机械稳定性自组装肽水凝胶的制备

摘要

本方案介绍了三种利用环境条件诱导肽自组装形成水凝胶的快速简便制备方法。此外，还描述了肽水凝胶的表征方法，证明在这些简单条件下可形成机械稳定的肽水凝胶。

摘要

多肽水凝胶是由纳米纤维或聚合物通过自组装形成的亲水性极强的三维网络凝胶，可构建锁水网络。其形态与细胞外基质高度相似，因而兼具多肽的生物学功能和响应性凝胶化特性。这些独特性质使其在组织工程、三维细胞培养、癌症治疗、再生医学及其他生物医学领域得到广泛应用。本文介绍了三种利用具有环境响应性凝胶化特性的自组装多肽制备ECF-5多肽水凝胶的方法：（1）pH响应性凝胶化：通过调节pH值诱导氨基酸残基的质子化或去质子化，改变多肽分子间的静电相互作用，从而促进其自组装形成水凝胶；（2）金属离子添加法：多价金属离子与带负电荷的氨基酸残基发生螯合，作为多肽之间的交联桥，形成网络状水凝胶；（3）溶剂置换法：疏水性多肽首先溶解于非极性有机溶剂中，随后在转移至极性水相环境时诱导其自组装形成水凝胶。这些方法均采用常规实验操作，促进多肽自组装为水凝胶。通过设计多肽序列以匹配特定的凝胶化诱导条件，可实现对微/纳米结构和生物学功能的精确调控，凸显了多肽水凝胶在生物医学领域的重要应用潜力。

引言

通过设计肽序列，肽之间的非共价相互作用可诱导其自组装，从而形成有序的微米和纳米结构，包括纳米管、纳米带、纳米纤维以及球形结构¹。当这些结构自组装为微米或纳米级纤维/带时，宏观上表现出水凝胶特性。肽自组装水凝胶与聚合物水凝胶不同，其通过非共价相互作用实现自组装，凝胶状态具有可逆性，并能对外界特定条件迅速响应，实现在溶液与凝胶相之间的转换²。例如，芳香族氨基酸肽可通过溶剂切换诱导凝胶化^3,4,5，RADA16肽通过阳离子与阴离子之间的静电相互作用形成凝胶⁶，E1Y9肽则可在Ca²⁺离子诱导下形成水凝胶⁷。天然氨基酸可被人体代谢，具有优异的生物相容性，这是聚合物水凝胶难以实现的特性⁸。蛋白质是执行生物学功能的分子，而肽序列的差异决定了其特定的生物学功能。因此，将特定的生物功能肽序列嵌入其中，并赋予其自组装能力，可设计出具有独特生物学功能和形态结构的肽自组装水凝胶^9,10....

方案

本研究中使用的质粒、试剂和设备的详细信息列在材料表中。

1. pH 响应法

1. 将5 mg ECF-5肽加入400 µL去离子水中。在40 kHz条件下超声处理30分钟，并充分混匀。
2. 向肽溶液中加入40 µL氢氧化钠溶液（1 M，经0.22 µm滤膜过滤）。涡旋振荡并充分混匀。继续超声处理15分钟，直至溶液完全澄清。
3. 加入60 µL盐酸。迅速涡旋并确保充分混匀。将混合物在室温下静置超过30分钟，以促进水凝胶形成。
   注意：如需使用，可用所需缓冲液替代去离子水。若固体颗粒较大，应预先研磨粉碎。通过超声处理使液体中的颗粒混合均匀。若肽对碱性条件敏感，可先加入1 M盐酸溶液，并重复上述步骤。根据需要调整酸和碱的用量，使pH接近等电点或目标pH值，同时确保保留其凝胶形成特性。

2. 金属离子添加法

1. 材料的制备
   1. 配制 pH 7.4 的 0.15 M Tris 和 0.1 M NaCl 缓冲液。经 0.22 µm 滤膜过滤后，4 °C 下保存，可保存一周。
   2. 使用步骤 1.1.1 中配制的缓冲液配制浓度为 10 mg/mL 的 ECF-5 自组装多肽溶液。通过超声处理使其溶解，并在....

结果

本文所述的三种制备多肽水凝胶的方法能够实现快速、经济且简便的生产。水凝胶的功能与其多肽序列相关。此处以ECF-5多肽作为代表性示例，展示其物理特性，包括微观形态和机械性能。

如图1A和补充图1所示，ECF-5肽包含一个类似谷胱甘肽的序列和一个苯丙氨酰二肽序列，使其具有谷胱甘肽的还原特性以及自组装能力。将ECF-5肽预先溶解于DMSO中，随后迅速与水溶液混合。在此阶段，该肽迅速发生自组装，数分钟内形成固体凝胶。当最终肽浓度超过1%时，可用镊子夹取该凝胶。

凝胶表面的原子力显微镜（AFM）成像显示，存在由大量肽纤维构成的网络结构，具有密集的孔隙以锁住水分子。稀释后，单根纤维的形貌如图1D所示，高度约为3.5 nm，形成高度一致的较宽纤维束。这与凝胶网络中观察到的纤维形貌一致。此外，在中性条件下，钙金属离子也能诱导该肽形成水凝胶，尽管此过程相对较慢，且形成的凝胶更软。

讨论

在过去几十年中，随着从淀粉样蛋白衍生的自组装肽序列被发现，研究人员基于这些序列的特性设计出了大量自组装肽，在生物医学和材料科学领域展现出巨大的应用潜力¹⁹。肽类水凝胶在组织培养、药物递送和肿瘤治疗中表现出独特的生物功能化能力²⁰。

本文介绍了三种肽类水凝胶的简单快速制备方法：pH响应型、金属离子添加型和溶剂交换型。自组装肽根据其序列特征产生不同的非共价相互作用，其中以疏水相互作用为主导，其次是静电相互作用。这些相互作用导致各异的自组装特性，并促进肽从可溶状态向不溶状态转变。例如，氨基酸和肽均具有特定的等电点，在等电点时其溶解度最低；当溶液pH显著偏离等电点时，其溶解度增加，从而促进自组装的发生。因此，调节溶液pH可触发某些肽的自组装过程¹³。然而，具有高度极性等电点的肽可能结构不稳定，易发生脱酰胺或水解反应。

在金属离子诱导的多肽水凝胶形成过程中，多肽通常含有带负电荷的氨基酸，如谷氨酸.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3-氨基丙基三乙氧基硅烷	Aladdin	A107147	/
原子力显微镜	Bruker	Multimode Nanoscope VIII	/
CaCl2	Aladdin	C290953	/
二苯丙氨酸（FF）	Chinesepeptide	可定制	纯度 > 95%
DMSO	Sigma-aldrich	34869	/
ECF-5 肽	Chinesepeptide	序列：ECAFF	纯度 > 95%
盐酸	Aladdin	H399657	/
云母	Sigma-aldrich	AFM-71856-02	/
磷酸盐缓冲液	Aladdin	P492453	/
流变仪	Anton Paar GmbH	MCR302	/
硅悬臂梁	MikroMasch	XSC11	/
氯化钠	Aladdin	C111549	/
氢氧化钠	Aladdin	S140903	/
TRIS 盐酸盐	Aladdin	T431531	/