我们提供了一种利用茎溃疡病原菌评估杨树抗性的逐步实验方案 体内 叶片接种法。该方法特别适用于大规模评估 Cytospora chrysosperma 和 Botryosphaeria dothidea 中国杨树育种后代中的溃疡病抗性研究
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方法文章
活体叶片接种：一种评估杨树杂交无性系对茎干溃疡病抗病性的替代方法
* These authors contributed equally
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摘要
摘要
由病原菌引起的茎腐病 Cytospora chrysosperma (Pers.) Fr.) 和 Botryosphaeria dothidea (Moug. ex Fr.) Ces. & de Not. 是中国杨树人工林中的两种主要森林病害，有时可导致全部杨树幼苗死亡或严重破坏成熟的杨树林。杂交育种是防控和管理林木病害最直接且高效的方法。然而，基于抗病性评估或抗病克隆筛选的方法在实际应用中仍面临挑战。 体外 茎部接种效率低、耗时长且成本高，限制了杨树溃疡病杂交育种的发展。本研究提出了一种替代方法，通过评估茎部溃疡病原菌的抗病性 体内 叶片接种。本方法所用试验材料可为温室或田间1年生杨树幼苗，或多年生杨树的当年生枝条。该替代方法的关键步骤是接种叶片的选择：第5至第7片叶。th 新成熟的叶片可能是最合适的。叶片接种法的第二个关键步骤是通过针刺在植物叶片上制造伤口，以提供足够的病害位点来评估病害严重程度。对于杨树育种早期阶段产生的足量叶片而言，这一点尤为重要。 体内 叶片接种有助于对杨树溃疡病病原菌进行快速、准确和大规模的抗病无性系筛选。此外，该叶片接种方法也可作为筛选杨树溃疡病病原菌致病型的有效手段。 C. chrysosperma, B.dothidea或其他杨树茎干溃疡病病原菌。
引言
杨树干溃疡病主要由两种坏死性病原菌Cytospora chrysosperma (Pers.) Fr. 和 Botryosphaeria dothidea (Moug. ex Fr.) Ces. & de Not. 引起，严重威胁中国东北、华北和西北（三北）地区杨树人工林的发展与存活。杂交育种是防控林木病害最直接且高效的方法；然而，相较于速生、高产或其他杨树杂交品种育种方面取得的进展，针对杨树溃疡病抗性的育种研究仍十分匮乏。目前仅有少量关于抗病杂交育种的研究报道1,2,3，且在杨树造林中尚未培育出抗溃疡病的杂交品种。
常规杂交育种的关键步骤是基于杂交后代表型获取进行克隆筛选。然而，获取病理表型（pathotypes）耗时、费力、令人疲劳、成本高昂，且依赖专家判断 过程。对于木本植物而言，由于其生命周期长、生长缓慢且植株庞大，导致耗时、耗力且成本高昂，因此更具挑战性。例如，在杨树中，杂交后代的溃疡病抗性筛选需在杂交后5-7年才能通过传统方法进行 体外 茎部接种方法1,2,3此外，由于这种低效且高消耗的抗病筛选方法的限制，研究人员只能从少数亚群（例如，已选育的高产或速生杨树无性系）中重新筛选溃疡病抗性无性系，而无法从全部杂交后代中进行筛选。因此，采用常规的茎秆接种方法，难以准确鉴定真正的抗性无性系，也无法揭示育种后代中的抗病多样性，从而限制了抗病相关基因或基因模块的挖掘。相比之下，杨树速生/高产育种已取得快速发展，这些育种项目可在育种前两年通过表型选择甚至基因组选择获得杂交后代4，杨树抗溃疡病育种进展缓慢。杂交后代的抗病性筛选（或检测）以及病原菌接种方法已成为杨树溃疡病抗性育种中的关键限速步骤。
在本实验方案中，我们介绍了一种针对杨树茎干溃疡病病原菌的新型接种方法， 体内 叶片接种方法。利用该方法，我们可在5-7天内快速高效地检测数十种杨树物种（品种或无性系）的溃疡病抗性。验证实验表明 体内 叶片接种与传统方法一致 体外 茎接种法用于茎溃疡病抗性检测，而叶片接种法适用于杨树溃疡病的大规模抗性筛选，例如在茎溃疡病育种中对全基因型抗性后代进行筛选。该方法解决了杨树溃疡病杂交育种中抗性后代选择的病理学难题。
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方案
1. 溃疡病原菌的真菌培养
- 制备马铃薯葡萄糖琼脂（PDA；马铃薯提取物 6.0 g，葡萄糖 20.0 g，琼脂 20.0 g）培养基用于真菌菌株培养；将上述成分溶于水中并定容至 1000 mL，在 100 °C 下完全溶解培养基，持续 10 分钟。
- 将 PDA 培养基分装至 25 mL 试管中（每管 15.0 mL）；在 121.1 °C 下灭菌 30 分钟。将培养基倒入培养皿（直径 9.0 cm）中，并在室温（RT）下冷却。
- 将已在 PDA 培养基中于 28 °C 培养 7 天的病原真菌菌丝体切成约 0.5 cm 的正方形小块；将真菌小块接种于 PDA 平板中央（菌丝面朝向培养基）。
- 将病原真菌置于恒温培养箱中（28 °C，避光）培养 7–10 天。
- 将带有真菌菌丝体的 PDA 培养基切成正方形小块（边长 1.0–1.2 cm）。
2. 杨树材料的准备
- 对于1年生的杨树无性系（栽培） > 3个月），选取新近成熟且完全伸展的叶片（始终为5-7片）th 幼苗或枝条顶端的叶片作为接种材料，确保无虫害、病害及机械损伤。
- 对于多年生杨树杂交克隆（栽培）1年生枝条 > 2个月），选择顶部的5-7个th 选择枝条的叶片作为接种材料。确保所有测试的杨树无性系的叶片均健康，并处于相同的光照条件下（遮荫或光照）。
3. 接种叶片的预处理
- 用清水喷洒杨树叶片 ，干燥后，在接种操作前1小时或1天，用75%酒精擦拭选定的叶片。
4. 在体 叶片接种
- 对于小叶片（叶片宽度小于5 cm），使用整片叶片进行实验；对于大叶片（叶片宽度大于或等于5 cm），从叶片中部两侧对称采集直径为1 cm的叶圆片。所有样品应避开主脉，并立即放入液氮中速冻，随后于-80°C保存备用。 < 8.0 cm），将两块方形真菌菌丝块和PDA（或水琼脂，WA）块（边长1.0–1.2 cm）接种至杨树无性系顶部5–7片叶片的上表面，菌丝面朝向叶片。确保接种位置位于叶片半叶的中央区域，距离主脉约1–2 cm，避免遮挡侧脉。每个无性系在6片叶片上共接种12个位点（其中10个位点接种菌丝块，2个位点接种PDA块）。
- 对于大型叶片（叶宽 ≥ 8.0 cm），将四个方形真菌菌丝块及PDA（或WA）块接种至杨树顶部5–7片叶片上。每个无性系接种12个位点，分布在3片叶片上（其中菌丝块接种10个位点，PDA块接种2个位点）。
- 用透明胶带（宽6.0 cm）包裹接种后的叶片，并轻轻按压使其与叶片贴合，以防止菌丝体（或PDA）块在实验过程中移动和失水。
- 在五个位点穿刺叶片和菌丝（或PDA）块，直至针头从杨树叶片的上表面穿透至下表面。其中一个位点位于中心，其余四个位点分别靠近立方体的四个顶点，距顶点1-2 mm处。
注意：建议由3人团队协作完成真菌接种操作。对杨树杂交群体进行接种操作时（>100 个基因型）的实验可在团队合作下于 4 小时内完成。所有待测叶片接种并包裹后，再进行刺伤操作，以减轻不同刺伤时间对病害严重程度的影响。 - 检查菌丝接种物的位置移动和水分流失情况，并从叶片下表面观察刺伤接种点周围坏死病斑的出现，持续观察至第3天rd 接种当天
- 接种后3天内，观察菌丝块的位置移动和失水情况。将发生位移和失水的菌丝块定义为无效接种，予以标记并从最终的致病型鉴定中剔除；其余菌丝块定义为有效接种。
注意：本实验方案将接种有效方块数超过五个的杨树克隆定义为无效接种克隆；因此，每个杨树克隆至少提供30个有效接种位点，这些位点将发展为30个独立的坏死斑。
- 接种后3天内，观察菌丝块的位置移动和失水情况。将发生位移和失水的菌丝块定义为无效接种，予以标记并从最终的致病型鉴定中剔除；其余菌丝块定义为有效接种。
- 实验结束时（接种后约5-7天），将所有接种过的叶片摘下，用塑料样品袋带回实验室，并于4 °C保存。
5. 实验室中获取杨树叶片致病型及其对茎干溃疡病抗性的评估
- 小心地从叶片上移除透明胶带 和菌丝（或PDA）接种物 。
- 观察并鉴定每个杨树无性系的叶片致病变型，包括坏死斑点的形状和颜色 ，以及在刺入位点周围叶片表面形成的真菌菌丝样结构、分生孢子器和分生孢子。
- 使用相机拍摄叶片图像（同时放置标尺），或使用扫描仪扫描叶片（同时放置标尺），获取分辨率超过300 dpi的图像，然后将图像保存为JPEG、TIFF或PNG格式。
6. 疾病发生情况的鉴定与统计分析
- 在 ImageJ 1.54g 软件（http://imagj.org）中打开病叶图像。
- 根据叶片图像中的标尺设置比例尺。
- 使用魔棒（描记）工具识别并测量病斑。
- 在测量完所有坏死斑块的面积后，记录并将面积值导出为电子表格。
- 设定疾病判定标准：
- 若菌丝块覆盖穿刺位点周围的病斑面积显著大于PDA块覆盖的病斑面积，则将这些位点定义为病害位点。
- 若菌丝块覆盖穿刺位点的形态特征与PDA覆盖位点相比发生显著变化，包括病斑颜色改变、产生菌丝状结构、分生孢子器及分生孢子等，则也将该位点定义为病害位点。
- 计算每个杨树杂交无性系有效PDA病斑区域的平均面积。根据平均面积，将某一杨树无性系的所有接种菌丝块穿刺位点分为两类：发病与未发病。然后计算该测试杨树无性系的发病率（公式1：发病率（%）= 发病穿刺位点数 / 有效穿刺位点总数 × 100）。
- 计算叶片中病斑区域的平均面积（n = 50）。根据所有测试杨树无性系叶片病斑平均面积的数值，建立五级病害分级标准。
- 基于上述病害分级标准，计算每个杨树无性系的病情指数（公式2）（公式2：病情指数 = ∑（各级穿刺位点数 × 各级病害严重度值）/（最高严重度级别值 × 有效穿刺位点总数）× 100）。
- 使用Shapiro-Wilk检验，通过任意合适的数据分析软件验证不同抗性水平下杨树无性系数目是否符合正态分布。
- 根据病情指数，将所有测试的杨树无性系划分为五类（或七类）：极高抗性（VHR）、高抗性（HR）、抗性（R）、无抗性无感病性（NRNS）、感病性（S）、高感病性（HS）和极高感病性（VHS）组5。
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结果
本实验方案中，以48个杨树杂交克隆为材料，接种溃疡病病原菌C. chrysosperma， schematic workflow 如图1所示。这些杨树杂交克隆为中国林业科学研究院（CAF）北京市苗圃培育的美洲黑杨（P. deltoides）杂交后代。
溃疡病病原菌 C. chrysosperma 分离株 CZC 是一种典型的真菌菌株（具有中等致病性），常用于杨树溃疡病的生理学研究6,7,8,9，并保存于本实验室。结果表明，接种溃疡病病原菌 C. chrysosperma 后，杨树叶片上出现坏死病斑（图2B、C
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讨论
本方案提供了一种快速高效的杨树溃疡病抗性病原菌接种方法，适用于需要大规模抗病性筛选的研究领域，如杨树溃疡病抗性杂交育种及茎溃疡病原菌致病性筛选。
该方法的第一个关键点是通过新成熟叶片接种来评估抗病性，而非采用成熟茎/枝接种。因此，在杨树杂交育种中，利用叶片接种法可在1-2年内完成对溃疡病抗性无性系的筛选；相比之下，茎部接种途径的抗性筛选需在育种后5–7年才能进行，叶片接种法显著缩短了杨树溃疡病的育种周期。叶片法的第二个关键步骤是叶片的选择。叶片的抗病性随其个体发育阶段（叶龄或在枝条上的位置）而变化，这一现象称为叶片个体发育抗性，或叶龄相关抗性。12,13因此，测试叶片与茎/枝之间的植株抗性相关性对于叶片接种方法的有效性至关重要。在杂交杨树中，“五个中部叶片”的叶斑抗性与茎干溃疡病抗性无关。Septoria 相互作用13；然而，Wei 等人的研究14 我们...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由林木遗传育种国家重点实验室中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金（项目编号 CAFYBB2020ZY001-2）和国家自然科学基金（项目编号 32171776）共同资助，资助对象为 Jiaping Zhao。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 铝箔 | Biosharp | BS-QT-027B | |
| C. chrysosperma 分离株 | 中国林业文化收藏中心 | CFCC86775 | 实验室分离与保存 |
| Cytospora chrysosperma | 中国林业科学研究院林业新技术研究所植物生理学实验室 | NCBI登录号：rRNA-ITS为MK994101，EF1为MN025273α 基因 CGMCC 编号：40575 | 实验室分离与保存 |
| 爱普生 Perfection V370 Photo | Epson | V370 | 扫描仪；将叶片扫描成图像 |
| PDA（马铃薯葡萄糖琼脂） | Solarbio | P8931 | 为真菌生长提供营养 |
| 聚乙烯塑料薄膜 | 固定叶片上的真菌 | ||
| 银白杨 变种 锥状肌 | 中国林业科学研究院林业新技术研究所植物生理学实验室 | 由本实验室培养 | |
| SPSS | IBM | 数据分析软件 | |
| 恒温培养箱 | 上海坤天实验室仪器有限公司 | KTD-6000 | 为真菌生长提供环境 |
| 坚固型 TG-6 相机 | OLYMPUS | 拍摄病叶照片 |
参考文献
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