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活体叶片接种：一种评估杨树杂交无性系对茎干溃疡病抗病性的替代方法

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DOI：

10.3791/67290

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2024年9月20日

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1State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Institute of Ecological Conservation and Restoration, Chinese Academy of Forestry, 2Comprehensive Experimental Center in Yellow River Delta of Chinese Academy of Forestry, 3Beijing Haidian Kaiwen Academy High School, 4State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们提供了一种利用茎溃疡病原菌评估杨树抗性的逐步实验方案 体内 叶片接种法。该方法特别适用于大规模评估 Cytospora chrysosperma 和 Botryosphaeria dothidea 中国杨树育种后代中的溃疡病抗性研究

摘要

由病原菌引起的茎腐病 Cytospora chrysosperma (Pers.) Fr.) 和 Botryosphaeria dothidea (Moug. ex Fr.) Ces. & de Not. 是中国杨树人工林中的两种主要森林病害，有时可导致全部杨树幼苗死亡或严重破坏成熟的杨树林。杂交育种是防控和管理林木病害最直接且高效的方法。然而，基于抗病性评估或抗病克隆筛选的方法在实际应用中仍面临挑战。 体外 茎部接种效率低、耗时长且成本高，限制了杨树溃疡病杂交育种的发展。本研究提出了一种替代方法，通过评估茎部溃疡病原菌的抗病性 体内 叶片接种。本方法所用试验材料可为温室或田间1年生杨树幼苗，或多年生杨树的当年生枝条。该替代方法的关键步骤是接种叶片的选择：第5至第7片叶。th 新成熟的叶片可能是最合适的。叶片接种法的第二个关键步骤是通过针刺在植物叶片上制造伤口，以提供足够的病害位点来评估病害严重程度。对于杨树育种早期阶段产生的足量叶片而言，这一点尤为重要。 体内 叶片接种有助于对杨树溃疡病病原菌进行快速、准确和大规模的抗病无性系筛选。此外，该叶片接种方法也可作为筛选杨树溃疡病病原菌致病型的有效手段。 C. chrysosperma, B.dothidea或其他杨树茎干溃疡病病原菌。

引言

杨树干溃疡病主要由两种坏死性病原菌Cytospora chrysosperma (Pers.) Fr. 和 Botryosphaeria dothidea (Moug. ex Fr.) Ces. & de Not. 引起，严重威胁中国东北、华北和西北（三北）地区杨树人工林的发展与存活。杂交育种是防控林木病害最直接且高效的方法；然而，相较于速生、高产或其他杨树杂交品种育种方面取得的进展，针对杨树溃疡病抗性的育种研究仍十分匮乏。目前仅有少量关于抗病杂交育种的研究报道1,2,3，且在杨树造林中尚未培育出抗溃疡病的杂交品种。

常规杂交育种的关键步骤是基于杂交后代表型获取进行克隆筛选。然而，获取病理表型（pathotypes）耗时、费力、令人疲劳、成本高昂，且依赖专家判断 过程。对于木本植物而言，由于其生命周期长、生长缓慢且植株庞大，导致耗时、耗力且成本高昂，因此更具挑战性。例如，在杨树中，杂交后代的溃疡病抗性筛选需在杂交后5-7年才能通过传统方法进行 体外 茎部接种方法1,2,3此外，由于这种低效且高消耗的抗病筛选方法的限制，研究人员只能从少数亚群（例如，已选育的高产或速生杨树无性系）中重新筛选溃疡病抗性无性系，而无法从全部杂交后代中进行筛选。因此，采用常规的茎秆接种方法，难以准确鉴定真正的抗性无性系，也无法揭示育种后代中的抗病多样性，从而限制了抗病相关基因或基因模块的挖掘。相比之下，杨树速生/高产育种已取得快速发展，这些育种项目可在育种前两年通过表型选择甚至基因组选择获得杂交后代4，杨树抗溃疡病育种进展缓慢。杂交后代的抗病性筛选（或检测）以及病原菌接种方法已成为杨树溃疡病抗性育种中的关键限速步骤。

在本实验方案中，我们介绍了一种针对杨树茎干溃疡病病原菌的新型接种方法， 体内 叶片接种方法。利用该方法，我们可在5-7天内快速高效地检测数十种杨树物种（品种或无性系）的溃疡病抗性。验证实验表明 体内 叶片接种与传统方法一致 体外 茎接种法用于茎溃疡病抗性检测，而叶片接种法适用于杨树溃疡病的大规模抗性筛选，例如在茎溃疡病育种中对全基因型抗性后代进行筛选。该方法解决了杨树溃疡病杂交育种中抗性后代选择的病理学难题。

方案

1. 溃疡病原菌的真菌培养

  1. 制备马铃薯葡萄糖琼脂（PDA；马铃薯提取物 6.0 g，葡萄糖 20.0 g，琼脂 20.0 g）培养基用于真菌菌株培养；将上述成分溶于水中并定容至 1000 mL，在 100 °C 下完全溶解培养基，持续 10 分钟。
  2. 将 PDA 培养基分装至 25 mL 试管中（每管 15.0 mL）；在 121.1 °C 下灭菌 30 分钟。将培养基倒入培养皿（直径 9.0 cm）中，并在室温（RT）下冷却。
  3. 将已在 PDA 培养基中于 28 °C 培养 7 天的病原真菌菌丝体切成约 0.5 cm 的正方形小块；将真菌小块接种于 PDA 平板中央（菌丝面朝向培养基）。
  4. 将病原真菌置于恒温培养箱中（28 °C，避光）培养 7–10 天。
  5. 将带有真菌菌丝体的 PDA 培养基切成正方形小块（边长 1.0–1.2 cm）。

2. 杨树材料的准备

  1. 对于1年生的杨树无性系（栽培） > 3个月），选取新近成熟且完全伸展的叶片（始终为5-7片）th 幼苗或枝条顶端的叶片作为接种材料，确保无虫害、病害及机械损伤。
  2. 对于多年生杨树杂交克隆（栽培）1年生枝条 > 2个月），选择顶部的5-7个th 选择枝条的叶片作为接种材料。确保所有测试的杨树无性系的叶片均健康，并处于相同的光照条件下（遮荫或光照）。

3. 接种叶片的预处理

  1. 用清水喷洒杨树叶片 ，干燥后，在接种操作前1小时或1天，用75%酒精擦拭选定的叶片。

4. 在体 叶片接种

  1. 对于小叶片（叶片宽度小于5 cm），使用整片叶片进行实验；对于大叶片（叶片宽度大于或等于5 cm），从叶片中部两侧对称采集直径为1 cm的叶圆片。所有样品应避开主脉，并立即放入液氮中速冻，随后于-80°C保存备用。 < 8.0 cm），将两块方形真菌菌丝块和PDA（或水琼脂，WA）块（边长1.0–1.2 cm）接种至杨树无性系顶部5–7片叶片的上表面，菌丝面朝向叶片。确保接种位置位于叶片半叶的中央区域，距离主脉约1–2 cm，避免遮挡侧脉。每个无性系在6片叶片上共接种12个位点（其中10个位点接种菌丝块，2个位点接种PDA块）。
  2. 对于大型叶片（叶宽 ≥ 8.0 cm），将四个方形真菌菌丝块及PDA（或WA）块接种至杨树顶部5–7片叶片上。每个无性系接种12个位点，分布在3片叶片上（其中菌丝块接种10个位点，PDA块接种2个位点）。
  3. 用透明胶带（宽6.0 cm）包裹接种后的叶片，并轻轻按压使其与叶片贴合，以防止菌丝体（或PDA）块在实验过程中移动和失水。
  4. 在五个位点穿刺叶片和菌丝（或PDA）块，直至针头从杨树叶片的上表面穿透至下表面。其中一个位点位于中心，其余四个位点分别靠近立方体的四个顶点，距顶点1-2 mm处。
    注意：建议由3人团队协作完成真菌接种操作。对杨树杂交群体进行接种操作时（>100 个基因型）的实验可在团队合作下于 4 小时内完成。所有待测叶片接种并包裹后，再进行刺伤操作，以减轻不同刺伤时间对病害严重程度的影响。
  5. 检查菌丝接种物的位置移动和水分流失情况，并从叶片下表面观察刺伤接种点周围坏死病斑的出现，持续观察至第3天rd 接种当天
    1. 接种后3天内，观察菌丝块的位置移动和失水情况。将发生位移和失水的菌丝块定义为无效接种，予以标记并从最终的致病型鉴定中剔除；其余菌丝块定义为有效接种。
      注意：本实验方案将接种有效方块数超过五个的杨树克隆定义为无效接种克隆；因此，每个杨树克隆至少提供30个有效接种位点，这些位点将发展为30个独立的坏死斑。
  6. 实验结束时（接种后约5-7天），将所有接种过的叶片摘下，用塑料样品袋带回实验室，并于4 °C保存。

5. 实验室中获取杨树叶片致病型及其对茎干溃疡病抗性的评估

  1. 小心地从叶片上移除透明胶带 和菌丝（或PDA）接种物 。
  2. 观察并鉴定每个杨树无性系的叶片致病变型，包括坏死斑点的形状和颜色 ，以及在刺入位点周围叶片表面形成的真菌菌丝样结构、分生孢子器和分生孢子。
  3. 使用相机拍摄叶片图像（同时放置标尺），或使用扫描仪扫描叶片（同时放置标尺），获取分辨率超过300 dpi的图像，然后将图像保存为JPEG、TIFF或PNG格式。

6. 疾病发生情况的鉴定与统计分析

  1. 在 ImageJ 1.54g 软件（http://imagj.org）中打开病叶图像。
  2. 根据叶片图像中的标尺设置比例尺。
  3. 使用魔棒（描记）工具识别并测量病斑。
  4. 在测量完所有坏死斑块的面积后，记录并将面积值导出为电子表格。
  5. 设定疾病判定标准：
    1. 若菌丝块覆盖穿刺位点周围的病斑面积显著大于PDA块覆盖的病斑面积，则将这些位点定义为病害位点。
    2. 若菌丝块覆盖穿刺位点的形态特征与PDA覆盖位点相比发生显著变化，包括病斑颜色改变、产生菌丝状结构、分生孢子器及分生孢子等，则也将该位点定义为病害位点。
  6. 计算每个杨树杂交无性系有效PDA病斑区域的平均面积。根据平均面积，将某一杨树无性系的所有接种菌丝块穿刺位点分为两类：发病与未发病。然后计算该测试杨树无性系的发病率（公式1：发病率（%）= 发病穿刺位点数 / 有效穿刺位点总数 × 100）。
  7. 计算叶片中病斑区域的平均面积（n = 50）。根据所有测试杨树无性系叶片病斑平均面积的数值，建立五级病害分级标准。
  8. 基于上述病害分级标准，计算每个杨树无性系的病情指数（公式2）（公式2：病情指数 = ∑（各级穿刺位点数 × 各级病害严重度值）/（最高严重度级别值 × 有效穿刺位点总数）× 100）。
  9. 使用Shapiro-Wilk检验，通过任意合适的数据分析软件验证不同抗性水平下杨树无性系数目是否符合正态分布。
  10. 根据病情指数，将所有测试的杨树无性系划分为五类（或七类）：极高抗性（VHR）、高抗性（HR）、抗性（R）、无抗性无感病性（NRNS）、感病性（S）、高感病性（HS）和极高感病性（VHS）组5。

结果

本实验方案中，以48个杨树杂交克隆为材料，接种溃疡病病原菌C. chrysosperma， schematic workflow 如图1所示。这些杨树杂交克隆为中国林业科学研究院（CAF）北京市苗圃培育的美洲黑杨（P. deltoides）杂交后代。

溃疡病病原菌 C. chrysosperma 分离株 CZC 是一种典型的真菌菌株（具有中等致病性），常用于杨树溃疡病的生理学研究6,7,8,9，并保存于本实验室。结果表明，接种溃疡病病原菌 C. chrysosperma 后，杨树叶片上出现坏死病斑（图2B、C），甚至形成类似分生孢子器的结构（图2D–F）。此外，结果还表明，叶片位置（或叶龄和叶片发育阶段）（图2G–I）以及叶片的光照条件（图2J–L）会影响接种溃疡病病原菌 C. chrysosperma 分离株 CZC 后叶片的发病严重程度。

真菌接种物的致病性是未知杂交群体抗性筛选中的一个关键因素。然而，在育种中关于选择强毒菌株的问题上存在两种对立的观点：使用最强毒力的菌株10和使用中等毒力的菌株11。在本实验方案的预实验中，我们从10个真菌分离物对杂交杨树“北丰3号”的致病性检测中，选择了C. chrysosperma分离物CZC。令人鼓舞的是，SPSS中的Shapiro-Wilk检验分析结果表明，在48个杨树杂交无性系中，不同抗性水平的杨树无性系分布呈正态分布，说明该分离物适用于当前杨树杂交群体的抗性筛选。48个杨树无性系抗性筛选的部分结果如图3A-C所示。此外，结果表明，病原菌B. dothidea的六个分离物对杂交杨树“北丰3号”具有差异性毒力，其中分离物SD47和SD60在测试的真菌菌株中表现出最强的毒力（图3D-F），表明叶片接种方法也可用于杨树茎干溃疡病病原菌的毒力筛选。

杂交杨树无性系实验示意图；叶片上的菌丝块；ImageJ 分析结果
图1：通过茎溃疡抗性评估的示意图工作流程 在体 杨树克隆株的叶片接种 激活的茎溃疡病原菌 Cytospora chrysosperma 分离株CZC在PDA平板上培养于 28 °C在黑暗条件下培养10天。然后， C. chrysosperma 菌丝被切成方形小块（边长1.0–1.2 cm），并接种于最上层5–7个位置的表面th 1年生杨树幼苗或多年生杨树上的1年生枝条的叶片。菌丝块的菌丝面朝向叶片。对于小叶片（叶宽 < 8.0 cm）的叶片上接种2个菌丝块，而在大叶片（叶宽≥8.0 cm）上接种4个菌丝块。对于小苗或枝条上的小叶和大叶，则接种10个菌丝块以及2个PDA培养基块。接种后，用6.0–8.0 cm宽的塑料防护胶带包裹接种叶片，以固定菌丝块并防止水分流失。使用针刺在叶片及菌丝块中心和四个顶点处制造伤口位点。接种后的叶片在田间或温室中培养，并在接种后5–7天进行观察、拍照或扫描。随后将图像导入ImageJ软件，测量各杨树无性系由针刺伤口位点发展出的坏死斑的平均面积。最后，根据各杨树无性系坏死斑的平均面积计算病害发病率和病害指数。依据病害指数，将所有测试的杨树无性系划分为不同的抗性等级。 请点击此处以查看此图的放大版本。

叶片坏死研究；显微镜图像，柱状图显示不同光照条件下坏死区域的变化。
图2杂交杨树克隆B246受溃疡病原菌侵染后的典型叶片病斑特征 C. chrysosperma 通过叶片接种。 (A) 用PDA接种物接种；(B,C) 坏死斑；(D-F) 坏死斑点伴有分生孢子器结构； (G-I1年生幼苗/枝条上接种叶片的位置影响茎溃疡病原菌的病害严重程度 C. chrysosperma 在杂交杨树品种“Bofeng 3”上；(J-L光照条件影响杨树品种“Bofeng 3”的病害严重程度。 请点击此处以查看此图的放大版本。

杂交杨树无性系对B. dothidea抗性与感性叶片图像比较
图3抗性筛选与敏感性检测 抗性筛选A-C杂交杨树无性系及病原菌的敏感性检测 Botryosphaeria dothidea 分离株在（D-F) 杂交杨树克隆“Bofeng 3”利用 在体 叶片接种法 请点击此处以查看此图的放大版本。

严重程度等级分级标准等级
无病害无症状，坏死面积 0–2.0 mm²0
极轻微坏死面积 2.0–4.0 mm²1
轻度病害坏死面积 4.0–6.0 mm²2
中度病害坏死面积 6.0–8.0 mm²3
中重度病害坏死面积 8.0–10.0 mm²4
重度病害坏死面积大于 10.0 mm²5

表1：溃疡病原菌在叶片上诱导的坏死症状严重程度分级。

讨论

本方案提供了一种快速高效的杨树溃疡病抗性病原菌接种方法，适用于需要大规模抗病性筛选的研究领域，如杨树溃疡病抗性杂交育种及茎溃疡病原菌致病性筛选。

该方法的第一个关键点是通过新成熟叶片接种来评估抗病性，而非采用成熟茎/枝接种。因此，在杨树杂交育种中，利用叶片接种法可在1-2年内完成对溃疡病抗性无性系的筛选；相比之下，茎部接种途径的抗性筛选需在育种后5–7年才能进行，叶片接种法显著缩短了杨树溃疡病的育种周期。叶片法的第二个关键步骤是叶片的选择。叶片的抗病性随其个体发育阶段（叶龄或在枝条上的位置）而变化，这一现象称为叶片个体发育抗性，或叶龄相关抗性。12,13因此，测试叶片与茎/枝之间的植株抗性相关性对于叶片接种方法的有效性至关重要。在杂交杨树中，“五个中部叶片”的叶斑抗性与茎干溃疡病抗性无关。Septoria 相互作用13；然而，Wei 等人的研究14 我们的研究结果表明，顶部新成熟的叶片或顶部第5至7片叶的叶斑抗性th 叶片表现与茎腐病抗性一致 苹果属-V. ceratosperma 和杨树-C. chrysosperma 相互作用。因此， 体内 叶片接种法可用于杨树茎秆育种，顶部5-7片叶可作为接种材料。该方法的第三个关键点是在接种病原菌后，通过重复针刺产生足够数量的伤口位点（理论上建议30个，本方案中为50个），这些伤口位点将在三片杨树叶片上发展为50个独立的坏死斑，从而更准确地评估杨树后代对溃疡病的抗性。此外，还需注意保湿及光照条件的选择15 叶片中的性状有助于更稳定、准确地评估杨树茎干溃疡病的抗性。

在本实验方案中，选用1年生的杨树幼苗（栽培时间>3个月）和多年生杨树的1年生枝条（栽培时间>2个月）作为接种材料。杨树幼苗因其性状更一致且操作更简便，非常适合用于抗病性筛选。相反，选择杨树的枝条或叶片（应无病虫害和机械损伤，并处于相同的环境条件，如光照或遮阴）则较为困难。

与传统方法相比 体外 茎部接种法，该 体内 叶片接种法在多个方面显著提升了杨树溃疡病抗性育种的效率：1）为杨树茎干溃疡病的杂交育种提供了可行的抗病性筛选方法。根据我们的经验，一个由3人组成的团队可在1天内完成对200多个杨树杂交克隆的真菌接种，并在接种后5–7天获得结果。因此，通过3–6人的协作，育种人员可在较短时间内（例如1个月）完成对大规模杂交群体（例如1,000个基因型）的抗病性筛选。2）叶片接种法将溃疡病抗性克隆的首次选择时间大幅提前（从育种后5–7年缩短至1–2年），有利于抗性克隆的早期选择和苗期筛选。3）利用叶片接种法，研究人员可深入揭示全部杂交后代的抗性结构与多样性，并筛选出可用于生产或进一步育种的候选抗性克隆。4）此外，结合高通量测序技术，叶片接种法有助于挖掘与抗性相关的基因及基因调控模块。4并可基于基因组选择（GS）技术用于杨树抗病育种4最后，用于连续生产前5-7种th 在杨树生长季节采集叶片，育种人员可筛选杨树对不同病原菌株或不同病害病原的抗性；此外，叶片接种方法也为杨树多目标育种提供了可行途径，例如获得抗病的杂交无性系 C. chrysosperma 和 B. dothidea 同时检测多种溃疡病。但需要注意的是，该叶片接种方法是在一个相对较小的杂交杨树后代群体（48个基因型）中进行抗溃疡病筛选时建立的。因此，作为杨树抗溃疡病育种的关键策略，该方法的有效性仍需在更大规模的杂交杨树群体或栽培杨树种植园中进一步验证。

该方案将有助于研究杨树溃疡病（例如， Cytospora，Botryosphaeria，和 Septoria 疾病）杂交育种，为中国和北美地区的杨树造林提供抗性杨树杂交克隆。此外，本实验方案将有助于深入理解茎干溃疡病的致病机制，推动遗传分析和基因挖掘工作，并促进杨树分子育种的发展。同时，叶片接种方法还提供了一种准确且稳定的评估手段，可用于筛选溃疡病病原菌的感病性以及鉴定与真菌致病性相关的基因。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由林木遗传育种国家重点实验室中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金（项目编号 CAFYBB2020ZY001-2）和国家自然科学基金（项目编号 32171776）共同资助，资助对象为 Jiaping Zhao。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
铝箔BiosharpBS-QT-027B
C. chrysosperma 分离株中国林业文化收藏中心CFCC86775实验室分离与保存
Cytospora chrysosperma中国林业科学研究院林业新技术研究所植物生理学实验室NCBI登录号：rRNA-ITS为MK994101，EF1为MN025273α 基因   CGMCC 编号：40575实验室分离与保存
爱普生 Perfection V370 PhotoEpson V370扫描仪；将叶片扫描成图像
PDA（马铃薯葡萄糖琼脂） SolarbioP8931为真菌生长提供营养
聚乙烯塑料薄膜固定叶片上的真菌
银白杨 变种 锥状肌中国林业科学研究院林业新技术研究所植物生理学实验室由本实验室培养
SPSSIBM数据分析软件
恒温培养箱上海坤天实验室仪器有限公司KTD-6000为真菌生长提供环境
坚固型 TG-6 相机OLYMPUS拍摄病叶照片

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