我们提供了一种利用茎溃疡病原菌评估杨树抗性的逐步实验方案 体内 叶片接种法。该方法特别适用于大规模评估 Cytospora chrysosperma 和 Botryosphaeria dothidea 中国杨树育种后代中的溃疡病抗性研究
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方法文章
活体叶片接种：一种评估杨树杂交无性系对茎干溃疡病抗病性的替代方法
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
由病原菌引起的茎腐病 Cytospora chrysosperma (Pers.) Fr.) 和 Botryosphaeria dothidea (Moug. ex Fr.) Ces. & de Not. 是中国杨树人工林中的两种主要森林病害，有时可导致全部杨树幼苗死亡或严重破坏成熟的杨树林。杂交育种是防控和管理林木病害最直接且高效的方法。然而，基于抗病性评估或抗病克隆筛选的方法在实际应用中仍面临挑战。 体外 茎部接种效率低、耗时长且成本高，限制了杨树溃疡病杂交育种的发展。本研究提出了一种替代方法，通过评估茎部溃疡病原菌的抗病性 体内 叶片接种。本方法所用试验材料可为温室或田间1年生杨树幼苗，或多年生杨树的当年生枝条。该替代方法的关键步骤是接种叶片的选择：第5至第7片叶。th 新成熟的叶片可能是最合适的。叶片接种法的第二个关键步骤是通过针刺在植物叶片上制造伤口，以提供足够的病害位点来评估病害严重程度。对于杨树育种早期阶段产生的足量叶片而言，这一点尤为重要。 体内 叶片接种有助于对杨树溃疡病病原菌进行快速、准确和大规模的抗病无性系筛选。此外，该叶片接种方法也可作为筛选杨树溃疡病病原菌致病型的有效手段。 C. chrysosperma, B.dothidea或其他杨树茎干溃疡病病原菌。
引言
杨树干溃疡病主要由两种坏死性病原菌Cytospora chrysosperma (Pers.) Fr. 和 Botryosphaeria dothidea (Moug. ex Fr.) Ces. & de Not. 引起，严重威胁中国东北、华北和西北（三北）地区杨树人工林的发展与存活。杂交育种是防控林木病害最直接且高效的方法；然而，相较于速生、高产或其他杨树杂交品种育种方面取得的进展，针对杨树溃疡病抗性的育种研究仍十分匮乏。目前仅有少量关于抗病杂交育种的研究报道1,2,3，且在杨树造林中尚未培育出抗溃疡病的杂交品种。
常规杂交育种的关键步骤是基于杂交后代表型获取进行克隆筛选。然而，获取病理表型（pathotypes）耗时、费力、令人疲劳、成本高昂，且依赖专家判断 过程。对于木本植物而言，由于其生命周期长、生长缓慢且植株庞大，导致耗时、耗力且成本高昂，因此更具挑战性。例如，在杨树中，杂交后代的溃疡病抗性筛选需在杂交后5-7年才能通过传统方法进行 体外 茎部接种方法1,2,
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方案
1. 溃疡病原菌的真菌培养
- 制备马铃薯葡萄糖琼脂（PDA；马铃薯提取物 6.0 g，葡萄糖 20.0 g，琼脂 20.0 g）培养基用于真菌菌株培养；将上述成分溶于水中并定容至 1000 mL，在 100 °C 下完全溶解培养基，持续 10 分钟。
- 将 PDA 培养基分装至 25 mL 试管中（每管 15.0 mL）；在 121.1 °C 下灭菌 30 分钟。将培养基倒入培养皿（直径 9.0 cm）中，并在室温（RT）下冷却。
- 将已在 PDA 培养基中于 28 °C 培养 7 天的病原真菌菌丝体切成约 0.5 cm 的正方形小块；将真菌小块接种于 PDA 平板中央（菌丝面朝向培养基）。
- 将病原真菌置于恒温培养箱中（28 °C，避光）培养 7–10 天。
- 将带有真菌菌丝体的 PDA 培养基切成正方形小块（边长 1.0–1.2 cm）。
2. 杨树材料的准备
- 对于1年生的杨树无性系（栽培） > 3个月），选取新近成熟且完全伸展的叶片（始终为5-7片）th 幼苗或枝条顶端的叶片作为接种材料，确保无虫害、病害及机械损伤。
- 对于多年生杨树杂交克隆（栽培）1年生枝条 > 2个月），选择顶部的5-7个th....
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结果
本实验方案中，以48个杨树杂交克隆为材料，接种溃疡病病原菌C. chrysosperma， schematic workflow 如图1所示。这些杨树杂交克隆为中国林业科学研究院（CAF）北京市苗圃培育的美洲黑杨（P. deltoides）杂交后代。
溃疡病病原菌 C. chrysosperma 分离株 CZC 是一种典型的真菌菌株（具有中等致病性），常用于杨树溃疡病的生理学研究6,7,8,9，并保存于本实验室。结果表明，接种溃疡病病原菌 C. chrysosperma 后，杨树叶片上出现坏死病斑（图2B、C
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讨论
本方案提供了一种快速高效的杨树溃疡病抗性病原菌接种方法，适用于需要大规模抗病性筛选的研究领域，如杨树溃疡病抗性杂交育种及茎溃疡病原菌致病性筛选。
该方法的第一个关键点是通过新成熟叶片接种来评估抗病性，而非采用成熟茎/枝接种。因此，在杨树杂交育种中，利用叶片接种法可在1-2年内完成对溃疡病抗性无性系的筛选；相比之下，茎部接种途径的抗性筛选需在育种后5–7年才能进行，叶片接种法显著缩短了杨树溃疡病的育种周期。叶片法的第二个关键步骤是叶片的选择。叶片的抗病性随其个体发育阶段（叶龄或在枝条上的位置）而变化，这一现象称为叶片个体发育抗性，或叶龄相关抗性。12,13因此，测试叶片与茎/枝之间的植株抗性相关性对于叶片接种方法的有效性至关重要。在杂交杨树中，“五个中部叶片”的叶斑抗性与茎干溃疡病抗性无关。Septoria 相互作用13；然而，Wei 等人的研究14 我们.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由林木遗传育种国家重点实验室中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金（项目编号 CAFYBB2020ZY001-2）和国家自然科学基金（项目编号 32171776）共同资助，资助对象为 Jiaping Zhao。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 铝箔 | Biosharp | BS-QT-027B | |
| C. chrysosperma 分离株 | 中国林业文化收藏中心 | CFCC86775 | 实验室分离与保存 |
| Cytospora chrysosperma | 中国林业科学研究院林业新技术研究所植物生理学实验室 | NCBI登录号：rRNA-ITS为MK994101，EF1为MN025273α 基因 CGMCC 编号：40575 | 实验室分离与保存 |
| 爱普生 Perfection V370 Photo | Epson | V370 | 扫描仪；将叶片扫描成图像 |
| PDA（马铃薯葡萄糖琼脂） | Solarbio | P8931 | 为真菌生长提供营养 |
| 聚乙烯塑料薄膜 | 固定叶片上的真菌 | ||
| 银白杨 变种 锥状肌 | 中国林业科学研究院林业新技术研究所植物生理学实验室 | 由本实验室培养 | |
| SPSS | IBM | 数据分析软件 | |
| 恒温培养箱 | 上海坤天实验室仪器有限公司 | KTD-6000 | 为真菌生长提供环境 |
| 坚固型 TG-6 相机 | OLYMPUS | 拍摄病叶照片 |
参考文献
- Du, K., et al. Genetic analysis and seedling selection of the poplar progenies of Aigeiros section. Journal of Huazhong Agricultural University. 28 (5), 624-630 (2009).
- Shi, Y. Identification of canker resistance to selection poplar clones [Mas....
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