本方法描述了利用高效慢病毒介导的基因递送系统，在稳定表达靶向L2HGDH基因的sgRNA的人胚胎干细胞（hESC）系H9中，构建CRISPR介导的基因敲除。
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本文内容
摘要
摘要
用于基因组编辑的CRISPR-Cas9系统已彻底改变了包括干细胞在内的哺乳动物细胞中基因功能的研究。然而，该技术的实际应用，特别是在多能干细胞中，仍面临一些挑战，例如耗时长、劳动强度大以及编辑效率低。本文描述了一种利用高效且稳定的慢病毒介导的基因递送系统，在稳定表达针对L2HGDH基因的sgRNA的人胚胎干细胞（hESC）系中实现CRISPR介导的基因敲除的方法。靶向L2HGDH基因第1外显子的sgRNA经化学合成后克隆至lentiCRISPR v2-puro载体中，该载体将sgRNA与Cas9的组成型表达整合于一个高效的单载体系统中，从而获得更高的慢病毒滴度以感染hESC，并通过嘌呤霉素实现稳定筛选。经嘌呤霉素筛选的细胞进一步扩增，并采用有限稀释法获得单细胞克隆。扩增单克隆后，获得了多个L2HGDH基因的纯合敲除克隆，Western blot分析显示L2HGDH表达量完全降低100%。此外，通过MSBSP-PCR技术，将CRISPR突变位点定位在所选纯合克隆中Cas9的PAM识别序列上游。随后进行Sanger测序以分析确切的插入/缺失情况，并对克隆进行了功能表征。与先前报道的非病毒基因递送方法相比，该方法产生的纯合缺失比例显著更高。尽管本研究聚焦于L2HGDH基因，但这种稳健且经济高效的方法也可用于在多能干细胞中构建其他基因的纯合敲除，以开展基因功能研究。
引言
人类胚胎干细胞（hESCs）和诱导性多能干细胞（iPSCs）是具有分化为体内所有细胞类型潜能的干细胞。这些细胞是研究人类发育以及理解各种疾病潜在机制的重要工具，因此在再生医学、疾病建模和药物发现方面具有巨大前景。此类研究涉及探讨特定基因如何参与生物体的发育、功能及调控过程1,2。
为了阐明基因功能，研究人员采用了多种技术和方法，包括基因敲除或过表达等遗传操作以及基因组编辑。其中，CRISPR-Cas9 技术已成为基因敲除和基因编辑研究中最高效的方法1,2,3。CRISPR-Cas9 系统通过使用一种单链向导 RNA（sgRNA）分子发挥作用，该分子被特异性设计用于识别并结合特定的目标 DNA 序列。作为分子向导，sgRNA 将 Cas9 酶引导至基因组中需要修饰的精确位置。一旦结合到位，Cas9 即在指定位置引发 DNA 的双链断裂。DNA 断裂后，细胞自身的修复机制被激活，主要包括两种修复途径：非同源末端连接（NHEJ）和同源定向修复（HDR）。NHEJ 通常在断裂位点产生插入或缺失（indels），从而导致基因的破坏或失活；而 HDR 则能够在断裂位点插入新的 DNA 序....
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方案
本研究中使用的基因序列、试剂和设备的详细信息见材料表。
1. 单导向RNA（sgRNA）设计、克隆及慢病毒载体生产
注意：使用两种不同的靶向 L2HGDH 基因第一外显子的sgRNA序列，均引自Qiu等人的研究6，其中序列1和序列2的PAM位点分别为AGG和TGG。两种sgRNA长度均为20 bp，并在末端修饰以添加用于限制性内切酶Bsmb1的连接序列，以便克隆至目标载体（LentiCRISPRv2）中，具体方法如先前报道所述6。连接序列在sgRNA设计阶段即已加入，用于克隆目的。
- 将化学合成的sgRNA进行退火，并利用先前报道的优化方案，将其克隆至Bsmb1单切位点的慢病毒载体LentiCRISPRv2中67。
- 采用标准化且优化的方案进行慢病毒包装与浓缩7。
- 进行慢病毒生产时，使用DMEM培养基（含10% FBS和1×青霉素/链霉素（P/S））接种HEK293T细胞（密度为1 × 105 个细胞/cm2<....
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结果
将 L2HGDH sgRNA 克隆至 lentiCRISPRv2 puro 载体
lentiCRISPRv2 puro 载体购自商业来源（见材料表），并用 BsmB1 进行酶切，释放出一个 1.8 Kb 的填充片段。如图 2A所示，载体完全被酶切。对于每个构建体，使用反向 sgRNA 序列作为引物，并结合载体序列内的正向引物（U6-459F），对六个克隆进行插入片段存在与否的筛选。采用该方法，仅含有插入片段的克隆可扩增出 288 bp 的 PCR 产物，而不含 sgRNA 反向序列的阴性克隆则无 PCR 产物，如图 2B所示。
H9 感染、稳定筛选及蛋白质印迹分析
人胚胎干细胞（hESCs）被表达两种不同靶向 L2HGDH 基因第一外显子的 sgRNA 的慢病毒颗粒感染，并用嘌呤霉素进行筛选。通过对稳定共表达 sgRNA 和 Ca.......
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讨论
本研究建立了一种标准化方法，利用CRISPR-Cas9技术在人胚胎干细胞（hESCs）中实现高效且低成本的基因敲除。该方法从hESC感染开始，经过单细胞克隆筛选与扩增，在3-4周内成功实现了L2HGDH基因的纯合子缺失（表1）。尽管在大多数细胞中可通过瞬时转染实现CRISPR-Cas9介导的基因操作，但在干细胞中该方法面临转染效率低和细胞毒性高的挑战。已有不同研究报道，获得的克隆中最多有10%出现目标基因缺失。例如，Mali等人报道，在靶向AAVS1位点后，人诱导性多能干细胞中的基因组编辑效率为2%至4%3。另一项研究报道，在原始态hESCs中靶向TUNA（一种参与多能性和神经分化的长链非编码RNA）时，编辑效率为1.3%-8.4%14。Ocana等人在靶向人类多能干细胞中的CFTR基因时，报告的编辑效率最高达10%15。因此，为实现高效的基因编辑，必须采用高效的Cas9-gRNA递送方法，这一点在干细胞中尤为关键，因为与典型的体细胞和永生化细胞系相比，干细胞对.......
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
本研究工作得到了阿拉伯联合酋长国大学（UAEU）研究基金的资助，基金编号为 #12M105、#12R167（扎耶德健康科学中心）、21R105（扎耶德·本·苏丹慈善与人道主义基金会（ZCHF）），以及由阿布扎比先进技术研究委员会（ATRC）的技术项目管理支柱ASPIRE通过ASPIRE精准医学研究所阿布扎比（ASPIREPMRIAD）授予的VRI-20-10号基金。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-巯基乙醇 | Invitrogen | 31350010 | |
| 38.5 mL，无菌且经认证的开放式超透明管 | Beckman Coulter | C14292 | |
| Accutase | Stem cell technologies | 7920 | |
| bFGF 重组人源 | Invitrogen | PHG0261 | |
| Brachyury 兔单克隆抗体 | Abclonal | A5078 | |
| BsmBI-v2 | NEB | R0739S | |
| chir99021 | Tocris | 4423/10 | |
| Corning Matrigel 基底膜基质，无LDEV | Corning | 354234 | |
| 环杷明 | Stem cell technologies | 72074 | |
| DMEM 培养基 | Invitrogen | 11995073 | |
| DMEM 营养混合物 F12 | Invitrogen | 11320033 | |
| 不含 Ca 和 Mg 的 DPBS | PAN Biotech | P04-36500 | |
| 胎牛血清 | Invitrogen | 10270106 | |
| FoxA2/HNF3β | CST | 8186 | |
| GAPDH (14C10) 兔单克隆抗体 | CST | 2118S | |
| 温和细胞解离试剂 | Stem cell technologies | 7174 | |
| HyClone 非必需氨基酸 (NEAA) 100倍溶液 | GE healthcare | SH30238.01 | |
| Ki-67 (D3B5) 兔单克隆抗体 | CST | 9129 | |
| KnockOut 血清替代物 | Invitrogen | 10828028 | |
| L-谷氨酰胺，100倍 | Invitrogen | 2924190090 | |
| L2H-BMSBSP-F1 | Macrogen | CGTGCGGGTTCGCGTCTGGG | |
| L2HGDH 多克隆抗体 | Proteintech | 15707-1-AP | |
| L2HGDH-SgRNA1-F | Macrogen | CACCGCGTGCGG GTTCGCGTCTGGG | |
| L2HGDH-SgRNA1-R | Macrogen | AAACCCCAGACGC GAACCCGCACGC | |
| L2HGDH-SgRNA2-F | Macrogen | CACCGCCCGCGG GCTTTTCGCCGG | |
| L2HGDH-SgRNA2-R | Macrogen | AAACCCGGCGAA AAGCCCGCGGGC | |
| L2H-SeqF1 | Macrogen | GCTAAAGAGCGC GGGTCCTCGG | |
| L2H-SeqR1 | Macrogen | GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG | |
| L2H-UMSBSP-R1 | Macrogen | GTGGACGGGTTG TTCAAAGCCAGAG | |
| LentiCRISPRv2 | Addgene | 52961 | |
| mTesR1 完全培养基 | Stem cell technologies | 85850 | |
| Nanog 抗体 | CST | 3580 | |
| Neurobasal 培养基 1x CTS | Invitrogen | A1371201 | |
| Neuropan 2 补充剂 100倍 | PAN Biotech | P07-11050 | |
| Neuropan 27 补充剂 50倍 | PAN Biotech | P07-07200 | |
| Oct-4 抗体 | CST | 2750 | |
| Pax6 (D3A9V) XP 兔单克隆抗体 | CST | 60433 | |
| 青霉素-链霉素溶液 | Invitrogen | 15140122 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| Polybrene 感染试剂 | Sigma | TR1003- G | |
| 支化聚乙烯亚胺 | Sigma | 408727 | |
| psPAX2.0 | Addgene | 12260 | |
| 嘌呤霉素 | Invitrogen | A1113802 | |
| qPCR 慢病毒滴度检测试剂盒 | Abm | LV900 | |
| ROCK 抑制剂 Y-27632 二盐酸盐 | Tocris | 1254 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614/10 | |
| Sox2 抗体 | CST | 2748 | |
| 蔗糖 | Sigma | 57-50-1 | |
| 0.05% 胰蛋白酶-EDTA | Invitrogen | 25300062 | |
| U6-459F | Macrogen | GAGGGCCTATT TCCCATGATTC | |
| Wizard 基因组 DNA 纯化试剂盒 | Promega | A1120 | |
| XAV 939 | Tocris | 3748/10 |
参考文献
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- Jiang, F., Doudna, J. A. CRISPR-Cas9 structures and mechanisms. Annu Rev Biophys. 46 (1), 505-529 (2017).
- Mali, P., ....
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