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利用双光子激光消融发育期斑马鱼幼鱼中的成骨细胞

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DOI：

10.3791/67279

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2024年9月6日

 , 
1CRTD - Center for Regenerative Therapies TU Dresden, 2Center for Healthy Aging, Faculty of Medicine, TU Dresden

本文内容

摘要

本方案描述了一种在斑马鱼幼鱼中进行的双光子激光消融方法，该模型可用于研究骨再生以及免疫反应对消融的影响。

摘要

斑马鱼（Danio rerio）具有极强的器官和附肢再生能力。目前已有多种方法用于研究斑马鱼的骨骼再生，包括鳍条截断、鳞片拔除、颅骨开窗以及显微操作技术。本研究采用配备双光子激光器的共聚焦激光扫描系统，建立了一种激光消融方法，作为损伤模型，用于消融斑马鱼幼鱼发育中的鳃盖骨成骨细胞（osteoblasts）。该方法可实现对细胞的精确消融，消融区域的面积、形状和深度均可精细调节。此外，该方法可在消融前后对同一区域进行成像，从而能够分析损伤后的短期效应。在本实验体系中，研究了成骨细胞消融后损伤区域的免疫反应。结果显示，消融后巨噬细胞的募集显著增加，表明其在骨骼再生过程中具有重要作用。

引言

斑马鱼能够再生多种器官，例如视网膜、脑、心脏和胰腺1。此外，斑马鱼还能再生骨骼结构，因此被广泛用于研究鳍、鳞片和颅盖（头骨盖）的再生过程2。目前已有多种实验范式被用于研究组织和骨再生，包括鳍切除（截肢）、鳍骨折、颅骨钻孔3,4、冷冻损伤5,6以及基因靶向消融7,8,9。近年来，激光消融技术已在斑马鱼中被广泛应用于研究损伤后的愈合与再生反应10,11,12,13,14。

激光介导消融技术已应用于生物学研究的多个领域，如力学生物学、发育生物学、再生研究以及肿瘤外科手术10,11,12,15,16,17,18,19有多种激光消融方法，例如使用YAG（钇铝石榴石）、UV（紫外）或2p（双光子）激光器20激光消融能够以极高精度去除单个细胞或较大范围的组织，从而可用于研究多种生物学过程，例如免疫系统对肿瘤消融的响应。21 或在斑马鱼鳃盖骨再生过程中。在后一示例中，消融效果通过核内及胞质荧光信号的消失以及坏死染色得以确认10,22.

众所周知，先天免疫反应及其调控的动力学对于适当的组织再生至关重要。中性粒细胞和巨噬细胞是首先被招募到损伤部位的细胞，它们执行多种功能，如释放细胞因子和生长因子、清除细胞碎片以及重塑细胞外基质23。这种招募过程以及随后巨噬细胞的功能分化也已在截断的斑马鱼鳍24和经受激光“纳米切割”导致成骨细胞消融的发育中鳃盖骨中被观察到10。在后一实验中，经紫外激光和双光子激光介导的消融后，观察到成骨细胞数量的恢复、鳃盖骨的正常发育以及先天免疫细胞（中性粒细胞、巨噬细胞和类破骨细胞）向损伤区域的募集10。在斑马鱼中进行的通过糖皮质激素药理抑制免疫系统的实验显示，免疫失调会损害再生能力，从而支持了免疫系统在组织修复中的功能性作用3,10,25,26。

本文介绍了一种利用双光子激光介导消融技术研究斑马鱼发育过程中骨骼再生生物学的方法。具体而言，通过监测巨噬细胞向消融部位的募集情况，展示了在鳃盖骨中进行成骨细胞消融对免疫反应的影响。

方案

研究方案已获得萨克森州政府（Landesdirektion Sachsen）的批准，许可编号为25-5131/564/2、DD25-5131/450/4、25-5131/496/56、DD25.1-5131/354/87。所用斑马鱼品系的饲养均依照国家法律，并在标准化条件下进行，具体方法如前所述。27,28. 本研究中使用的所有试剂和设备的详细信息均列于 材料表.

1. 材料与溶液的准备

  1. 将胚胎保存在 1x E3 培养基中。通过将 170 mL 的 60x E3 储存液加入 10 L 去离子水中稀释，并添加 2 mL 0.1% 亚甲蓝，配制 1x E3 培养基。
    1. 通过将 17.2 g NaCl、0.76 g KCl、2.90 g CaCl2·2 H2O 和 4.90 g MgSO4·7 H2O 溶解于 1 L 去离子灭菌水中，配制 60x E3 储存液。
  2. 为幼鱼包埋，预先分装低熔点琼脂糖（LMA）至 1% 浓度，并于室温保存。
    1. 分装时，将 LMA 溶解于 1x E3 培养基中，例如将 500 mg LMA 加入 50 mL 1x E3 培养基的锥形瓶中，微波加热至琼脂糖完全溶解，然后分装至 1.5 mL 离心管中，每管 1 mL。

2. 斑马鱼繁殖与胚胎收集

注意：本研究使用了报告已定型成骨细胞 [osterix:nGFP = Tg(Ola.Sp7:NLS-GFP)zf132]29 和巨噬细胞 [mpeg:mCherry = Tg(mpeg:mCherry)gl23] 存在的双转基因斑马鱼幼鱼30（图1A）。

  1. 在交配前一晚，将带有目标单转基因的亲代斑马鱼放入标准交配笼中进行准备。
    注意：标准交配笼可使卵子进入下方隔层，亲代斑马鱼无法触及。
    1. 使用交配笼中的分隔板将雄鱼和雌鱼分开，直至交配前再移除分隔板。次日早晨移除分隔板以启动交配。
  2. 最迟于中午时分，将亲代斑马鱼从繁殖缸中移出，并通过滤网过滤交配笼中的水以收集胚胎。
    注意：若幼鱼的精确年龄对实验至关重要，应以约30分钟为间隔定期收集胚胎。在不同实验组的实验中，应使用同一次产卵的幼鱼。
  3. 将胚胎置于直径100 mm的培养皿中，加入1x E3培养基，并在28 °C的培养箱中培养31。
  4. 借助体视显微镜，使用塑料移液管从培养皿中移除未受精的卵和死亡的胚胎，并每天更换1x E3培养基。
  5. 实验前，使用荧光体视显微镜筛选出携带报告基因转基因的阳性幼鱼。

3. 幼虫包埋于低熔点琼脂糖中

  1. 将LMA分装液在65 °C的恒温金属块或水浴中融化。LMA融化后，保持在42 °C直至包埋（图1B）。向1 mL已融化的LMA分装液中加入50 µL的0.4% MS-222，使麻醉剂MS-222的终浓度达到0.02%。
  2. 用含0.02% MS-222的E3培养基麻醉4 dpf（受精后天数）的幼鱼（或更年长的幼鱼）。
  3. 使用3 mL塑料巴斯德吸管将麻醉后的幼鱼转移至玻璃底小培养皿中，并用同一吸管吸除多余的E3培养基（图1B）。注意避免幼鱼干燥。
    注意：可在同一培养皿中同时包埋多条幼鱼；建议包埋3至5条，以便有充足时间完成定位。
  4. 从水浴/恒温金属块中取出已融化的LMA琼脂糖，在培养皿中玻璃底面幼鱼所在位置滴加一滴正在冷却的LMA，使其覆盖该区域。注意LMA温度不宜过高，但需保持液态。
  5. 在琼脂糖凝固前，将幼鱼调整至理想的侧卧位置。此处应确保鳃盖尽可能贴近培养皿的玻璃底面，为倒置显微镜观察做好准备（图1B）。
  6. 待琼脂糖完全凝固后，向培养皿中加入E3培养基（含不超过0.02% MS-222），以防止琼脂糖干燥（图1B）。

斑马鱼幼体准备示意图；巨噬细胞标记为 mpeg1:mCherry，鳃盖骨标记为 osterix:nGFP。
图 1：包埋操作的示意图。（A）双转基因 Tg(osterix:nGFP; mpeg1:mCherry)29,30 斑马鱼幼体，其绿色标记的鳃盖成骨细胞和红色标记的巨噬细胞被用于实验。（B）包埋操作的工作流程，详见方案第3步。请点击此处查看该图的放大版本。

4. 体内 幼虫成像与激光消融

  1. 为了在转基因斑马鱼 Tg(osterix:nGFP; mpeg1:mCherry)29,30 的发育鳃盖骨中进行激光消融成骨细胞，使用配备 25x/0.95 水镜的倒置双光子激光扫描显微镜或等效装置。
  2. 将含有包埋幼鱼的培养皿置于倒置显微镜的载物台上，并将待消融区域置于视野中心。可通过 GFP 荧光信号轻松识别鳃盖骨。
  3. 当鳃盖骨在显微镜视野中聚焦并居中后，选择 z 轴堆栈参数（通常使用 1–2 µm 的 z 轴间隔），以成像整个鳃盖骨的厚度。同时，在特定 z 平面中选择待消融区域（通常位于鳃盖骨的后部区域）。双光子激光消融仅作用于该平面。
    注意：z 轴方向更高的分辨率将导致更长的成像时间，但可为后续获取数据的体积分析提供支持。
  4. 在消融前对目标鳃盖骨区域进行成像。检测 GFP 时，使用 488 nm 白光激光，并通过混合探测器在 495–550 nm 范围内收集信号（或等效设置）。检测巨噬细胞时，使用 555 nm 白光激光激发，并通过混合探测器在 595–780 nm 范围内检测 mCherry 信号（或等效设置）。
    1. 采用 512 × 512 的图像格式以获得良好的图像质量与时间比（若需更高分辨率或更快成像速度，也可选择其他格式）。
      注意：可在显微镜上安装温控培养箱，并调节至例如 28 °C。
  5. 使用感兴趣区域（ROI）工具，在选定的二维平面上绘制直径为 25 µm 的圆形区域（可根据实验需求选择其他形状和尺寸），并聚焦于鳃盖骨。
  6. 进行消融时，施加无物镜测量下的 450 mW 消融功率，以 400 Hz 扫描速度对选定区域进行双光子激光照射，总持续时间为 10 秒。消融过程中，可通过混合探测器在 401–443 nm 范围内（或等效设置）实时观察该区域。
  7. 消融后，使用与消融前相同的设置再次对同一 z 轴堆栈进行成像，以结构上确认消融效果。消融区域不再含有荧光细胞。

5. 幼虫回收及成像以监测免疫细胞募集

  1. 如果需要延迟进行免疫细胞募集的成像，请先将幼鱼从成像和麻醉状态中恢复。使用镊子或解剖针小心地将幼鱼从LMA中取出。
    1. 首先，移除覆盖在幼鱼上方的一层琼脂糖。其次，移除与幼鱼直接接触的琼脂糖。若立即进行免疫细胞募集成像，则省略此步骤。
  2. 将幼鱼重新放回含有纯E3培养基的培养皿中，并观察其恢复情况。幼鱼恢复的标志是能够自主游动。
  3. 在损伤后4或6小时（hpl），使用相同的显微镜设置再次对鳃盖区域进行成像，以评估消融对巨噬细胞募集的影响。为此，重复之前的包埋（步骤3）和成像操作（步骤4）。
  4. 成像结束后，将幼鱼从LMA中取出。根据法律规定，可通过将幼鱼置于冰水中孵育或在E3中加入过量MS-222进行过量麻醉处死。随后，样本可用于后续研究或按规定丢弃。

6. 图像分析与统计学分析

  1. 使用 Fiji 等图像处理软件处理图像32。根据所获取数据的 z 轴分辨率，可在 2D 或 3D 条件下进行分析。
  2. 通过手动方式定量巨噬细胞，可选择包含明显分离的细胞（例如通过识别主要细胞体），或 alternatively 对带有核标记的细胞进行定量，或在细胞重叠时通过测量面积进行定量（见下一步）。
  3. 为进行面积定量，创建一个涵盖巨噬细胞的掩膜。为此，在 Fiji 中使用 图像 > 调整 > 阈值 工具，并创建一个感兴趣区域 ROI（分析 > 工具 > ROI 管理器 > 添加）。在定量时排除背景中的小颗粒。
    1. 然后，测量面积（分析 > 测量）。需考虑是否应将重叠细胞荧光的区域包含在测量中。
      注意：此处省略了圆形消融区域的面积测量，因为在该区域内无法区分募集的巨噬细胞。
  4. 使用合适的软件绘制测量结果的图表。为比较消融前后的数据，应执行适当的统计检验（此处采用配对单尾 t 检验）。
    注意：可使用图像编辑和图形设计软件准备图示。

结果

激光消融操作按照上述方案进行。成骨细胞在消融区域内的GFP信号在消融后立即消失。为了研究成骨细胞消融后免疫反应的变化，对6 dpf幼鱼在消融前以及6 hpl时巨噬细胞的存在情况进行了成像观察。消融前，在鳃盖区域几乎观察不到巨噬细胞10（图2）。在6 hpl时，检测到消融的鳃盖区域出现巨噬细胞显著聚集，且视野中巨噬细胞数量增加，包括鳃盖及其周围区域10（图2）。

成骨细胞 osterix:nGFP 与巨噬细胞 mpeg1:mCherry 相互作用的荧光显微镜图像。
图 2：6 dpf 斑马鱼幼鱼在损伤后 6 小时的巨噬细胞募集。 未进行激光消融的鳃盖区域及损伤后 6 小时的鳃盖区域。成骨细胞标记为绿色，巨噬细胞标记为品红色，虚线圆圈表示激光消融区域。比例尺：50 µm。 请点击此处查看此图的放大版本。

在4天龄幼鱼中也分析了巨噬细胞的募集情况，这些幼鱼的鳃盖较小，在激光消融后4小时观察到了类似的结果（图3）。对巨噬细胞数量（位于激光消融位点以外区域）的定量分析显示，在所研究的时间范围内细胞数量有所增加（消融前为4.00 ± 2.37个巨噬细胞，消融后4小时为7.00 ± 2.76个巨噬细胞）（图3B）。同样，巨噬细胞所占面积（以µm2为单位测量，消融前为785.8 µm2 ± 723.1 µm2，消融后4小时为1553 µm2 ± 869.9 µm2）也有所增加（图3C）。由于巨噬细胞有时难以区分，建议采用测量巨噬细胞面积而非计数细胞数量的方法，本文即采用了此方法。

斑马鱼巨噬细胞行为的荧光显微镜图像，包含细胞计数和面积定量图。
图 3：4 日龄斑马鱼幼鱼在激光消融后 4 小时（4 hpl）的巨噬细胞募集情况。（A）未消融及消融后 4 hpl 的鳃盖区域。绿色标记成骨细胞，品红色标记巨噬细胞，虚线圆圈表示激光消融区域。比例尺：50 µm。（B）消融前（0 hpl）和消融后（4 hpl）鳃盖区域巨噬细胞数量的定量分析。（C）巨噬细胞面积的定量分析（排除激光消融位点）。采用配对单尾 t-检验。每个数据点代表一条幼鱼的数据，显示均值 ± 标准差，n = 6。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

激光消融已应用于生物研究的多个领域。特别是，它作为一种研究组织再生的方法非常有用10,11,12。例如，最近通过紫外激光或双光子激光消融实验，结合成骨细胞在激光消融位点的恢复情况，对先天免疫细胞的募集及其表型变化进行了动态分析10。活体成像可实现损伤后12小时（hpl）内的免疫细胞募集监测；然而，通过适当调整麻醉方案并获得相关机构批准，可设想更长时间的成像观察。在Geurtzen等人的研究中，分析持续至激光消融后数天，有助于明确消融部位的炎症微环境，并确立巨噬细胞在骨再生中的支持作用10。许多其他应用也可行，例如研究细胞死亡过程中活性氧物质 释放对骨组织的影响33 。

使用双光子激光介导细胞消融技术的一个优势在于，可将其与共聚焦成像相结合。此处使用的软件（见材料表）可设置为一种模式（实时数据模式），使成像与消融连续进行，从而加快实验进程。该技术的另一优势在于消融的精确性。消融的大小和形状可在软件中以非常精确的方式轻松调节。在本实验设置中，选择直径为25 µm的圆形区域进行消融。然而，在其他针对Drosophila的消融实验中，曾采用长度为25 µm的线性消融，通过切断相邻细胞间的连接来降低胚胎上皮组织中的组织张力34。这种高精度使得研究人员能够特异性地消融特定数量的细胞、单个细胞，甚至细胞膜。

值得注意的是，使用双光子激光造成的损伤类型并不类似于自然发生的损伤和细胞死亡，这一点在再生研究以及其他 学科中均需牢记 。特别是，激光消融通过完全破坏（烧毁）目标区域内的细胞来形成高度集中的损伤20，对周围组织的损伤极小；而机械性或其他类型的损伤往往在更广泛的范围内影响多种组织类型和层次。这可能导致涉及多种细胞死亡方式（如坏死、凋亡、自噬）35以及不同再生结果的多重后果。此外，细胞和分子层面对激光消融的反应也可能存在差异。例如，已有研究表明，尽管激光损伤部位周围的细胞可能失去质膜完整性，但它们仍能存活并恢复完整性36。激光消融还会导致细胞外基质受损区域的形成，这可能是由于激光束中心区域发生"热爆炸"以及邻近细胞受到强烈热暴露所致10,37。然而，如在激光消融的心脏组织中所显示，损伤区域周围的细胞会出现更多凋亡小体38，并且会触发免疫反应，本文结果也证实了这一点。除了上述差异外，激光辅助消融实验的另一局限性可能是损伤操作的深度以及样本尺寸的限制。在较厚样本中隐藏的结构可能无法被有效消融，成像也会变得困难。然而，这一问题在很大程度上取决于所使用的显微镜、激光器、物镜以及包埋方式。

在使用倒置显微镜系统（如本方案所述）时，必须将幼鱼包埋至鳃盖靠近培养皿玻璃底面的位置。此外，在用低熔点琼脂糖（LMA）覆盖幼鱼前（步骤3.4），务必测试其温度，因为过热的琼脂糖会损伤幼鱼。为避免此问题，建议提前从加热模块中取出LMA分装液，例如在移除玻璃底培养皿中残余E3培养基时即取出，并通过触碰手腕皮肤等方式测试温度。LMA应保持温热，但不可过热。

一旦幼虫被LMA覆盖，必须在LMA开始凝固前迅速将其放置到正确位置。侧向位置最容易实现；在本研究中，所需的位置是略微向腹侧倾斜的侧向。如果LMA在幼虫尚未正确放置时即已凝固，可将LMA去除（如步骤5.1所述），然后重复包埋过程。同样，为获得最佳成像质量和细胞消融效果，需要成像（及激光消融）的区域应尽可能靠近培养皿的玻璃底部，尽管这也取决于物镜的工作距离。

可以将多个幼虫置于同一培养皿中进行成像。这样做能够节省时间，并更有效地利用线性运动分析仪（LMA）。可包埋的幼虫数量取决于实验人员的经验，建议包埋3至5条幼虫。

也可以使用配备浸水物镜的直立显微镜系统进行激光消融。在此情况下，重要的是将幼体以略微腹侧朝上的视角（从上方观察）包埋，以便获得良好的成像质量，并成功对鳃盖进行激光消融。此外，幼体表面仅需覆盖一层薄的低熔点琼脂糖（LMA），以利于荧光信号的有效激发和检测。

本方案描述了一种通过双光子激光介导的成骨细胞消融技术，可用于在发育中的骨骼（特别是间鳃盖骨）上制造损伤。该方法可经调整后用于消融斑马鱼发育过程中其他骨骼中的细胞。此外，该技术也是研究受损组织再生的一种通用且有效的方法11,12。由于能够便捷地实施不同大小和形状的细胞消融与组织切割，该技术可广泛应用于多种实验设计和研究领域15,17,18,19,21,34。总体而言，双光子激光介导的消融技术具有高度的适应性，适用于不同组织、不同生物体，甚至可用于 in vitro 实验环境，是生物学研究中的一项 重要 工具。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由德国研究基金会（DFG）跨区域合作项目 Transregio 67（项目编号 387653785）以及 DFG 优先计划 SPP 2084 µBone（项目编号 KN 1102/2-1）资助，资助对象为 FK。本工作还得到了德累斯顿工业大学 CMCB 技术平台核心设施——光学显微镜设施（DFG 项目编号 413875620）的支持。德累斯顿工业大学的研究工作由萨克森州议会（“Landtag”）批准预算中的税收收入共同资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
二水合氯化钙，CaCl2·H2OCarl Roth5239.1
细胞培养皿，聚苯乙烯材质，100/20 mmGreiner Bio-one664160
Dumont #55 镊子FST11295-51尖端形状为直头，长度11 cm，尖端尺寸0.05 × 0.02 mm
Falcon 6孔板Corning353502
玻璃底小培养皿MatTekP35G-1.5-14-C35 mm 培养皿，1.5号盖玻片，玻璃直径14 mm，未包被
Insight X3 多光子激光器Spectra-Physics
Leica 应用套件LAS X，Leica Microsystems
低熔点琼脂糖 Biozyme840101Biozym Plaque Agarose
七水合硫酸镁，MgSO4·7H2OSigma-AldrichM5921
交配笼多种型号，例如 Tecniplast
亚甲蓝Carl RothA514.1
MS-222SIGMA AldrichA5040
氯化钾，KClPanReac AppliChem131494
氯化钠，NaClCarl Roth3957.1
SP8 FALCON Leica Microsystems配备 Insight X3 多光子激光器和 Leica 应用套件软件
不锈钢解剖针Bochem12010140 mm
体视显微镜系统 SZX16Olympus配备 LED 照明底座 SZX2-ILLTQ
恒温培养箱 TS - WTWxylemTS 608/2-i用于胚胎培养
移液管，3.5 mLSARSTEDT861171155 × 15 mm，低密度聚乙烯材质，透明
Zeiss SteREO Discovery.V12 版本 4.7.1.0.Zeiss配备 Axiocam MRm 相机和 AxioVision 软件

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双光子消融成骨细胞消融骨再生共聚焦显微镜巨噬细胞募集免疫反应鳃盖成像低熔点琼脂糖转基因斑马鱼
利用双光子激光消融发育期斑马鱼幼鱼中的成骨细胞
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