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方法文章

单分子FRET成像观察动力蛋白样GTP酶Atlastin的构象动力学

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DOI：

10.3791/67263

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2025年1月24日

 ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Medicinal Chemical Biology, College of Life Sciences, Frontiers Science Center for Cell Responses, Nankai University, 2National Laboratory for Condensed Matter Physics, Institute of Physics, Chinese Academy of Sciences, 3University of Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

动力蛋白超家族蛋白的功能依赖于与GTP水解相偶联的构象变化。本文描述了一种利用单分子FRET（smFRET）技术监测类动力蛋白GTP酶atlastin在不同核苷酸负载状态下构象动态变化的系统。

摘要

在内质网（ER）内的同型膜融合过程中，动力蛋白样蛋白 atlastin（ATL）的三螺旋中间结构域（3HB）相对于GTP酶结构域的刚体旋转是一个关键驱动因素。该过程的异常与遗传性痉挛性截瘫（HSP）——一种神经退行性疾病——密切相关。结构与生化研究表明，ATL的构象变化与GTP水解相关，但在GTP水解循环过程中实时观察这些构象动态仍具挑战性。为了更深入理解ATL功能背后的机械机制，研究采用了单分子Förster共振能量转移（smFRET）技术。通过三种特定策略，将人源ATL1的N端胞质区（ATL1cyto）固定于链霉亲和素包被的微流控腔室中，从而实现分子内和分子间smFRET成像。该方法可精确监测蛋白质在不同核苷酸加载状态下的构象变化，直接揭示单个分子的行为特征。此方法亦可用于研究其他力化学蛋白。

引言

在真核细胞中，动力蛋白超家族蛋白介导生物膜的重塑过程，包括膜管形成、断裂和融合1,2,3。这些蛋白的突变可导致多种人类疾病，例如神经退行性疾病。动力蛋白超家族成员通常包含一个GTP酶结构域、一个由螺旋束组成的中间结构域、一个膜结合基序以及一个GTP酶效应结构域（GED）。其中一种类似动力蛋白的GTP酶是atlastin（ATL），它可催化内质网（ER）的同型膜融合，从而形成网状结构4,5,6,7,8,9,10。哺乳动物中有三种ATL蛋白（ATL1-3）。ATL分子包含一个N端胞质区（ATLcyto），其中包括一个GTP酶结构域和一个三螺旋中间结构域（3HB），其后为两个跨膜区域，但缺乏典型的GED结构域。此外，ATL含有一个C端尾部，该区域在膜融合过程中发挥关键作用11,12,13。

已有研究报道，高效的膜融合依赖于ATLcyto中由GTP水解驱动的结构域重排14,15,16,17,18,19,20。然而，与利用构象变化产生的折叠能来驱动异型膜融合的SNARE复合物相比21，由ATL及其他融合特异性的类动力蛋白dynamin-like蛋白所介导的同型膜融合过程仍不明确22。目前已解析出三种在不同核苷酸结合状态下的人源ATL1cyto晶体结构14,15,16,23。在这些结构中，二聚体内的两个3HB结构域指向不同方向，但目前仍缺乏一个完整的模型来阐明ATLcyto的构象动力学与其GTP酶活性之间的偶联机制。

在先前的模型中，单体ATL分子以GTP依赖的方式跨不同膜形成二聚体，从而驱动膜融合。本文描述了三种策略，应用单分子Förster共振能量转移（smFRET）技术直接观察并准确检测单个ATL1cyto分子的行为。smFRET是一种强大的技术，广泛用于实时研究单个生物大分子的构象动态和相互作用，例如GPCR介导的β-arrestin激活24、Snf2介导的染色质重塑25，以及与GTP水解循环偶联的dynamin样蛋白MxA的结构域重排26。由于smFRET仅能有效检测约3 nm至约8 nm范围内的距离变化，因此需要同时进行分子间和分子内smFRET实验，以全面分析每种核苷酸结合状态下ATL1cyto的构象。我们构建了三种ATL1cyto突变体，其中所有天然半胱氨酸均被丙氨酸取代，并将K400（ATL1cyto-K）或T51/K400位点（ATL1cyto-TK）突变为半胱氨酸以用于荧光标记。将ATL1cyto二聚体或单体固定于链霉亲和素包被的微流控腔室中以进行分子间或分子内smFRET实验的策略如图1A所示，具体方法见图1B-D。该方法可更详细地揭示dynamin样蛋白在GTP水解各个步骤中的构象动态27。

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方案

本研究中所用试剂与设备的详细信息见材料表。

1. 蛋白质固定化反应室用修饰载玻片的制备

  1. 准备
    1. 准备 50 mL 的piranha溶液（由浓硫酸和过氧化氢按3:1的比例组成），将过氧化氢缓慢加入浓硫酸中，以防止温度过高。将其小心放置于通风橱中。
    2. 制备乙醇钠溶液。将 2 g NaOH 溶解于 15 mL ddH₂O 中。2加入35 mL无水乙醇，充分混匀，室温放置。
    3. 制备高盐溶液（0.1 M NaHCO₃）3 和 0.6 M 的 K2SO4）。完全溶解后，分装为每管500 µL，于-20 °C保存。
    4. 将SVA-mPEG和SVA-mPEG-biotin分别分装为每管约30 mg和每管3 mg，于-20 °C保存。
    5. 定制显微镜载玻片（75 mm × 26 mm × 1 mm），每片打6对直径为1.2 mm的孔。
  2. 清洁盖玻片表面
    1. 使用镊子夹取八片盖玻片并放入染色缸中。加入丙酮（约 50 mL）浸没盖玻片，将染色缸置于超声波清洗器中处理 30 分钟，然后用 ddH₂O 将盖玻片冲洗三次。2O.
    2. 用甲醇清洗盖玻片，步骤同1.2.1。
    3. 将piranha溶液（步骤1.1.1）加入染色缸中，置于95 °C水浴锅中加热2 h。待染色缸冷却至室温后，用ddH₂O至少冲洗盖玻片六次。2O.
    4. 将乙醇钠溶液加入染色缸中，置于超声波清洗器中处理15分钟，然后用ddH₂O冲洗三次。2O.
    5. 加入ddH₂O2将染色缸中的盖玻片用 ddH₂O 浸没，置于超声波清洗器中处理 15 分钟，随后用 ddH₂O 漂洗 3 次。2O.
  3. 盖玻片表面的氨基硅烷化修饰
    1. 在洁净台中将盖玻片夹在染色缸内，用氮气吹干，然后放入另一已预先干燥的染色缸中。
    2. 将染色缸置于干燥烘箱中，在120 °C下烘烤30分钟，然后在干燥器中冷却至室温。
    3. 向已预先干燥的烧杯中加入47.5 mL甲醇、2.5 mL乙酸和0.5 mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES），混匀后转移至染色缸中，孵育10分钟。
    4. 用 ddH₂O 清洗染色缸中的盖玻片2至少重复三次，并超声处理5分钟。
    5. 逐一取出盖玻片，用ddH₂O冲洗2用氮气吹干，然后放入直径10 cm的培养皿中，以备进行PEG修饰。
      注意：APTES 修饰必须在干燥环境中进行。
  4. 使用 SVA-mPEG-Biotin 和 SVA-mPEG 对盖玻片表面进行修饰
    注意：盖玻片表面的生物素修饰有助于保留生物素标记的蛋白质（或结合生物素-抗His的蛋白质） 通过 链霉亲和素
    1. 将包装的 SVA-mPEG 和 SVA-mPEG-Biotin 完全溶解于高盐溶液中（1 mg 对应 10 µL 高盐溶液）。按 1:100 的比例将 SVA-mPEG-Biotin 溶液加入 SVA-mPEG 溶液中。
      注意：使用涡旋振荡器震荡溶液，以确保 SVA-mPEG 或 SVA-mPEG-Biotin 完全溶解。SVA-mPEG 或 SVA-mPEG-Biotin 水溶液应在使用前配制。
    2. 将制备好的混合溶液滴加到盖玻片上，并用另一张盖玻片覆盖，此操作应避免气泡产生。将盖玻片置于适宜湿度环境中孵育超过2小时或过夜。
    3. 修饰完成后分离盖玻片，用ddH₂O冲洗2O，并用氮气吹干。标记未用SVA-mPEG和SVA-mPEG-biotin修饰的盖玻片表面。
    4. 将修饰后的盖玻片小心放入50 mL离心管中。抽真空后于-20 °C保存。
      注意：修饰后的盖玻片可在真空条件下保存1个月。

2. 蛋白质固定化反应室载玻片的制备

  1. 按照步骤 1.2 中所述方法清洗载玻片。
  2. 用氮气吹干载玻片，并将其放入 50 mL 微量离心管中。
  3. 按照步骤 1.4.4 中所述方法储存载玻片。

3. 蛋白质表达与纯化

  1. 准备
    1. 质粒：将感兴趣的 atlastin 家族成员或感兴趣的致病突变克隆至细菌表达载体（例如 pET-28a）中，并添加 Avitag27。通过定点诱变在相应位置引入半胱氨酸（例如 T51C 和 K400C27）。
    2. 配制以下缓冲液。
      1. LB（Luria-Bertani）培养基：将 10 g 胰蛋白胨、5 g 酵母提取物和 10 g 氯化钠溶于 1 L 去离子水（ddH2O）中，121°C 高压灭菌 20 分钟。
      2. 裂解缓冲液：配制含 25 mM HEPES（pH 7.4）、150 mM KCl、5 mM MgCl2、1× 完整无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合物、10 mM 咪唑和 0.5 mM TCEP 的溶液，4 °C 保存。
      3. 洗涤缓冲液：配制含 25 mM HEPES（pH 7.4）、150 mM KCl、5 mM MgCl2、30 mM 咪唑和 0.5 mM 三(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP）的溶液，4 °C 保存。
      4. 洗脱缓冲液：配制含 25 mM HEPES（pH 7.4）、150 mM KCl、5 mM MgCl2、150 mM 咪唑和 0.5 mM TCEP 的溶液，4 °C 保存。
      5. 纯化缓冲液：25 mM HEPES（pH 7.4）、150 mM KCl、5 mM MgCl2、0.5 mM TCEP，4 °C 保存。
  2. 蛋白纯化
    1. 采用细菌转化热激法将质粒27转入 Rosetta (DE3) (Biomed) E. coli 细胞中。将转化后的细胞悬浮于 LB 培养基中，并加入终浓度为 50 µg/µL 的卡那霉素。
      1. 37 °C 培养，直至培养基在 600 nm 处的吸光度达到 0.6–0.8。加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），终浓度为 50 µM，于 16 °C 诱导蛋白表达 20–24 小时。
        注：可通过测定细胞培养物在 600 nm 处的光密度（吸光度）来监测细菌或其他微生物培养物的生长速率。
    2. 室温下以 4000 × g 离心 20 分钟收集细胞，弃去上清液。
    3. 用 30 mL 裂解缓冲液重悬细胞沉淀，使用高压细胞破碎仪破碎细胞三次。
    4. 使用超速离心转子在 4 °C 下以 200,000 × g 离心 1 小时，澄清裂解液。
    5. 使用 Ni-NTA 柱分离蛋白。用洗涤缓冲液洗涤 Ni-NTA 柱 5 个柱体积，再用洗脱缓冲液洗脱蛋白 1 个柱体积。收集洗脱液，并使用离心过滤器浓缩至约 500 µL。
    6. 进一步通过尺寸排阻色谱法27纯化蛋白。每管收集 500 µL 洗脱液。
    7. 通过 SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）测定分子量以确认目标蛋白27。收集目标蛋白用于后续修饰。

4. 蛋白质生物素标记

  1. 准备
    1. 配制以下储存液。
      1. 将四水合乙酸镁（MgOAc·4H2O）溶解于25 mM HEPES缓冲液（pH 7.7）中，配制成100 mM（10×）溶液。每管分装100 µL，于-20 °C保存。
      2. 将腺苷5-三磷酸二钠盐（ATP）溶解于ddH2O中，配制成100 mM（10×）溶液。用NaOH调节pH至7.4。每管分装100 µL，于-80 °C保存。
      3. 将D-生物素（d-biotin）溶解于ddH2O中，配制成500 µM溶液。每管分装100 µL，于-20 °C保存。
      4. 将链霉亲和素（streptavidin）溶解于ddH2O中，配制成1 mg/mL溶液。每管分装20 µL，于-20 °C保存。
    2. 蛋白生物素化缓冲液：加入25 mM HEPES（pH 7.7）、200 mM L-谷氨酸钾和0.5 mM TCEP。4 °C保存。
    3. 纯化BirA生物素连接酶，并于-80 °C保存。
  2. 蛋白生物素化
    1. 将蛋白缓冲液置换为蛋白生物素化缓冲液。进行生物素化反应时，混合以下组分至终体积1 mL：100 µL 100 mM ATP、100 µL 100 mM MgOAc、100 µL 500 µM d-biotin、10 µL 100 µM BirA生物素连接酶和50 µM蛋白，于4 °C孵育过夜。
    2. 使用10 K MWCO离心过滤器去除游离的d-biotin。
    3. 将20 µL生物素化蛋白与20 µL 15 µM链霉亲和素在冰上孵育20分钟。通过SDS-PAGE27检测蛋白生物素化效率。

5. 蛋白质荧光标记

  1. 准备
    1. 将荧光染料 LD555（供体）和 LD655（受体）溶解于二甲基亚砜（DMSO）中，配制成终浓度为 5 mM 的溶液。储存于 -20 °C。
    2. 配制标记缓冲液：将 25 mM HEPES（pH 7.4）、150 mM KCl 和 5 mM MgCl2 混合。储存于 4 °C。
    3. 将蛋白缓冲液置换为标记缓冲液。
  2. 荧光染料标记
    1. 进行分子内单分子 FRET 实验时，按 1:1.2:1.2 的比例将 ATL1cyto-TK 与 LD555 和 LD655 混合，总体积为 100 µL（荧光染料总体积不得超过 1 µL），在 4 °C 下孵育 5 小时。
    2. 进行分子间单分子 FRET 实验时，将 ATL1cyto-K 或 ATL1cyto-T 与 LD555 按 1:1.2 的比例混合孵育，同时将生物素化的 ATL1cyto-K 与 LD655 按 1:1.2 的比例混合孵育，均在 4 °C 下孵育 5 小时（孵育体积与步骤 5.2.1 相同）。
      注意：蛋白与染料共孵育可灵活选择 LD555（供体）和 LD655（受体）的标记位点。LD555 标记在 T51C 或 K400C 位点并不影响 FRET 实验结果。供体标记在 T51C 位点的示意图见（图 1C、D）。
    3. 使用 7 K MWCO 离心脱盐柱去除未结合的游离荧光染料27。
    4. 向荧光染料标记的蛋白中加入 TCEP，使其终浓度为 0.5 mM。
    5. 使用分光光度计检测蛋白的标记效率。分别测定蛋白在 280 nm 处的吸光度、LD555 在 555 nm 处的吸光度以及 LD655 在 655 nm 处的吸光度，并根据各自的摩尔消光系数计算摩尔浓度。蛋白标记效率 =（荧光染料摩尔浓度 / 蛋白摩尔浓度）× 100%。

6. 单分子FRET成像

  1. 准备
    1. 配制孵育缓冲液：将 25 mM HEPES（pH 7.4）、150 mM KCl 和 5 mM MgCl2 混合。4 °C 保存。
    2. 配制 1 mg/mL 链霉亲和素（溶于 ddH2O）和 1 mg/mL 生物素化抗-His 抗体，用于蛋白固定。
    3. 配制 25 mM 苯甲酸（pH 7.4；溶于 7.1.1 中所述缓冲液）和 100 mM 原儿茶酸 3,4-双加氧酶（PCD）（溶于 40% 甘油溶液），以减少单分子 FRET 实验中的光漂白。
    4. 配制 100 mM 鸟苷-5'-二磷酸钠盐（GDP）、鸟苷-5'-O-[γ-硫代]三磷酸（GTPγS）和 AlCl3 储存液（均溶于 ddH2O）。配制 1 M NaF 储存液（溶于 ddH2O）。
    5. 取出真空保存的盖玻片和载玻片，在洁净台中用定制双面胶将两者小心粘合。安装管路和接头，构建具有六个通道的微流控腔室27。
      注意：避免修饰后的盖玻片长时间暴露于空气中。在开始单分子 FRET 实验前，应先完成微流控腔室的制备27。
  2. 成像位置校正
    注意：实验过程中需分别从供体和受体通道采集荧光信号。由于显微镜的使用，供体与受体通道的监测视野可能存在轻微偏差。为减小该偏差，实验开始前必须进行成像位置校准。
    1. 充分混匀 10% 聚苯乙烯微球（直径 3 µm），取 10 µL 加入未修饰的载玻片上，并用未修饰的盖玻片封片。
    2. 选择包含尽可能多聚苯乙烯微球的视野，使用全内反射荧光（TIRF）显微镜在明场下采集视频。
      注意：本实验采用高数值孔径油浸物镜（100×）进行高分辨率成像。单分子 FRET 实验中，使用 EMCCD 相机以 30 ms 帧间隔采集信号。
    3. 使用自定义脚本对同一聚苯乙烯微球在供体通道和受体通道中的中心位置进行对齐，并将校准图文件保存为 txt 文件。本研究使用的自定义 MATLAB 代码可在 https://github.com/yangchenguang-1994/HMM-FRET 获取。
  3. 在腔室内固定蛋白
    1. 进行分子间单分子 FRET 实验时，将 LD555 标记的 ATL1cyto-K 或 ATL1cyto-T 与 LD655 标记的 ATL1cyto-K-生物素按 1:1 比例混合，终浓度为 1 mM GTPγS 或 GDP/AlF4-，冰上孵育 1 小时以形成蛋白二聚体。
    2. 进行 ATL1cyto-T 与 ATL1cyto-K 分子间单分子 FRET 实验时，将 LD555 标记的 ATL1cyto-T 与 LD655 标记的 ATL1cyto-K-生物素按 1:1 比例混合，终浓度为 1 mM GTPγS 或 GDP/AlF4-，冰上孵育 1 小时以获得二聚化蛋白。
    3. 进行分子内单分子 FRET 实验时，在 GDP 条件下进行实验前，将 LD555 和 LD655 标记的 ATL1cyto-TK 与 1 mM GDP 在冰上孵育 1 小时。
    4. 进行分子间单分子 FRET 实验时，加入 10 µg/mL 链霉亲和素（用 200 µL 孵育缓冲液稀释），孵育 10 分钟以固定蛋白。进行分子内单分子 FRET 实验时，加入 10 µg/mL 生物素化抗-His 抗体（用 200 µL 孵育缓冲液稀释），孵育 10 分钟以固定蛋白。每次加入溶液前，用孵育缓冲液冲洗通道一次。
    5. 将 ATL1 二聚体稀释至约 0.3 nM 或单体稀释至约 1 nM（溶于 200 µL 孵育缓冲液），孵育 10 分钟以在通道内固定蛋白。用孵育缓冲液冲洗通道两次。向通道中加入苯甲酸和 PCD，终浓度为 2.5 mM（用 200 µL 缓冲液稀释）。
      注意：为模拟 ATL1cyto 分子在 GTP 水解过程中的不同阶段，在蛋白固定于通道后，每一步缓冲液中均加入核苷酸（GDP、GTPγS 和 GDP/AlF4-），终浓度为 1 mM。加入 GTPγS 模拟 GTP 结合，加入 GDP/AlF4- 模拟 GTP 水解，加入 GDP 模拟 Pi 释放，无核苷酸状态代表 GDP 释放。
  4. 单分子 FRET 成像
    1. 调节焦平面。使用粗调和细调焦旋钮，调整焦平面使样品清晰对焦。本实验采用自动对焦系统实现最佳聚焦。
    2. 设置激发光源。使用 532 nm 激光作为激发光源。将激光功率调节至适当水平以激发荧光团。本实验中使用 20–40 mW 的激光功率。
    3. 将 EMCCD 相机连接至显微镜。设置相机以 30 ms 帧间隔进行记录。确保相机设置为 16 位模式以获取高分辨率数据。
    4. 记录视频，确保采集过程中焦点保持稳定。在记录荧光信号时，尽可能延长 532 nm 激光照射时间，直至大多数荧光分子被淬灭。
    5. 将记录的视频以 16 位 TIFF 格式保存，用于后续分析。

7. 数据采集与分析

  1. 在从录制的视频中提取FRET轨迹之前，先加载用于校正的map txt文件。选择FRET轨迹，并将每条FRET轨迹数据保存为txt格式，以供进一步分析。
  2. 从txt文件中提取数据，并使用Matlab2022a中的自编脚本计算FRET值。自定义的MATLAB代码可在 https://github.com/yangchenguang-1994/HMM-FRET 获取。
    注意：FRET值通过公式 ILD655/(γILD555+ILD655) 计算。ILD555 和 ILD655 分别代表LD555和LD655的荧光强度。γ 是通过公式 γ = FA/FD 获得的参数。FA 表示受体荧光强度的减少量，FD 表示供体荧光强度的增加量。
  3. 在Origin 2022中使用GaussAmp对单分子FRET（smFRET）数据进行拟合，以获得分布直方图。
    注意：对于具有多个FRET状态的数据（分子间smFRET中GTPγS条件下的数据，或分子内smFRET在GDP或Apo条件下的数据），可采用多峰拟合。

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结果

单分子FRET实验在全内反射荧光显微镜（TIRF）上进行，每30 ms采集一次荧光染料的荧光强度。图2A-C展示了在无或含有不同核苷酸条件下，LD555（供体）和/或LD655（受体）标记的ATL1cyto分子的代表性图像。记录了单个颗粒上两种荧光染料的荧光强度，并提取出数百条表现出典型单分子特征的FRET轨迹。代表性轨迹如图2D-F所示。在无核苷酸或存在GDP的条件下，ATL1cyto单体表现出具有四个FRET态的动态FRET轨迹（图2D），表明ATL1的GTP酶结构域与3HB区域在这些状态下具有柔性；但GDP结合的ATL1cyto倾向于闭合构象，而GDP释放会改变ATL1cyto的构象偏好，使其转向开放构象（

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讨论

FRET 技术基于两种荧光染料（供体和受体）之间的能量转移。当这两种染料彼此靠近时（通常为 1-10 nm），被激发的供体会将其能量转移给受体，导致供体荧光强度降低，同时受体荧光强度增加。

在单分子FRET实验中，分子被稀释至极低浓度并固定在载玻片上，通过全内反射荧光显微镜（TIRF）检测单个分子的FRET信号。供体和受体荧光染料共价连接至分子的特定位置，当蛋白质发生构象变化或与其他分子相互作用时，FRET效率与荧光团之间的距离呈负相关。因此，通过测量受体与供体荧光强度的比值，可获得有关单个生物大分子构象动态、折叠动力学以及聚合物形成与解离的重要信息。

在当前的实验中，利用蛋白质中的半胱氨酸通过马来酰亚胺残基标记荧光团。然而，使用该方法标记蛋白质需要将蛋白质中的半胱氨酸残基突变为其他氨基酸（例如丙氨酸），并将需要标记的氨基酸突变为半胱氨酸。引入多个突变可能导致蛋白质结构和功能的改变。因此，在进行单分子实验之前，有必要分析多个突变对蛋白质的影响。除了马来酰亚胺与半胱氨酸的反应外，还可以通过将非天然氨基酸引入目标蛋白质，并利用点击...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

X.B. 受国家自然科学基金（32371287）、中央高校基本科研业务费专项资金（63223043 和 63233053）以及南开大学人才培育计划（035-BB042112）资助。Y.L. 受国家自然科学基金（12022409 和 T2221001）以及中国科学院前沿科学重点研究计划（ZDBS-LY-SLH015）资助。L.M. 受国家自然科学基金（32271274 和 31770812）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10 K 离心过滤器AmiconUFC901096
3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES） Sigma-Aldrich440140
45 Ti 转子
532 nm 激光器Olympus
640 nm 激光器Olympus
7 K 分子量截留值旋转脱盐柱赛默飞世尔科技89882
三磷酸腺苷二钠盐（ATP）罗氏11140965001
苯甲酸Sigma-Aldrich242381
Biotin-PEG-SVA-5000莱桑生物170-124
生物素标记的抗His抗体Bioss 抗体bs-0287R-bio
d-生物素Sigma-AldrichB4501
无EDTA蛋白酶抑制剂混合物罗氏11873580001
EMCCD相机安道尔IX897
鸟苷-5′-三磷酸′二磷酸鸟苷钠盐（GDP）Sigma-Aldrich G7127
鸟苷5'-O-[γ-硫代]三磷酸（GTPγS罗氏10220647001
高数值孔径油浸物镜尼康尼康，100倍，数值孔径1.49，油浸
ImageJ美国国立卫生研究院https://imagej.net/ij/
异丙基-Β-D-硫代半乳糖苷Sigma-AldrichI5502
LD555-MALLumidyne4
LD655-MALLumidyne10
L-谷氨酸钾Sigma-AldrichG1501
四水合乙酸镁Sigma-AldrichM0631
MatlabThe MathWorks，美国马萨诸塞州纳蒂克https://www.mathworks.com/
显微镜盖玻片Fisherbrand18834 (24 mm × 60 mm
显微镜载玻片定制，（75 mm × 26 mm × 1 毫米）带6对直径为1.2 毫米的通孔
mPEG-SVA-5000莱桑生物170-106
Ni Sepharose 6 Fast FlowCytiva17531802
起源Origin 软件https://www.originlab.com/
聚苯乙烯颗粒QDSphereAG1265
原儿茶酸3,4-双加氧酶Sigma-AldrichP8279
链霉亲和素Sangon BiotechA610492
Superdex 200 Increase (10/300 GL)Cytiva28990944
全内反射荧光显微镜尼康Ti2
盐酸三(2-羧乙基)膦 (TCEP)赛默飞世尔科技75259

参考文献

  1. Jimah, J. R., Hinshaw, J. E. Structural insights into the mechanism of dynamin superfamily proteins. Trends Cell Biol. 29 (3), 257-273 (2019).
  2. Kalia, R., Frost, A. Open and cut: Allosteric motion and membrane fission by dynamin superfamily proteins. Mol Biol Cell. 30 (17), 2097-2104 (2019).
  3. Ramachandran, R., Schmid, S. L. The dynamin superfamily. Curr Biol. 28 (8), R411-R416 (2018).
  4. Bryce, S., et al. Human atlastin-3 is a constitutive ER membrane fusion catalyst. J Cell Biol. 222 (7), e202211021(2023).
  5. Crosby, D., et al. Reconstitution of human atlastin fusion activity reveals autoinhibition by the C terminus. J Cell Biol. 221 (2), e202107070(2022).
  6. Hu, J., et al. A class of dynamin-like GTPases involved in the generation of the tubular er network. Cell. 138 (3), 549-561 (2009).
  7. Jang, E., et al. Human atlastins are sufficient to drive the fusion of liposomes with a physiological lipid composition. J Cell Biol. 222 (4), e202109090(2023).
  8. Liu, X., et al. Atlastin-1 regulates morphology and function of endoplasmic reticulum in dendrites. Nat Commun. 10 (1), 568(2019).
  9. Orso, G., et al. Homotypic fusion of ER membranes requires the dynamin-like gtpase atlastin. Nature. 460 (7258), 978-983 (2009).
  10. Rismanchi, N., Soderblom, C., Stadler, J., Zhu, P. P., Blackstone, C. Atlastin GTPases are required for Golgi apparatus and er morphogenesis. Hum Mol Genet. 17 (11), 1591-1604 (2008).
  11. Faust, J. E., et al. The atlastin C-terminal tail is an amphipathic helix that perturbs the bilayer structure during endoplasmic reticulum homotypic fusion. J Biol Chem. 290 (8), 4772-4783 (2015).
  12. Liu, T. Y., et al. Lipid interaction of the c terminus and association of the transmembrane segments facilitate atlastin-mediated homotypic endoplasmic reticulum fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), E2146-E2154 (2012).
  13. Moss, T. J., Andreazza, C., Verma, A., Daga, A., Mcnew, J. A. Membrane fusion by the GTPase atlastin requires a conserved c-terminal cytoplasmic tail and dimerization through the middle domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (27), 11133-11138 (2011).
  14. Bian, X., et al. Structures of the atlastin GTpase provide insight into homotypic fusion of endoplasmic reticulum membranes. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (10), 3976-3981 (2011).
  15. Byrnes, L. J., et al. Structural basis for conformational switching and GTP loading of the large g protein atlastin. EMBO J. 32 (3), 369-384 (2013).
  16. Byrnes, L. J., Sondermann, H. Structural basis for the nucleotide-dependent dimerization of the large g protein atlastin-1/spg3a. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (6), 2216-2221 (2011).
  17. Morin-Leisk, J., et al. An intramolecular salt bridge drives the soluble domain of gtp-bound atlastin into the postfusion conformation. J Cell Biol. 195 (4), 605-615 (2011).
  18. Pendin, D., et al. GTP-dependent packing of a three-helix bundle is required for atlastin-mediated fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (39), 16283-16288 (2011).
  19. Winsor, J., Hackney, D. D., Lee, T. H. The crossover conformational shift of the GTPase atlastin provides the energy driving ER fusion. J Cell Biol. 216 (5), 1321-1335 (2017).
  20. Yan, L., et al. Structures of the yeast dynamin-like GTPase sey1p provide insight into homotypic er fusion. J Cell Biol. 210 (6), 961-972 (2015).
  21. Rizo, J. Molecular mechanisms underlying neurotransmitter release. Annu Rev Biophys. 51, 377-408 (2022).
  22. Gao, S., Hu, J. Mitochondrial fusion: The machineries in and out. Trends Cell Biol. 31 (1), 62-74 (2021).
  23. Kelly, C. M., Byrnes, L. J., Neela, N., Sondermann, H., O'donnell, J. P. The hypervariable region of atlastin-1 is a site for intrinsic and extrinsic regulation. J Cell Biol. 220 (11), e202104128(2021).
  24. Asher, W. B., et al. GPCR-mediated beta-arrestin activation deconvoluted with single-molecule precision. Cell. 185 (10), 1661-1675.e16 (2022).
  25. Li, M., et al. Mechanism of DNA translocation underlying chromatin remodelling by snf2. Nature. 567 (7748), 409-413 (2019).
  26. Chen, Y., et al. Conformational dynamics of dynamin-like MXA revealed by single-molecule fret. Nat Commun. 8, 15744(2017).
  27. Shi, L., et al. Dissecting the mechanism of atlastin-mediated homotypic membrane fusion at the single-molecule level. Nat Commun. 15 (1), 2488(2024).
  28. Guelly, C., et al. Targeted high-throughput sequencing identifies mutations in atlastin-1 as a cause of hereditary sensory neuropathy type i. Am J Hum Genet. 88 (1), 99-105 (2011).
  29. Montagna, A., Vajente, N., Pendin, D., Daga, A. In vivo analysis of CRISPR/Cas9 induced atlastin pathological mutations in drosophila. Front Neurosci. 14, 547746(2020).
  30. Ulengin, I., Park, J. J., Lee, T. H. ER network formation and membrane fusion by atlastin1/spg3a disease variants. Mol Biol Cell. 26 (9), 1616-1628 (2015).
  31. Zhao, X., et al. Mutations in a newly identified GTPase gene cause autosomal dominant hereditary spastic paraplegia. Nat Genet. 29 (3), 326-331 (2001).

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单分子FRET成像观察动力蛋白样GTP酶Atlastin的构象动力学
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