工具包，这些工具包提供集成开发环境 （IDE） 来编写和上传所需的代码。这些工具包支持 C/C++ 编程，并提供通用输入/输出 （GPIO） 访问，这对于控制脉冲照明至关重要。 补充文件 1 中描述了用于这些目的的协议和代码的详细说明。
7. 在实验的相应时间点结束时（补充表 4），在安全的红灯下收获细胞。吸出培养基并用冷 PBS 洗涤细胞。
8. 为了分离蛋白质，用 500 μL 补充有 5% v/v 2-巯基乙醇的 2x Laemmli 样品缓冲液裂解细胞。将裂解物在 100 °C 下孵育 5 分钟。通过蛋白质凝胶电泳和 Western blotting 分析细胞裂解物²¹。
   注:2x Laemmli 缓冲液的成分如下:对于 500 mL:5.18 g Tris-HCL、131.5 mL 甘油、52.5 mL 20% SDS、0.5 g 溴酚蓝，最终 pH 值为 6.8。
9. 通过评估内源性 p130cas 在 Tyr249 上和桩蛋白在 TyrY118 上的磷酸化水平来评估 LightR-Src 活性 ^22,23（图 2）。通过评估 MEK1 在 Ser217/221 位点和 ERK1/2 位点对 TyrY202/204 位点的磷酸化水平来评估 LightR-bRaf^{活性 24,25}。

3. LightR-Cre 活性的功能分析

1. 对于 LightR-Cre 活性的功能分析，每 3.5 cm 细胞培养皿接种 1 x 10⁶ 个 LinXE 细胞。将细胞在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育 16-18 小时。
2. 按照第 2 节、 图 2A 和 补充表 5 中概述的方案转染细胞。共转染总共 2 μg DNA，以 1:9 的比例共转染 LightR-Cre-iRFP670 和报告基因质粒 Floxed-STOP-mCherry²。
3. 转染后 16-18 小时后，照射细胞。高效的 LightR-Cre 活化需要长时间的照明。因此，为避免光毒性，使用由微控制器控制的 465 nm LED 面板灯系统，使用 8 小时的脉冲照明，2 秒开和 20 秒关，如第 2 节和 补充文件 1 中所述。
4. 使用带有 20 倍空气物镜的落射荧光显微镜进行成像。对于 LightR-Cre-iRFP670 的可视化，请使用 Cy5 过滤器集，对于来自 Floxed-mCherry 表达的 mCherry 的可视化，请使用 RFP 过滤器集。
   注意:对于成像，使用配备 Cy5/RFP 光立方的落射荧光显微镜。

4. 活细胞成像样品的制备

1. 在细胞培养基中每 35 mm 组织培养皿接种 2 x 10^个 5 个 HeLa 细胞，并在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育 2 小时。
2. 一旦细胞贴壁且汇合度约为 60%-70%，则使用以下混合物之一共转染 HeLa 细胞:（i） 0.85 μg FastLightR-Src-mCherry-myc/0.15 μg Stargazin-iRFP，或 （ii） 0.75 μg FastLightR-bRaf-Venus/0.25 μg mCherry-ERK2
   注:在 FastLightR-Src 实验中，Stargazin-iRFP 用于标记质膜以进行细胞扩散分析。如果需要更高的 FastLightR-Src 表达，可以省略 stargazin-iRFP，而可以使用 1 μg FastLightR-Src 代替。在这些情况下，应使用膜染料来观察细胞。质膜染色剂通常用于标记细胞膜。
3. 用铝箔盖住培养皿，以避免细胞意外照射，并在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育 16-18 小时。
4. 在红光照明下完成以下所有步骤，以避免无意中激活构建体。暴露在白光下会诱导 LightR 激酶的激活，并可能影响后续结果。
5. 同一天，在 37 °C 下用 5 mg/L 纤连蛋白的 PBS 溶液包被 3 个圆形玻璃盖玻片（直径 25 mm，厚度 0.17 mm）过夜。
6. 转染后 16-18 小时用 PBS 冲洗盖玻片，并将 ~1 x 10⁵ 个转染的 HeLa 细胞接种到每个盖玻片上。在 37 °C 和 5% CO₂ 下在细胞培养基中孵育 2 小时。
   注意:低接种密度是必要的，以确保视野中的细胞不会相互接触。
7. 通过将 FBS 添加到 Levobitz 的 L-15 成像培养基中至最终浓度为 5% 来制备成像培养基。通过 0.22 μm 过滤器过滤溶液并将其加热至 37 °C。
8. 将矿物油预热至 37 °C。
9. 用 PBS 洗涤含有细胞的盖玻片两次。如果使用膜染料，请在清洗盖玻片之前按照制造商的说明对细胞进行染色。
10. 小心地将盖玻片放入活细胞成像室中。向腔室中加入 1 mL 的 L-15 成像介质。
11. 在介质顶部添加 1 mL 矿物油，以防止成像过程中蒸发。
12. 将腔室在 37 °C 下避光，直到准备成像。

5. FastLightR-Src 的全局激活和成像（图 3）

1. 将蓝色 LED 显微镜环形灯连接到显微镜聚光镜上，将其放置在样品架上方约 1.5 cm 处。将环形灯的 AC/DC 控制继电器连接到显微镜计算机。
   注意:对于本研究中的实验，照明是通过成像软件的晶体管-晶体管逻辑 （TTL） 接口来控制的。如果没有外部照明源，落射荧光照明也可用于全局激活 LightR 构建体。GFP 激发波长，例如 490/20 nm 激发滤光片，可有效激活 LightR。
2. 将腔室放在预热至 37 °C 的显微镜载物台上，并选择表达 FastLightR-Src-mCherry 和 Stargazin-iRFP（图 3B）或 FastLightR-bRaf-Venus 和 mCherry ERK-2（图 5B）的细胞。
3. 对于全局照明和成像实验的研究，请使用与显微镜兼容的高性能物镜 （40x），具有复消色差校正、平场校正和高数值孔径。
   1. 对于基于 Src 激酶的全局照明研究，使用 561/10 nm 激发和 595/40 nm 发射滤光片来可视化 FastLightR-Src-mCherry，并使用 640/20 nm 激发和 655LP 发射滤光片来可视化 stargazin-iRFP。
   2. 对于基于 bRaf 激酶的全局照明研究，使用 514/10 nm 激发和 540/21 nm 发射滤光片来可视化 FastLightR-bRaf-Venus，并使用 561/10 nm 激发和 595/40 nm 发射滤光片来可视化 mCherry-ERK-2。
   3. 在所有荧光成像通道中使用多波段多向色镜。
4. 根据实验条件，请考虑以下建议。
   1. 在照明前对细胞进行至少 10 分钟的成像，以确定细胞的基线活性。
      注:需要此基线来确定通过照明激活 FastLightR 激酶是否会诱导细胞行为或蛋白质定位的任何变化。还可以进行较长时间的基础成像以提供更大的统计意义。
   2. 由于 FastLightR 的快速失活动力学，包括许多用于成像的细胞可能会导致 Src/bRaf 在载物台位置之间失活，并可以减弱其反应。为避免此类错误，在所述方案中分析 FastLightR-Kinase 活性时，以 4 个细胞/分钟的速度成像，并每分钟对每个选定的细胞进行一次成像，总共 110 分钟（补充文件 2）。
   3. 在连续照明上使用脉冲照明，以减少蓝光的潜在光毒性作用。4 个细胞/分钟中的每一个细胞 12 秒的照明是有效的（补充文件 2， 图 3A）。
      注意:应根据经验确定不同结构和照明源类型的照明周期。
   4. 在细胞成像期间关闭 Illumination 以避免荧光通道渗漏。
      注意:一次对过多的细胞进行成像会减少样品可用的总照明时间，从而导致激活不足导致响应减弱。
5. 成像后，将电影另存为 。TIF 堆栈文件格式进行分析。
   注意:由于与环形光相比，GFP 落射荧光的照明不太均匀，因此使用 GFP 落射荧光的实验将需要更频繁的照明。这导致每次实验成像的细胞更少。

6. FastLightR-Src 的亚细胞活化和成像（图 4）

1. 将腔室放在预热至 37 °C 的显微镜载物台上，并选择同时表达 FastLightR-Src-mCherry 和 Stargazin-iRFP 的单个细胞。
2. 选择要照亮的细胞内的特定区域 （ROI）。本研究在所选细胞的外围选择一个小区域。
   注意:对于局部照明，使用由 TIRF 模块在 FRAP 模式下聚焦的 445 nm 激光器或通过成像软件通过 TTL 接口控制的微镜设备。任何图案照明系统都适用于这些实验。如果使用基于扫描的系统，请确定激光强度和均匀性，以便在不损坏细胞的情况下充分激活。
3. 在照明前以基础状态每分钟对所选细胞成像 20 分钟，局部照明时 50 分钟，然后在激活后 20 分钟，总共 90 分钟（补充文件 2）。
4. 对于激活和失活，请提供适合目标蛋白的适当时间，以允许 LightR 蛋白完全失活。对于 FastLightR-Src，允许至少 10 分钟的去活以使残余活性消融，并在演示的局部照明实验装置中允许 20 分钟去活。
5. 成像后，将电影另存为 。TIF 堆栈文件格式进行分析。

7. 细胞扩散分析

1. 准备用于数据处理和分析的图像。确保图像位于 .TIF 堆栈格式。直接从成像软件保存这些内容或使用开源程序进行转换。
2. 从补充数据压缩文件中下载 CellGeo 脚本包²⁶.
   注意:CellGeo 包包含几个不同的脚本。根据协议第 7-9 节中介绍的分析类型，从列表中选择所需的软件包。
3. 打开并运行名为 MovThresh 的脚本，以创建单元格的掩码。
   1. 选择 File > Import （.tif） 并选择单元格的 Stargazin-iRFP 图像。
   2. 使用左下角的滚动条扫描帧。如果建议的阈值合适，请转到步骤 7.4。
   3. 如果建议的阈值与单元格的行为不一致，请在 Curve Selection （曲线选择） 下选择平滑曲线或自定义曲线。通过滚动帧，然后调整窗口右侧的阈值来创建自定义曲线。
   4. 单击 Re-Threshold。
   5. 点击 文件 > 另存为蒙版， 更改文件的名称，然后使用 另存为 选项。
4. 在开源图像分析程序中打开新创建的堆栈文件。
5. 选择 图像 > 调整阈值 > > 应用。
6. 选择 Analyze > Analyze particles > Check display results -> OK。
7. 通过将任何给定时间的面积除以蓝光照射前同一细胞的平均面积来计算每个细胞的面积变化。
8. 将面积变化绘制为折线图或条形图。
9. 计算在相同条件下处理的所有细胞的每个时间点的平均值和 90% 置信区间。

8. 细胞边缘动力学分析

1. 使用协议第 7 节中描述的步骤准备堆栈文件。
2. 打开并运行标题为 ProActive 的脚本。
   1. 选择 "文件">"导入 > 遮罩 （.tif）， 然后选择通过 MovThresh 脚本创建的遮罩。
   2. 在右下角选择感兴趣的分析活动（Protrusive、Retractive 或 Total）。
   3. 选择规范化的类型。通常，面积归一化用于这些分析。
   4. 使用左侧的滑块选择参考的起始帧。右侧的滞后滑块将确定两个时间点之间的时间滞后，用于测量像元获得和丢失的面积。
   5. 如果所选帧数和滞后数加大于影片中的帧数，则不会显示预览图像。将这些值重置为等于小于帧总数。
3. 通过选中 Results 部分下的 Smooth Curve 复选框来修改突出或缩回的阈值。这将对特定时段内的阈值进行平均，从而解决将微小波动检测为活动的问题。
4. 选择 Run the Range 以计算 frame 和 lag 滑块指定的时间内的活动。
5. 通过选择 文件 > 另存为 > 结果 （.mat） 来保存数值数据，并使用它来确定平均伸出或回缩活动。
6. 确定每个时间点的 90% 置信区间。
   注意:这将保存一个包含多个不同值的数组。脚本附带的 "How to use ProActive" 文本文件详细描述了每个值所代表的内容以及如何确定它们²⁶.
7. 通过选择 File > Save As > Images （.tif） 来保存活动的可视化表示形式。

9. 质心偏移分析

1. 对于质心平移分析，请使用任何可以确定质心坐标的软件。
2. 在分析软件中，如协议第 7 节所述打开感兴趣细胞的遮罩图像堆栈。
3. 选择 Measure > Integrated Morphometry Analysis，然后单击 Preferences > Draw Centroid Mark > Check，然后选择 Measure。
   1. 在移动之前记录质心坐标 （A）。
   2. 在实验结束时记录质心坐标 （B）。
   3. 记录照明图案中心的坐标 （C）。
4. 现在已经收集了三个点，确定角度 BAC⁸。θ₁ 对应于角度 ABC，θ ₂ 对应于角度 CBA（图 4Cii）。使用以下公式执行此作:
   cosθ = cos（θ₁ - θ₂） = cosθ₁cosθ₂ + sinθ₁sinθ₂
   注意:计算器可用于直接从坐标确定角度和距离，以便于使用。
5. 通过将单元质心以像素为单位行进的距离乘以转换因子来确定质心位移，其中 1 个像素等于 0.4 μm。像素到距离的特定转换将取决于系统上的放大倍率和相机设置。
6. 确定质心偏移角度和距离后，打开能够生成极坐标图像的绘图软件。
7. 将质心移位角作为 θ 测量值，将行进距离作为半径。利用方差分析检验 95% 置信区间。
8. 绘制结果并保存图像。

结果

LightR-Src 是按照 图 1A、B 中描述的策略设计和生成的。LightR-Src 的生化分析在连续照明 60 分钟时响应蓝光，获得已知内源性 Src 底物 p130Cas （Y249）²² 和 paxillin （Y118）²³ 的磷酸化（图 2B）。值得注意的是，当 LightR-Src 仅在转染后 16-18 小时内在黑暗中表达时，未观察到 Src 激酶的背景激活。此外，具有 D388R 突变的 LightR-Src 的催化失活突变体不会诱导 Src 底物的磷酸化，表明磷酸化是由活性 LightR-Src 进行的，而不是由蓝光照明的非特异性效应引起的（图 2B）。承认 Src²⁷ 激酶在活细胞中振荡活性的报道，我们研究了是否可以调整 LightR-Src 以表现出循环激活。最初的 LightR-Src 显示出缓慢的失活动力学（图 2C），促使产生一个新的变体 Fast-LightR-Src，在两个 VVD 中都含有 I85V 突变。 图 2D 表明 Fast-LightR-Src 显示出明显更快的失活动力学，并在关灯后 10 分钟内完全失活，而 LightR-Src 则超过一个小时。使用 FastLightR-Src，我们还能够实现重复的激活/失活循环（图 2E）。这些结果共同证明了 LightR 工具在活细胞中实现对 Src 活性的特异性和严格控制的调节的能力。

FastLightR-Src 的应用还允许评估瞬时 Src 激活对细胞形态动力学的影响。在 HeLa 细胞中激活 FastLightR-Src 会诱导细胞扩散，一旦 FastLightR-Src 失活，这个过程就会停止。激活后，我们观察到 FastLightR-Src 从核周隔室转移到黏着斑和质膜，这是野生型 Src 激酶^11,12 表现出的行为。表达催化失活突变体 D388RLightR-Src 的光照细胞无法显示这种扩散效应（图 3B，C）。这进一步证实了 FastLightR-Src 的功能与其野生型对应物类似。细胞区域的局部照明导致 FastLightR-Src 的局部激活，表现为局部积累的 LightR Src 在黏着斑中，并伴有局部膜突起的形成（图 4B （i）、（ii））和细胞质心移动（图 4C （i）、（ii）），导致细胞向光移动。在确定了 LightR 工具在 Src 激酶调节中的应用后，我们展示了 LightR 扩展到 bRaf 激酶和 DNA 重组酶 Cre 调节的广泛用途。LightR-bRaf 的分析显示光诱导的 bRaf、MEK1 内源性底物磷酸化和 ERK1/2 激酶的下游磷酸化^24,25，其水平与组成型活性 bRaf 突变体 （V600E） 的水平相当（图 5A）。相反，催化失活的 D575RLightR-bRaf 没有 MEK1 和 ERK1/2 磷酸化，与未照射的 LightR-bRaf 样品相当，从而证实了 LightR-bRaf 调节的特异性。活细胞成像表明，FastLightR-bRaf 激活/失活的重复循环诱导 ERK2 重复转位进出细胞核，这与 bRaf 激活²⁸ 的已知结果相吻合（图 5B）。LightR-Cre 的激活导致报告基因 mCherry 基因的成功重组，证明了 LightR 对不同类别的酶的适用性（图 5C）。

图 1:LightR 方法的开发策略。 （A） 两种 Vivid 单体在暗态 （PDB: 2PD7） 和点亮态下的二聚体 （PDB: 3RH8） 的晶体结构。（B） LightR 设计的卡通表现。插入催化结构域的两个串联连接的 VVD 光感受器在黑暗中破坏蛋白质的催化活性。响应蓝光的 VVD 二聚化可恢复蛋白质活性。（C） （i） Src （PDB 1Y57） 和 （ii） bRaf （PDB 4MNF） 催化结构域的晶体结构。（ii） Cre 重组酶 （PDB 1MA7） 的结构。黄色箭头表示 LightR 插入位点，并表示取代氨基酸。（D） 将 LightR 结构域插入目标酶序列的克隆策略示意图¹⁹。在第 1 步中，使用专门设计的引物对 LightR 片段进行 PCR 合成，该片段的两侧是插入位点前后靶基因退火位点。在第 2 步中，由此产生的 LightR 片段被证明用作"巨引物"，通过快速变化定点诱变将 LightR 插入靶酶基因。面板 A-C 经 Shaaya 等人 ¹⁰ 许可进行了改编和修改。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2:工程化 LightR 蛋白的生化表征。（A） LightR Src 生化表征实验方案的示意图。（B） 使用 465 nm LED 设置，用蓝光连续照射 60 分钟，用蓝光连续照射 60 分钟，在 C 端带有 mCherry 和 myc 标签。探测细胞裂解物对 Src 底物、桩蛋白和 p130Cas 的磷酸化。Western Blot 结果显示，内源性桩蛋白和 p130Cas 在活细胞中响应 LightR-Src 的激活而磷酸化。（C，D）在 C 端瞬时表达带有串联 mCherry-myc 标签的指定 LightR-Src 构建体的 LinXE 细胞连续暴露在蓝光下指定时间（0 分钟和 30 分钟），然后置于黑暗中指定时间。探测细胞裂解物对 Src 底物的磷酸化，显示 （C） LightR-Src 和 （D） FastLightR-Src 之间的活化和失活动力学比较。（E） 在 C 端瞬时表达带有串联 mCherry-myc 标签的指定 LightR-Src 构建体的 LinXE 细胞连续暴露在蓝光下 20 分钟，然后在黑暗中重复孵育 10 分钟，在光照下孵育 20 分钟。收集细胞裂解物并探测 Src 底物的磷酸化，显示 Src 激酶在激活和失活状态之间循环的效率。所有实验至少重复 3 次，结果相似。每个蛋白质印迹图 B-E 旁边显示的数字代表蛋白质的分子量，以千道尔顿 （kDa） 为单位。面板 B-E 已经 Shaaya 等人 ¹⁰ 许可进行了改编和修改。请单击此处查看此图的较大版本。

图 3:全局和时间照明控制及其对 FastLightR-Src 活动的影响。（A） 全局和时间循环照明实验方案的卡通表示以及随后的数据分析。（B，C）使用宽场荧光显微镜从延时系列获得的 HeLa 细胞的代表性图像中描述了蓝光对细胞形态的调节和 FastLightR-Src 定位。这些细胞瞬时共表达 FastLightR-Src-mCherry-myc （N = 10 个细胞） 或催化失活的 D388RLightR-Src-mCherry-myc （N = 9 个细胞） 以及 Stargazin-iRFP670 （质膜标志物）。每分钟进行一次活细胞成像，同时用蓝光（蓝色轮廓）对细胞进行全面照射。（B） 黄色箭头突出显示了类似于粘着斑的结构处的 FastLightR-Src 定位。图像是使用宽场荧光显微镜从延时序列的 HeLa 细胞中获得的。（C） 每个面板上显示了 FastLightR-Src 与 D388RLightR-Src 激活诱导的细胞面积变化的定量。照明窗口以蓝色矩形表示。图形表示均值± 90% 置信区间。图 B 和 C 经 Shaaya 等人许可进行了改编和修改¹⁰。请单击此处查看此图的较大版本。

图 4:局部亚细胞照明控制及其对 FastLightR-Src 活性的影响。 （A） 局部亚细胞照明控制实验方案的卡通表示。（B） （i） 延时序列，说明表达 FastLightR-Src-mCherry 的 HeLa 细胞，局部用蓝光照射（由蓝色圆圈表示）。使用全内反射荧光显微镜（60 倍物镜）每分钟捕获一次图像。图像显示为以指定时间间隔获取的反向对比度图像。（ii） 细胞投影图像，显示在指定时间间隔内形成的突起。在实验时间轴上对细胞形态进行阈值处理和掩盖代表了分析细胞扩散和细胞边缘动力学的平台。单元格的指定照明区域由蓝色圆圈勾勒。（C） （i） 表示质心相对于局部蓝光照明的迁移距离 （d） 和偏差角 （θ） 的单元格的极坐标图。黑点表示表达催化失活的 D388RLightR-Src（N = 6 个细胞）或 FastLightR-Src（N = 10 个细胞）的单个 HeLa 细胞。（ii） 示意图，显示细胞质心从局部蓝光刺激的开始 （1） 到结论 （2） 行进的质心移动距离 （d）。偏差角 （θ） 表示细胞质心运动与蓝光位置的发散程度。浅灰色阴影表示细胞响应局部 FastLightR-Src 刺激而突出的区域。单元格的指定照明区域由蓝色实线圆圈表示。图 B 和 C 改编自 Shaaya 等人 ¹⁰。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 5:LightR 方法的广泛适用性。 （A） LightR-bRaf 的调节。瞬时表达 LightR-bRaf-Venus、催化失活的 D575R LightR-bRaf Venus 或组成型活性 bRaf （V600E）-Venus 的 LinXE 细胞暴露于指定时间的连续蓝光下。探测细胞裂解物对指定蛋白质的磷酸化。（B） 使用宽场荧光显微镜从延时系列活细胞成像中获得的代表性图像说明了瞬时共表达 FastLightR-bRaf-Venus 和 mCherry-ERK2 的 LinXE 细胞中全局蓝光反应的调节。这些电池用蓝光（每秒 50 ms 脉冲，每分钟 50 个脉冲）全面照射，持续以蓝色标出的指定持续时间。每分钟进行一次 mCherry-ERK2 的活细胞成像。黄色箭头突出显示了由工程 bRaf 的蓝光激活诱导的核 ERK2 定位阶段。（C） 用 Floxed-stop-mCherry 报告基因和 LightR-Cre-iRFP670 瞬时共转染 LinXE 细胞。将细胞置于黑暗条件或脉冲蓝光 （2 秒开，10 秒灭） 长达 8 小时。使用宽场荧光显微镜（10 倍物镜）以相同的设置采集每个通道所有时间点的图像，并将其调整为一致的亮度和对比度水平，以便于比较不同样品中的蛋白质表达水平。该实验至少重复了 3 次，产生了相似的结果。该图改编自Shaaya et ^al.10。 请单击此处查看此图的较大版本。

补充表 1:LightR 序列。请点击此处下载此文件。

补充表 2:LightR 插入位点的描述和 LightR-Protein 设计的检查表。请点击此处下载此文件。

补充表 3:LightR 克隆引物。请点击此处下载此文件。

补充表 4:LightR-Protein 活性生化分析的转染条件。请点击此处下载此文件。

补充表 5:用于基于成像的 LightR 蛋白活性分析的转染条件。请点击此处下载此文件。

补充文件 1:使用集成开发环境 （IDE） 的脉冲照明。请点击此处下载此文件。

补充文件 2:显微镜照明设置。请点击此处下载此文件。

讨论

我们的研究提出了一种用于研究不同信号通路的光遗传学方法，并证明了其在解决不同生物学问题方面的广泛适用性。LightR 工具系统提供了几个基本优势:（1） 蛋白质活性的变构调节，（2） 对活性的严格时间控制，可以调整以实现不同的激活和失活动力学，（3） 亚细胞水平活性的空间分辨率，（4） 信号调节和生物活性的特异性，以及 （5） 对各种靶蛋白的广泛适用性。值得注意的是，LightR 独特地将所有这些优势集成到一个工具中，从而向前迈出了重要的一步。

LightR 作为变构开关的设计具有几个优点。当 LightR 插入小型柔性环中时，其控制蛋白质活性的能力为具有不同结构和功能的各种蛋白质的应用提供了相当大的多功能性。作为变构开关，LightR 仅调节目标蛋白质的靶结构域，而不会影响蛋白质的其他结构域。因此，该方法允许在不影响蛋白质的基本功能（例如与其结合伴侣的相互作用或细胞内的天然定位）的情况下对活性进行特异性调节。通过使用光介导的同二聚化或异二聚化控制，双组分光遗传学系统已成功应用于蛋白质定位、相互作用或其他基本功能的调节 29,30,31,32,33,34,35.然而，这些系统通常需要两种蛋白质的优化等摩尔表达，这使得它们的应用更具挑战性。使用 LightR 系统的变构调节是在单个蛋白质中实现的，因此为询问细胞信号转导提供了一种更通用的方法。

LightR 开关对不同蛋白质类别的广泛适用性部分是通过优化 LightR 结构域内的不同模块来实现的。连接 LightR 和目标蛋白的连接子以及连接 LightR 内两个 VVD 结构域的连接子（VVD 连接子间连接子）可以影响调节效率。VVD 间柔性接头 （GGS）4G（GGS）3 的选择提供了足够的灵活性和长度，以确保 VVD 单体在 LightR 结构域内的结合和解离。到目前为止，该接头确保了所有靶向蛋白的成功调节。然而，当 LightR 结构域在黑暗中不能充分灭活蛋白质时，可以引入更坚硬的接头，使 VVD 结构域进一步分开，以增强 LightR 夹的打开，从而保持酶无活性。接头仍应保持足够的柔韧性，以实现 VVD 的二聚化和目标蛋白的激活。为了将 LightR 连接到目标蛋白质，我们使用短柔性接头 GPGGSGG 和 GSGGPG，添加到 LightR 结构域的 N 端和 C 端。它们在连接中提供了足够的灵活性，从而防止了对目标蛋白质的不可逆破坏。然而，它们足够短，可以在黑暗中使目标蛋白质发生扭曲，同时促进蛋白质在光线下恢复功能。这些接头支持 LightR 对许多蛋白质应用的调节。然而，在某些情况下，当这些接头在黑暗中可能无法提供足够的蛋白质失活时，缩短接头可能是有益的。这种 Linker 缩短会降低柔韧性并增强在黑暗中打开 LightR 夹引起的失真，从而最大限度地减少任何泄漏。然而，由于点燃状态下的潜在结构扭曲，这种调整可能会损害酶的最大活性。或者，在构象不稳定性不是一个重大问题的情况下，替换插入环中的多个氨基酸可以提供类似的平衡灵活性的好处。

许多关键的信号转导过程被瞬时激活或以振荡方式调节 36,37,38,39,40,41,42,43。LightR 工具的可调性使我们能够模拟复杂的信号模式，从而为询问时间控制的生物过程提供了一种强大的方法。我们通过将 I85V 突变引入两个 VVD 结构域来调节 LightR 的关闭动力学来实现这一目标。这种突变将 VVD 二聚体在暗态下的半衰期从 18,000 秒缩短到 780 秒¹⁹，从而促进 FastLightR-酶的快速失活。

快速灭活动力学还能够在亚细胞分辨率下调节蛋白质活性。LightR 酶具有慢速动力学，由于活化构建体的细胞内扩散，可能难以观察到亚细胞活化的影响。通过快速动力学，任何扩散到局部照明区域之外的 FastLightR 酶都会被迅速灭活。通过选择性激活特定的亚细胞区域，研究人员可以深入了解蛋白质的局部功能，从而更好地了解它们对复杂细胞通路和信号转导网络的贡献。

虽然 FastLightR 对于细胞内蛋白质活动的空间和时间限制光学控制非常宝贵，但仍有一些应用可能需要慢速动力学。具有慢速动力学的 LightR 可以在需要持续和增强蓝光诱导活性的研究中实施。这些应用只需要不频繁的照明脉冲来维持连续的光遗传学活性，从而最大限度地减少光毒性等问题。对于不同的场景，可以单独或相互串联地实施各种动力学修改^10,18，为调整 LightR 性能以优化其特定实验的应用提供有前途的解决方案。

LightR 酶的适用性取决于它们模拟内源性酶的生物学功能的能力。因此，评估它们的底物特异性、下游信号传导和亚细胞定位至关重要。LightR-Src 活性的特异性通过 Src 底物（包括桩蛋白和 p130Cas^22,23）的磷酸化来证实。FastLightR-Src 在循环照明下在核周区域和黏着斑之间穿梭，导致细胞扩散。这种现象成功地类似于早期对天然 Src 激酶的观察，并进一步证实了本工具在探索 Src 生物学方面的有效性 11,12,44,45,46,47。LightR-bRaf 在靶向信号复合物（如 MEK 和 ERK 激酶）方面也表现出特异性^24,25。此外，FastLightR-bRaf 表现出 ERK 核穿梭飞机响应蓝光的循环振荡，这是 bRaf 激活的已知结果²⁸。LightR 酶紧密模拟内源性蛋白质功能的能力为研究其功能提供了宝贵的工具。

上述讨论描述了 LightR 激酶在定义的细胞区室内复制精确细胞信号通路的能力。与激酶的这种成功相一致，LightR-Cre 作为一个说明性模型，展示了源自 P1 噬菌体的原始 Cre 重组酶的功能。Cre 重组酶属于位点特异性重组酶整合酶家族，它通过促进靶 DNA 上称为 loxP 的两个识别位点之间的重组来发挥作用。这种重组导致 DNA 通过交叉事件重排。根据靶 DNA 上 loxP 位点的方向，交叉事件可导致染色体元件的缺失、复制或易位⁴⁸。Cre 重组酶已广泛用于生成诱导基因调控的体内模型^49,50。然而，其他自发的、化学诱导的或光遗传学诱导的 cre 重组酶系统对动物模型中诱导 DNA 重组的时间和地点的控制有限。LightR-Cre 通过对 DNA 重组进行严格的时间和空间控制来克服这些限制。此外，LightR 的可调性使我们能够消除不需要的泄漏活动，并确保高精度地调节 Cre。这些功能为疾病病理学建模和新疗法的开发提供了新的机会。

激酶和 DNA 重组酶中 LightR 的精确调节进一步证明该工具可以以相同的策略应用于多种蛋白质。除了激活各种酶类别外，LightR 还可以潜在地连接到其他蛋白质类型上，其中变构调节可用于将蛋白质定位到特定的亚细胞区域、诱导蛋白质-蛋白质相互作用、设计蓝光诱导生物传感器等。由于特异性结构域靶向的变构优势，LightRs 还可以在同一蛋白质中与其他化学遗传学和光遗传学方法结合，以实现更高程度的可调性来研究生物过程。

我们已经成功地将 LightR 应用于多种其他蛋白质（正在准备的手稿）。尽管取得了这些成功，但功能性 LightR 蛋白的开发可能面临潜在的挑战，尤其是在选择合适的插入位点和准确模拟靶蛋白的生物学功能方面。当晶体结构不可用时，研究人员必须依赖预测的结构或氨基酸序列信息，因此需要更多的故障排除来设计具有多个插入位点或氨基酸取代的蛋白质。此外，必须微调工程化蛋白质活性，以准确复制细胞内的生物功能。这些实验的成功取决于工程蛋白及其内源性同源物的精确功能模拟，这通常需要严格的故障排除，并且可能因细胞类型、靶蛋白类别和类型以及蓝光激活的强度和持续时间而异。

总之，LightR 系统代表了实现对蛋白质功能的精确时空控制的强大工具。它的稳健性、可调性和多功能性使其在研究复杂的细胞过程、揭示信号通路和阐明基因调控机制方面具有不可估量的价值。通过为研究人员提供前所未有的蛋白质活性控制，LightR 系统有望促进我们对基本生物过程的理解，并为创新的治疗干预铺平道路。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
#1.5 玻璃盖玻片 25 mm 圆形	Warner Instruments	64-0715
1.5 mL 试管	美国科学	cc7682-3394
2x Laemmli 缓冲液			500 mL：5.18 gTris-HCL，131.5 mL 甘油，52.5 mL 20% SDS，0.5 g 溴酚蓝，最终 pH 值 6.84-20
% Mini-PROTEAN TGX 预制胶	Biorad	4561096
5x Phusion Plus 缓冲液	Thermo Scientific	F538L
60 LED 显微镜环形灯	Boli 光学	ML46241324	蓝色 LED，直径 60 mm，5 W
琼脂糖	GoldBiotech	A-201
抗 ERK 1/2 抗体	信号传导	9102
抗 GAPDH 抗体	invitrogen	AM4300
抗 GFPClontech		632380
抗 mCherry 抗体	invitrogen	M11217
抗 MEK	细胞信号传导	9122
抗 p130Cas	BD Biosciences	610271
抗桩蛋白	细胞信号传导	2542
抗磷酸化 Erk 1/2 T202/Y204 抗体	细胞信号传导	9101
抗磷酸化 pY249 p130Cas	细胞信号传导	4014
抗磷酸化 Y118 桩蛋白	细胞信号传导	2541
Anto-phospho-S217/221 MEK	Cell信号	9121
Arduino兼容电源	公司电脑	LJH -186
Arduino Uno Rev3	Arduino	‎
Attofluor 细胞室	invitrogen	A7816
基准胎牛血清 （FBS）	Gemini Bio-products	100-106	热灭活三重 0.1 & micro;m 无菌过滤
bRaf-V600E-Venus			来自 MUSC BSA John O'Bryan博士的礼物
	GoldBiotech	A-420
羧苄青霉素（二钠）	Gold Biotechnology	C-103-25
CellMask Deep Red 质膜染料	invitrogen	C10046
菌落筛选 MasterMix	Genesee	42-138
DH5a 感受态细胞	NEB	C2987H
DMEM	康宁	15-013-CV
DNA 分子量标准	GoldBio	D010-500
dNTPs	NEB	N04475
DPN1 酶	NEB	R01765
DTT	GoldBio	DTT10	DL-二硫苏糖醇，Cleland's 试剂
EGTA	Acros
FastLightR-bRaf-mVenus	Addgene	#162155
来自牛血浆的纤连蛋白	西格玛	F1141
FuGENE（R） 6 转染试剂	Promega	E2692	转染试剂
凝胶绿色核酸染料	GoldBio	G-740-500
凝胶加载染料 紫色 6x	NEB	B7024A
GeneJET 凝胶提取试剂盒	Thermo Scientific	K0692	凝胶提取试剂盒
GeneJET 质粒小量制备试剂盒	Thermo Scientific	K0502
Glutamax	Gibco	35050-061	GlutaMAX-l （100x） 100 mL
HEK 293T 细胞	ATCC	CRL-11268
HeLa 细胞	ATCC	CRM-CCL-2
HEPES	费歇尔	BP310-500
物联网继电器	数字记录器	DLI 705020645490	用于照明的 AC/DC 控制继电器
卡那霉素单硫酸盐	金 生物技术	K-120-25
KCl	Sigma	P-4504
L-15 1x	康宁	10-045-CV
LB 琼脂	Fisher	BP1425-2
LED 植物生长灯系统	HQRP	884667106091218	LED 面板灯系统
LightR-bRaf-mVenus	Addgene	#162154
LightR-iCre-miRFP670	Addgene	#162158
MATLAB	Mathworks	R2024a	运行CellGEO脚本
的软件 Metamorph	Molecular Devices		成像分析软件
MgCl2	Fisher Chemical	M33-500
矿物油	Sigma	M5310
MiniPrep 试剂盒	基因选择	96-308
Mini-PROTEAN TGX 预制胶 12 孔	Bio-Rad	4561085
分子生物学级水	康宁	46-000-CV
多波段多色镜	89903BS	Chroma
NaCl	费舍尔化学	S271-3
不含 Ca 和 Mg的 PBS	康宁	21-031-CV
pCAG-iCre	Addgene	#89573
pcDNA3.1_Floxed-STOP mCherry	Addgene	#122963
pCEFL-ERK2			来自 Channing Der 博士实验室的礼物，UNC
PCR 管	labForce	1149Z65	0.2 mL 8 联排管和管盖，硬质联排管，独立连接圆顶盖
Phusion Plus DNA 聚合酶	Thermo Scientific	F630S
pmiRFP670-N1	Addgene	#79987
Polygon 400 图案照明器	Mightex	DSI-G-00C
底漆	IDT
PVDF 膜	BioRad	1620219	免疫印迹 PVDF/滤纸三明治
T0.25% 胰蛋白酶，2.21 mM，eDTA，1x [-] 康宁钠		25-053-CI
Tris-乙酸-EDTA （TAE） 50x	菲舍尔	BP1332-1	用于电泳
UPlanSApo 40x 显微镜物镜	奥林巴斯	1-U2B828
USB TTL 盒	National Instruments	6501	用于 TTL 接口
&-巯基乙醇	Fisher Chemical	O3446I-100