小鼠心脏表面移植棕色脂肪组织的手术模型

摘要

建立了一种在小鼠心脏表面移植棕色脂肪组织的独特外科模型。该模型可能有助于深入理解心外膜脂肪组织（EAT）对心脏疾病的影响以及EAT棕色化在心脏保护中的作用。

摘要

应建立一种小鼠模型，用于研究褐色化的心外膜脂肪组织（EAT）对冠状动脉及心肌的旁分泌作用。由于其特殊的解剖位置并与心脏表面直接相连，EAT 被认为不仅是能量储存器官，更是参与多种心血管疾病的重要的旁分泌调节因子。多项研究表明，EAT 褐色化可通过抗炎表型转化、释放心脏保护因子以及细胞外囊泡等多种机制，在心血管疾病中展现出潜在的治疗前景。然而，啮齿类动物模型天生缺乏 EAT，限制了对其在心血管疾病中功能的实验研究。既往研究已采用脂肪组织移植技术，探索脂肪组织与其他器官之间的内分泌及旁分泌相互作用。这凸显了建立一种将棕色脂肪组织（BAT）移植至小鼠心脏表面的手术模型的必要性，以研究其对心血管疾病的旁分泌效应，并探索 EAT 褐色化的潜在保护作用。本研究建立了一种独特的小鼠心脏表面棕色脂肪组织移植手术方法，并在术后四周评估了移植物的存活情况及受体小鼠的生存状态。该模型可应用于后续实验，以深入探究 EAT 褐色化的相关机制。

引言

心脏外膜脂肪组织（EAT）是一种位于心脏表面的异质性多功能脂肪库，直接附着于心肌并包绕主要冠状动脉，且与心肌之间无结缔组织分隔¹。由于其在解剖位置上与心肌和冠状动脉相邻，EAT 能够以旁分泌依赖的方式主动分泌大量且多样的生物活性因子，从而调控心房颤动、动脉粥样硬化和心力衰竭等心血管疾病^2,3,4。EAT 可能是心血管疾病的危险因素，目前认为其有望成为代谢性心血管药物治疗的新靶点⁵。

然而，与人类不同，小鼠心脏表面几乎不存在明显的脏层心外膜脂肪组织（EAT）。事实上，目前关于EAT的大多数实验都是在 体外 由于缺乏用于观察 EAT 功能的实验动物模型 体内⁶因此，科学家只能纯化并分析EAT分泌组 体外，且目前尚无适用的实验模型可全面观察 EAT 的真实功能 体内因此，建立EAT小鼠模型将有助于阐明EAT如何对邻近心肌和冠状动脉发挥其独特作用。

棕色脂肪组织（BAT）具有内在的产热能力，并可改善葡萄糖代谢⁷。近期研究发现，BAT可能在心脏疾病中发挥心肌保护作用。棕色脂肪组织分泌的小细胞外囊泡可通过向心脏递送具有心肌保护作用的miRNA，参与运动诱导的心脏保护效应⁸。BAT还可释放12,13-二羟基十八烯酸（12,13-diHOME）和一氧化氮合酶1（NOS1），通过调节钙循环来增强心脏功能⁹。源自棕色脂肪组织的成纤维细胞生长因子21（FGF21）可通过激活A₂A受体，减轻高血压引起的心脏重构¹⁰。此外，BAT能够释放骨形态发生蛋白3b（BMP3b），减少缺血-再灌注（I/R）损伤所致的心肌损害¹¹。

这些研究表明，棕色脂肪组织（BAT）通过内分泌机制在心血管疾病中发挥心脏保护作用。另有证据表明，在成功的BAT移植模型中，将正常小鼠的BAT移植到高脂饮食小鼠的肩胛间区域后，可观察到受体小鼠的葡萄糖代谢和胰岛素敏感性增强，脂肪质量减少，肥胖状况得到改善。BAT移植可能通过多种机制发挥其有益作用，包括BAT相关细胞因子的内分泌释放、交感神经系统激活、BAT对甘油三酯的摄取增加，以及改善肥胖小鼠的葡萄糖耐受性和胰岛素抵抗^12,13。因此，BAT移植可能成为治疗心脏疾病的一种潜在治疗策略。

然而，由于物种间的差异，小鼠心脏缺乏心外膜脂肪组织（EAT），使得棕色脂肪组织（BAT）对心脏的旁分泌作用尚不明确。此外，将BAT原位移植到心脏表面是否比其他策略具有更优的益处，目前仍不清楚。

为了评估棕色脂肪组织（BAT）对心脏的功能影响，并阐明其对心肌细胞和冠状动脉的旁分泌作用，本团队旨在描述一种建立显微外科模型的逐步操作流程 原位 将棕色脂肪组织（BAT）移植到小鼠心脏上。与仅能模拟BAT内分泌作用的皮下移植不同，该方法可用于研究直接的旁分泌相互作用。通过观察小鼠心脏表面为BAT移植物建立血液供应的情况，采用常规术后观察指标来确认BAT移植物成功定植与存活。

方案

获取脂肪组织的实验方案已通过中南大学机构审查委员会的审查和批准。以下所列的动物使用方案已在中国中南大学湘雅二医院的机构动物护理和使用委员会（批准号：20230188）审查通过，方案编号：2024054。所有实验均严格遵循动物安全与人道护理指南进行。本研究使用3至8周龄、体重为12–25 g的C57/BL6野生型雄性小鼠。受体动物在手术前1小时皮下注射0.1 mg/kg的丁丙诺啡进行预先镇痛。在移植后，受体动物以相同剂量再次给予丁丙诺啡，并在术后前48小时内根据需要重复给药。所用试剂与设备的详细信息见《材料表》。

1. 供体棕色脂肪组织（BAT）的采集

1. 将3至8周龄的供体小鼠置于充满2%异氟烷与100%氧气（流速0.5–1.0 L/min）混合气体的诱导室中，进行麻醉₂为验证麻醉深度是否合适，可对小鼠的趾甲床施加压力或进行脚趾夹捏反射测试。
2. 将小鼠俯卧位放置于加热垫上，并用胶带固定其四肢。
3. 沿颈部皮肤中线向下移动约1厘米，寻找一处凹陷，以确定肩胛窝的位置。
4. 在此处剃除毛发，并用聚维酮碘对皮肤消毒三次。
5. 在肩胛窝处做一条长约1厘米的纵向切口，以暴露其中的脂肪组织。仔细分离表层的白色脂肪组织与肌肉层，暴露下方呈棕红色的一侧的棕色脂肪组织（BAT）。采集30 mg BAT用于移植。
6. 使用无菌生理盐水冲洗棕色脂肪组织以去除血液和碎片。
7. 使用眼科剪将棕色脂肪组织（BAT）剪成小块（5 × 5 mm，约20 mg），并在准备受体小鼠的同时，将其置于37 °C的完全组织培养培养基中保存。

2. 移植前的准备

1. 使用高压灭菌器对显微外科器械进行灭菌，并佩戴无菌手套。
   注意：需要以下手术器械：钝头剪刀、显微剪刀、显微镊、粗弯齿镊（×2）、细45°角弯镊（×2）、角形弹簧剪刀、胸腔牵开器、2-0可吸收缝线、7/0 Prolene缝线以及持针器。
2. 用75%异丙醇消毒手术区域。
3. 手术过程中使用设定为37 °C ± 1 °C的加热垫，以维持正常的体温和稳定的心率。
4. 准备棉签，以备出血时使用。

3. 小鼠的准备与插管

1. 使用脱毛膏去除受体小鼠颈部至胸部中段的毛发。
2. 将小鼠置于充满2%异氟烷与0.5–1.0 L/min纯氧混合气体的诱导室中进行麻醉₂. 适当镇静后，使用1.7%异氟烷与100%氧气以0.7 L/min流速混合维持麻醉₂.
3. 将小鼠仰卧置于加热垫上，并用胶带固定其四肢。
4. 用复方碘溶液对手术区域进行消毒，随后使用70%酒精。重复此过程三次。
5. 用无菌手术巾覆盖小鼠，仅暴露手术区域，以防止污染。
6. 每只小鼠使用一副新的无菌手套。
7. 用橡皮筋套住门牙以拉伸颈部。一手持弯头镊子轻轻将舌头拨向一侧，另一手持PE-90气管插管插入气管。确保小鼠头部与插管处于同一水平位置，以保证插管正确就位。
8. 确认导管插入气管而非食管。必要时，沿颈部皮肤做纵向切口（约6-7 mm）以暴露气管进行验证。
9. 将气管插管连接至容量控制式啮齿类动物呼吸机，设置呼吸频率为140次/分钟，潮气量为0.2 mL。用胶带固定插管。
   注意：机械通气成功的指标——小鼠的胸廓运动应规律，并与呼吸机的呼吸频率同步。

4. EAT 移植

1. 从胸骨上切迹开始，沿胸骨正中线（小鼠前胸壁上的一条白线）做一道1 cm的切口，以暴露心脏前壁。在手术显微镜下使用胸腔牵开器牵开胸骨。操作过程中避免损伤肺组织和胸廓内动脉。
2. 使用尖端精细的45°角镊子轻轻分离并切除心脏周围的壁层心外膜黏膜。
3. 在左心室前壁处打开心包膜。将一块干净且富含血管的小块棕色脂肪组织（BAT）放置于心脏表面。使用7/0 Prolene缝线并打两个外科结，将BAT机械固定在左心室表面。注意避免穿透心壁。
4. 移除胸腔牵开器，并夹闭呼吸机出气口2秒，以使肺重新充气。
5. 使用2-0可吸收缝线，采用间断缝合方式关闭肋间组织。
6. 使用2-0可吸收缝线，采用连续缝合方式关闭皮肤层。

5. 术后护理

1. 术后给予0.3 mL生理盐水腹腔注射，以补充液体。
2. 皮下注射布托啡诺（0.1 mg/kg）以缓解切口疼痛，并给予恩诺沙星（5 mg/kg）预防感染。
3. 将小鼠置于加热灯下，直至其从麻醉中苏醒并恢复胸卧位，能够自由活动。随后将小鼠转移至单独的笼子，提供食物和水。由于胸部暂时存在轻微活动受限，应在笼底放置凝胶状食物，便于取食。
4. 术后观察受体小鼠1小时，然后将其送回动物饲养设施。术后最初24小时内每日检查三次，监测其活动情况和营养摄入。术后前72小时内密切观察疼痛和痛苦迹象。每日检查动物健康状况，并每周称重一次。
5. 若发现任何小鼠出现疼痛、痛苦或摄食减少的迹象，应咨询兽医人员。
   注意：必要时考虑提前实施安乐死。安乐死方法为使用CO₂过量暴露7分钟，随后进行颈椎脱位（遵循机构批准的方案）。若出现棕色脂肪组织自体移植片坏死、吸收或排斥，定义为特定实验终点，应实施安乐死。

结果

根据术前、术中和术后结果的观察，成功建立了将棕色脂肪组织（BAT）移植到心脏表面的小鼠模型。BAT 从供体小鼠肩胛区域获取，每块 BAT 移植物重量约为 0.1 g。

苏木精-伊红染色证实了移植物的组成为棕色脂肪组织（BAT）。低倍镜下可见大量棕色脂肪细胞在富含毛细血管的疏松结缔组织内形成小叶状结构。棕色脂肪细胞的细胞质中含有多个小脂滴空泡，细胞核呈圆形且位于中央。高倍镜下，棕色脂肪细胞在形态上与白色脂肪细胞相似，但直径较小。棕色脂肪细胞的细胞核呈圆形或椭圆形，位于细胞中央或偏心位置。细胞质呈嗜酸性，含有大小不一的多个脂滴，广泛分布于细胞质中。在棕色脂肪细胞之间还可观察到毛细血管和神经。通过检测UCP1表达的免疫组织化学染色进一步确认移植的脂肪组织为棕色脂肪组织（图1）。棕色脂肪移植物已成功固定于左心室前壁（图2）。

棕色脂肪组织（BAT）移植后四周，受体小鼠的饮食、活动及体重均未出现显著变化。胸部切口愈合良好，并已完全被正常毛发覆盖。根据伦理指南对受体小鼠实施安乐死，取出心脏及心外膜上的BAT移植物用于组织学检查。苏木精-伊红染色显示，BAT移植物仍保持活性，呈现出典型的BAT组织学特征，并与邻近心肌建立了微循环。未见明显炎性细胞浸润或脂肪液化现象。Masson三色染色显示，在用于固定移植组织的心肌缝合线周围形成了纤维结缔组织。在移植物内部及周围均观察到纤维结缔组织，但脂肪组织未出现明显的分隔化或结构破坏。针对CD31和UCP1的免疫组织化学染色进一步表明，移植的BAT内有新生微血管形成，并证实移植物中部分棕色脂肪细胞得以存活（图3）。

图 1：供体小鼠棕色脂肪组织的分离与鉴定。（A,B）从用于移植的供体小鼠中获取的棕色脂肪组织（BAT）（白色箭头所示）。（C）棕色脂肪组织中UCP1表达的代表性免疫组织化学染色结果（比例尺 = 100 µm）。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：动物模型的建立。本图展示了建立动物模型的操作流程。通过正中开胸术暴露心脏前壁，使用胸骨牵开器进行操作。将棕色脂肪组织（BAT）移植物固定于心脏表面。随后使用间断缝合关闭肌肉层和皮肤切口。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：移植后四周小鼠心脏上棕色脂肪组织移植的评估。 （A）胸骨前正中切口瘢痕（白色箭头）。 （B,C）固定于心脏心尖部位的棕色脂肪组织（BAT）移植物（白色箭头）。 （D）移植后四周BAT同种异体移植物与心肌的代表性苏木精-伊红（H&E）染色图像（比例尺 = 100 µm）。实心黑色三角形指示心肌组织，* 指示BAT移植物，黑色箭头指示毛细血管。 （E）移植后四周BAT同种异体移植物与心肌的Masson三色染色代表性图像（比例尺 = 200 µm）。 （F）移植后四周BAT同种异体移植物与心肌中CD31表达的免疫组织化学染色。黑色箭头指示移植物中CD31阳性表达（比例尺 = 100 µm）。 （G）移植后四周BAT同种异体移植物与心肌中UCP1表达的免疫组织化学染色（比例尺 = 50 µm）。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本研究成功建立了一种将棕色脂肪组织（BAT）移植至心肌表面的手术模型。心外膜脂肪组织（EAT）是一种独特的脂肪储存库，直接与心肌和冠状动脉相连，共享相同的微循环系统，从而促进二者之间的密切相互作用。既往研究表明，EAT与多种心脏疾病相关，包括冠状动脉疾病、心房颤动和心肌肥厚。然而，尽管这些研究证实EAT的体积与心脏疾病的范围和严重程度相关，但EAT影响心脏病理过程的具体机制仍有待阐明^{1,2,3,4,5,14,15,16}。

另一方面，BAT被认为在保护哺乳动物免受低温伤害方面具有天然作用。其细胞质中含有多个较小的多房性脂滴，并富含线粒体。BAT是一种产热型脂肪组织，能够调节能量消耗并维持葡萄糖和脂质稳态，因此成为代谢性疾病和心血管疾病的潜在治疗靶点^17,18,19。一些临床研究表明，BAT体积与心血管疾病呈负相关。BAT体积较大的个体，其2型糖尿病、冠状动脉疾病、血脂异常、充血性心力衰竭、脑血管疾病和高血压的患病率较低^7,20,21。

先前的一项研究证明，棕色脂肪组织（BAT）来源的小细胞外囊泡（sEVs）可被心肌细胞摄取，从而抑制心肌缺血/再灌注（MI/R）相关的MAPK通路的活化⁸。另一项研究发现，BAT释放含有心脏保护性微小RNA（microRNAs）的sEVs，这些microRNAs有助于运动相关的心脏保护作用²²。这些发现阐明了BAT与心肌细胞之间相互作用的机制，并强调BAT来源的sEVs及其所含的microRNA是运动诱导心脏保护的潜在候选因子。此外，BAT来源的神经调节蛋白4（neuregulin 4, Nrg4）已被证明可在雄性小鼠中减轻内皮炎症和动脉粥样硬化²³，进一步表明BAT在心血管健康中具有保护性的内分泌功能。

此外，转录分析表明，人类心脏周围脂肪组织（EAT）高度表达棕色脂肪组织（BAT）标志物，如 UCP-1、PRDM16 和 PGC-1α，其表达水平高于其他脂肪储存部位^5,6,24,25。这提示 EAT 可能在一定程度上发挥类似 BAT 的功能。这些发现支持了以下假说：EAT 的棕色化可能保护心肌和冠状动脉免受低温影响，并作为对抗缺血或缺氧的防御机制。综上所述，这些研究表明，BAT 会释放多种生物活性因子，对心血管系统产生有益且具有保护作用的影响⁶。

在以往的研究中，已将棕色脂肪组织（BAT）移植模型应用于多种疾病模型，以阐明BAT对疾病发生和进展的影响。这些研究包括BAT移植对多囊卵巢综合征（PCOS）²⁶的影响、其在卵巢衰老中的调节作用²⁷，以及其对全身代谢的影响^28,29。然而，BAT移植对心脏的病理生理效应尚未被研究。

作为一种能够分泌多种信号分子的器官，棕色脂肪组织（BAT）主要通过内分泌途径影响正常机体的心血管病理生理过程，将这些分子递送至心脏或血管¹¹。然而，BAT是否能够通过旁分泌途径直接调控心脏的病理生理过程，目前尚不明确。建立一种适用于心脏表面的棕色脂肪组织移植的可靠模型，将有助于研究BAT与心脏之间的直接相互作用。

鉴于棕色脂肪组织（BAT）在小鼠体内解剖学上位于肩胛间区，其与其他器官之间的相互作用主要依赖于体循环 通过 内分泌信号。此外，一些研究表明，心脏外膜脂肪组织（EAT）具有发生褐变转化的潜力。多种饮食、环境及药物干预措施在诱导肥胖和/或冠状动脉疾病（CAD）患者EAT褐变方面已显示出一定前景。这种转化可能有助于缓解加重血管损伤并加速冠状动脉粥样硬化的缺氧和炎症微环境。^4,24,30然而，仍需进一步研究以确定参与EAT褐变的具体因子和通路。此外，还需借助实验动物模型来探究EAT表型与其失衡的炎症谱所介导的心血管结局之间的关系。

研究心脏外膜脂肪组织（EAT）的一个主要局限在于，啮齿类动物几乎不存在明显的EAT。在人类中，由于获取样本需经胸廓切开术，因此对新鲜EAT的研究也颇具挑战性。既往研究曾采用一种模型，即将高脂饮食小鼠来源的脂肪组织移植至心肌梗死小鼠的腹腔内，以证明糖尿病相关的脂肪组织可加重缺血-再灌注损伤。³¹脂肪组织移植模型的应用使得探索棕色脂肪组织对心脏的影响成为可能 通过 旁分泌信号传导

建立该模型的主要目的是研究棕色脂肪组织（BAT）作为类似心外膜脂肪组织（EAT）的旁分泌器官，对心肌和冠状动脉潜在的治疗作用。未来，该模型可用于研究BAT在抑制动脉粥样硬化斑块进展、改善心肌缺血性损伤以及缓解心房颤动方面的心脏保护作用。此外，该模型还可能为促进EAT褐变的益处提供间接证据。

2013年，哈佛医学院的一个研究团队通过将棕色脂肪组织（BAT）连接至附睾脂肪垫，将其移植到受体小鼠的腹腔内，以评估因BAT质量增加而对代谢稳态带来的改善作用via增加BAT质量³²。在1960年代的一项早期研究中，研究人员从供体的肩胛间区域分离BAT，并将其移植至受体肾脏包膜下，持续1-2周。此外，在另一项研究中，BAT被移植到仓鼠的眼前房，通过组织学分析评估移植的BAT是否存活¹²。然而，将BAT移植至啮齿类动物心外膜区域的可行性及其存活情况仍不清楚。

在小鼠中进行心外膜手术现已成为诱导心肌梗死模型的常规方法。有趣的是，有研究团队已在猪模型的心包腔/液中成功递送了药理学制剂，用于研究心房颤动、相对不应期以及缺血性心肌病。基于这些研究，有必要通过手术方法建立一种用于心外膜棕色脂肪组织（BAT）移植的啮齿类动物模型。

根据实验结果，从供体小鼠的肩胛间区域分离出两块棕色脂肪组织（BAT）。BAT被皮下脂肪组织（SAT）覆盖，颜色较SAT更深，并具有丰富的血液供应。BAT的苏木精和伊红（H&E）染色显示，棕色脂肪细胞含有较小的多房性脂滴，且血管化程度高，毛细血管腔内可见红细胞。所采集的每块BAT组织重量约为30–40 mg。然而，移植的BAT移植物重量限制在约20 mg，因为移植物进一步增大将导致小鼠在术后1–2天内死亡。该结果的可能原因是胸腔与心脏前壁之间的空间有限。相对较大的移植物可能施加过度压力，从而可能导致心包填塞。

麻醉维持 通过 气管插管，并通过观察小鼠胸部起伏的幅度和节律来监测麻醉深度。选择正中开胸以暴露心脏前壁，便于棕色脂肪组织移植。由于心脏周围脂肪组织（EAT）与心肌及冠状动脉直接相连，其间无结缔组织分隔，因此操作步骤包括打开心包，将棕色脂肪组织置于心脏表面，随后缝合心包。

移植后四周，按照伦理指南对受体小鼠实施安乐死，并打开胸腔以评估棕色脂肪组织的整合与存活情况。这些结果证实，棕色脂肪组织同种异体移植物成功存活。

综上所述，已成功建立一种在小鼠心脏表面移植棕色脂肪组织（BAT）的手术模型。该模型可能有助于深入理解心脏周围脂肪组织（EAT）对心脏疾病的影响以及EAT棕色化在心脏保护方面的潜在作用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1% 青霉素/链霉素	Gibco, Invitrogen, New York, USA	03-031-1BCS	移植物的组织保存
10% 胎牛血清（FBS）	Bovogen, New Zealand, Australia	1907B	移植物的组织保存
2-0 可吸收缝线	上海浦东金环医用制品有限公司	17Y1204J	皮肤缝合
6 至 8 周龄雄性 C57BL/6J 小鼠	湖南斯莱克景达动物实验有限公司
7/0 Prolene 缝线	上海浦东金环医用制品有限公司	R731	将棕色脂肪组织固定于心脏
茜素红染色液	武汉赛维尔生物科技有限公司	CR2203058	移植物的茜素红染色
弯头弹簧剪	津钟外科器械有限公司	Y3C040	组织解剖与分离
钝头剪	津钟外科器械有限公司	J22010	组织解剖与分离
胸腔牵开器	TIGERGENE 公司	TG-CK-07PK	牵开并固定胸腔
粗弯镊	津钟外科器械有限公司	JD1060	组织解剖与分离
DMEM:F12 (1:1) 培养基	Gibco, Invitrogen, New York, USA	C11330500BT	移植物的组织保存
精细 45° 角镊	津钟外科器械有限公司	Y4E040	组织解剖与分离
异氟烷	深圳市瑞沃德生命科技有限公司	R510-22	小鼠气体麻醉
显微镊	津钟外科器械有限公司	JD1050	组织解剖与分离
显微剪	津钟外科器械有限公司	Y00030	组织解剖与分离
持针器	津钟外科器械有限公司	Y3G150	缝合时持针
眼科剪	津钟外科器械有限公司	Y3C060	组织解剖与分离
手术显微镜	Murzider 公司	MSD203	用于棕色脂肪组织移植物的手术移植
容积控制式啮齿类动物呼吸机	南京科威巴斯生物科技有限公司	KW-MZJ-Z	小鼠气体麻醉