发育中的斑马鱼幼虫的双光子激光介导的成骨细胞消融

Summary

该协议描述了在斑马鱼幼虫中进行的双光子激光消融方法，该方法用作研究骨再生和免疫反应对消融的影响的模型。

Abstract

斑马鱼 （Danio rerio） 具有出色的再生不同器官和附属物的能力。斑马鱼的骨骼再生已经使用不同的方法进行了研究，例如鳍截肢、拔鳞、颅骨环切和显微镜方法。使用配备双光子激光器的共聚焦激光扫描装置，开发了一种激光消融方法作为病变范式，以消融斑马鱼幼虫发育中的成骨细胞（成骨细胞）。这里描述的方法允许以精确的方式消融细胞，因为面积、形状和深度可以微调。此外，这种方法允许在消融之前和之后对区域进行成像，以便分析损伤的短期影响。在这个实验装置中，研究了受伤区域成骨细胞消融后的免疫反应。消融后观察到巨噬细胞募集的增加，表明它们在骨再生过程中存在的相关性。

Introduction

斑马鱼可以再生各种器官，例如视网膜、大脑、心脏和胰腺¹。此外，斑马鱼可以再生骨骼元素，这就是为什么它们被用来研究鳍、鳞片和颅骨（颅帽）的再生²。不同的实验范式已被用于研究组织和骨骼再生，例如鳍切除术（截肢）、鳍骨折、颅骨穿孔 ^3,4、冷冻损伤 ^5,6 或遗传消融 ^7,8,9。最近，激光消融方法已广泛用于斑马鱼，以研究受伤后的愈合和再生反应 10,11,12,13,14。

激光介导的消融已用于生物学研究的不同领域，例如机械生物学、发育生物学、再生研究和肿瘤手术 10,11,12,15,16,17,18,19。激光烧蚀的方法多种多样，例如使用 YAG（钇铝石榴石）、UV（紫外线）或 2p（双光子）激光器²⁰。激光消融可以非常准确地去除单个细胞或较大部分的组织，从而能够研究不同的过程，例如免疫系统对肿瘤消融的反应²¹ 或斑马鱼鳃盖再生过程中。在后一个例子中，通过细胞核和细胞质荧光团信号的消失以及坏死染色来证实消融^10,22。

众所周知，先天免疫反应及其调节动力学对于适当的组织再生至关重要。中性粒细胞和巨噬细胞是最早被募集到损伤部位的细胞，它们在那里发挥不同的作用，例如细胞因子和生长因子释放、细胞碎片清除和细胞外基质重塑²³。在截肢的斑马鱼鳍²⁴ 和发育中的鳃盖中也观察到这种募集和随后的巨噬细胞功能化，鳃盖经受激光"纳米解剖"导致成骨细胞消融¹⁰。在后一个实验中，观察到紫外激光和双光子激光介导的消融后成骨细胞数量恢复、鳃盖发育正常以及先天免疫细胞（中性粒细胞、巨噬细胞和破骨细胞样细胞）向受伤区域募集¹⁰。使用糖皮质激素对免疫系统进行药理学抑制的斑马鱼实验表明，免疫力失调后再生受损，支持免疫系统在组织修复中的功能作用 3,10,25,26。

在这里，描述了一种双光子激光介导的消融方法，用于研究发育中的斑马鱼骨骼中骨再生的生物学。特别是，成骨细胞消融方法在鳃盖中的作用表现在免疫反应方面，这是通过监测巨噬细胞募集到消融部位来研究的。

Protocol

该研究方案获得了萨克森州州长的批准，许可证编号为 25-5131/564/2、DD25-5131/450/4、25-5131/496/56、DD25.1-5131/354/87。所使用的斑马鱼品系根据国家法律和标准化条件进行维护^{，如前所述 27,28}。材料表中列出了研究中使用的所有试剂和设备的详细信息。

1. 材料和溶液的制备

1. 将胚胎维持在 1x E3 培养基中。通过在 10 L 去离子水中稀释 170 mL 的 60x E3 原液并加入 2 mL 0.1% 亚甲蓝来制备 1x E3 培养基。
   1. 通过在 1 L 去离子高压灭菌水中混合 17.2 g NaCl、0.76 g KCl、2.90 g CaCl₂·2 H₂O、4.90 g MgSO₄·7 H₂O 来制备 60x E3 培养基储备液。
2. 对于幼虫包埋，提前准备 1% 低熔点琼脂糖 （LMA） 的等分试样，并将其保存在室温下。
   1. 要制备等分试样，将 LMA 溶解在 1x E3 培养基中，例如，在锥形瓶中将 500 mg LMA 溶于 50 mL 1x E3 中，在微波炉中加热溶液直至琼脂糖完全溶解，然后将其分装成 1 mL 等分试样，装在 1.5 mL 试管中。

2. 斑马鱼育种和胚胎采集

注意:双转基因斑马鱼幼虫报告存在定型成骨细胞 [osterix:nGFP = Tg（Ola.Sp7:NLS-GFP）^zf132]²⁹ 和巨噬细胞 [mpeg:mCherry = Tg（mpeg:mCherry）^gl23] 在这里使用³⁰ （图 1A）。

1. 在交配前一天晚上，将具有所需单转基因的亲本斑马鱼放在标准交配笼中。
   注意:标准交配笼允许卵传递到亲本斑马鱼无法接触到它们的较低隔间。
   1. 使用交配笼中的隔板将雄性和雌性分开，直到交配。第二天早上取下隔板以开始交配。
2. 最迟在中午，从繁殖箱中取出亲本斑马鱼并收集胚胎，通过筛子过滤交配笼中的水。
   注意:如果幼虫的确切年龄是决定性的，请定期收获胚胎，间隔约为 30 分钟。离合器配合应用于不同实验组的实验。
3. 将胚胎放入含有 1x E3 培养基的 100 mm 直径培养皿中，并将它们保存在 28 °C³¹ 的培养箱中。
4. 在立体显微镜的帮助下，使用塑料移液器从培养皿中取出未受精的鸡蛋和死胚胎，并每天更换 1x E3 培养基。
5. 实验前，使用荧光立体显微镜对报告基因转基因阳性的幼虫进行分类。

3. 幼虫包埋在低熔点琼脂糖中

1. 在 65 °C 的热块或水浴中熔化 LMA 等分试样。 一旦LMA熔化，将其保持在42°C直至包埋（图1B）。将 50 μL 0.4% MS-222 添加到熔化的 1 mL LMA 等分试样中，以达到 0.02% MS-222 浓度用于麻醉。
2. 在 0.02% MS-222 E3 培养基中麻醉 4 dpf（受精后天数）幼虫（或更老的幼虫）。
3. 使用 3 mL 塑料巴斯德移液器将麻醉的幼虫转移到玻璃底微孔培养皿中，并使用相同的移液器去除多余的 E3 培养基（图 1B）。避免幼虫干燥。
   注意:一个培养皿中可以同时包埋多个幼虫;建议包埋 3 到 5 只幼虫，以便有足够的时间放置。
4. 从水浴/热块中取出熔化的 LMA 琼脂糖，向培养皿中加入（冷却）LMA 滴，覆盖幼虫所在的玻璃底部。注意 LMA 不会太热，但仍然是液体。
5. 然后，在琼脂糖凝固之前将幼虫置于所需的横向位置。在这里，确保鳃盖的横向位置尽可能靠近培养皿的玻璃底部，作为反向显微镜设置的准备（图 1B）。
6. 让琼脂糖凝固，然后将 E3 培养基（最多含有 0.02% MS-222）添加到培养皿中，以避免琼脂糖干燥（图 1B）。

图 1:包埋程序的示意图。（A） 双转基因 Tg（osterix:nGFP;mpeg1:mCherry）^29,30 只斑马鱼幼虫，绿色标记的鳃盖成骨细胞和红色标记的巨噬细胞。（B） 嵌入程序的工作流程，如协议的步骤 3 中所述。请单击此处查看此图的较大版本。

4. 幼虫 的活体 成像和激光消融

1. 激光消融转基因斑马鱼发育中鳃盖中的成骨细胞 Tg（osterix:nGFP;mpeg1:mCherry）^29,30，使用带有 25x/0.95 水物镜或等效设置的倒置双光子激光扫描显微镜。
2. 将带有嵌入幼虫的培养皿放在倒置显微镜的显微载物台上，并将所需的消融区域定位在视野中心。在 GFP 荧光信号的帮助下，可以很容易地识别鳃盖。
3. 一旦鳃盖聚焦并在显微镜的视野中居中，选择 z 堆栈设置（通常使用 1-2 μm z 间隔）来对鳃盖的整个宽度进行成像。同时，在特定的 z 平面中选择要消融的区域（通常在鳃盖的后区）。双光子激光烧蚀仅在该平面上施加。
   注意:z 维度的分辨率越高，成像时间越长，但稍后将能够对采集的数据进行体积分析。
4. 消融前对感兴趣的鳃盖区域进行成像。对于 GFP 检测，请使用 488 nm 的白光激光器和 495 nm 至 550 nm 或等效波长的混合检测器。使用 555 nm（白光激光）激发对巨噬细胞进行成像，在混合检测器（或等效检测器）上，mCherry 检测范围为 595 至 780 nm。
   1. 使用 512 x 512 图像格式以获得良好的质量/时间比（如果需要更高分辨率或更高的速度，可以使用其他格式）。
      注意:可以使用安装在显微镜上的温控培养箱并进行调整，例如，至 28 °C。
5. 在选定的 2D 平面上绘制一个直径为 25 μm 的圆形区域（可根据实验选择其他形状和大小），使用 ROI 工具聚焦鳃盖。
6. 要进行消融，请以 450 mW 的功率（无物镜测量）施加，并以 400 Hz 的扫描速度和 10 秒的总持续时间将所选区域暴露于双光子激光器。在消融过程中，可以使用 401-443 nm 或等效范围内的混合探测器可视化该区域。
7. 消融后，通过使用相同的设置再次成像相同的 z 堆栈来确认消融的结构。消融区域不再包含荧光细胞。

5. 幼虫的恢复和成像监测免疫细胞募集

1. 如果需要延迟进行免疫细胞募集的成像，请从成像和麻醉中恢复幼虫。使用镊子或解剖针小心地从 LMA 中取出幼虫。
   1. 首先，去除覆盖幼虫的一层琼脂糖。其次，去除与幼虫直接接触的琼脂糖。如果正在立即进行免疫细胞募集的成像，则省略此步骤。
2. 将幼虫放回装有纯 E3 培养基的培养皿中，并检查其恢复情况。幼虫的游泳可以明显恢复。
3. 在 4 或 6 hpl（病变后小时），在同一显微镜上使用相同的设置再次对鳃盖区域进行成像，以检查消融对巨噬细胞募集的影响。为此，请重复嵌入（步骤 3）和之前执行的成像（步骤 4）。
4. 成像后，从 LMA 中取出幼虫。根据法律要求，可以通过在冰水中孵育或在 E3 中过量的 MS-222 来杀死幼虫。然后，标本可用于后续研究或丢弃。

6. 图像分析和统计分析

1. 使用图像处理软件（如 Fiji³²）处理图像。根据所采集数据的 z 分辨率，可以在 2D 或 3D 中进行分析。
2. 通过包括明显分离的细胞（例如通过识别主要细胞体），或者用核标记定量细胞，或者在细胞重叠的情况下测量面积（下一步），手动定量巨噬细胞。
3. 为了量化该区域，请创建一个包含巨噬细胞的面膜。为此，请使用 Image > Adjust > Threshold 工具，并在斐济创建一个 ROI（Analyze > Tools > ROI Manager > Add）。在背景中排除小颗粒进行定量。
   1. 然后，测量面积 （Analyze > Measure）。考虑是否需要在测量中包括重叠细胞荧光的区域。
      注意:在这里，面积测量中省略了圆形消融区域，因为在该区域无法区分募集的巨噬细胞。
4. 使用合适的软件生成图表，绘制测量结果。为了比较消融前后的数据，请进行适当的统计检验（这里进行了成对的单尾 t 检验 ）。
   注意:可以使用照片编辑和图形设计软件准备这些图表。

Results

按照上述方案中的指示进行激光消融。消融后消融区成骨细胞的 GFP 信号瞬间消失。为了研究成骨细胞消融对免疫反应的反应，对 6 dpf 幼虫中巨噬细胞在 6 hpl 之前和 6 hpl 时的存在进行了成像。消融前，在鳃盖区¹⁰ 观察到的巨噬细胞非常少（图 2）。在 6 hpl 时，检测到巨噬细胞在消融的鳃盖区的强烈积累和视野中巨噬细胞数量的增加，包括鳃盖和鳃盖周围区域¹⁰ （图 2）。

图 2:6 dpf 斑马鱼幼虫中 6 hpl 的巨噬细胞募集。 未消融的鳃盖区，为 6 hpl。鳃盖成骨细胞标记为绿色，巨噬细胞标记为品红色，虚线圆圈表示激光消融区域。比例尺:50 μm。 请点击此处查看此图的较大版本。

还在 4 hpl 时分析了 4 dpf 幼虫中巨噬细胞募集，鳃盖小得多，观察到类似的结果（图 3）。巨噬细胞数量（在直接激光消融部位之外）的定量显示，在研究的时间范围内增加（消融前 4.00 ± 2.37 个巨噬细胞，而 4 hpl 时为 7.00 ± 2.76 个巨噬细胞）（ 图 3B）。同样，巨噬细胞面积（以消融前 μm²、785.8 μm² ± 723.1 μm² 为单位测量，而 4 hpl 时为 1553 μm² ± 869.9 μm² ）增加（图 3C）。由于巨噬细胞有时难以区分，因此建议测量巨噬细胞面积而不是巨噬细胞数量，就像这里所做的那样。

图 3:4 dpf 斑马鱼幼虫中 4 hpl 的巨噬细胞募集。 （A） 未消融且 4 hpl 的鳃盖区。鳃盖成骨细胞标记为绿色，巨噬细胞标记为品红色，虚线圆圈表示激光消融区域。比例尺:50 μm。（B） 消融前 （0 hpl） 和消融后 （4 hpl） 鳃盖区巨噬细胞数量的定量。（C） 巨噬细胞面积的定量（不包括激光消融部位）。配对的单尾 t 检验。每个点代表一个幼虫的数据，并显示 SD ±平均值，n = 6。 请单击此处查看此图的较大版本。

Discussion

激光消融已应用于生物学研究的各个学科。特别是，它作为研究组织再生的方法很有用 10,11,12。例如，最近使用紫外激光或双光子激光消融测定分析了先天免疫细胞随时间的变化，以及激光消融位点成骨细胞的恢复¹⁰。免疫细胞募集的实时成像在病变后 12 小时 （hpl） 进行;但是，通过对麻醉进行适当调整并获得相关当局的批准，可以设想更长的成像时间。在 Geurtzen 等人中，在激光消融后长达几天内进行了分析，有助于确定消融部位的炎症环境，以及确定巨噬细胞在骨再生中的支持作用¹⁰。许多其他应用，例如研究活性氧在骨组织中细胞死亡时释放³³ 的作用，都是可以想象的。

使用双光子激光介导的细胞消融术的优势之一是可以将其与共聚焦成像相结合。这里使用的软件（参见 材料表）可以设置为成像和消融连续发生的模式（实时数据模式），从而加快过程。该技术的另一个优点是消融的准确性。消融的大小和形状可以在软件中以非常精确的方式轻松调整。在此处介绍的实验设置中，选择直径为 25 μm 的圆形区域进行消融。然而，果 蝇 中的其他消融实验采用了 25 μm 线性消融，以便通过切割相邻细胞连接来降低胚胎上皮的组织张力³⁴。这种准确性允许消融特定和受控数量的细胞、单个细胞甚至细胞膜。

值得注意的是，使用双光子激光进行的病变类型与自然发生的损伤和细胞死亡不同，这在再生研究中需要牢记，但也需要牢记其他学科。特别是，激光消融通过完全破坏（燃烧）感兴趣区域中的细胞²⁰ 而对周围组织的损伤最小，从而产生非常集中的病变，而机械或其他类型的损伤往往在更广泛的范围内影响多种组织类型和层。这可能导致多种后果，涉及不同类型的细胞死亡（例如坏死、凋亡、自噬）³⁵ 和不同的再生结果。此外，对激光消融的反应可能在细胞和分子方面有所不同。例如，研究表明，尽管激光损伤部位周围的细胞可能会失去质膜完整性，但它们可以在损伤中存活并恢复完整性³⁶。激光消融还会导致细胞外基质受损的区域，这可能是由于所施加激光束中心的"热爆炸"以及直接相邻细胞中的强烈热暴露造成的^10,37。然而，激光消融位点周围的细胞显示凋亡小体数量增加，如激光消融心脏组织³⁸ 所示，并触发免疫反应，如图所示。除了描述的差异之外，激光辅助消融测定的另一个限制可能是可以进行损伤的深度和标本大小的有限。隐藏在厚标本中的结构可能无法适当消融，并且难以成像。然而，这在很大程度上取决于所使用的显微镜和激光器，以及物镜和嵌入。

以某种方式包埋幼虫，使鳃盖靠近培养皿的玻璃底部，这在使用倒置设置的情况下是必不可少的，如所提出的方案所示。此外，在将 LMA 用于覆盖幼虫之前（步骤 3.4）测试其温度非常重要，因为热琼脂糖会损坏幼虫。为避免这种情况，请尽早从加热块中取出 LMA 等分试样，例如，从玻璃底培养皿中取出剩余的 E3 培养基，并测试温度，例如在手腕皮肤上。LMA 应该是温暖的，但不是热的。

一旦幼虫被 LMA 覆盖，在 LMA 开始凝固之前迅速将它们置于正确的位置非常重要。横向位置最容易实现;在所介绍的研究中，所需的位置是外侧，略微向腹侧倾斜。如果 LMA 在幼虫正确定位之前凝固，则可以去除 LMA（如步骤 5.1 中）并重复包埋。同样，重要的是，要成像（和激光烧蚀）的区域应尽可能靠近培养皿的玻璃底部，以实现最佳图像质量和细胞消融，尽管这也取决于物镜的工作距离。

可以将多个幼虫包埋在同一培养皿中进行成像。这将节省时间并更好地利用 LMA。可以包埋的幼虫数量将取决于实验者的经验，但建议使用 3-5 只幼虫。

激光消融也可以使用采用浸渍透镜的正置显微装置进行。在这种情况下，重要的是将幼虫嵌入略微腹侧的视图（从上方），以实现良好的成像质量和鳃盖的激光消融成功。此外，只有一层薄薄的 LMA 应覆盖幼虫，以允许良好的激发和检测荧光信号。

在该协议中，成骨细胞的双光子激光介导的消融装置被描述为一种在发育中的骨骼中执行病变的方法，特别是在鳃盖中。这种方法可以适用于消融发育中的斑马鱼其他骨骼中的细胞。此外，它通常是研究受伤组织再生的有用方法^11,12。易于进行不同大小和形状的消融和组织切割，使其可用于不同的实验装置和研究领域 15,17,18,19,21,34。总而言之，双光子激光介导的消融是一种适应性很强的方法 - 适用于不同的组织、生物体，甚至体外环境 - 它代表了生物学研究中的重要工具。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
氯化钙二水合物，CaCl2·H2O	Carl Roth	5239.1
细胞培养皿，PS，100/20 mm	Greiner Bio-one	664160
Dumont #55 Foceps	FST	11295-51	尖端形状直，11 cm，0.05 x 0.02 mm
Falcon 6 孔板	Corning	353502
玻璃底微孔培养皿	MatTek	P35G-1.5-14-C	35 mm 培养皿，1.5 号盖玻片，玻璃直径 14 mm，未镀膜
Insight X3 多光子激光器	Spectra-Physics
徕卡应用套件	LAS X，徕卡显微系统
公司 低熔点琼脂糖	Biozyme		840101 Biozym 噬菌斑 琼脂糖
硫酸镁 七水合物， MgSO4·7H2O	Sigma-Aldrich	M5921
交配笼			多种，例如 Tecniplast
亚甲蓝	Carl Roth	A514.1
MS-222	SIGMA Aldrich	A5040
氯化钾、KCl	PanReac AppliChem	131494
氯化钠、NaCl	Carl Roth	3957.1
SP8 猎鹰	徕卡显微系统		配备 Insight X3 多光子激光器和徕卡应用套件软件
不锈钢解剖针	Bochem	12010	140 mm
体视显微镜系统 SZX16	奥林巴斯		配备 LED 照明底座 SZX2-ILLTQ
恒温柜 TS - WTW	木质部	TS 608/2-i	用于孵化（胚胎）
转移移液管，3.5 mL	SARSTEDT	861171	155 x 15 mm，LD-PE，透明
蔡司 SteREO Discovery.V12 版本 4.7.1.0。	蔡司		配备 Axiocam MRm 相机和 AxioVision 软件