本方法描述了利用高效慢病毒介导的基因递送系统，在稳定表达靶向L2HGDH基因的sgRNA的人胚胎干细胞（hESC）系H9中，构建CRISPR介导的基因敲除。
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本文内容
摘要
摘要
用于基因组编辑的CRISPR-Cas9系统已彻底改变了包括干细胞在内的哺乳动物细胞中基因功能的研究。然而，该技术的实际应用，特别是在多能干细胞中，仍面临一些挑战，例如耗时长、劳动强度大以及编辑效率低。本文描述了一种利用高效且稳定的慢病毒介导的基因递送系统，在稳定表达针对L2HGDH基因的sgRNA的人胚胎干细胞（hESC）系中实现CRISPR介导的基因敲除的方法。靶向L2HGDH基因第1外显子的sgRNA经化学合成后克隆至lentiCRISPR v2-puro载体中，该载体将sgRNA与Cas9的组成型表达整合于一个高效的单载体系统中，从而获得更高的慢病毒滴度以感染hESC，并通过嘌呤霉素实现稳定筛选。经嘌呤霉素筛选的细胞进一步扩增，并采用有限稀释法获得单细胞克隆。扩增单克隆后，获得了多个L2HGDH基因的纯合敲除克隆，Western blot分析显示L2HGDH表达量完全降低100%。此外，通过MSBSP-PCR技术，将CRISPR突变位点定位在所选纯合克隆中Cas9的PAM识别序列上游。随后进行Sanger测序以分析确切的插入/缺失情况，并对克隆进行了功能表征。与先前报道的非病毒基因递送方法相比，该方法产生的纯合缺失比例显著更高。尽管本研究聚焦于L2HGDH基因，但这种稳健且经济高效的方法也可用于在多能干细胞中构建其他基因的纯合敲除，以开展基因功能研究。
引言
人类胚胎干细胞（hESCs）和诱导性多能干细胞（iPSCs）是具有分化为体内所有细胞类型潜能的干细胞。这些细胞是研究人类发育以及理解各种疾病潜在机制的重要工具，因此在再生医学、疾病建模和药物发现方面具有巨大前景。此类研究涉及探讨特定基因如何参与生物体的发育、功能及调控过程1,2。
为了阐明基因功能，研究人员采用了多种技术和方法，包括基因敲除或过表达等遗传操作以及基因组编辑。其中，CRISPR-Cas9 技术已成为基因敲除和基因编辑研究中最高效的方法1,2,3。CRISPR-Cas9 系统通过使用一种单链向导 RNA（sgRNA）分子发挥作用，该分子被特异性设计用于识别并结合特定的目标 DNA 序列。作为分子向导，sgRNA 将 Cas9 酶引导至基因组中需要修饰的精确位置。一旦结合到位，Cas9 即在指定位置引发 DNA 的双链断裂。DNA 断裂后，细胞自身的修复机制被激活，主要包括两种修复途径：非同源末端连接（NHEJ）和同源定向修复（HDR）。NHEJ 通常在断裂位点产生插入或缺失（indels），从而导致基因的破坏或失活；而 HDR 则能够在断裂位点插入新的 DNA 序列，实现靶向遗传修饰的引入4。
鉴于基因敲除在多能干细胞中的重要性，已有多种关于利用CRISPR-Cas9技术在人胚胎干细胞（hESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs）中实现基因敲除的实验方案发表。然而，这些方案中的许多存在显著局限性，例如耗时极长、劳动强度大，且由于采用非病毒基因递送方法，导致效率较低5。这些问题在hESCs/iPSCs中尤为突出，因为这些细胞相较于其他细胞类型已知具有更低的基因编辑效率5。通过提高携带Cas9和sgRNA的质粒递送效率，可在一定程度上克服上述部分限制。使用慢病毒载体系统可成功实现这一目标，并显著改善基因编辑效果。慢病毒包装方案成熟且操作简便，便于实验室广泛采用，即使经验有限的研究人员也能轻松掌握。慢病毒在多种细胞类型中均表现出高效的感染能力，包括hESCs和iPSCs。因此，在hESCs/iPSCs中开展常规基因功能研究时，采用慢病毒系统表达Cas9-sgRNA是理想的选择。
本文提供了一种简单直接的方法，可在比传统方案更短的时间内实现人胚胎干细胞（hESCs）中高效基于CRISPR-Cas9的基因删除（图1）。尽管本研究使用了组成型表达Cas9和sgRNA的慢病毒载体，但也可轻易替换为药物可诱导的Cas9表达系统，以实现对Cas9表达的可控调节。
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方案
本研究中使用的基因序列、试剂和设备的详细信息见材料表。
1. 单导向RNA（sgRNA）设计、克隆及慢病毒载体生产
注意：使用两种不同的靶向 L2HGDH 基因第一外显子的sgRNA序列，均引自Qiu等人的研究6，其中序列1和序列2的PAM位点分别为AGG和TGG。两种sgRNA长度均为20 bp，并在末端修饰以添加用于限制性内切酶Bsmb1的连接序列，以便克隆至目标载体（LentiCRISPRv2）中，具体方法如先前报道所述6。连接序列在sgRNA设计阶段即已加入，用于克隆目的。
- 将化学合成的sgRNA进行退火，并利用先前报道的优化方案，将其克隆至Bsmb1单切位点的慢病毒载体LentiCRISPRv2中67。
- 采用标准化且优化的方案进行慢病毒包装与浓缩7。
- 进行慢病毒生产时，使用DMEM培养基（含10% FBS和1×青霉素/链霉素（P/S））接种HEK293T细胞（密度为1 × 105 个细胞/cm2），在37 °C、5% CO2及湿润条件下，于组织培养箱中过夜培养。
- 当细胞融合度达到90%时，使用低成本阳离子聚合物PEI，将入门载体（空骨架或表达sgRNA的质粒）与包装质粒共同转染至HEK293T细胞中，具体操作如先前所述7。
- 转染后48小时和72小时收集含有慢病毒上清液（LVS）颗粒的条件培养基，并使用蔗糖垫进行超速离心，在4 °C下以1,25,000 × g离心2小时。
- 将LVS颗粒浓缩至原体积的至少200倍，分装后保存于PBS中，置于-80 °C冰箱中直至使用。
- 按照制造商说明书，使用qPCR慢病毒滴度检测试剂盒测定慢病毒颗粒的滴度（参见材料表）。
2. 慢病毒感染与单细胞克隆扩增
- 对于LVS颗粒感染，将含有1 × 105个细胞/0.5 mL hESC培养基（基础培养基 + P/S + 10 µM Rock抑制剂）的人胚胎干细胞（H9）悬液接种于经完全Matrigel（1:50稀释）包被的24孔板中，每孔加入500 µL培养基，过夜培养以使细胞贴壁。额外接种若干孔细胞，不进行LVS感染但接受嘌呤霉素处理，作为未感染对照组。
注意：细胞计数可使用手动血细胞计数板或自动细胞计数仪进行。 - 次日，以感染复数（MOI）为10的条件感染细胞，并加入8 µg/mL聚凝胺，于37 °C孵育8小时，随后更换为新鲜的hESC培养基 + P/S（不含Rock抑制剂），继续培养至细胞融合度达到90%。
- 当细胞融合度达到90%时（通常为感染后48–72小时），开始添加浓度为0.8 µg/mL的嘌呤霉素进行筛选，并持续筛选直至未感染组细胞全部死亡（对照组）。
- 筛选完成后（通常为4–6天），将稳定转导的细胞按1:4比例传代，扩增后用于冻存及后续分析。
- 使用表达L2HGDH-sgRNA-16的细胞进行单细胞筛选和克隆扩增。
- 为此，制备相当于500个细胞/10 mL完全生长培养基的细胞悬液，每孔加入100 µL该悬液至96孔板的各个孔中。
- 细胞静置培养3天后开始观察。
- 标记出形成单克隆的孔，并每隔一天更换培养基，直至克隆生长至足够大小（通常约2周），然后进行进一步扩增、冻存和分析。
3. 基因组DNA提取、MS-BSP PCR及Sanger测序
- 根据制造商说明，使用基因组DNA提取试剂盒从细胞中分离基因组DNA（参见材料表）。
- 采用基于突变位点的特异性引物（MS-BSP）分析法，对PAM识别序列上游的突变位点进行定位8。
- 为此，设计一条无偏性的右引物L2H-UMSBSP-R1，用于扩增Exon1外侧区域，以无偏好性地扩增任何目标序列。
- 设计一条有偏性的左引物L2H-BMSBSP-F1，其序列与sgRNA完全相同，用于扩增靠近PAM识别序列的目标区域。
注意：在极高严谨性的PCR条件下，未发生突变的克隆会在凝胶上观察到扩增产物；而在PAM识别序列上游附近存在突变的CRISPR敲除克隆中则不会观察到扩增产物。 - 为定位单碱基对突变，通过PCR扩增一段长度为468 bp、覆盖L2HGDH基因整个Exon1的序列，并进行Sanger测序，随后使用clustalw进行多序列比对分析8。
4. 人胚胎干细胞分化及拟胚体（EB）形成实验
- 按照既定方案，使用双SMAD抑制法对对照组及不同CRISPR克隆的人胚胎干细胞（H9）进行定向分化，诱导其向神经外胚层命运分化9,10,11。
- 当细胞融合度达到90%时，在100% KSR培养基中加入LDN193189（200 nM）和SB431542（10 µM）处理24小时，随后加入XAV939（2 µM）继续处理2天。
- 3天后，在8天内将KSR培养基比例（Knockout DMEM补充15% (v/v) KSR、1% (v/v) L-谷氨酰胺、1% (v/v) P/S、1% (v/v) 10 mM MEM以及0.1% (v/v) 2-巯基乙醇）逐步降低（75%、50%、25%），并与N2培养基（DMEM/F12补充1x N2添加剂、1x P/S）混合，最终完全替换为100% N2培养基。
- 在第12天开始时，使用PAX6作为神经外胚层标志物对细胞进行固定，用于免疫染色。
- 对于中胚层和内胚层命运决定的研究，采用基于小分子CHIR99021的方法，具体步骤见先前发表的文献12,13。
- 当细胞融合度达到70%时，在确定性内胚层（DE）培养基中加入3 µM CHIR99021处理24小时，随后固定细胞，使用Brachyury作为中胚层特异性标志物进行免疫染色。
- 对于内胚层阶段，继续在不含CHIR99021的DE培养基中额外培养24小时，然后固定细胞，使用FOXA2进行免疫染色。
- 对于拟胚体（EB）形成实验，将细胞接种于低吸附细胞培养表面，不使用Matrigel，在悬浮条件下培养24小时后拍摄显微图像。
5. 蛋白质印迹分析
- 用 PBS 洗涤细胞两次，然后使用含有 1% SDS 和 1× 蛋白酶与磷酸酶抑制剂混合物的 1× RIPA 缓冲液裂解细胞。
- 在 4 °C 条件下，以 16,000 × g 离心 10 分钟澄清裂解液，随后收集上清液。
- 使用 BCA 蛋白定量试剂盒按照制造商说明书测定总蛋白浓度，并用 4× 上样缓冲液将样品调整至 2 µg/µL。
- 在 70 °C 变性蛋白样品 10 分钟，等量上样后使用 4%–12% 的梯度 SDS-PAGE 凝胶进行电泳分离7，随后在 4 °C 条件下以恒定电压 100 V 转移至 PVDF 膜上，持续 1 小时。
- 用 5% 脱脂牛奶封闭膜，然后在 4 °C 条件下与一抗稀释液孵育过夜，并持续旋转。
- 随后，用 PBST 缓冲液洗涤膜 5 次，再在室温下与相应的 HRP 标记二抗孵育 1 小时。
- 再次用 PBST 缓冲液洗涤膜 5 次，加入化学发光底物孵育后，使用 X 射线胶片显影。
6. 免疫染色
- 将细胞接种于P4孔板中，在固定前至少培养24小时，以确保细胞充分贴附于表面。
- 用PBS洗涤细胞3次，以去除死亡细胞及培养基成分，随后在室温下用4%多聚甲醛固定15分钟。
- 使用0.3% Triton X-100对细胞进行透化处理，然后在室温下用含2% BSA的PBS封闭非特异性结合位点，封闭时间为1小时。
- 将样品与一抗（OCT4、NANOG、SOX2、KI67、PAX6、Brachuary、FOXA2）在1% BSA中稀释后，于4 °C孵育过夜。
- 用PBS洗涤细胞3次，然后加入相应的二抗（羊抗小鼠488、羊抗兔488、羊抗小鼠546、羊抗兔546），用1% BSA稀释后于室温孵育1小时。
- 最后用PBS洗涤样品3次，用DAPI复染，然后使用荧光显微镜成像。
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结果
将 L2HGDH sgRNA 克隆至 lentiCRISPRv2 puro 载体
lentiCRISPRv2 puro 载体购自商业来源（见材料表），并用 BsmB1 进行酶切，释放出一个 1.8 Kb 的填充片段。如图 2A所示，载体完全被酶切。对于每个构建体，使用反向 sgRNA 序列作为引物，并结合载体序列内的正向引物（U6-459F），对六个克隆进行插入片段存在与否的筛选。采用该方法，仅含有插入片段的克隆可扩增出 288 bp 的 PCR 产物，而不含 sgRNA 反向序列的阴性克隆则无 PCR 产物，如图 2B所示。
H9 感染、稳定筛选及蛋白质印迹分析
人胚胎干细胞（hESCs）被表达两种不同靶向 L2HGDH 基因第一外显子的 sgRNA 的慢病毒颗粒感染，并用嘌呤霉素进行筛选。通过对稳定共表达 sgRNA 和 Ca...
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讨论
本研究建立了一种标准化方法，利用CRISPR-Cas9技术在人胚胎干细胞（hESCs）中实现高效且低成本的基因敲除。该方法从hESC感染开始，经过单细胞克隆筛选与扩增，在3-4周内成功实现了L2HGDH基因的纯合子缺失（表1）。尽管在大多数细胞中可通过瞬时转染实现CRISPR-Cas9介导的基因操作，但在干细胞中该方法面临转染效率低和细胞毒性高的挑战。已有不同研究报道，获得的克隆中最多有10%出现目标基因缺失。例如，Mali等人报道，在靶向AAVS1位点后，人诱导性多能干细胞中的基因组编辑效率为2%至4%3。另一项研究报道，在原始态hESCs中靶向TUNA（一种参与多能性和神经分化的长链非编码RNA）时，编辑效率为1.3%-8.4%14。Ocana等人在靶向人类多能干细胞中的CFTR基因时，报告的编辑效率最高达10%15。因此，为实现高效的基因编辑，必须采用高效的Cas9-gRNA递送方法，这一点在干细胞中尤为关键，因为与典型的体细胞和永生化细胞系相比，干细胞对...
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
本研究工作得到了阿拉伯联合酋长国大学（UAEU）研究基金的资助，基金编号为 #12M105、#12R167（扎耶德健康科学中心）、21R105（扎耶德·本·苏丹慈善与人道主义基金会（ZCHF）），以及由阿布扎比先进技术研究委员会（ATRC）的技术项目管理支柱ASPIRE通过ASPIRE精准医学研究所阿布扎比（ASPIREPMRIAD）授予的VRI-20-10号基金。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-巯基乙醇 | Invitrogen | 31350010 | |
| 38.5 mL，无菌且经认证的开放式超透明管 | Beckman Coulter | C14292 | |
| Accutase | Stem cell technologies | 7920 | |
| bFGF 重组人源 | Invitrogen | PHG0261 | |
| Brachyury 兔单克隆抗体 | Abclonal | A5078 | |
| BsmBI-v2 | NEB | R0739S | |
| chir99021 | Tocris | 4423/10 | |
| Corning Matrigel 基底膜基质，无LDEV | Corning | 354234 | |
| 环杷明 | Stem cell technologies | 72074 | |
| DMEM 培养基 | Invitrogen | 11995073 | |
| DMEM 营养混合物 F12 | Invitrogen | 11320033 | |
| 不含 Ca 和 Mg 的 DPBS | PAN Biotech | P04-36500 | |
| 胎牛血清 | Invitrogen | 10270106 | |
| FoxA2/HNF3β | CST | 8186 | |
| GAPDH (14C10) 兔单克隆抗体 | CST | 2118S | |
| 温和细胞解离试剂 | Stem cell technologies | 7174 | |
| HyClone 非必需氨基酸 (NEAA) 100倍溶液 | GE healthcare | SH30238.01 | |
| Ki-67 (D3B5) 兔单克隆抗体 | CST | 9129 | |
| KnockOut 血清替代物 | Invitrogen | 10828028 | |
| L-谷氨酰胺，100倍 | Invitrogen | 2924190090 | |
| L2H-BMSBSP-F1 | Macrogen | CGTGCGGGTTCGCGTCTGGG | |
| L2HGDH 多克隆抗体 | Proteintech | 15707-1-AP | |
| L2HGDH-SgRNA1-F | Macrogen | CACCGCGTGCGG GTTCGCGTCTGGG | |
| L2HGDH-SgRNA1-R | Macrogen | AAACCCCAGACGC GAACCCGCACGC | |
| L2HGDH-SgRNA2-F | Macrogen | CACCGCCCGCGG GCTTTTCGCCGG | |
| L2HGDH-SgRNA2-R | Macrogen | AAACCCGGCGAA AAGCCCGCGGGC | |
| L2H-SeqF1 | Macrogen | GCTAAAGAGCGC GGGTCCTCGG | |
| L2H-SeqR1 | Macrogen | GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG | |
| L2H-UMSBSP-R1 | Macrogen | GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG | |
| LentiCRISPRv2 | Addgene | 52961 | |
| mTesR1 完全培养基 | Stem cell technologies | 85850 | |
| Nanog 抗体 | CST | 3580 | |
| Neurobasal 培养基 1x CTS | Invitrogen | A1371201 | |
| Neuropan 2 补充剂 100倍 | PAN Biotech | P07-11050 | |
| Neuropan 27 补充剂 50倍 | PAN Biotech | P07-07200 | |
| Oct-4 抗体 | CST | 2750 | |
| Pax6 (D3A9V) XP 兔单克隆抗体 | CST | 60433 | |
| 青霉素-链霉素溶液 | Invitrogen | 15140122 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| Polybrene 感染试剂 | Sigma | TR1003- G | |
| 支化聚乙烯亚胺 | Sigma | 408727 | |
| psPAX2.0 | Addgene | 12260 | |
| 嘌呤霉素 | Invitrogen | A1113802 | |
| qPCR 慢病毒滴度检测试剂盒 | Abm | LV900 | |
| ROCK 抑制剂 Y-27632 二盐酸盐 | Tocris | 1254 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614/10 | |
| Sox2 抗体 | CST | 2748 | |
| 蔗糖 | Sigma | 57-50-1 | |
| 0.05% 胰蛋白酶-EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
| U6-459F | Macrogen | GAGGGCCTATT TCCCATGATTC | |
| Wizard 基因组 DNA 纯化试剂盒 | Promega | A1120 | |
| XAV 939 | Tocris | 3748/10 |
参考文献
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