单分子FRET成像观察动力蛋白样GTP酶Atlastin的构象动力学

摘要

动力蛋白超家族蛋白的功能依赖于与GTP水解相偶联的构象变化。本文描述了一种利用单分子FRET（smFRET）技术监测类动力蛋白GTP酶atlastin在不同核苷酸负载状态下构象动态变化的系统。

摘要

在内质网（ER）内的同型膜融合过程中，动力蛋白样蛋白 atlastin（ATL）的三螺旋中间结构域（3HB）相对于GTP酶结构域的刚体旋转是一个关键驱动因素。该过程的异常与遗传性痉挛性截瘫（HSP）——一种神经退行性疾病——密切相关。结构与生化研究表明，ATL的构象变化与GTP水解相关，但在GTP水解循环过程中实时观察这些构象动态仍具挑战性。为了更深入理解ATL功能背后的机械机制，研究采用了单分子Förster共振能量转移（smFRET）技术。通过三种特定策略，将人源ATL1的N端胞质区（ATL1cyto）固定于链霉亲和素包被的微流控腔室中，从而实现分子内和分子间smFRET成像。该方法可精确监测蛋白质在不同核苷酸加载状态下的构象变化，直接揭示单个分子的行为特征。此方法亦可用于研究其他力化学蛋白。

引言

在真核细胞中，动力蛋白超家族蛋白介导生物膜的重塑过程，包括膜管形成、断裂和融合^1,2,3。这些蛋白的突变可导致多种人类疾病，例如神经退行性疾病。动力蛋白超家族成员通常包含一个GTP酶结构域、一个由螺旋束组成的中间结构域、一个膜结合基序以及一个GTP酶效应结构域（GED）。其中一种类似动力蛋白的GTP酶是atlastin（ATL），它可催化内质网（ER）的同型膜融合，从而形成网状结构^{4,5,6,7,8,9,10}。哺乳动物中有三种ATL蛋白（ATL1-3）。ATL分子包含一个N端胞质区（ATL_cyto），其中包括一个GTP酶结构域和一个三螺旋中间结构域（3HB），其后为两个跨膜区域，但缺乏典型的GED结构域。此外，ATL含有一个C端尾部，该区域在膜融合过程中发挥关键作用....

方案

本研究中所用试剂与设备的详细信息见材料表。

1. 蛋白质固定化反应室用修饰载玻片的制备

1. 准备
   1. 准备 50 mL 的piranha溶液（由浓硫酸和过氧化氢按3:1的比例组成），将过氧化氢缓慢加入浓硫酸中，以防止温度过高。将其小心放置于通风橱中。
   2. 制备乙醇钠溶液。将 2 g NaOH 溶解于 15 mL ddH₂O 中。₂加入35 mL无水乙醇，充分混匀，室温放置。
   3. 制备高盐溶液（0.1 M NaHCO₃）₃ 和 0.6 M 的 K₂SO₄）。完全溶解后，分装为每管500 µL，于-20 °C保存。
   4. 将SVA-mPEG和SVA-mPEG-biotin分别分装为每管约30 mg和每管3 mg，于-20 °C保存。
   5. 定制显微镜载玻片（75 mm × 26 mm × 1 mm），每片打6对直径为1.2 mm的孔。
2. 清洁盖玻片表面
   1. 使用镊子夹取八片盖玻片并放入染色缸中。加入丙酮（约 50 mL）浸没盖玻片，将染色缸置于超声波清洗器中处理 30 分钟，然后用 ddH₂O 将盖玻片冲洗三次。₂O.
   ....

结果

单分子FRET实验在全内反射荧光显微镜（TIRF）上进行，每30 ms采集一次荧光染料的荧光强度。图2A-C展示了在无或含有不同核苷酸条件下，LD555（供体）和/或LD655（受体）标记的ATL1_cyto分子的代表性图像。记录了单个颗粒上两种荧光染料的荧光强度，并提取出数百条表现出典型单分子特征的FRET轨迹。代表性轨迹如图2D-F所示。在无核苷酸或存在GDP的条件下，ATL1_cyto单体表现出具有四个FRET态的动态FRET轨迹（图2D），表明ATL1的GTP酶结构域与3HB区域在这些状态下具有柔性；但GDP结合的ATL1_cyto倾向于闭合构象，而GDP释放会改变ATL1_cyto的构象偏好，使其转向开放构象（

讨论

FRET 技术基于两种荧光染料（供体和受体）之间的能量转移。当这两种染料彼此靠近时（通常为 1-10 nm），被激发的供体会将其能量转移给受体，导致供体荧光强度降低，同时受体荧光强度增加。

在单分子FRET实验中，分子被稀释至极低浓度并固定在载玻片上，通过全内反射荧光显微镜（TIRF）检测单个分子的FRET信号。供体和受体荧光染料共价连接至分子的特定位置，当蛋白质发生构象变化或与其他分子相互作用时，FRET效率与荧光团之间的距离呈负相关。因此，通过测量受体与供体荧光强度的比值，可获得有关单个生物大分子构象动态、折叠动力学以及聚合物形成与解离的重要信息。

在当前的实验中，利用蛋白质中的半胱氨酸通过马来酰亚胺残基标记荧光团。然而，使用该方法标记蛋白质需要将蛋白质中的半胱氨酸残基突变为其他氨基酸（例如丙氨酸），并将需要标记的氨基酸突变为半胱氨酸。引入多个突变可能导致蛋白质结构和功能的改变。因此，在进行单分子实验之前，有必要分析多个突变对蛋白质的影响。除了马来酰亚胺与半胱氨酸的反应外，还可以通过将非天然氨基酸引入目标蛋白质，并利用点击.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10 K 离心过滤器	Amicon	UFC901096
3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）	Sigma-Aldrich	440140
45 Ti 转子
532 nm 激光器	Olympus
640 nm 激光器	Olympus
7 K 分子量截留值旋转脱盐柱	赛默飞世尔科技	89882
三磷酸腺苷二钠盐（ATP）	罗氏	11140965001
苯甲酸	Sigma-Aldrich	242381
Biotin-PEG-SVA-5000	莱桑生物	170-124
生物素标记的抗His抗体	Bioss 抗体	bs-0287R-bio
d-生物素	Sigma-Aldrich	B4501
无EDTA蛋白酶抑制剂混合物	罗氏	11873580001
EMCCD相机	安道尔	IX897
鸟苷-5′-三磷酸′二磷酸鸟苷钠盐（GDP）	Sigma-Aldrich	G7127
鸟苷5'-O-[γ-硫代]三磷酸（GTPγS	罗氏	10220647001
高数值孔径油浸物镜	尼康		尼康，100倍，数值孔径1.49，油浸
ImageJ	美国国立卫生研究院		https://imagej.net/ij/
异丙基-Β-D-硫代半乳糖苷	Sigma-Aldrich	I5502
LD555-MAL	Lumidyne	4
LD655-MAL	Lumidyne	10
L-谷氨酸钾	Sigma-Aldrich	G1501
四水合乙酸镁	Sigma-Aldrich	M0631
Matlab	The MathWorks，美国马萨诸塞州纳蒂克		https://www.mathworks.com/
显微镜盖玻片	Fisherbrand	18834	(24 mm × 60 mm
显微镜载玻片			定制，（75 mm × 26 mm × 1 毫米）带6对直径为1.2 毫米的通孔
mPEG-SVA-5000	莱桑生物	170-106
Ni Sepharose 6 Fast Flow	Cytiva	17531802
起源	Origin 软件		https://www.originlab.com/
聚苯乙烯颗粒	QDSphere	AG1265
原儿茶酸3,4-双加氧酶	Sigma-Aldrich	P8279
链霉亲和素	Sangon Biotech	A610492
Superdex 200 Increase (10/300 GL)	Cytiva	28990944
全内反射荧光显微镜	尼康	Ti2
盐酸三(2-羧乙基)膦 (TCEP)	赛默飞世尔科技	75259