本方案描述了一种工程化的蓝光激活变构开关（LightR）结构域，可用于可逆地进行时空控制蛋白质活性。以Src酪氨酸激酶为模型，本研究提供了开发和表征光调控Src（LightR-Src）的详细方案，并展示了该方法在不同酶类中的广泛适用性。
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本文内容
摘要
摘要
光遗传学技术有望实现对酶活性的复杂时空控制，其精度可达亚细胞水平。然而，大多数光遗传学方法在将多种功能整合到一种适用于多种靶蛋白的单一工具中时，常面临重大挑战。如何实现对“开启/关闭”动力学的精确控制、确保在黑暗条件下最小的渗漏活性，并在哺乳动物细胞中以亚细胞精度高效发挥作用，是该领域常见的难题。一个有前景的解决方案是利用理性设计的光敏结构域，通过别构效应来调控蛋白质活性。基于这一策略，我们开发出一种具备所有理想特性的光遗传学方法。该方法通过将光调控别构开关模块（LightR）插入靶蛋白中，利用蓝光（465 nm）调控酶活性。LightR结构域由两个Vivid（VVD）光感受结构域连接而成，形成一种光敏感夹子，可插入酶催化结构域内的一个小而灵活的环区。在黑暗状态下，LightR夹子处于开放状态，导致酶催化结构域构象畸变而失活；当暴露于蓝光时，LightR结构域闭合，恢复催化结构域的正常构象，从而恢复酶活性。本文中，我们讨论了构建光调控蛋白激酶的设计策略 ，并展示了其在蓝光控制下的可逆性、动力学特性以及在亚细胞水平上的精确调控能力，实现了高度精确的时空控制。以Src酪氨酸激酶为模型，我们展示了一种有效调控LightR-Src激酶活性的实验方案。此外，我们还证明了LightR系统适用于不同类型的酶，拓展了该工具在研究多种疾病相关信号通路机制问题中的应用价值。
引言
细胞在生理或病理条件下解读外部信号并将其转化为特定反应的能力，由特定的蛋白质群组所调控。任何蛋白质在这些复杂反应中的作用，通常由其亚细胞定位、表达水平以及瞬时、持续或振荡性激活的时间动态所决定。要解析这些独立参数在信号转导调控中的作用，需要能够模拟亚细胞水平上蛋白质活性复杂时空控制的方法。传统的技术手段，如基因操作和小分子抑制剂，在这方面存在局限性。相比之下，光遗传学技术有望通过操控或模拟生理与病理过程，实现对生物过程的精细解析。然而，现有的工具往往缺乏广泛的适用性或亚细胞水平的精确控制。一些已有策略能够实现对蛋白质定位和相互作用的严密调控，但无法直接控制酶活性1,2,3,4；另一些方法虽可调控酶活性，但可能缺乏亚细胞特异性，或在不同酶类之间适用性有限5,6,7,8,9。在本实验方案中，我们介绍一种新型的蛋白质工程技术，将光遗传学的优势集于一身：实现严密的....
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方案
1. LightR 的设计与开发（图 1）
- 战略规划
注意：LightR 结构域由来自粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）的两个串联连接的Vivid（VVD）光感受器结构域组成13,14,15,16在光照条件下，VVDs 会发生同源二聚化，这种二聚化涉及构象变化，使得一个 VVD 单体的 N 末端靠近另一个 VVD 单体的 C 末端（图1A）。将两个VVD结构域通过一个柔性连接肽相连，可形成一种类似夹钳的结构域，该结构域在黑暗中呈开放状态，而在蓝光照射下则关闭。将此夹钳结构整合到酶的催化结构域中，即可实现光介导的酶活性调控。在黑暗条件下，开放的夹钳结构会扭曲催化结构域，使酶失活；蓝光照射则促使夹钳闭合，恢复酶的活性（图1B）。这一概念可应用于来自不同家族的酶，包括蛋白激酶和DNA重组酶。10 (图1C....
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结果
LightR-Src 的设计与构建遵循 图 1A、B 中所述策略。生化分析表明，在持续蓝光照射 60 分钟后，LightR-Src 可激活已知的内源性 Src 底物 p130Cas (Y249)22 和 paxillin (Y118)23 的磷酸化（图 2B）。值得注意的是，当 LightR-Src 仅在转染后 16–18 小时的黑暗条件下表达时，未观察到 Src 激酶的背景激活。此外，催化失活突变体 LightR-Src（D388R 突变）不能诱导 Src 底物的磷酸化，表明磷酸化由有活性的 LightR-Src 所介导，而非蓝光照射的非特异性效应所致（图 2B）。鉴于已有文献报道 Src27 激酶在活细胞中存在振荡性活性，我们进一步探究了 LightR-Src 是否可被调控以实现周.......
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讨论
本研究提出了一种用于研究多种信号通路的光遗传学方法，并展示了其在解决不同生物学问题中的广泛应用性。LightR 工具系统具备多项关键优势：（1）对蛋白质活性的变构调控；（2）对活性进行严密的时间控制，且可调节以实现不同的激活与失活动力学；（3）在亚细胞水平上实现活性的空间分辨；（4）信号调控和生物学效应的高度特异性；（5）适用于多种靶蛋白的广泛适用性。值得注意的是，LightR 独特地将所有这些优势整合于单一工具之中，从而实现了重要的技术进步。
将LightR设计为别构开关具有多项优势。LightR能够插入蛋白质中较小的柔性环内并调控其活性，这一特性使其在结构和功能多样的各类蛋白质中均具有广泛的应用灵活性。作为一种别构开关，LightR仅调控目标蛋白的特定结构域，而不影响蛋白的其他结构域。因此，该方法可在不损害蛋白质重要功能（例如与结合伴侣的相互作用或在细胞内的天然定位）的前提下，实现对蛋白活性的特异性调控。双组分光遗传学系统已成功用于调控蛋白质定位、相互作用或其他关键功能，其机制依赖于光控同源或异源二聚化29,.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢 Mark Shaaya 博士在 LightR 酶及其相关实验方案开发中的贡献。pCAG-iCre 由 Wilson Wong 惠赠（Addgene 质粒 #89573），pcDNA3.1 Floxed-STOP mCherry 由 Mositoshi Sato 惠赠（Addgene 质粒 #122963），携带 V600E 突变的 bRaf-Venus 质粒由 John O'Bryan 博士（MUSC）惠赠；ERK2 基因来自 pCEFL-ERK2（由北卡罗来纳大学 Channing Der 实验室惠赠），将其克隆至 mCherry-C1 载体骨架中，获得 mCherry-ERK2 质粒。; pmiRFP670-N1由Vladislav Verkhusha惠赠（Addgene质粒# 79987）。本研究获得美国国立卫生研究院（NIH）基金R33CA258012、R35GM145318和P01HL151327（资助对象：AK）的支持。NL获得了T32 VBST培训基金T32HL144459的进一步资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| #1.5 玻璃盖玻片 25 mm 圆形 | Warner Instruments | 64-0715 | |
| 1.5 mL 离心管 | USA Scientific | cc7682-3394 | |
| 2x Laemmli缓冲液 | 500 mL：5.18 g Tris-HCl，131.5 mL 甘油，52.5 mL 20% SDS，0.5 g 溴酚蓝，终末 pH 6.8 | ||
| 4-20% Mini-PROTEAN TGX 预制胶 | 伯乐（Biorad） | 4561096 | |
| 5x Phusion Plus 缓冲液 | 赛默飞世尔科技 | F538L | |
| 60 LED 显微镜环形灯 | Boli Optics | ML46241324 | 蓝色LED，60 mm直径，5 W |
| 琼脂糖 | GoldBiotech | A-201 | |
| 抗 Erk 1/2 抗体 | 细胞信号传导 | 9102 | |
| 抗GAPDH抗体 | invitrogen | AM4300 | |
| 抗GFP | Clontech | 632380 | |
| 抗mCherry抗体 | invitrogen | M11217 | |
| 抗MEK | 细胞信号传导 | 9122 | |
| 抗p130Cas | BD 生物科学 | 610271 | |
| 抗paxillin | 细胞信号传导 | 2542 | |
| 抗磷酸化 Erk 1/2 T202/Y204 抗体 | 细胞信号传导 | 9101 | |
| 抗磷酸化-pY249 p130Cas | 细胞信号传导 | 4014 | |
| 抗磷酸化-Y118 脱节蛋白 | 细胞信号转导 | 2541 | |
| 抗磷酸化S217/221 MEK | 细胞信号传导 | 9121 | |
| Arduino 兼容电源 | 企业计算机 | LJH -186 | |
| Arduino Uno Rev3 | Arduino | A000066 | |
| Attofluor 细胞培养皿 | invitrogen | A7816 | |
| 标准胎牛血清（FBS） | 健美生物制品 | 100-106 | 热灭活三重 0.1 µm 经无菌过滤 |
| bRaf-V600E-Venus | 约翰·奥布莱恩博士（Dr. John O'Bryan）惠赠，南卡罗来纳医科大学（MUSC） | ||
| BSA | GoldBiotech | A-420 | |
| 羧苄青霉素（二钠） | Gold Biotechnology | C-103-25 | |
| CellMask 深红色细胞膜染料 | invitrogen | c10046 | |
| 菌落筛选主混合液 | 杰内西 | 42-138 | |
| DH5α 感受态细胞 | NEB | C2987H | |
| DMEM | 康宁 | 15-013-CV | |
| DNA Ladder | GoldBio | D010-500 | |
| dNTPs | NEB | N04475 | |
| DpnI 酶 | NEB | R01765 | |
| DTT | GoldBio | DTT10 | DL-二硫苏糖醇，克莱兰德试剂 |
| EGTA | 阿克罗斯 | 409910250 | |
| FastLightR-bRaf-mVenus | Addgene | #162155 | |
| 牛血浆来源的纤连蛋白 | Sigma | F1141 | |
| FuGENE(R) 6 转染试剂 | Promega | E2692 | 转染试剂 |
| Gel Green 核酸染料 | GoldBio | G-740-500 | |
| 6× 紫色上样缓冲液 | NEB | B7024A | |
| GeneJET 胶回收试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | K0692 | 凝胶回收试剂盒 |
| GeneJET 质粒小提试剂盒 | 赛默飞世尔科技 | K0502 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | GlutaMAX-l（100倍浓度）100 mL |
| HEK 293T细胞 | ATCC | CRL-11268 | |
| HeLa 细胞 | ATCC | CRM-CCL-2 | |
| HEPES | Fischer | BP310-500 | |
| Iot 继电器 | 数字记录仪 | DLI 705020645490 | 用于照明的交直流控制继电器 |
| 卡那霉素单硫酸盐 | Gold Biotechnology | K-120-25 | |
| KCl | Sigma | P-4504 | |
| L-15 1x | 康宁 | 10-045-CV | |
| LB 琼脂 | Fisher | BP1425-2 | |
| LED植物生长灯系统 | HQRP | 884667106091218 | LED面板灯系统 |
| LightR-bRaf-mVenus | Addgene | #162154 | |
| LightR-iCre-miRFP670 | Addgene | #162158 | |
| MATLAB | Mathworks | R2024a | 运行 CellGEO 脚本的软件 |
| 美塔莫夫 | Molecular Devices | 成像分析软件 | |
| MgCl₂2 | Fisher Chemical | M33-500 | |
| 矿物油 | Sigma | M5310 | |
| MiniPrep 试剂盒 | 基因选择 | 96-308 | |
| Mini-PROTEAN TGX 预制胶，12 孔 | Bio-Rad | 4561085 | |
| 分子生物学级水 | 康宁 | 46-000-CV | |
| 多波段多色镜 | 89903BS | Chroma | |
| NaCl | Fisher Chemical | S271-3 | |
| 不含钙和镁的 PBS | 康宁 | 21-031-CV | |
| pCAG-iCre | Addgene | #89573 | |
| pcDNA3.1_Floxed-STOP mCherry | Addgene | #122963 | |
| pCEFL-ERK2 | 来自北卡罗来纳大学Channing Der博士实验室的馈赠 | ||
| PCR管 | labForce | 1149Z65 | 0.2 mL 8联管及盖子，刚性条带，单独连接的圆顶盖 |
| Phusion Plus DNA聚合酶 | 赛默飞世尔科技 | F630S | |
| pmiRFP670-N1 | Addgene | #79987 | |
| Polygon 400 图案化照明器 | Mightex | DSI-G-00C | |
| 引物 | IDT | ||
| PVDF 膜 | 伯乐（BioRad） | 1620219 | 免疫印迹 PVDF 膜/滤纸夹心结构 |
| 0.25% 胰蛋白酶，2.21 mM EDTA，1x，无钠 | 康宁 | 25-053-CI | |
| Tris-乙酸盐-EDTA (TAE) 50倍浓缩液 | Fischer | BP1332-1 | 用于电泳 |
| UPlanSApo 40倍物镜 | Olympus | 1-U2B828 | |
| USB TTL 盒 | 国家仪器公司 | 6501 | 用于TTL接口 |
| β-巯基乙醇 | Fisher Chemical | O3446I-100 |
参考文献
- Guntas, G., et al. Engineering an improved light-induced dimer (iLID) for controlling the localization and activity of signaling proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (1), 112-117 (2015).
- Kawano, F., Okazaki, R., Yazawa, M., Sato, M.
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重印与许可
