利用多重荧光免疫组织化学染色法检测反复种植失败女性子宫自然杀伤细胞的四种亚型

摘要

本研究提出了一种利用先进的多重荧光免疫组织化学染色技术，在胚胎着床窗口期定量子宫自然杀伤细胞亚群的开创性方法。

摘要

免疫组织化学（IHC）在生物研究和临床诊断中发挥着关键作用，是识别和可视化组织抗原最常用的方法。然而，传统的IHC染色方法在区分多种免疫细胞亚型方面存在局限性。这一挑战促使科学家探索新的技术和方法，以精确识别和区分免疫细胞亚型。近年来，多重IHC技术应运而生，能够在同一组织样本中同时检测并可视化多种抗原。子宫自然杀伤（uNK）细胞在早期妊娠过程中发挥着关键作用，包括蜕膜化、子宫螺旋动脉重塑以及胚胎着床等过程。不同亚型的uNK细胞具有不同的功能，使其能够协调多种生物学事件，以确保胚胎正常发育和成功妊娠。因此，深入研究uNK细胞亚型对于阐明妊娠期间免疫调控机制至关重要。此类研究为不孕症和反复生殖失败等相关疾病的机制理解提供了宝贵见解，并开拓了新的研究路径。本文介绍了一种详细的多重IHC染色方案，用于研究着床窗口期（WOI）子宫内膜样本中四种uNK细胞亚型的密度。该方案包括样本制备、亚型标志物的优化、显微成像及数据分析。该多重IHC染色方案具有高特异性和高灵敏度，可实现不同uNK细胞亚型的同步检测，为研究人员探索妊娠期间免疫调控的复杂性与机制提供了有力工具。

引言

首例有记录的活产后 体外 体外受精-胚胎移植（IVF-ET）于1978年首次报道。在过去的40年中，不孕夫妇对IVF-ET技术的需求一直居高不下¹2021年，美国共有238,126名患者启动了共计413,776个试管婴儿（IVF）周期。与两年前相比，周期数增加了25%，与2012年相比则增长了135%。²这一增长主要归因于不孕症患病率的上升以及妊娠计划的推迟。胚胎培养技术与超排卵方案的进步使得每次胚胎移植周期的活产率显著提高，在40岁以下女性中达到30%–50%，而在40岁以上女性中则低于30%。²然而，尽管取得了这些进展，超过一半的移植胚胎仍无法着床。反复着床失败（RIF）通常定义为连续三次或以上高质量胚胎移植尝试失败，影响约15%接受体外受精-胚胎移植（IVF-ET）的女性。³反复种植失败（RIF）的夫妇极为脆弱，更容易接受昂贵且不必要的治疗程序，从而面临过度的风险⁴因此，了解反复着床失败（RIF）的原因并提高胚胎着床率，对于提升体外受精-胚胎移植（IVF-ET）的成功率至关重要，尤其是对于RIF患者。子宫内膜的准备是成功胚胎着床的关键环节。该过程的一个显著特征是子宫自然杀伤细胞（uNK细胞）的大量积聚，其比例在分泌中期子宫内膜淋巴细胞中约占30%，而在早期妊娠的蜕膜组织中则上升至70%–80%。⁵值得注意的是，uNK细胞不同于外周NK细胞，后者是先天免疫系统中的重要细胞毒性淋巴细胞，可通过裂解或诱导凋亡导致感染细胞死亡。尽管uNK细胞的确切功能尚未完全阐明，但多项证据表明其参与血管生成重塑、滋养层细胞侵袭以及胎儿发育过程。⁶. 过去20年来，子宫自然杀伤细胞（uNK细胞）占间质细胞百分比与反复种植失败（RIF）之间的关联受到广泛关注。一项近期纳入8项研究、共604名女性的荟萃分析表明，与生育正常女性相比，RIF女性在黄体中期子宫内膜CD56+ uNK细胞密度显著升高⁷然而，需要注意的是，黄体中期的uNK细胞特征与蜕膜自然杀伤细胞（dNK细胞）存在显著差异。尽管uNK细胞在妊娠后可能进一步分化为多种dNK细胞亚群，但仅检测uNK细胞并不能准确反映dNK细胞的情况。⁸子宫自然杀伤细胞（uNK细胞）经历动态分化过程，在月经周期和蜕膜化过程中发挥不同作用，其复杂性无法仅通过CD56单一标记进行识别。要全面理解uNK细胞在子宫内膜准备过程中的行为，需要使用多种标记物。我们近期的研究采用单细胞RNA测序技术，系统分析了月经周期中uNK细胞的异质性。经流式细胞术验证的结果显示，存在四种不同的uNK细胞亚型，各亚型在月经周期中均表现出动态变化⁹基因富集分析和基因本体功能富集分析表明，这些uNK亚群在月经周期的不同阶段发挥着不同的功能。然而，流式细胞术在临床实验室中并非普遍可用，且新鲜子宫内膜组织需立即进行酶消化处理，导致实验步骤一旦出错便无法重复。

因此，本研究的目的是探讨利用多重染色检测方法对这四种NK细胞亚群进行检测，从而提供一种更为实用的诊断方法。在多重染色中，针对不同靶标的特异性抗体分别与不同的荧光染料标记物相连，这些荧光染料在特定波长的光激发下会发射出不同波长的光。与传统的免疫组化（IHC）染色方法相比，该方法能够对样本中多个靶标的相对丰度和分布进行定量比较，并提供不同靶标之间相互作用和共定位的信息，使我们能够识别出不同类型的uNK细胞。这一方法不仅将加深我们对uNK细胞与反复种植失败（RIF）之间关系的理解，还将为研究子宫内膜相关疾病中的其他免疫细胞亚群提供新的思路。

方案

本研究获得了香港中文大学—新界东联网临床研究伦理委员会（CREC 参考编号：2022.581）的批准。反复种植失败（RIF）患者来自香港中文大学威尔斯亲王医院辅助生殖技术中心。RIF 的定义为：年龄小于 40 岁的女性，在至少 3 个新鲜或冷冻胚胎移植周期中，累计移植不少于 4 个优质胚胎后仍未获得临床妊娠¹⁰。在采集子宫内膜活检样本前，已从参与者处获得知情同意。

1. 子宫内膜样本的采集与处理

1. 子宫内膜标本采集时间
   1. 按照严格方案采集子宫内膜样本，以确保研究参与者之间的一致性。对于自然周期患者，自月经周期第9天起进行尿液分析^th 月经周期的第7天进行子宫内膜活检^th LH峰后第7天（LH+7）¹¹ 对于接受激素替代治疗（HRT）周期的患者，从月经周期第2天开始，每日口服6 mg戊酸雌二醇。
   2. 在月经周期第13天通过超声检查评估子宫内膜厚度。当子宫内膜厚度达到或超过8 mm时，经阴道给予黄体酮，并在给药后5天进行子宫内膜活检¹².
2. 子宫内膜样本采集与固定：将吸管取样器插入宫腔，推进至宫底部；通过下拉内部活塞产生负压，同时在宫腔内进行旋转和上下移动，刮取子宫内膜表面组织。用生理盐水冲洗所采集的标本，以去除宫颈及宫腔分泌物。测量样本并评估其大小。对于尺寸为3 mm × 15–25 mm的样本，应立即浸入10 mL 10%中性缓冲福尔马林溶液中，在室温下固定24–48小时。
3. 脱水：固定完成后，对样本进行脱水处理，以乙醇逐步置换组织中的水分。具体操作为将组织依次浸入70%、80%、90%和100%的乙醇溶液中，确保彻底脱水。最后一次乙醇处理后，用二甲苯透明样本，以去除残留的乙醇，并为石蜡浸润做准备。
4. 包埋：将组织平整地放置于模具底部后，熔化石蜡并小心地加入样本中，确保子宫内膜组织完全包埋在石蜡基质中。用石蜡填充模具后，置于冷冻台冷却以促进石蜡凝固。待石蜡块完全硬化后，于室温下保存，直至后续处理需要时取出。
   注意：所使用的模具经过特别选择，以适应所获取的子宫内膜样本的大小，使子宫内膜组织能够平展地置于底部而不发生折叠，从而确保后续切片时的最佳方向性，同时避免产生不必要的多余部分。
5. 包埋切片：为进行切片，将石蜡包埋块置于4 °C冰箱中冷藏2 h。使用切片机将样品切成4 µm厚的切片，随后将切片铺展在42 °C预热的蒸馏水表面，并转移至防脱玻片上。将切片置于切片烘片机中过夜，使用前于室温下保存。

2. 多重免疫组织化学条件的优化

1. 免疫组化（IHC）验证：为验证免疫组化染色参数，应采用系统性方法精细调整抗原修复条件、抗体浓度和孵育时间。
   1. 在制造商推荐的稀释范围内，对每种抗体测试2-3个不同浓度。通过比较pH 6和pH 9的缓冲液来优化抗原修复条件，并在室温下孵育1.5小时与4 °C过夜孵育两种方案之间评估染色效果。
   2. 仔细评估每种条件，重点关注染色强度、特异性和背景噪声。选择能够产生最清晰、最特异染色且非特异性结合最少的最优组合。这一严格的验证过程确保了免疫组化方案的最高准确性和可重复性。
2. 酪胺信号放大（TSA）单plex染色：在确定各抗体的最佳染色参数后，优化不同TSA荧光染料与抗体的配对。将表达水平较高的标志物与荧光强度较低的染料配对，或反之亦然。在此阶段，根据观察到的荧光信号强度调整抗体浓度和孵育时间。若观察到明显的背景染色或非特异性染色，则更换配对的染料¹³。
3. TSA多重染色：对于多重免疫组化（m-IHC）方案，染色顺序已根据既定原则进行了精心设计。为确保多重染色过程能反映单标记染色的灵敏度和特异性，优先将表达水平较低的抗体安排在染色序列的早期阶段。将需要碱性修复进行抗原修复的抗体置于染色序列的末尾，因为相较于酸性修复方法，碱性修复更为稳定，而酸性修复在某些情况下可能加剧非特异性染色伪影。
4. 根据步骤2.1和2.2的研究结果，结合各抗体的抗原修复需求和表达密度，决定使用哪些抗体及其在染色流程中的阶段。例如，CXCR4抗体需要碱性修复进行抗原修复，因此被安排在染色的最后阶段；相反，CD49a抗体因其表达密度较低，被安排在染色序列的第一位。此举旨在最大化成功检测的可能性，并尽量减少多重染色后期可能出现的遮蔽效应。
5. 对于其余抗体，在优化阶段测试不同的组合，以确定在灵敏度和特异性之间达到最佳平衡的最有效染色顺序。这些比较分析的结果将指导最终多重抗体组合的设计，具体如Table 1所示，确保所选抗体组合在最小化背景信号的同时实现最优性能。

3. 多重免疫组化（m-IHC）流程

1. 脱蜡、水化与固定：将组织切片在 60 °C 下烘烤 2 小时，随后依次浸入二甲苯 I（10 分钟）、二甲苯 II（10 分钟）、100% 乙醇（5 分钟）、95% 乙醇（5 分钟）、80% 乙醇（5 分钟）、75% 乙醇（5 分钟）、ddH₂O（每次 2 分钟，共 3 次）、10% 中性缓冲福尔马林（至少 20 分钟），再用 ddH₂O 洗涤（每次 2 分钟，共 3 次）。
2. 抗原修复：根据 表 1 中每种抗体所列的条件，向耐热抗原修复盒中加入 200 mL 相应的 AR6 或 AR9 缓冲液。将切片置于对应的抗原修复缓冲液中，高火微波加热约 2 分钟至沸腾；随后松散覆盖盒盖，低火加热 15 分钟，冷却至室温。用 ddH₂O 和 PBST 冲洗切片。
3. 绘制疏水屏障：用吸水纸吸去多余液体后，使用疏水屏障笔在组织周围画出完整封闭的圆圈。
4. 内源性酶活性的灭活：用 3% 过氧化氢处理切片，在室温下孵育 8 分钟。用 PBST 洗涤 3 次，每次 2 分钟。
5. 非特异性位点的封闭：用吸水纸干燥后，加入封闭液（1x 抗体稀释/封闭液），在室温下孵育 10 分钟。
6. 一抗孵育：去除封闭液后，每张切片加入 150 µL 第一抗体 CD49a，按 1:1000 比例用 1x 抗体稀释液稀释。按照第 2 节中已优化的条件进行孵育。孵育后用 PBST 洗涤 3 次，每次 2 分钟。其余抗体的具体稀释比例请参见 表 1。
7. 二抗孵育：在加入二抗前，用吸水纸吸去多余水分，以防试剂被稀释。每张切片加入 4–5 滴（约 150 µL）1x Anti-Ms + Rb HRP 二抗，室温孵育 10 分钟。孵育后用 PBST 洗涤 3 次，每次 2 分钟。
   注：请注意，1x Anti-Ms + Rb HRP 二抗特异性识别兔源和小鼠源的一抗。
8. TSA 染料信号放大：吸去多余水分后，将 TSA 染料用扩增稀释液按 1:100 稀释。每张切片加入 150 µL 稀释后的 TSA 染料溶液，室温孵育 10 分钟。用 PBST 洗涤 3 次，每次 2 分钟。
9. 对相应的抗体和染料重复步骤 3.2 和 3.5–3.8 的 TSA 操作流程。
10. 细胞核染色：完成最后一轮抗体染色后，将切片置于耐热盒中，加入 200 mL AR6 缓冲液，微波加热至沸腾 2 分钟，再低火加热 15 分钟，以去除未结合的荧光染料。将样本冷却至室温，用 ddH₂O 和 PBST 冲洗。每张切片滴加 150 µL 用 PBST 稀释 1:10 的 DAPI 工作液，室温孵育 10 分钟，再用 ddH₂O 洗涤 2 次。
11. 封片：将切片在避光环境中完全风干约 30 分钟后，加入一滴（约 30 µL）抗淬灭荧光封片剂，盖上盖玻片。
    注：自首次使用 TSA 染料起，所有操作均需避光。染色完成后应尽快进行观察和图像采集，以防止荧光淬灭。

4. 图像采集与分析

1. 曝光时间：使用能够继承与荧光染料相对应的激发和发射波长的成像仪采集图像。设置曝光时间时，需检查具有广泛标记表达水平的切片以确保准确性。针对每个标记/滤光片组合，手动对切片的不同区域进行对焦，并使用自动曝光功能来设定曝光时间。
2. 根据TSA染料选择相应的滤光片，并检测多个切片以确定每个通道的最佳曝光时间。在后续所有图像采集过程中一致应用这些设置，以保证成像数据之间的可比性。
3. 采集区域的选择：为确保组织切片间的采样无偏倚，并在每个分析视野中一致包含管腔上皮结构，应随机选择初始图像采集区域，关键标准是视野中必须存在管腔上皮边界。
4. 在采集初始视野后，通过从起始点向左或向右移动一个视野（每幅图像之间跳过一个视野）系统性地选择后续区域，同时确保管腔上皮边界保留在视野范围内。重复此过程，至少采集五个不同的区域，每个区域均需包含部分管腔上皮，以在整个分析过程中保持一致的分析深度¹⁴。该方法旨在所有采集视野中涵盖至少约10,000个基质细胞，以确保数据收集的全面性和代表性。
5. 图像分析
   1. 图像预处理：为导入并分析多光谱图像，首先在软件界面中导航至 文件 > 打开图像，以加载文件及自发荧光（AF）切片。上传图像后，点击 选择荧光染料 按钮，并选择适当的光谱库，以进行荧光染料解混。完成所有荧光染料的选择后，点击 确定 确认选择。为分离AF光谱，使用AF吸管工具从AF图像中选取具有代表性的组织区域，注意排除任何非组织像素。采样完成后，点击界面左下角的 准备图像 或 全部准备¹⁵。
   2. 组织分割：通过在图像中手动勾画每种组织类型3-5个基础区域来启动分割过程，包括含有上皮细胞的上皮区域、含有基质细胞的基质区域以及无细胞成分的空白区域。若初始分割结果不理想，可手动添加更多注释区域以优化训练数据集，从而提高后续分析的准确性和可靠性。对区域和参数的这种动态调整可确保软件在当前及其他导入图像中更准确地自动识别相似结构。
      注：初始注释作为软件学习各组织组分特征的训练数据集。软件的分割能力将根据组织的复杂性和变异性进行迭代优化。
   3. 细胞分割：点击 分割细胞 以启动细胞分割。在细胞分割设置中，选择细胞核和细胞膜。选择 DAPI 以识别细胞核，并调节强度设置，确保检测到所有细胞核且无背景噪声。选择 CD16、CD49a 和 CD56 信号以定位细胞膜，并利用该信号辅助细胞核的分割。使用 细胞核组分分割 功能区分位置紧密相邻的细胞核。
      注：DAPI标记细胞内部结构。当细胞核彼此靠近或呈现融合状态时，细胞核组分分割功能有助于区分各个细胞核。此步骤对于获得可靠的细胞计数并保持分析完整性至关重要。
   4. 细胞表型鉴定：采用四种不同的细胞表面标志物（CD56、CD49a、CXCR4 和 CD16）以区分NK细胞的不同亚型。在表型鉴定方案中，将这四个标志物标记为待分析表型。在关联视图部分，为每种表型分配特定颜色以便识别。通过“添加”按钮，将细胞分类为标志物阳性或阴性表达；例如，在CD56表型中，细胞可被标记为CD56+或CD56-。在训练过程中，需手动标注每种表型至少五个细胞。若初始训练未能取得有效结果，应进行额外的手动标注。
   5. 完成细胞表型鉴定配置后，图像中的每个细胞将显示其四种表面标志物的表达情况（阳性或阴性）。将所得数据导出至电子表格以进行进一步分析。
   6. 数据处理：将所有图像获得的数据导入电子表格进行处理。计算各uNK细胞亚型占图像中细胞总数的百分比。最终细胞计数为多幅图像的平均值，从而全面反映样本中各类uNK细胞亚型的分布情况。

结果

为了在自然周期女性中保持子宫内膜样本采集时间的一致性，通过尿液检测精确判断其黄体生成素（LH）峰的出现，并在LH峰后第7天进行子宫内膜活检。对于接受激素替代治疗（HRT）周期的女性，样本采集时间定于开始补充孕酮后的第5天。为了定量分析子宫内膜中不同亚型的自然杀伤细胞（NK细胞），采用多重免疫组化（m-IHC）染色法。实验流程的示意图见图1。

优化实验流程对于获得高质量的多重免疫组化（m-IHC）染色结果至关重要，以确保实验结果的准确性和可重复性。最初采用免疫组化（IHC）方法确定合适的抗体浓度，并选择抗原修复液AR6或AR9。对于CD56、CD16和CD49等抗体，推荐使用pH为6的抗原修复液；而对于CXCR4抗体，使用pH为9的抗原修复液相比pH为6的缓冲液可获得更优的染色效果。在确定抗体稀释比例、孵育时间及抗原修复条件等参数后，可根据抗体的亲和力选择最合适的TSA荧光染料。对于高亲和力的抗体，应选择荧光亮度较弱的染料进行匹配。TSA染料信号强度的参考数据见表2。完成TSA单重检测后，可确定TSA多重检测的染色顺序。由于这四种抗体旨在识别不同的子宫自然杀伤（uNK）细胞亚型，抗体间的共定位不可避免。为最大限度减少光谱重叠并防止荧光基团之间的干扰，采用以下策略：选择发射波长尽可能远离的荧光基团，比较TSA多重检测与TSA单重检测中阳性信号的位置和数量以确认其一致性（图2），并确保背景清晰（图3）¹⁶。

在完成多重免疫组化（m-IHC）染色流程的优化与操作后，采用成像工作站进行图像采集，并使用图像分析软件对图像进行深入分析（图4）。对于子宫自然杀伤（uNK）细胞的分类，本研究同时采用了传统与创新的分类方法。传统的分类方法依据CD16的表达水平，将NK细胞分为两类：CD56+CD16- 和 CD56+CD16+¹⁷。在此基础上，我们进一步采用一种新型分类策略，以更精细地解析NK细胞的异质性。基于前期单细胞RNA测序（scRNA-seq）研究结果，我们通过荧光激活细胞分选技术（FACS）分离单个NK细胞，并进行RNA测序，以获取每个细胞的转录组谱型。分析结果显示存在四种不同的NK细胞亚型：NK1（CD56+CD49a+CXCR4-）、NK2（CD56+CD49a+CXCR4+）、NK3（CD56+CD49a-CXCR4-）和NK4（CD56+CD49a-CXCR4+）。这些亚型的特征在于CD49a和CXCR4表达模式的差异，其中CD56作为所有NK细胞的通用标志物。CD49a特异性表达于NK1和NK2亚型中，而CXCR4则存在于NK2和NK4亚型中。为验证该分类体系的准确性，我们进行了流式细胞术分析以确认亚型划分方法的可靠性（图5）⁹。各uNK细胞亚型的比例以占间质细胞总数的百分比形式呈现。

图1：子宫内膜NK细胞分析工作流程示意图。主要步骤包括子宫内膜的获取与收集、m-IHC抗体组合的优化、子宫内膜的m-IHC染色，以及图像的获取与分析。图示使用BioRender.com创建。请点击此处查看此图的放大版本。

图 2：通过 DAB、TSA 单重染色和 TSA 多重染色进行生物标志物定量的代表性图像。 各抗体经 DAB 染色（左图）、TSA 单重免疫组化染色（中图）和 TSA 多重免疫组化染色（右图）后的代表性图像显示，在多重免疫组化（m-IHC）开发过程中结果偏差极小。下方模拟的 TSA 免疫组化图像高度还原了相应的明场图像。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：子宫内膜多重免疫组化（m-IHC）染色后的实验结果。（A）使用成像仪在200倍放大倍数下获取的未解混图像。（B）对该未解混图像的进一步放大。（C-F）使用成像软件进行光谱解混后，在TSA染料570（CD16）、TSA染料650（CD56）、TSA染料620（CXCR4）和TSA染料520（CD49a）通道中观察到的图像。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：分析多重免疫组化染色图像。 使用成像软件的（A）组织分割、（B）细胞分割和（C）细胞表型功能对图像进行分析。请点击此处查看该图的放大版本。

图 5：子宫内膜 NK 细胞亚型分析。（A）根据 CD16 的表达情况，传统子宫内膜 NK 细胞可分为 CD56+CD16-NK 细胞和 CD56+CD16+NK 细胞。（B）创新的亚型分析方法将子宫内膜 NK 细胞分为四类：NK1（CD56+CD49a+CXCR4-）、NK2（CD56+CD49a+CXCR4+）、NK3（CD56+CD49a-CXCR4-）和 NK4（CD56+CD49a-CXCR4+）。请点击此处查看该图的放大版本。

染色周期	标记物	克隆号	公司	产品编号	抗体稀释比例	抗原修复缓冲液	荧光素
1	CD49a	CL7207	Novus Biologicals	NBP2-76478	1:1000	AR6	TSA 520
2	CD56	CD564	Leica	NCL-L-CD56-504	1:100	AR6	TSA 650
3	CD16	SP175	abcam	ab183354	1:100	AR6	TSA 570
4	CXCR4	44716	R&D	MAB172	1:100	AR9	TSA 620

表1：多重免疫组化（m-IHC）中所用抗体及TSA染料的浓度列表。

荧光团	Mantra
TSA 染料 520	高
TSA 染料 540	中
TSA 染料 570	中
TSA 染料 620	中
TSA 染料 650	高
TSA 染料 690	低

表2：TSA染料及其对应的荧光强度。

讨论

胚胎着床涉及胚胎与子宫内膜之间复杂的相互作用。子宫内膜稳态的免疫状态在决定子宫内膜容受性方面起着关键作用。在着床窗口期（WOI），子宫内膜中占主导地位的白细胞群体是自然杀伤细胞（NK细胞）。约90%的子宫内自然杀伤细胞（uNK细胞）表现出高水平的CD56表达，但缺乏CD16表达。然而，有一小部分uNK细胞类似于外周血NK细胞，表现为低水平CD56表达但CD16表达阳性¹⁸。这两种uNK细胞亚型具有不同的功能。CD56+CD16-亚型主要参与细胞因子产生、血管重塑以及与滋养层细胞的相互作用，这些功能对于妊娠的建立和维持至关重要。相比之下，CD56+CD16+亚型具有更高的细胞毒性。通过单细胞RNA测序，我们最近的研究进一步将uNK细胞分为四个亚群，根据其特定表型和功能，将CD56+CD16-调节性NK细胞进一步细分为三个亚群⁹。NK1亚群特征为CD56+CD49a+CXCR4-，参与组织重塑；NK2亚群由CD56+CD49a+CXCR4+鉴定，调节免疫应答；NK3亚群标志为CD56+CD49a-CXCR4-，与滋养层细胞相互作用；NK4亚群表现为CD56+CD49a-CXCR4+，与CD56+CD16+ NK细胞具有相似性，表现出细胞毒功能⁹。在本研究中，我们首次成功建立了利用多重免疫组化（m-IHC）染色鉴定这四种不同NK细胞亚群的实验方案。

传统的免疫组化染色和流式细胞术是鉴定免疫细胞最常用的方法，每种方法都有其优势和局限性¹⁹。尽管传统免疫组化因操作简便、易于获取而在临床环境中广泛应用，但在同时检测多种抗原以及对阳性信号进行定量方面存在挑战。这给准确表征免疫细胞表型带来了显著困难，因为精确测定通常需要使用多种标志物。另一方面，流式细胞术能够同时检测多种细胞标志物，但需要大量新鲜样本，且无法提供细胞在组织内空间位置的信息。值得注意的是，子宫内膜免疫细胞在子宫内膜组织中的分布并非均匀；例如，与靠近腔面的区域相比，uNK细胞在子宫内膜基底层附近更为密集地聚集²⁰。通过多重免疫组化（m-IHC）结合机器学习算法的图像分析平台，可实现组织分割、细胞分割以及阳性细胞的识别，从而克服传统免疫组化和流式细胞术的上述局限。该方法可在数分钟内分析数万个细胞，显著提高分析效率；通过自动识别阳性细胞减少观察者偏差；并利用多种标志物实现更精确的分析。此外，该方法无需新鲜样本，必要时还可进行批量实验或重复分析。

采用多重免疫组化（m-IHC）技术对子宫自然杀伤细胞（uNK细胞）表型进行全面评估，有助于深入理解uNK细胞与胚胎着床之间的相关性，以及其在反复种植失败（RIF）女性中的变化。除uNK细胞外，其他子宫内膜免疫细胞也在局部免疫稳态中发挥重要作用。例如，调节性T淋巴细胞（Treg细胞）通过释放IL-10和TGF-β等抑制性因子，抑制Th1和Th2细胞的活性，从而维持免疫耐受²¹。M2型巨噬细胞的分化受类固醇和Th2细胞因子调控，通过上调精氨酸酶活性并抑制一氧化氮生成，促进免疫耐受状态的建立²²。此外，树突状细胞（DCs）在子宫内分化为成熟的耐受性细胞，释放sFLT1和TGF-β1等因子，调控血管新生并抑制CD8+ T细胞功能，从而维持免疫稳态并支持胚胎发育¹⁸。与uNK细胞类似，这些免疫细胞也具有异质性，单一标记物无法准确识别其表型。应用m-IHC技术评估uNK细胞亚群，展示了识别这些子宫内膜免疫细胞亚群的潜在可能性。

除了子宫内膜外，该方法还可应用于多种组织以鉴定免疫细胞表型。在将其应用于其他组织时，仅需进行少量调整即可确保最佳染色效果。此外，如果研究人员计划替换某些标记物，可对原始抗体组合进行修改以满足特定的实验需求。该抗体组合的多功能性和灵活性使其成为研究不同组织或不同细胞亚群的适用工具。

该技术不仅有助于深入了解子宫内膜免疫细胞的细微变化，从而解析子宫内膜容受性不良的潜在机制，还为诊断检测方法的开发提供了可能。由于石蜡包埋块和切片易于获取和保存，该技术已得以广泛应用。通过标准化的染色面板，医院可结合自动化染色技术与先进的软件算法，显著提高分析流程的效率。多重免疫组化（m-IHC）技术的诸多优势使其成为临床实践中的可行选择。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
CD49a	Novus Biologicals	NBP2-76478	一抗
CD56	Leica	NCL-L-CD56-504	一抗
CD16	abcam	ab183354	一抗
CXCR4	R&D	MAB172	一抗
扩增稀释液	Akoya Biosciences	FP1498 系列	荧光染料稀释缓冲液
抗体稀释液	Akoya Biosciences	ARD1001EA	用于稀释抗体
柠檬酸盐缓冲液，pH 6.0 / 9.0 (10x)	Akoya Biosciences	A6001/A9001	抗原修复液
inForm 高级图像分析软件	Akoya Biosciences	inForm Tissue Finder 软件 2.2.6	数据分析软件
Mantra 工作站	Akoya Biosciences	CLS140089	光谱成像
微波炉	Akoya Biosciences	逆变器	微波脱抗
TSA 520	Akoya Biosciences	FP1487001K	适用的基于酪胺的荧光试剂
TSA 620	Akoya Biosciences	FP1495001K	适用的基于酪胺的荧光试剂
TSA 650	Akoya Biosciences	FP1496001K	适用的基于酪胺的荧光试剂
TSA 570	Akoya Biosciences	FP1488001K	适用的基于酪胺的荧光试剂
多聚-L-赖氨酸包被载玻片	Fisher Technologies	120-550-15	常规组织学用途载玻片
PolyHRP 广谱试剂	Perkin Elmer	ARH1001EA	二抗
Invitrogen™ Fluoromount-G™ 封片介质	ThemoFisher Science	495802	封片
光谱 DAPI	Akoya Biosciences	FP1490A	核酸染色