方法文章

用于观察动力蛋白样 GTP 酶弹性蛋白构象动力学的单分子 FRET 成像

DOI：

10.3791/67263

⸱

2025年1月24日

 ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Medicinal Chemical Biology, College of Life Sciences, Frontiers Science Center for Cell Responses, Nankai University, 2National Laboratory for Condensed Matter Physics, Institute of Physics, Chinese Academy of Sciences, 3University of Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

dynamin 超家族蛋白的功能取决于与 GTP 水解偶联的构象变化。使用单分子 FRET （smFRET） 技术描述了一个系统，用于监测不同核苷酸负载状态下动力蛋白样 GTP 酶弹性蛋白的构象动力学。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

三螺旋中间结构域 （3HB） 相对于动力蛋白样蛋白弹性蛋白 （ATL） 的 GTP 酶结构域的刚体旋转是内质网 （ER） 内同型膜融合的关键驱动因素。这一过程的中断与遗传性痉挛性截瘫 （HSP） 有关，HSP 是一种神经退行性疾病。结构和生化研究表明，ATL 的构象变化与 GTP 水解有关，但在 GTP 水解循环期间实时可视化这些构象动力学仍然具有挑战性。为了更好地了解 ATL 功能背后的机械机制，使用了单分子 Förster 共振能量转移 （smFRET）。采用三种特异性策略将人 ATL1 （ATL1cyto） 的 N 末端胞质区域固定在链霉亲和素包被的微流控室中，促进分子内和分子间 smFRET 成像的应用。这允许精确监测各种核苷酸负载状态下的蛋白质构象，从而直接了解单个分子的行为。该方法也可用于研究其他机械化学蛋白质。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在真核细胞中，动力蛋白超家族蛋白介导生物膜的重塑，包括膜管、裂变和融合 1,2,3。这些蛋白质的突变会导致多种人类疾病，例如神经退行性疾病。动力蛋白超家族的成员通常包含一个 GTP 酶结构域、一个由螺旋束组成的中间结构域、一个膜结合基序和一个 GTP 酶效应结构域 （GED）。一种这种动力蛋白样 GTP 酶是弹性蛋白 （ATL），它催化内质网 （ER） 的同型膜融合以形成网络 4,5,6,7,8,9,10。哺乳动物中有三种 ATL （ATL1-3）。ATL 分子由一个 N 末端胞质区域 （ATLcyto） 组成，包括一个 GTP 酶结构域和一个三螺旋中间结构域 （3HB），然后是两个跨膜区域，但缺乏典型的 GED。或者，ATL 包含一个 C 末端尾部，该尾部在膜融合中起关键作用 11,12,13。

据报道，高效的膜融合依赖于 ATL细胞14、15、16、17、18、19、20 中的 GTP 水解依赖性结构域重排。然而，与利用构象变化产生的折叠能量驱动异型膜融合21 的 SNARE 复合物相比，由 ATL 和其他融合特异性动力蛋白样蛋白介导的同型膜融合过程22 仍然难以捉摸。在不同的核苷酸加载条件下确定了人 ATL1细胞 的三种晶体结构14、15、16、23。在结构中，二聚体中的两个 3HB 指向不同的方向，但仍然缺少解释 ATL细胞 的构象动力学及其 GTP 酶活性如何耦合的综合模型。

在之前的模型中，单体 ATL 分子以 GTP 依赖性方式跨不同膜形成二聚体，以驱动膜融合。本文描述了三种策略，以应用单分子 Förster 共振能量转移 （smFRET） 来直接观察和准确检测单个 ATL1细胞分子的行为。smFRET 是一种强大的技术，广泛用于实时研究单个生物分子的构象动力学和相互作用，例如 GPCR 介导的 β-arrestin 激活24、Snf225 的染色质重塑以及动力蛋白样蛋白 MxA 与 GTP 水解循环偶联的结构域重排26。由于 smFRET 只能有效检测从 ~3 nm 到 ~8 nm 的距离变化，因此需要分子间和分子内 smFRET 实验来全面分析 ATL1细胞在每种核苷酸负载状态下的构象。我们生成了三种 ATL1细胞构建体，其中所有天然半胱氨酸都被丙氨酸取代，K400 （ATL1cyto-K） 或 T51/K400 对 （ATL1cyto-TK） 突变为半胱氨酸进行荧光团标记。将 ATL1细胞二聚体或单体固定在链霉亲和素包被的微流体室（图 1A）中用于分子间或分子内 smFRET 实验的策略如图 1B-D 所示。该方法提供了有关 GTP 水解每个步骤中动力蛋白样蛋白构象动力学的更多详细信息27。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究中使用的试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 蛋白质固定室改良盖玻片的制备

  1. 制备
    1. 通过将过氧化氢缓慢添加到浓硫酸中来制备 50 mL 食人鱼溶液（由浓硫酸和过氧化氢以 3:1 的比例组成），以防止温度过高。小心地将其放入通风橱中。
    2. 制备乙醇钠溶液。将 2 g NaOH 溶解在 15 mL ddH2O 中，加入 35 mL 无水乙醇，并完全混合。在室温下放置。
    3. 制备高盐溶液（0.1 M NaHCO3 和 0.6 M K2SO4）。完全溶解并分装 500 μL/管。储存在 -20 °C。
    4. 将 SVA-mPEG 和 SVA-mPEG-生物素分装成每管约 30 毫克和每管约 3 毫克。储存在 -20 °C。
    5. 定制显微镜载玻片（75 mm × 26 mm × 1 mm），带 6 对直径为 1.2 mm 的孔。
  2. 清洁盖玻片表面
    1. 用镊子拿起八个盖玻片并将它们放入染色罐中。加入丙酮 （~50 mL） 覆盖盖玻片，将染色罐放入超声波清洗机中 30 分钟，然后用 ddH2O 冲洗盖玻片 3 次。
    2. 如步骤 1.2.1 所示，用甲醇清洗盖玻片。
    3. 将食人鱼溶液（步骤1.1.1）加入染色罐中，并在95°C水浴壶中加热2小时。染色罐冷却至室温后，用 ddH2O 冲洗盖玻片至少六次。
    4. 将乙醇钠溶液加入染色罐中，置于超声波清洗器中 15 分钟，然后用 ddH2O 冲洗 3 次。
    5. 将 ddH2O 加入染色罐中以覆盖盖玻片，放入超声波清洁器中 15 分钟，然后用 ddH2O 冲洗 3 次。
  3. 盖玻片表面的氨基硅烷化修饰。
    1. 将盖玻片夹在干净的工作台上的染色罐中，用氮气干燥，然后放入另一个染色罐中（预先干燥）。
    2. 将染色罐在干燥箱中于 120 °C 烘烤 30 分钟，然后在干燥器中冷却至室温。
    3. 向烧杯中加入 47.5 mL 甲醇、2.5 mL 乙酸和 0.5 mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷 （APTES）（预先干燥），混合均匀，加入染色罐中，孵育 10 分钟。
    4. 用 ddH2O 冲洗染色罐中的盖玻片至少 3 次，并超声处理 5 分钟。
    5. 逐个取出盖玻片，用 ddH2O 冲洗，用氮气吹干，放入 10 厘米直径的培养皿中，准备进行 PEG 修饰。
      注意:APTES 改性必须在干燥的环境中进行。
  4. 用 SVA-mPEG-生物素和 SVA-mPEG 修饰盖玻片表面
    注:盖玻片表面的生物素修饰有助于 通过 链霉亲和素保留生物素化蛋白质（或与生物素抗 His 结合的蛋白质）。
    1. 将包装的 SVA-mPEG 和 SVA-mPEG-生物素完全溶解在高盐溶液（1 mg 相当于 10 μL 高盐溶液）中。将 SVA-mPEG-生物素溶液以 1:100 的比例添加到 SVA-mPEG 溶液中。
      注:使用涡旋摇动溶液，以确保 SVA-mPEG 或 SVA-mPEG-生物素完全溶解。使用前应制备 SVA-mPEG 或 SVA-mPEG-生物素水溶液。
    2. 将准备好的混合溶液滴在盖玻片上，然后用另一张盖玻片盖住。这个过程应该可以防止气泡的产生。将盖玻片在适当的湿度下充分孵育 2 小时以上或过夜。
    3. 修改完成后分离盖玻片，用 ddH2O 冲洗，然后用氮气吹干。标记未用 SVA-mPEG 和 SVA-mPEG-生物素修饰的盖玻片表面。
    4. 小心地将改良的盖玻片放入 50 mL 微量离心管中。吸尘后储存在 -20 °C。
      注意:修改后的盖玻片可以在真空下储存 1 个月。

2. 制备用于蛋白质固定室的显微镜载玻片

  1. 按照步骤 1.2 中的盖玻片所述清洗显微镜载玻片。
  2. 用氮气吹干显微镜载玻片，然后将其放入 50 mL 微量离心管中。
  3. 按照步骤 1.4.4 中的说明储存显微镜载玻片。

3. 蛋白表达和纯化

  1. 制备
    1. 质粒:将感兴趣的弹性蛋白家族成员或感兴趣的致病突变克隆到细菌表达载体中，例如 pET-28a，并添加 Avitag27。通过定点诱变（例如，T51C 和 K400C27）在相关位置引入半胱氨酸。
    2. 准备以下缓冲液。
      1. Luria-Bertani （LB） 培养基:将 10 g 胰蛋白胨、5 g 酵母提取物和 10 g 氯化钠与 1 L ddH2O. 高压灭菌器在 121°C 下混合 20 分钟。
      2. 裂解缓冲液:混合 25 mM HEPES （pH 7.4）、150 mM KCl、5 mM MgCl2、1x 完全不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合物、10 mM 咪唑和 0.5 mM TCEP。储存在 4 °C。
      3. 洗涤缓冲液:混合 25 mM HEPES （pH 7.4）、150 mM KCl、5 mM MgCl2、30 mM 咪唑和 0.5 mM 三（2-羧乙基）盐酸膦 （TCEP）。储存在 4 °C。
      4. 洗脱缓冲液:混合 25 mM HEPES （pH 7.4）、150 mM KCl、5 mM MgCl2、150 mM 咪唑和 0.5 mM TCEP。储存在 4 °C。
      5. 纯化缓冲液:25 mM HEPES （pH 7.4）、150 mM KCl、5 mM MgCl2、0.5 mM TCEP。储存在 4 °C。
  2. 蛋白纯化
    1. 使用细菌转化热休克方法将质粒27 转移到 Rosetta （DE3） （Biomed） 大肠杆菌 细胞中。将转移的细胞悬浮在添加终浓度为 50 μg/μL 卡那霉素的 LB 培养基中。
      1. 在 37 °C 下培养，直到培养基在 600 nm 处的吸光度为 0.6-0.8。加入终浓度为 50 μM 的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 （IPTG），以在 16 °C 下诱导蛋白质表达 20-24 小时。
        注:可以通过测量 600 nm 处细胞生长培养物的光密度（吸光度）来监测细菌或其他微生物细胞培养物的生长速率。
    2. 通过在室温下以 4000 × g 离心 20 分钟来收获细胞。丢弃上清液。
    3. 用 30 mL 裂解缓冲液重悬细胞沉淀。使用高压细胞破碎机将细胞破碎 3 次。
    4. 使用超速离心机转子在 4 °C 下以 2,00,000 × g 离心 1 小时，澄清裂解物。
    5. 使用 Ni-NTA 柱分离蛋白质。用洗涤缓冲液洗涤 Ni-NTA 柱 5 倍柱体积。用洗脱缓冲液洗脱蛋白质 1 倍柱体积。收集洗脱液并使用离心过滤器浓缩至 ~ 500 μL。
    6. 此外，通过尺寸排阻色谱法纯化蛋白质27.收集洗脱液（每管 500 μL）。
    7. 通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE） 确定的分子量确认靶蛋白27。收集靶蛋白以进行进一步修饰。

4. 蛋白质生物素化

  1. 制备
    1. 准备以下储备溶液。
      1. 将乙酸镁四水合物 （MgOAc·4H2O） 溶解在 25 mM 浓度为 100 mM （10× 的 HEPES 缓冲液 （pH 7.7） 中。每管分装 100 μL 并储存在 -20 °C。
      2. 将 5-三磷酸腺苷二钠盐 （ATP） 溶于 ddH2O 中，浓度为 100 mM （10×）。使用 NaOH 将 pH 值调节至 7.4。每管分装 100 μL 并储存在 -80 °C。
      3. 将 d-生物素溶解在 ddH2O 中，浓度为 500 μM。每管分装 100 μL 并储存在 -20 °C。
      4. 将链霉亲和素溶解在 ddH2O 中，浓度为 1 mg/mL。每管分装 20 μL 并储存在 -20 °C。
    2. 蛋白质生物素化缓冲液:添加 25 mM HEPES （pH 7.7）、200 mM L-谷氨酸钾和 0.5 mM TCEP。储存在 4 °C。
    3. 纯化 BirA 生物素连接酶并储存在 -80 °C。
  2. 蛋白质生物素化
    1. 将蛋白质缓冲液更改为蛋白质生物素化缓冲液。对于生物素化，混合 100 μL 100 mM ATP、100 μL 100 mM MgOAc、100 μL 500 μM d-生物素、10 μL 100 μM BirA 生物素连接酶、50 μM 蛋白质至最终体积为 1 mL，并在 4 °C 下孵育过夜。
    2. 使用 10 K MWCO 离心过滤器去除游离的 d-生物素。
    3. 将 20 μL 生物素化蛋白与 20 μL 15 μM 链霉亲和素在冰上孵育 20 分钟。通过 SDS-PAGE27 检测蛋白质生物素化的效率。

5. 蛋白质荧光团标记

  1. 制备
    1. 将荧光团 LD555（供体）和 LD655（受体）溶解在二甲基亚砜 （DMSO） 中，至终浓度为 5 mM。储存在 -20 °C。
    2. 准备标记缓冲液:混合 25 mM 的 HEPES （pH 7.4）、150 mM 的 KCl 和 5 mM 的 MgCl2。储存在 4 °C。
    3. 将蛋白质缓冲液更改为标记缓冲液。
  2. 荧光基团标记
    1. 对于分子内 smFRET 测定，将 ATL1细胞-TK 与 LD555 和 LD655 以 1:1.2:1.2 的比例混合，最终体积为 100 μL（荧光团的总体积不应超过 1 μL），并在 4 °C 下孵育 5 小时。
    2. 对于分子间smFRET实验，将ATL1cyto-K 或ATL1cyto-T 与LD555以1:1.2的比例孵育，同时将生物素化的ATL1cyto-K 与LD655以1:1.2的比例孵育，在4°C下孵育5小时（与5.2.1中的孵育体积相同）。
      注:蛋白质和染料的共孵育允许灵活地标记 LD555（供体）和 LD655（受体）的位置。LD555 被标记为 T51C 或 K400C 的事实不会影响 FRET 实验的结果。提供了在 T51C 位点标记的供体的示意图（图 1C、D）。
    3. 使用 7 K MWCO 离心脱盐柱去除多余的游离荧光团27。
    4. 将 TCEP 添加到终浓度为 0.5 mM 的荧光团标记的蛋白质中。
    5. 使用分光光度计检测蛋白质的标记效率。测量 280 nm 处的蛋白质吸光度、555 nm 处的 LD555 吸光度和 655 nm 处的 LD555 吸光度，并分别使用它们的消光系数计算摩尔浓度。蛋白质标记效率 = （荧光染料的摩尔浓度/蛋白质的摩尔浓度） x 100%。

6. 单分子 FRET 成像

  1. 制备
    1. 准备孵育缓冲液:混合 25 mM HEPES （pH 7.4）、150 mM KCl 和 5 mM MgCl2。储存在 4 °C。
    2. 制备 1 mg/mL 链霉亲和素（溶于 ddH2O）和 1 mg/mL 生物素化抗 His 抗体，用于固定蛋白质。
    3. 准备 25 mM 苯甲酸（pH 7.4;如7.1.1所述溶于缓冲液中）和 100 mM 原儿茶酸 3,4-双加氧酶 （PCD）（溶于 40% 甘油溶液中），以尽量减少 smFRET 实验期间的光漂白。
    4. 制备 100 mM 鸟苷 5'-二磷酸钠盐 （GDP）、鸟苷 5'-O-[γ-硫代]三磷酸 （GTPγS） 和溶解在 ddH2O 中的 AlCl3 储备溶液。制备 1 M 溶解在 ddH2O 中的 NaF 储备溶液。
    5. 取出真空保存的盖玻片和显微镜载玻片，在干净的工作台上用定制的双面胶带小心地将它们粘在一起。安装软管和尖端以形成具有六个通道的微流体室27。
      注意:请勿将修改后的盖玻片长时间暴露在空气中。在开始 smFRET 实验之前准备微流体室27 。
  2. 映射校正
    注意:在实验过程中，将分别从供体和受体通道收集荧光信号。由于使用显微镜，供体和受体通道的监测区域可能会有轻微的偏差。为了减少监测区域的偏差，必须在开始实验前进行面分布验证校准。
    1. 彻底混合 10% 聚苯乙烯颗粒（直径 3 μm），向显微镜载玻片中加入 10 μL 颗粒（未改性），并用盖玻片（未改性）覆盖。
    2. 选择具有尽可能多的聚苯乙烯颗粒的视野。使用全内反射荧光 （TIRF） 显微镜在明场下捕获视频。
      注:高数值孔径油浸物镜 （100x） 用于高分辨率成像。对于 smFRET 实验，使用 EMCCD 相机以 30 ms 的帧间隔捕获信号。
    3. 使用自定义脚本对齐供体通道和受体通道中同一聚苯乙烯粒子的中心位置，并将映射文件另存为 txt 文件。本研究中使用的自定义 MATLAB 代码可在 https://github.com/yangchenguang-1994/HMM-FRET） 中找到。
  3. 将蛋白质固定在腔室中
    1. 对于分子间 smFRET 实验，将 LD555 标记的 ATL1细胞-K 或 ATL1细胞-T 和 LD655 标记的 ATL1细胞-K-生物素以 1:1 的比例与终浓度为 1 mM 的 GTPγS 或 GDP/AlF4- 混合，并在冰上孵育 1 小时以二聚化蛋白质。
    2. 对于 ATL1cyto-T 和 ATL1cyto-K 分子间 smFRET 实验，将 LD555 标记的 ATL1cyto-T 和 LD655 标记的 ATL1cyto-K-生物素以 1:1 的比例混合，终浓度为 1 mM 的 GTPγS 或 GDP/AlF4-，并在冰上孵育 1 小时以获得二聚化蛋白。
    3. 对于分子内 smFRET 测定，在 GDP 条件下进行 smFRET 实验之前，将 LD555 和 LD655 标记的 ATL1cyto-TK 与 1 mM GDP 在冰上孵育 1 小时。
    4. 对于分子间 smFRET 实验，将 10 μg/mL 链霉亲和素（用 200 μL 孵育缓冲液稀释）孵育 10 分钟以固定蛋白质。对于分子内 smFRET 检测，加入 10 μg/mL 生物素化抗 His 抗体（用 200 μL 孵育缓冲液稀释）并孵育 10 分钟以固定蛋白质。在添加每种溶液之前，用孵育缓冲液冲洗通道一次。
    5. 在 200 μL 孵育缓冲液中将 ATL1 二聚体稀释至 ~0.3 nM 或将单体稀释至 ~1 nM，并孵育 10 分钟以将蛋白质固定在通道中。用孵育缓冲液冲洗通道两次。向通道中加入苯甲酸和 PCD，终浓度为 2.5 mM（用 200 μL 缓冲液稀释）。
      注:为了模拟 GTP 水解过程中 ATL1细胞分子的不同阶段，在将蛋白质固定在通道中后，在每个步骤中将终浓度为 1 mM 的核苷酸（GDP、GTPγS 和 GDP/AlF4-）添加到缓冲液中。GTPγS 添加模拟 GTP 结合，GDP/AlF4 添加模拟 GTP 水解，GDP 添加模拟 Pi 释放，载脂脂蛋白代表 GDP 释放。
  4. smFRET 成像
    1. 调整焦平面。使用粗调和微调调焦旋钮，调整焦平面，使样品清晰聚焦。在这里，使用自动对焦系统来实现最佳对焦。
    2. 设置 Excitation Source。使用 532 nm 激光器作为激发光源。将激光功率调整到合适的水平以激发荧光团。这里使用了 20-40 mW 的激光功率。
    3. 将 EMCCD 相机连接到显微镜。将相机设置为以 30 毫秒的帧间隔进行录制。确保将相机设置为以 16 位模式捕获图像以获取高分辨率数据。
    4. 录制影片，确保在整个采集过程中焦点保持稳定。在记录荧光信号时，尽可能延长 532nm 激光照射时间，直到大部分荧光分子被淬灭。
    5. 将录制的动画保存为 16 位 TIFF 格式以供进一步分析。

7. 数据采集和分析

  1. 在从录制的电影中提取FRET轨迹之前，先加载映射txt文件进行校正。选择 FRET 轨迹并以 txt 格式保存每个 FRET 轨迹数据以供进一步分析。
  2. 从 txt 文件中提取数据，并使用 Matlab2022a 中的自制脚本计算 FRET 值。自定义 MATLAB 代码可在 https://github.com/yangchenguang-1994/HMM-FRET 获取。
    注意:FRET 值使用公式 ILD655/（γILD555+ILD655） 计算。ILD555 和 ILD655 分别代表 LD555 和 LD655 荧光强度。γ 是通过公式 γ = FA/FD 获得的参数。FA 表示受体强度的递减，FD 是供体强度的增加。
  3. 在 Origin 2022 中通过 GaussAmp 拟合 smFRET 数据，得到分布直方图。
    注:对于具有多种 FRET 状态的数据（分子间 smFRET 中 GTPγS 条件下的数据或 GDP 或 Apo 条件下的分子内 smFRET 数据），可以使用多峰拟合。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在 TIRF 显微镜上通过每 30 ms 捕获荧光团的荧光强度进行 smFRET 实验。在不存在或存在不同核苷酸的情况下，LD555（供体）和/或 LD655（受体）标记的 ATL1细胞分子的代表性图像如图 2A-C 所示。记录了两个荧光团在单个颗粒上的荧光强度，并提取了数百个表现出典型单分子特征的 FRET 轨迹。代表性迹线如图 2D-F 所示。在不存在或存在 GDP 的情况下，ATL1细胞单体显示出具有四种 FRET 状态的动态 FRET 轨迹（图 2D），表明 ATL1 的 GTP 酶结构域-3HB 区域在这些状态下是灵活的，但 GDP 结合的 ATL1细胞更喜欢接近的构象，而 GDP 释放改变了 ATL1细胞对开放构象的构象偏好（<...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FRET 技术基于两种荧光染料（供体和受体）之间的能量转移。在它们彼此接近（通常为 1-10 nm）的情况下，激发的供体将其能量传递给受体，导致供体荧光强度降低，受体荧光强度增加。

在 smFRET 实验中，分子被稀释至非常低的浓度并固定在载玻片上，并通过 TIRF 显微镜检测单个分子的 FRET 信号。供体和受体荧光染料共价连接到分子中的特定位置，当蛋白质发生构象变化或与其他分子相互作用时，FRET 效率与荧光团之间的距离呈反相关。因此，可以测量受体和供体荧光强度的比率，以提供有关单个生物大分子的构象动力学、折叠动力学以及聚合物形成和解离的重要信息。

在目前的测定中，蛋白质中的半胱氨酸用于标记带有马来酰亚胺残基的荧光团。然而，使用这种方法标记蛋白质需要将蛋白质中的半胱氨酸残基突变为其他氨基酸（例如丙氨酸），并将需要标记的氨基酸突变为半胱氨酸。引入多个突变可能导致蛋白质结构和功能发生变化。因此，在进行单分子实验之前，有必要分析多个突变对蛋白质的影响。除了马来酰...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者声明没有利益冲突。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

X.B. 得到了国家自然科学基金 （32371287）、中央高校基本科研业务费 （63223043 和 63233053） 和南开大学人才培养工程 （035-BB042112） 的支持。Y.L. 得到了中国国家自然科学基金 （12022409 和 T2221001） 和中国科学院前沿科学重点研究计划 （ZDBS-LY-SLH015） 的支持。L.M. 得到了中国国家自然科学基金 （32271274 和 31770812） 的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10 K 离心过滤器AmiconUFC901096
3-氨基丙基三乙氧基硅烷 （APTES） Sigma-Aldrich440140
45 Ti 转子
532 nm 激光器奥林巴斯
640 nm 激光器奥林巴斯
7 K MWCO 离心脱盐色谱柱Thermo Scientific89882
5-三磷酸腺苷二钠盐 （ATP）罗氏11140965001
苯甲酸Sigma-Aldrich242381
生物素-PEG-SVA-5000Laysan Bio170-124
生物素化抗 His 抗体Bioss 抗体bs-0287R-bio
d-生物素Sigma-AldrichB4501
不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合物罗氏11873580001
EMCCD 相机AndorIX897
鸟苷 5′-二磷酸钠盐 （GDP）Sigma-Aldrich G7127
鸟苷 5'-O-[γ-硫代]三磷酸盐 （GTP&γ;S）罗氏10220647001
高数值孔径油浸物尼尼康，100x，N.A. 1.49，油浸
ImageJNIHhttps://imagej.net/ij/
异丙基-β;-D-硫代半乳糖苷Sigma-AldrichI5502
LD555-MALLumidyne4
LD655-MALLumidyne10
L-谷氨酸钾Sigma-AldrichG1501
乙酸镁四水合Sigma-AldrichM0631
MatlabMathWorks，马萨诸塞州https://www.mathworks.com/
显微镜盖玻片Fisherbrand18834 （24 毫米及时间;60 mm）
显微镜载玻片定制，（75 mm & times; 26 mm × 1 mm），带 6 对直径为 1.2 mm 的通孔
mPEG-SVA-5000Laysan Bio170-106
Ni Sepharose 6 FF FlowCytiva17531802
Origin Origin软件https://www.originlab.com/
聚苯乙烯颗粒QDSphereAG1265
原儿茶酸 3,4-双加氧酶Sigma-AldrichP8279
链霉亲和素Sangon BiotechA610492
Superdex 200 Increase （10/300 GL）Cytiva28990944
TIRF 显微镜康Ti2
三（2-羧乙基）盐酸膦 （TCEP）Thermo75259
镜 康物 内蒂克 尼

参考文献

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Atlastin GTP GTP FRET FRET EMCCD

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