机械稳定性自组装肽水凝胶的制备

摘要

本方案介绍了三种利用环境条件诱导肽自组装形成水凝胶的快速简便制备方法。此外，还描述了肽水凝胶的表征方法，证明在这些简单条件下可形成机械稳定的肽水凝胶。

摘要

多肽水凝胶是由纳米纤维或聚合物通过自组装形成的亲水性极强的三维网络凝胶，可构建锁水网络。其形态与细胞外基质高度相似，因而兼具多肽的生物学功能和响应性凝胶化特性。这些独特性质使其在组织工程、三维细胞培养、癌症治疗、再生医学及其他生物医学领域得到广泛应用。本文介绍了三种利用具有环境响应性凝胶化特性的自组装多肽制备ECF-5多肽水凝胶的方法：（1）pH响应性凝胶化：通过调节pH值诱导氨基酸残基的质子化或去质子化，改变多肽分子间的静电相互作用，从而促进其自组装形成水凝胶；（2）金属离子添加法：多价金属离子与带负电荷的氨基酸残基发生螯合，作为多肽之间的交联桥，形成网络状水凝胶；（3）溶剂置换法：疏水性多肽首先溶解于非极性有机溶剂中，随后在转移至极性水相环境时诱导其自组装形成水凝胶。这些方法均采用常规实验操作，促进多肽自组装为水凝胶。通过设计多肽序列以匹配特定的凝胶化诱导条件，可实现对微/纳米结构和生物学功能的精确调控，凸显了多肽水凝胶在生物医学领域的重要应用潜力。

引言

通过设计肽序列，肽之间的非共价相互作用可诱导其自组装，从而形成有序的微米和纳米结构，包括纳米管、纳米带、纳米纤维以及球形结构¹。当这些结构自组装为微米或纳米级纤维/带时，宏观上表现出水凝胶特性。肽自组装水凝胶与聚合物水凝胶不同，其通过非共价相互作用实现自组装，凝胶状态具有可逆性，并能对外界特定条件迅速响应，实现在溶液与凝胶相之间的转换²。例如，芳香族氨基酸肽可通过溶剂切换诱导凝胶化^3,4,5，RADA16肽通过阳离子与阴离子之间的静电相互作用形成凝胶⁶，E1Y9肽则可在Ca²⁺离子诱导下形成水凝胶⁷。天然氨基酸可被人体代谢，具有优异的生物相容性，这是聚合物水凝胶难以实现的特性⁸。蛋白质是执行生物学功能的分子，而肽序列的差异决定了其特定的生物学功能。因此，将特定的生物功能肽序列嵌入其中，并赋予其自组装能力，可设计出具有独特生物学功能和形态结构的肽自组装水凝胶^9,10,11。本文介绍了三种通过环境响应触发凝胶过程的肽水凝胶制备方法，并简要讨论了表征肽水凝胶机械性能和形态结构的方法。

pH 值调控氨基酸的电荷状态，从而触发某些肽的凝胶化过程。例如，带正电荷的氨基酸（如精氨酸、赖氨酸、组氨酸）受 pH 值调控，可呈现正电性或中性状态；带负电荷的氨基酸则受 pH 值调控，呈现负电性或中性状态，使其偏离等电点，从而改变其在水溶液中的亲水性。因此，调控肽之间的静电作用和疏水相互作用，有助于其有序自组装。Zhang 等人设计了一种两亲性、pH 响应型自组装肽 methotrexate-coupled KKFKFEFEF，该肽在体外和体内均可响应弱酸性环境，实现从溶液到凝胶的相变。这促进了高效的细胞摄取和内吞作用，从而实现抗癌药物的递送，并提高化疗效果¹²。Shen 等人¹³设计了 FF8（KRRFFRRK）肽，该肽在 pH 值大于 9.4 时易于自组装形成纤维。在中性条件下，微生物通过其带负电荷的磷脂膜与带正电荷的肽发生静电相互作用，中和正电荷，并与磷脂分子协同自组装，导致膜破裂，增强杀菌效果¹³。

利用配位金属触发肽的超分子自组装形成水凝胶是一种相对罕见的方法¹⁴。当金属离子与肽发生静电相互作用时，会形成连接肽分子的盐桥，从而引发非共价相互作用和自组装，最终产生凝胶化特性。例如，Abul-Haija 等人¹⁵设计了三肽FFD，其在加入铜离子后可从液态转变为水凝胶。Tao 等人¹⁶开发了富含谷氨酸和苯丙氨酸的肽E3F3，该肽在锌离子存在下可自组装成纤维状水凝胶，并用于前列腺药物递送。

通过溶剂交换形成多肽水凝胶是最常见的超分子自组装触发条件。当疏水性多肽溶解于有机溶剂后，其疏水基团会充分暴露。当转移至水相时，疏水基团相互靠近，水分子促进多肽氢键的形成，从而导致快速自组装并易于形成水凝胶。例如，Zhang 等人¹⁷设计了一种多肽，可在极性有机溶剂中高浓度稳定溶解，加入水稀释后自组装形成β-折叠结构，进而构建多肽纤维水凝胶。Shen 等人¹³设计了一种还原性多肽ECF-5（ECAFF），预先溶解于二甲基亚砜（DMSO）中，随后注入水相形成还原性水凝胶，用于靶向清除缺血-再灌注过程中产生的活性氧，在完成清除作用后该凝胶进一步降解为溶液。

本研究基于以往经验，选取了三种简单、快速且具有高度普适性的多肽水凝胶制备策略：（1）pH响应法：将多肽溶解于pH值远离其等电点的溶液中，随后将pH调节至接近等电点。这种变化可促使某些自组装多肽形成纤维并构建多肽水凝胶；（2）金属离子添加法：向水溶性、带负电荷的自组装多肽中加入配位阳离子。多肽之间的金属配位螯合作用促使其自组装形成水凝胶；（3）溶剂置换法：将高浓度多肽溶解于有机溶剂中，然后稀释至水相，从而诱导凝胶化行为。

方案

本研究中使用的质粒、试剂和设备的详细信息列在材料表中。

1. pH 响应法

1. 将5 mg ECF-5肽加入400 µL去离子水中。在40 kHz条件下超声处理30分钟，并充分混匀。
2. 向肽溶液中加入40 µL氢氧化钠溶液（1 M，经0.22 µm滤膜过滤）。涡旋振荡并充分混匀。继续超声处理15分钟，直至溶液完全澄清。
3. 加入60 µL盐酸。迅速涡旋并确保充分混匀。将混合物在室温下静置超过30分钟，以促进水凝胶形成。
   注意：如需使用，可用所需缓冲液替代去离子水。若固体颗粒较大，应预先研磨粉碎。通过超声处理使液体中的颗粒混合均匀。若肽对碱性条件敏感，可先加入1 M盐酸溶液，并重复上述步骤。根据需要调整酸和碱的用量，使pH接近等电点或目标pH值，同时确保保留其凝胶形成特性。

2. 金属离子添加法

1. 材料的制备
   1. 配制 pH 7.4 的 0.15 M Tris 和 0.1 M NaCl 缓冲液。经 0.22 µm 滤膜过滤后，4 °C 下保存，可保存一周。
   2. 使用步骤 1.1.1 中配制的缓冲液配制浓度为 10 mg/mL 的 ECF-5 自组装多肽溶液。通过超声处理使其溶解，并在 4 °C 下保存。
   3. 使用去离子水配制 50 mg/mL 的氯化钙溶液。在 4 °C 下保存。
2. 金属离子诱导多肽水凝胶的形成
   1. 将 40 µL 氯化钙溶液加入 460 µL ECF-5 多肽溶液中。涡旋振荡并充分混匀。室温下静置超过 2 小时。
      注意：避免使用磷酸盐缓冲液，因其可能导致钙离子沉淀。

3. 溶剂交换法

1. 材料准备
   1. 称取10 mg ECF-5肽冻干粉，加入100 µL DMSO中，通过超声充分混匀，于4 °C保存。
   2. 配制10 mM PBS缓冲液，过滤除菌，于4 °C保存，并在1周内使用。
2. 溶剂诱导肽水凝胶形成
   1. 将1 mL PBS迅速加入DMSO溶解的肽溶液中，涡旋并充分混匀，室温静置5分钟。
   2. 加入500 µL PBS，静置15分钟，弃去上清液，保留底部凝胶。重复此步骤三次以去除DMSO。
      注意：若DMSO影响后续实验，可考虑将肽溶解于更高浓度的DMSO中，以减少其影响。

4. 水凝胶的流变力学表征

1. 流变学分析
   1. 将水凝胶舀取至25 mm铝制平行板上。使用流变仪对多肽水凝胶进行动态时间扫描流变学分析¹⁸。
2. 频率扫描与应变扫描分析
   1. 采用0.3%的控制应变和10 rad/s的频率，系统地进行频率扫描和应变扫描分析¹⁸。确保温度控制在25 °C。

5. 纤维形貌的原子力显微镜（AFM）表征

1. 材料准备
   1. 配制95%乙醇溶液，并加入5% APTES。于-20 °C保存，一个月内使用完毕。
   2. 使用双面胶剥离云母片层。用APTES溶液将云母表面粘附固定，静置5分钟。使用前用纯水充分冲洗。
   3. 将水凝胶稀释并充分混匀，滴加至修饰后的云母表面，静置吸附5分钟。用纯水冲洗表面后干燥，备用。
2. 检测方法
   1. 采用配备扫描器的多模式原子力显微镜（AFM）观察肽纤维或水凝胶的形貌。使用标称弹性常数为48 N/m的硅悬臂梁探针。
   2. 启动仪器并定位探针。选择轻敲模式对样品进行扫描以获取图像。

结果

本文所述的三种制备多肽水凝胶的方法能够实现快速、经济且简便的生产。水凝胶的功能与其多肽序列相关。此处以ECF-5多肽作为代表性示例，展示其物理特性，包括微观形态和机械性能。

如图1A和补充图1所示，ECF-5肽包含一个类似谷胱甘肽的序列和一个苯丙氨酰二肽序列，使其具有谷胱甘肽的还原特性以及自组装能力。将ECF-5肽预先溶解于DMSO中，随后迅速与水溶液混合。在此阶段，该肽迅速发生自组装，数分钟内形成固体凝胶。当最终肽浓度超过1%时，可用镊子夹取该凝胶。

凝胶表面的原子力显微镜（AFM）成像显示，存在由大量肽纤维构成的网络结构，具有密集的孔隙以锁住水分子。稀释后，单根纤维的形貌如图1D所示，高度约为3.5 nm，形成高度一致的较宽纤维束。这与凝胶网络中观察到的纤维形貌一致。此外，在中性条件下，钙金属离子也能诱导该肽形成水凝胶，尽管此过程相对较慢，且形成的凝胶更软。

采用三种方法（pH响应、金属添加和溶剂交换）制备的水凝胶的宏观行为如图2A所示。与去离子水相比，所有水凝胶均表现出半固体特性。流变学常用于区分水凝胶与溶胶。

采用流变学技术比较了通过上述三种凝胶化方法制备的ECF-5水凝胶的宏观粘弹性。如图2所示，ECF-5水凝胶表现出典型水凝胶的粘弹性特征。在应变为0.3%时，展示了不同频率下储能模量（G'）与损耗模量（G''）之间的关系。ECF-5水凝胶的模量对频率依赖性较弱。三种方法制备的水凝胶储能模量（G'）均约为10 kPa，约为损耗模量（G''）的10倍，表现出典型的半固体水凝胶特性（图2B）。这表明，无论采用何种制备方法，ECF-5水凝胶均具有典型的水凝胶粘弹性。

在10 rad/s下，储能模量（G'）和损耗模量（G''）随应变水平变化的曲线图（图2C）显示，在0.1%至10%的应变范围内，G'和G''均基本保持恒定，且G'约为G''的10倍。这表明ECF-5水凝胶是典型的具有应力承受能力的粘弹性水凝胶。

图1：ECF-5多肽水凝胶。 （A）ECF-5的化学结构。（B）1%浓度下ECF-5多肽水凝胶的宏观形貌。（C）水凝胶表面的微观结构。（D）ECF-5多肽纤维的显微形貌。请点击此处查看此图的放大版本。

图 2：水凝胶的宏观形貌与流变学表征。（A）三种不同诱导条件下形成的水凝胶的宏观形貌，所有样品中ECF-5肽的终浓度均为3 mg/mL。在1%浓度下，ECF-5水凝胶在三种诱导条件下的频率（B）和应变（B）对储能模量（G'）和损耗模量（G''）的影响。请点击此处查看本图的放大版本。

补充图1：肽ECAFF的液相色谱-质谱分析。 （A）保留时间为13.238 min处的峰为产物峰。色谱柱洗脱液在220 nm波长下监测，流速为1 mL/min，流动相为含0.1%三氟乙酸的100%乙腈。ECF-5的产率为97.33%。 （B）电喷雾电离/质谱分析确认ECF-5的分子量为616.1。 请点击此处下载该文件。

讨论

在过去几十年中，随着从淀粉样蛋白衍生的自组装肽序列被发现，研究人员基于这些序列的特性设计出了大量自组装肽，在生物医学和材料科学领域展现出巨大的应用潜力¹⁹。肽类水凝胶在组织培养、药物递送和肿瘤治疗中表现出独特的生物功能化能力²⁰。

本文介绍了三种肽类水凝胶的简单快速制备方法：pH响应型、金属离子添加型和溶剂交换型。自组装肽根据其序列特征产生不同的非共价相互作用，其中以疏水相互作用为主导，其次是静电相互作用。这些相互作用导致各异的自组装特性，并促进肽从可溶状态向不溶状态转变。例如，氨基酸和肽均具有特定的等电点，在等电点时其溶解度最低；当溶液pH显著偏离等电点时，其溶解度增加，从而促进自组装的发生。因此，调节溶液pH可触发某些肽的自组装过程¹³。然而，具有高度极性等电点的肽可能结构不稳定，易发生脱酰胺或水解反应。

在金属离子诱导的多肽水凝胶形成过程中，多肽通常含有带负电荷的氨基酸，如谷氨酸和天冬氨酸。这些多肽可在二价金属离子的作用下，以金属离子作为桥梁相互连接，从而触发自组装。或者，含有组氨酸残基的多肽可与某些二价金属阳离子形成配位键，诱导自组装。金属离子通过降低多肽之间的静电排斥并增强其相互吸引，促进多肽自组装，进而形成多肽水凝胶¹⁴。尽管该方法适用于需要特定金属离子的应用场景，但在大多数生理条件下可能并不必要，且金属离子难以被轻易去除。

一些高度疏水的多肽首先溶解在水溶性有机溶剂中，然后加入原本不溶于水的水相中，以快速形成多肽水凝胶。然而，许多有机溶剂在生物应用中可能产生不利影响，尤其是在较高浓度时。本文所述方法专门适用于自组装多肽。多肽的设计基于上述触发机制，旨在实现所需的生物学功能，同时将不良影响降至最低。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
3-氨基丙基三乙氧基硅烷	Aladdin	A107147	/
原子力显微镜	Bruker	Multimode Nanoscope VIII	/
CaCl2	Aladdin	C290953	/
二苯丙氨酸（FF）	Chinesepeptide	可定制	纯度 > 95%
DMSO	Sigma-aldrich	34869	/
ECF-5 肽	Chinesepeptide	序列：ECAFF	纯度 > 95%
盐酸	Aladdin	H399657	/
云母	Sigma-aldrich	AFM-71856-02	/
磷酸盐缓冲液	Aladdin	P492453	/
流变仪	Anton Paar GmbH	MCR302	/
硅悬臂梁	MikroMasch	XSC11	/
氯化钠	Aladdin	C111549	/
氢氧化钠	Aladdin	S140903	/
TRIS 盐酸盐	Aladdin	T431531	/