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方法文章

一种基于贻贝（Mytilus galloprovincialis）血细胞运动性的毒理学与生态毒理学检测方法

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DOI：

10.3791/67285

⸱

2024年12月13日

 ,  ,  , 
1Department of Biological and Environmental Sciences and Technologies (DiSTeBA), University of Salento, 2NBFC, National Biodiversity Future Center

本文内容

摘要

该文章提出了一种新颖的方法 体外 基于污染物对生物运动性影响的快速灵敏毒性及生态毒性评估方法 Mytilus galloprovincialis 血细胞。该方法旨在促进更符合伦理且更灵敏的毒理学和生态毒理学暴露试验的发展。

摘要

血细胞是双壳类软体动物中具有免疫活性的循环细胞，在介导细胞免疫的多种重要功能中发挥关键作用。在免疫反应的早期阶段，血细胞会主动迁移至感染部位。这种固有的运动能力是这些细胞的基本特征，代表了一种整合了细胞黏附、细胞信号传导、细胞骨架动态变化以及细胞体积改变等多种过程的关键细胞功能。因此，药物或污染物暴露后细胞运动性的改变可作为一项有效的毒理学终点指标。尽管细胞运动性在细胞生理学中具有基础性作用，但从毒理学角度对其开展的研究仍较为匮乏。本研究提出一种新颖的 体外 一种基于评估血细胞运动性的污染物毒性和生态毒性快速灵敏检测方法 Mytilus galloprovincialis我们建立了一种基于血细胞黏附于96孔聚苯乙烯微孔板底部的细胞运动性检测方法。在暴露于不同浓度药物后，通过延时显微成像结合细胞追踪技术，定量分析细胞的运动轨迹和速度，从而评估药物对血细胞运动性的影响。由于可相对无创地从动物体内采集血细胞，该方法为污染物和药物作用效果及其作用机制的筛选提供了一种替代性检测手段。该方法符合3R原则（替代、减少与优化），有助于解决伦理问题，并减少对脊椎动物的使用。 体内 动物实验。

引言

基于效应的方法，例如 体外 和 体内 生物测定法代表了检测环境化学污染物对生物体影响的创新工具，并可作为环境监测和风险评估的手段1,2,3,4它们通过克服经典分析化学方法的一些局限性，对后者形成了有力补充。例如，基于效应的方法能够评估污染物的生物可利用性、对生物体健康的影响，以及混合物的联合毒理学效应。而这些联合效应仅依靠化学分析往往无法预测。5.

近年来，新兴关注污染物（新兴污染物）的生态毒理学研究领域中，基于效应的方法可作为检测生物暴露情况和评估其对生物群影响的有用工具1,5,6,7。多种基于效应的方法在环境监测与评估中采用双壳类软体动物作为测试生物8,9。这些生物具备若干特性，使其适用于生态毒理学研究，例如分布广泛、具有滤食性、固着生活方式、能够生物富集多种环境污染物并产生可检测的污染物响应、可利用不同生命阶段进行实验，以及易于在实验室条件下维持7。它们对污染物暴露高度敏感，并根据物种、生命阶段和环境条件的不同，对有毒污染物表现出多种响应8,9,10。因此，多个环境指南将双壳类物种列为标准化的测试物种10,11。

在双壳类软体动物中，广泛分布的Mytilus galloprovincialis因其在接触化学污染后可产生早期可检测的响应，成为生态毒理学研究中最常用的物种之一，这些响应包括金属硫蛋白的诱导、抗氧化酶活性的改变、溶酶体膜不稳定、脂质过氧化、脂褐素积累、微核频率升高以及碳酸酐酶的诱导12,13,14,15。血细胞是具有免疫功能的血淋巴细胞，被广泛用于研究环境污染物对双壳类软体动物的毒理学影响4,13,16,17。这些细胞在机体免疫应答中起关键作用，执行多种重要的细胞介导的先天免疫功能，包括通过吞噬作用清除微生物，以及在呼吸爆发过程中释放溶酶体酶、抗菌肽和活性氧代谢物等多种细胞毒性反应18,19,20。血细胞本质上是可运动的细胞21,22,23 ，能够在机体免疫应答的早期迁移至感染部位。总体而言，运动能力是所有免疫细胞的基本特征，因为它使这些细胞能够进行免疫监视，从而保护机体24。针对多种软体动物物种的研究表明，血细胞的运动能力在其免疫应答、伤口愈合以及与病原体的相互作用中均具有关键作用。这种运动能力受特定分子通路的调控，凸显了软体动物血细胞功能的复杂性与特化性21,25,26,27。

尽管运动性在血细胞生理学中具有根本重要性，但极少有研究探讨血细胞运动性对环境化学污染物的敏感性23,28,29,30最近，我们课题组表征了自发运动的特征 Mytilus galloprovincialis 在经组织培养处理的聚苯乙烯96孔微孔板中培养血细胞，并检测血细胞运动对敏感性的响应 体外 对对乙酰氨基酚的暴露23. M. galloprovincialis 血细胞表现出基于伪足的随机样运动和快速的形态变化，这与之前在另一种贻贝物种中观察到的结果一致。 Mytilus edulis21,22,23,28, 并且已在人类免疫细胞中有所描述31血细胞的运动性最近被证明对化学应激因子敏感23,28. 基于上述先前研究结果，本研究提出了一种新型的 体外 基于运动性评估污染物毒性和生态毒性的快速灵敏方法 M. galloprovincialis 血细胞及其变化，通过细胞运动速度分析（平均速度、迁移距离、欧几里得距离和方向性）进行量化。该方法提供了以下可能性 体外 在短期实验（持续1-4小时）或长期暴露实验（持续24-48小时）中检测多种物质的毒性。

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方案

所有实验均在意大利动物福利立法（D.L.26/2014）的框架下进行，该法规实施了欧洲委员会理事会指令（2010/63 EEC）。Mytilus galloprovincialis 是一种滤食性双壳类动物，通常称为地中海贻贝。它原产于地中海及欧洲大西洋沿岸南部地区，已被引入并在北美西部、亚洲和南非广泛分布。该物种在全球多个地区是重要的商业渔业资源。所用试剂和设备的详细信息列于材料表中。

1. 人工海水（ASTM）或过滤天然海水的制备

  1. 根据 ASTM D1141-98 (2021)32 配制人工海水（ASW）时，将以下盐类溶解于蒸馏水中（每升水中的克数）：27.65 NaCl、0.133 NaHCO3、3.33 MgCl2·6H2O、2.66 Na2SO4、0.733 CaCl2·2H2O、0.466 KCl、0.067 KBr、0.02 H3BO3、0.013 SrCl2·6H2O、0.0019 NaF。ASW 溶液的 pH 值为 7.80。
  2. 配制过滤天然海水（FSW）时，采集未受人为活动影响地点的天然海水（37 PSU），使用 0.2 µm 滤膜进行过滤。

2. 动物适应

  1. 将成年贻贝样本（Mytilus galloprovincialis Lam.）在恒温室内含曝气人工海水（ASW）或过滤海水（FSW）的静水培养箱中驯化24小时（每只动物1升，期间禁食），温度保持在15 °C，用于后续实验。

3. 血细胞运动性评估的试剂制备

  1. 按上述方法制备过滤海水（FSW）或标准生理盐水（SPS）。将4.77 g HEPES（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸）、25.48 g NaCl、13.06 g MgSO4、0.75 g KCl 和 1.47 g CaCl2 溶解于约800 mL蒸馏水中，再加蒸馏水定容至1 L。用1 M NaOH调节pH至7.36。
  2. 用二甲基亚砜（DMSO）配制20 mg/mL中性红储备液。
  3. 配制中性红染色液：取5 µL中性红储备液加入995 µL FSW或SPS中。
  4. 配制含2 mM L-谷氨酰胺、40 IU/mL青霉素G和100 µg/mL链霉素的FSW或SPS：向10 mL FSW/SPS中加入100 µL 2 mM L-谷氨酰胺溶液和100 µL青霉素/链霉素混合液。
  5. 用FSW或SPS配制0.4%台盼蓝溶液。
    注意：中性红储备液的配制参照Martínez-Gómez等33的方法。中性红储备液在4 °C保存时可稳定2–3周。中性红染色液和0.4%台盼蓝溶液应在使用前新鲜配制。

4. 血淋巴取样

  1. 用注射器预先吸入 0.5 mL 过滤海水（FSW）或标准生理盐水（SPS）（15 °C 下）。
  2. 用解剖刀沿腹面轻轻且小心地撬开贝壳瓣。保持解剖刀位置不动，或使用移液器吸头固定开口。将皮下注射器的针头插入两瓣壳之间的空隙。
  3. 根据 UNEP/RAMOGE34 的方法，用预先装液的注射器从后闭壳肌中缓慢吸取 0.5 mL 血淋巴。
  4. 将针头从注射器上取下，并将注射器内的液体转移至微量离心管中。
  5. 从 3–4 只贻贝中采集血淋巴，并在 15 °C 下按个体间的相同比例将样品混合于同一管中。
    注意：预先在注射器中装液可在采样时立即将血淋巴以 1:1 比例稀释。根据 Martínez-Gómez 等人33 的研究，使用 FSW 或 SPS 以 50:50 比例稀释血淋巴是防止血细胞聚集的常用方法。

5. 血细胞铺板与培养

  1. 使用血细胞计数板对细胞进行计数。
  2. 用 FSW 或 SPS 将血淋巴稀释至浓度为 1 × 106 个细胞/mL。
  3. 通过台盼蓝染色法评估悬浮血细胞的活力：将 100 µL 溶于 FSW 或 SPS 中的 0.4% 台盼蓝溶液加入 100 µL 血细胞悬液中，于 15 °C 孵育 5 分钟。
  4. 随后，取一滴悬液加入血细胞计数板中，在显微镜下观察并计数未染色（有活力）和已染色（无活力）的细胞。
  5. 根据所计数细胞总数中活细胞所占比例评估血细胞活力35。
  6. 使用以下公式进行细胞活力评估35：
    活细胞百分比 (%) = [活细胞数 / 总细胞数（活细胞 + 无活力细胞）] × 100
  7. 确保血细胞活力高于 95%，方可继续后续实验步骤。
  8. 将 50 µL 稀释后的血淋巴加入细胞培养用 96 孔平底聚苯乙烯 TC 处理微孔板的每个孔中，并盖上盖子。
  9. 于 15 °C 静置 30 分钟，使血细胞贴附于孔底形成单层细胞。
  10. 用微量移液器轻轻吸除多余的血淋巴。

6. 短期检测

  1. 对于短期实验（1–4 小时内），立即将贴壁于孔板底部的细胞与 100 µL 溶于 FSW 或 SPS 中的不同浓度待测物质在 15 °C 下孵育。每种实验条件至少使用三个孔，进行三次重复测定。
  2. 孵育结束后，按照步骤 8 评估细胞运动能力。

7. 长时间暴露实验

  1. 对于长时间暴露实验，即24-48小时暴露实验，将培养的贴壁细胞与溶于培养基（FSW或ASW）中并添加有2 mM L-谷氨酰胺、40 IU/mL青霉素G和100 µg/mL链霉素的不同浓度待测物质在15°C条件下共同孵育。每种实验条件至少使用三个孔，进行三次重复测定。
  2. 孵育结束后，按照步骤8评估细胞运动能力。

8. 利用延时显微镜评估细胞运动性

  1. 将含有贴壁活体血细胞的多孔板放入多功能酶标仪中。
  2. 通过延时显微镜对多孔板上的细胞进行实时成像，评估贴壁活细胞的运动性：在20倍放大倍数和明场彩色成像条件下，以每分钟1张图像的速率，连续10分钟采集每孔中同一兴趣区域（ROI）的图像（所用ROI尺寸为720 µm × 720 µm）。
  3. 为更清晰地观察血细胞，在延时显微镜成像前使用活体染料中性红对细胞进行染色，步骤如下：
    1. 移除各孔中的培养液。
    2. 向含有贴壁细胞的多孔板各孔中加入100 µL 含待测物质的生理盐水中溶解的中性红染色液  。
    3. 在15 °C条件下孵育15分钟，随后洗去多余染料。
    4. 加入100 µL溶于过滤人工海水（FSW）或标准生理盐水（SPS）中的待测物质。对细胞进行成像以评估其运动性。
      注：使用多功能酶标仪可同时从大量孔中获取图像，从而实现对所有实验条件及重复样本中细胞运动性的同步检测。中性红染料会被溶酶体摄取并在其中蓄积，表现为细胞质内微小的橙色斑点，而细胞核因嗜酸性活体染料不对其进行染色而呈现为透明空洞。图像采集在室温20 °C下持续进行10分钟。

9. 细胞追踪与速度测量参数的计算

  1. 使用 ImageJ 对每个孔中在延时显微镜下获取的相同感兴趣区域的图像帧进行分析。
  2. 将图像保存在名称中不含空格的文件夹中。图像格式可为 JPEG 或 PNG。
  3. 打开 ImageJ。点击 文件 > 导入 > 图像序列。
  4. 使用 ImageJ 的 手动追踪 插件对单个细胞进行细胞追踪。在连续图像中标记单个细胞的位置，从而实现对细胞位置随时间变化的追踪。
  5. 每孔至少分析 40 个细胞，排除离开记录视野的细胞。
  6. 将来自 ImageJ 插件"Manual Tracking"的数据集导入免费的 Chemotaxis and Migration Tool 软件中。
  7. 使用 Chemotaxis and Migration Tool 软件，根据该软件免费提供的用户指南36中的详细说明或以下步骤，量化诸如平均速度、欧几里得距离、迁移距离和方向性等速度参数：
    1. 将来自 ImageJ 插件"Manual Tracking"的数据集导入 Chemotaxis and Migration Tool 软件。
    2. 选择所需的切片数量（例如，用于追踪的图像数量）。
    3. 通过设置 x/y 像素大小和时间间隔来校准软件。x/y 校准表示像素边长（单位为 µm），时间间隔表示每张图像之间的时间间隔。
    4. 调整参数和数值后，点击 应用设置。
    5. 绘制轨迹并导出为图像。点击 测量值 按钮查看测量结果，并保存数据。
    6. 点击 统计 按钮，保存轨迹序列的速度和方向性数据。
  8. 比较对照组细胞与在不同浓度测试物质处理下的血细胞所计算出的速度参数。
    注：迁移距离（单位为 µm）指观察期间（10 分钟）细胞迁移路径的总长度。欧几里得距离（同样以 µm 为单位）指细胞起始点与终点之间的直线距离。平均速度（单位为 µm min-1）通过每个细胞的迁移距离除以追踪持续时间计算得出。方向性定义为每条轨迹的欧几里得距离与总迁移距离的比值。

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结果

本研究介绍了一种利用Mytilus galloprovincialis血细胞运动性快速、灵敏地评估污染物毒性和生态毒性的新型体外方法。图1A-C展示了血细胞在培养孔底部贴附30分钟后具有代表性的延时成像结果。在进行运动性评估前，图中细胞已用中性红染色。采用多功能酶标仪在20倍放大倍数下，以每分钟拍摄一张图像的频率，连续10分钟通过光学显微镜监测细胞运动。图1A-C显示了从同一兴趣区域（ROI）在0分钟、5分钟和10分钟时采集的11帧图像中的三帧。三幅图像中对相同的细胞进行了编号，以突出其移动轨迹，且编号在各图间保持一致，以清晰展示其运动路径。

细胞表现出基于片状伪足活性的单细胞运动以及快速的形态变化。细胞用活体染料中性红进行标记，以提高追踪过程中的可视性。中性红是一种两亲性弱阳离子染料，可轻易穿...

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讨论

本研究中描述的方案是一种新型的体外方法，适用于通过评估M. galloprovincialis血细胞的运动能力及其变化，快速且灵敏地测定药物和污染物的毒性。运动能力是这些细胞免疫功能的一个独特方面21,22,23,37,38，因此细胞运动能力的任何改变都可能预示着这些细胞免疫功能的改变。细胞运动是一项关键的细胞功能，整合了多种细胞过程，如细胞黏附、细胞信号传导、细胞骨架活性、细胞内信号传递以及细胞体积调控，并需要复杂生化与生物力学信号的整合与协调39,40,41。这些过程中的任何一个或其组成部分...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由意大利大学与研究部授予迪斯特巴（DiSTeBA）的“"Dipartimento di Eccellenza"”项目资助，项目编号CUP: F85D18000130001，以及由欧洲联盟NextGenerationEU计划PNRR资助的国家生物多样性未来中心（NBFC），项目编号CN00000033。我们还感谢萨伦托大学生物与环境科学与技术系的BIOforIU基础设施提供的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.2 µm 滤膜（直径 25 mm）ABLUO 实验耗材
2.5 ml 皮下注射器针头 22GRays2522CM32实验耗材
96 孔平底聚苯乙烯 TC 处理微孔板Corning3916实验耗材
CaCl2·2H2OMerk (Sigma - Aldrich) C3881-1KG化学试剂
Chemotaxis and Migration Tool 软件 (Ibidi GmbH)软件
Cytation 5 Agilent BioTeckCytation 5设备：细胞成像多功能读板仪
二甲基亚砜（DMSO） Merk (Sigma - Aldrich) 472301溶剂
Falcon 15 mL 锥底离心管Corning352196实验耗材
H3BO3Merk (Sigma - Aldrich) B0394化学试剂
血细胞计数板 Fast read 102BiosigmaBVS100实验耗材
HEPES（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸）Merk (Sigma - Aldrich) H3375-500G化学试剂
ImageJ 软件NIH软件
KBrMerk (Sigma - Aldrich) P9881化学试剂
KClMerk 104936化学试剂
L-谷氨酰胺Merk (Sigma - Aldrich) G7513细胞培养基必需氨基酸
MgCl2·6H2OMerk (Sigma - Aldrich) M2670化学试剂
MgSO4Merk (Sigma - Aldrich) M7506化学试剂
显微镜 Nikon Eclipse E600Nikon设备：细胞成像 
Na2SO4Riedel-de Haen31481化学试剂
NaClMerk (Sigma - Aldrich) 31434-1KG-R化学试剂
NaFFluka71519 500g化学试剂
NaHCO3Merk (Sigma - Aldrich) S5761-1KG化学试剂
中性红Merk (Sigma - Aldrich) N4638-1G活细胞染料
青霉素/链霉素Merk (Sigma - Aldrich) P0781-100ML细胞培养用抗生素
SrCl2·6H2OMerk (Sigma - Aldrich) 255521化学试剂
台盼蓝 Merk (Sigma - Aldrich) T8154细胞染料

参考文献

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血细胞运动性贻贝血细胞毒性检测生态毒理学检测细胞追踪延时显微成像环境生物监测细胞迁移免疫反应
一种基于贻贝（Mytilus galloprovincialis）血细胞运动性的毒理学与生态毒理学检测方法
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