本研究提出了一种利用先进的多重荧光免疫组织化学染色技术，在胚胎着床窗口期定量子宫自然杀伤细胞亚群的开创性方法。
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本文内容
摘要
摘要
免疫组织化学（IHC）在生物研究和临床诊断中发挥着关键作用，是识别和可视化组织抗原最常用的方法。然而，传统的IHC染色方法在区分多种免疫细胞亚型方面存在局限性。这一挑战促使科学家探索新的技术和方法，以精确识别和区分免疫细胞亚型。近年来，多重IHC技术应运而生，能够在同一组织样本中同时检测并可视化多种抗原。子宫自然杀伤（uNK）细胞在早期妊娠过程中发挥着关键作用，包括蜕膜化、子宫螺旋动脉重塑以及胚胎着床等过程。不同亚型的uNK细胞具有不同的功能，使其能够协调多种生物学事件，以确保胚胎正常发育和成功妊娠。因此，深入研究uNK细胞亚型对于阐明妊娠期间免疫调控机制至关重要。此类研究为不孕症和反复生殖失败等相关疾病的机制理解提供了宝贵见解，并开拓了新的研究路径。本文介绍了一种详细的多重IHC染色方案，用于研究着床窗口期（WOI）子宫内膜样本中四种uNK细胞亚型的密度。该方案包括样本制备、亚型标志物的优化、显微成像及数据分析。该多重IHC染色方案具有高特异性和高灵敏度，可实现不同uNK细胞亚型的同步检测，为研究人员探索妊娠期间免疫调控的复杂性与机制提供了有力工具。
引言
首例有记录的活产后 体外 体外受精-胚胎移植（IVF-ET）于1978年首次报道。在过去的40年中，不孕夫妇对IVF-ET技术的需求一直居高不下12021年，美国共有238,126名患者启动了共计413,776个试管婴儿（IVF）周期。与两年前相比，周期数增加了25%，与2012年相比则增长了135%。2这一增长主要归因于不孕症患病率的上升以及妊娠计划的推迟。胚胎培养技术与超排卵方案的进步使得每次胚胎移植周期的活产率显著提高，在40岁以下女性中达到30%–50%，而在40岁以上女性中则低于30%。2然而，尽管取得了这些进展，超过一半的移植胚胎仍无法着床。反复着床失败（RIF）通常定义为连续三次或以上高质量胚胎移植尝试失败，影响约15%接受体外受精-胚胎移植（IVF-ET）的女性。3反复种植失败（RIF）的夫妇极为脆弱，更容易接受昂贵且不必要的治疗程序，从而面临过度的风险4因此，了解反复着床失败（RIF）的原因并提高胚胎着床率，对于提升体外受精-胚胎移植（IVF-ET）的成功率至关重要，尤其是对于RIF患者。子宫内膜的准备是成功胚胎着床的关键环节。该过程的一个显著特征是子宫自然杀伤细胞（uNK细胞）的大量积聚，其比例在分泌中期子宫内膜淋巴细胞中约占30%，而在早期妊娠的蜕膜组织中....
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方案
本研究获得了香港中文大学—新界东联网临床研究伦理委员会（CREC 参考编号：2022.581）的批准。反复种植失败（RIF）患者来自香港中文大学威尔斯亲王医院辅助生殖技术中心。RIF 的定义为：年龄小于 40 岁的女性，在至少 3 个新鲜或冷冻胚胎移植周期中，累计移植不少于 4 个优质胚胎后仍未获得临床妊娠10。在采集子宫内膜活检样本前，已从参与者处获得知情同意。
1. 子宫内膜样本的采集与处理
- 子宫内膜标本采集时间
- 按照严格方案采集子宫内膜样本，以确保研究参与者之间的一致性。对于自然周期患者，自月经周期第9天起进行尿液分析th 月经周期的第7天进行子宫内膜活检th LH峰后第7天（LH+7）11 对于接受激素替代治疗（HRT）周期的患者，从月经周期第2天开始，每日口服6 mg戊酸雌二醇。
- 在月经周期第13天通过超声检查评估子宫内膜厚度。当子宫内膜厚度达到或超过8 mm时，经阴道给予黄体酮，并在给药后5天进行子宫内膜活检12.
- 子宫内膜样本采集与固定：将吸管取样器插入宫腔，推进至宫底部；通过下拉内部活塞产生负压，同时在宫腔内进行旋转和上下移动....
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结果
为了在自然周期女性中保持子宫内膜样本采集时间的一致性，通过尿液检测精确判断其黄体生成素（LH）峰的出现，并在LH峰后第7天进行子宫内膜活检。对于接受激素替代治疗（HRT）周期的女性，样本采集时间定于开始补充孕酮后的第5天。为了定量子宫内膜中不同亚型的自然杀伤（NK）细胞，采用多重免疫组化（m-IHC）染色法。实验流程示意图见图1。
优化实验流程对于获得高质量的多重免疫组化（m-IHC）染色结果至关重要，以确保实验结果的准确性和一致性。最初采用免疫组化（IHC）方法确定合适的抗体浓度，并选择抗原修复液AR6或AR9。对于CD56、CD16和CD49等抗体，推荐使用pH为6的抗原修复液；而对于CXCR4抗体，使用pH为9的抗原修复液相比pH为6的缓冲液可获得更优的染色效果。在确定包括抗体稀释比例、孵育时间及抗原修复条件在内的各项参数后，可根据抗体的亲和力选择最合适的TSA荧光染料。对于高亲和力的抗体，应选用荧光亮度较弱的染料进行匹配。TSA染料信号强度的参考数据见表2。完成TSA单重染色实验后.......
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讨论
胚胎着床涉及胚胎与子宫内膜之间复杂的相互作用。子宫内膜稳态的免疫状态在决定子宫内膜容受性方面起着关键作用。在着床窗口期（WOI），子宫内膜中占主导地位的白细胞群体是自然杀伤细胞（NK细胞）。约90%的子宫内自然杀伤细胞（uNK细胞）表现出高水平的CD56表达，但缺乏CD16表达。然而，有一小部分uNK细胞类似于外周血NK细胞，表现为低水平CD56表达但CD16表达阳性18。这两种uNK细胞亚型具有不同的功能。CD56+CD16-亚型主要参与细胞因子产生、血管重塑以及与滋养层细胞的相互作用，这些功能对于妊娠的建立和维持至关重要。相比之下，CD56+CD16+亚型具有更高的细胞毒性。通过单细胞RNA测序，我们最近的研究进一步将uNK细胞分为四个亚群，根据其特定表型和功能，将CD56+CD16-调节性NK细胞进一步细分为三个亚群9。NK1亚群特征为CD56+CD49a+CXCR4-，参与组织重塑；NK2亚群由CD56+CD49a+CXCR4+鉴定，调节免疫应答；NK3亚群标志为CD56+CD49a-CXCR4-，与滋养层细胞相互作用；NK4亚群表现.......
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披露
作者声明不存在任何利益冲突。
致谢
本研究由健康与医学研究基金（10210956）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| CD49a | Novus Biologicals | NBP2-76478 | 一抗 |
| CD56 | Leica | NCL-L-CD56-504 | 一抗 |
| CD16 | abcam | ab183354 | 一抗 |
| CXCR4 | R&D | MAB172 | 一抗 |
| 扩增稀释液 | Akoya Biosciences | FP1498 系列 | 荧光染料稀释缓冲液 |
| 抗体稀释液 | Akoya Biosciences | ARD1001EA | 用于稀释抗体 |
| 柠檬酸盐缓冲液，pH 6.0 / 9.0 (10x) | Akoya Biosciences | A6001/A9001 | 抗原修复液 |
| inForm 高级图像分析软件 | Akoya Biosciences | inForm Tissue Finder 软件 2.2.6 | 数据分析软件 |
| Mantra 工作站 | Akoya Biosciences | CLS140089 | 光谱成像 |
| 微波炉 | Akoya Biosciences | 逆变器 | 微波脱抗 |
| TSA 520 | Akoya Biosciences | FP1487001K | 适用的基于酪胺的荧光试剂 |
| TSA 620 | Akoya Biosciences | FP1495001K | 适用的基于酪胺的荧光试剂 |
| TSA 650 | Akoya Biosciences | FP1496001K | 适用的基于酪胺的荧光试剂 |
| TSA 570 | Akoya Biosciences | FP1488001K | 适用的基于酪胺的荧光试剂 |
| 多聚-L-赖氨酸包被载玻片 | Fisher Technologies | 120-550-15 | 常规组织学用途载玻片 |
| PolyHRP 广谱试剂 | Perkin Elmer | ARH1001EA | 二抗 |
| Invitrogen™ Fluoromount-G™ 封片介质 | ThemoFisher Science | 495802 | 封片 |
| 光谱 DAPI | Akoya Biosciences | FP1490A | 核酸染色 |
参考文献
- De Geyter, C. Assisted reproductive technology: Impact on society and need for surveillance. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab. 33 (1), 3-8 (2019).
- State-Specific Assisted Reproductive Technology Surveillance. CDC. , https://www.cdc.gov/art/state-specific-surveillance/2021/index.html (2024).
- Busnelli, A., ....
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