尽管原核生物缺乏细胞器系统，但其细胞内存在特定的亚细胞区域，这些区域含有定位的蛋白质。对亚细胞区域中酶和蛋白质进行定性与定量分析，对于开发药物和疫苗靶点具有重要意义。本文以Triton X-114为例，介绍钩端螺旋体蛋白的亚细胞分级分离及其分析方法。
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摘要
摘要
原核生物缺乏精确的亚细胞器，但具有不同的区域，如细胞质、内膜、周质和外膜，大多数生物化学和生理功能在这些区域中有序进行。因此，要理解蛋白质的功能特性，必须阐明其亚细胞定位。然而，由于革兰氏阴性菌具有复杂的磷脂双分子层，从中提取亚细胞蛋白质面临挑战。尽管Triton X-114在提取外膜蛋白（OMP）方面已显示出潜力，但仍缺乏简明的实验方案。本方案以螺旋体属的Leptospira为模型，展示了一种逐步提取亚细胞蛋白质的工作流程。该技术结合了亚细胞分级分离和相分离，可获得分别富含细胞质蛋白、外膜蛋白和内膜蛋白的不同组分。去垢剂Triton X-114因其适宜的浊点温度（约22 °C）和较低的临界胶束浓度（CMC），非常适合用于相分离，能够在最小变性的条件下高效提取和纯化天然蛋白质。值得注意的是，分析结果表明该方法能够有效区分来自内膜和外膜的蛋白质与细胞质蛋白。
引言
亚细胞蛋白质组学（SCP）分析通过研究细菌细胞特定亚细胞区室内的蛋白质组，在阐明细菌致病机制方面发挥着关键作用。这种亚细胞蛋白质组学方法可对不同区室中的细菌蛋白质进行表征，通过排除高丰度蛋白质以降低复杂性，从而揭示其组织结构及相对丰度1,2。例如，通过采用亚细胞分级分离结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术，对Shewanella oneidensis开展的一项研究揭示了其蛋白质组的大量信息，提供了关于细胞区室结构和蛋白质丰度的关键细节。该研究为后续探索革兰氏阴性菌的亚细胞结构提供了基础框架3。在细菌致病性研究领域，明确细菌在in vivo感染过程中的蛋白质组对于理解致病机制至关重要4。通过对不同感染阶段上皮细胞内沙门氏菌（Salmonella）的蛋白质组进行研究，已成功揭示了细菌病原体在其胞内微环境中所采用的适应性策略4,5。SCP策略通过评估蛋白质在不同细胞区室中的丰度与转位情况，全面揭示细胞动态变化。该方法有助于广泛鉴定来自多种细菌区室的蛋白质，从而增强对细菌蛋白质组的深入分析6,7。
蛋白质的亚细胞分布不仅决定了其功能活性，还增强了其功能多样性8。例如，酶的调控机制和活性水平因其亚细胞定位的不同而存在差异。以转谷氨酰胺酶（TGases）为例，其在花粉管的不同亚细胞区室中表现出不同的功能或调控机制：细胞质中的TGases以Ca(2+)-依赖的方式将伯胺整合到胞质蛋白（如肌动蛋白和微管蛋白）中，并与细胞骨架相互作用；膜结合型TGases与高尔基体和质膜相关，提示其在胞吐运输中发挥作用；而细胞壁相关的TGases则通过与细胞壁标记物共定位来调控顶端生长。这些功能差异由特定区室中的作用机制所介导9。此外，细菌包膜中氧化蛋白的修复凸显了暴露于活性氧环境下的特定细胞区室中酶系统的关键作用10。以内皮型一氧化氮合酶（eNOS）为例，其亚细胞定位受脂质修饰调控，从而影响其与多种细胞膜的相互作用11。酶的区室化维持了有利于酶与底物相互作用的独特微环境，进而促进特定区室内的代谢过程12。
细菌及其他原核生物没有明确的亚细胞器；但存在不同的区域，包括细胞质、内膜、周质和外膜。生物体内的大多数生物化学和生理功能都分布在各种亚细胞区室中13。因此，蛋白质的亚细胞定位对于预测其功能特性具有重要意义。然而，由于革兰氏阴性菌具有复杂的双层膜磷脂双分子层结构，从中提取亚细胞蛋白质面临诸多挑战。传统的提取方法使用十二烷基硫酸钠（SDS）等去垢剂以及尿素等添加剂，常常会破坏膜蛋白的完整性，从而影响下游分析14,15。此外，脂质组成在塑造膜蛋白构象变化方面起着重要作用。溶解的成功与否取决于去垢剂-脂质-蛋白比例等因素，因为该过程涉及去垢剂插入脂质双分子层，进而实现蛋白的溶解16。选择合适的去垢剂对于有效溶解膜蛋白至关重要，需考虑浊点温度和孵育时间等因素17。脂质环境可能影响膜蛋白的构象变化18,19。
去垢剂对于从生物膜中提取膜蛋白并确保其在水溶液中的溶解性至关重要，这是后续蛋白质纯化的先决条件。然而，膜蛋白的纯化通常具有挑战性，因为它们被从天然的脂质膜环境中移除，并置于去垢剂缓冲液中，而后者仅能部分模拟膜的物理和化学性质20。提取后，膜蛋白通常通过透析、蛋白质沉淀以及一些色谱方法作为可溶性蛋白进行后续纯化20,21。相分离为基于色谱的纯化方案提供了一种强有力的替代或补充方法，并可直接应用于已溶解的蛋白质。基本原理是，相分离可使内在膜蛋白分配至富含去垢剂的相中，而胞质蛋白则保留在去垢剂耗尽的水相中20,22。已有研究报道多种去垢剂可用于膜蛋白的溶解20，包括Triton系列（Triton X-100 & Triton X-114）、Tween系列（Tween-20, & -80）、阴离子型去垢剂、阳离子型去垢剂、聚氧乙烯醚类去垢剂等，但这些去垢剂在维持蛋白质结构与功能方面各有优缺点20。这些去垢剂的理化性质显著影响膜蛋白的相分配和溶解效果20。去垢剂是具有极性头部和疏水性碳氢链的两亲性分子。在低浓度下，它们以单体形式存在于水中；当浓度超过临界胶束浓度（CMC）时，会形成胶束，其大小取决于去垢剂类型，聚集数表示每个胶束中的分子数量（也称为胶束分子量）。另一个重要因素是"浊点"，通过改变水相胶束去垢剂溶液的温度，可使其变得浑浊并最终形成两个不同的相。该过程被称为相分离或浊点萃取。较高的CMC可产生更多的膜蛋白，对应于高浓度但结合较弱的去垢剂，可通过透析将其置换至含有确定浓度去垢剂的缓冲液中20。然而，大多数去垢剂达到高CMC需要较高的浊点温度，这可能影响所提取蛋白的结构与功能，并干扰下游操作。此外，该相中高浓度的去垢剂可能对蛋白质有害，并因黏度过高而导致液体操作困难，难以精确移取体积。例如，Triton X-100在浊点温度64–65 °C以上时，可在去垢剂胶束中获得较高的膜蛋白得率。为降低工作温度，可通过添加9%–23% (NH4)2SO4 或 16%–25% NaCl 将浊点降至室温（RT），但会导致去垢剂浓度升高，可能影响蛋白质稳定性。类似地，基于Tween的萃取需使用较高的浊点温度（Tween 20为76 °C，Tween 80为93 °C）。阴离子去垢剂SDS常用于蛋白质实验，但通常会导致蛋白质变性20。研究人员为高效提取膜蛋白，发现Triton X-114是一种经典去垢剂，因其约22 °C的适宜浊点温度，非常适合用于膜蛋白研究。Triton X-114由Bordier于1981年首次引入，此后已广泛用于从多种来源（包括动物和植物组织以及微生物）中提取和纯化膜蛋白20,22。Triton X-114的低CMC使其难以通过透析去除，但其温和的性质可最大程度减少去垢剂富集相对膜蛋白的变性作用。此外，Triton X-114形成的胶束较小（n = 7–8），相较于Triton X-100更小20。James G. Pryde的研究方案采用Triton X-114从培养的哺乳动物细胞中提取膜蛋白。通过将温度升至20 °C以上（30 °C孵育3分钟），内在膜蛋白被分配至去垢剂富集相，而外周膜蛋白和胞质蛋白则从去垢剂耗尽的水相中回收22。此外，David A. Haake等人使用Triton X-114从Leptospira interrogans中提取外膜蛋白（OMPs），实验中添加或不添加CaCl2作为辅助剂23,24。后续研究证实，Triton X-114可在无需甘油或CaCl2等添加剂的情况下，有效提取亚细胞组分中的OMPs25,26。然而，盐类的加入可能提高去垢剂浓度，从而影响使用高通量质谱技术的大规模蛋白质组学研究20。在我们关于亚细胞蛋白质组分析的工作中，采用了Triton X-114结合串联质谱技术，实现了对所有亚细胞组分（包括胞质蛋白、内膜蛋白和外膜蛋白）的显著富集25,26。本方案的主要目标是在最小化下游操作问题的前提下，高效富集典型革兰氏阴性细菌细胞的各个亚细胞组分。此外，该方案设计为成本低廉且耗时较短。本文详细阐述了实验室优化的亚细胞蛋白分离方案，并讨论了提取过程中遇到的每一个瓶颈问题。
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方案
注意：本实验方案使用问号钩端螺旋体（Leptospira interrogans）进行亚细胞蛋白质提取实验。尽管本方案可经调整后用于其他革兰氏阴性细菌，但可能需要根据具体的研究目标进行优化。材料表和表1分别列出了化学品与设备，以及缓冲液和试剂溶液的组成成分，而表2则概述了实验室设施。
1. Leptospira 菌株及培养条件
- 获取 L. interrogans 血清群Icterohaemorrhagiae血清型Copenhageni菌株Fiocruz L1-130
注：该菌株由位于印度布莱尔港的印度医学研究委员会—区域医学研究中心（WHO 合作中心）提供，该中心专注于钩端螺旋体病的诊断、参考、研究与培训。 - 培养 钩端螺旋体 （含有约 1 × 106 细胞/mL）置于50 mL添加了1%牛血清白蛋白（BSA）的Ellinghausen McCullough Johnson Harris（EMJH）培养基中。
- 在30 °C下培养，直至菌液达到对数生长中期（3.5 × 108 细胞/mL）。在营养琼脂平板上检测培养基的等分试样，以确保培养基未受污染。
注意：使用暗视野显微镜和Petroff-Hausser计数板对细胞进行计数。具体操作步骤参见先前发表的文章27.
2. 细胞收获
- 经过7天的培养后，将三份生物学重复的L. interrogans培养物等体积（每份25 mL）转移至离心管中。
注意：Leptospira培养物在转移过程中需在生物安全二级（BSL-2）实验室的层流罩内操作。 - 将所有离心管在4 °C条件下以2500 × g离心45分钟。小心倾去上清液至含有消毒剂的烧杯中并弃去。保留细胞沉淀用于下一步操作。
- 用含5 mM MgCl2的磷酸盐缓冲液（每次1 mL）将细胞沉淀洗涤三次，每次洗涤后在4 °C条件下以10,000 × g离心10分钟。
注意：此步骤可去除细胞沉淀表面残留的EMJH培养基中的BSA。
3. 亚细胞蛋白提取
- Triton X-114 提取
- 将收获后获得的 Leptospira 细胞沉淀，按每份沉淀加入 1 mL 的比例加入提取缓冲液进行处理，该缓冲液含有 10 mM Tris-Cl（pH 8）、1% Triton X-114 和 150 mM NaCl（表 1）（可选——可根据 实验目的添加蛋白酶抑制剂混合物）。
注：该步骤仅需将细菌暴露于去垢剂溶液中，通过向沉淀中加入提取缓冲液以提取膜蛋白。 - 在低于 25 °C 的条件下，使用移液器轻轻混匀提取缓冲液与沉淀，直至溶液明显变浑浊。
- 将混合物在 4 °C 下孵育过夜。
- 再次用移液器混匀所得提取液，并在 4 °C 下以 15,000 × g 离心 30 分钟。
- 将上清液倾入另一小瓶中，保留细胞沉淀用于后续提取步骤。
注：此上清液含有来自细胞质和外膜的亲水性与疏水性蛋白的混合物，用于后续相分离。 - 向细胞沉淀中加入 50 µL 含有 10 mM Tris-Cl（pH 8）、8 M 尿素、蛋白酶抑制剂混合物和 1% 十二烷基硫酸钠（SDS）的缓冲液。
- 加入提取缓冲液后连续涡旋混合 5 分钟，然后在 4 °C 下再孵育 5 分钟。
- 再次在 4 °C 下以 15,000 × g 离心 30 分钟，将所得上清液标记为沉淀组分（P）。
注：研究发现，Leptospira 的沉淀组分富含内膜蛋白25,26。
- 将收获后获得的 Leptospira 细胞沉淀，按每份沉淀加入 1 mL 的比例加入提取缓冲液进行处理，该缓冲液含有 10 mM Tris-Cl（pH 8）、1% Triton X-114 和 150 mM NaCl（表 1）（可选——可根据 实验目的添加蛋白酶抑制剂混合物）。
- 相分离
- 将提取所得上清液中的 Triton X-114 浓度调整至 2%。例如，若上清液体积为 900 µL，则加入 9 µL Triton X-114 去垢剂以达到目标浓度。
- 将混合物在 37 °C 下孵育 1 小时，然后在 30 °C 下以 2000 × g 离心 5 分钟。此低速离心可加速相分离。
- 使混合物分离为两个明显不同的相：水相和去垢剂相。确保通过低速离心实现清晰的相分离。如有必要，在分离前静置 1 分钟。若未发生相分离，可重复步骤 3.2.2。
注：可通过肉眼观察、分光光度计测定浊度或静态光散射法检测相分离。为提高浊点测定的准确性，可在溶液中加入浓度为 500 nM 的疏水性染料（5-十六烷酰氨基荧光素），并采用紫外-可见光谱（UV-VIS）进行分析。 - 用无菌注射器穿刺两相界面，分离上层水相并转移至另一小瓶中；使用移液器分离下层去垢剂相，并储存于另一小瓶中。
注：在分离过程中应小心操作含有两相的小瓶。在用注射器穿刺前，先打开瓶盖，以防针头断裂或难以吸取上层水相。使用注射器可更准确地测量各相体积，并最大限度减少蛋白在两相间的交叉污染。 - 将两相分别标记为水相（A）和去垢剂相（D），并于 -20 °C 保存以备后续使用。
4. 蛋白质定量
- 使用二辛可宁酸法28或其他任何合适的方法测定各Triton X-114组分（水相、去垢剂相和沉淀相）的蛋白质浓度。
5. 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶电泳
注意：每个组分（水相、去垢剂相、沉淀相）的蛋白质必须用β-巯基乙醇进行还原处理，然后通过10% SDS-PAGE分离（三个生物学重复）。10% SDS-PAGE的配方见表1。对于靶向特定蛋白质的实验，任何酶活性分析都需在天然形式下进行，以便在非变性PAGE中实现分离。
- 用四倍于样品体积的预冷丙酮重悬蛋白样品，在 -20 °C 下孵育至少 2 小时，然后在 14,000 × g 离心 10 分钟。此外，将沉淀部分用 80% 预冷丙酮重悬，在 4 °C 下孵育 5 分钟，再于 14,000 × g 离心 10 分钟以去除过量的尿素盐晶体。
- 离心后，小心移除上清液，并将蛋白沉淀置于干燥浴中，直至管内残留的丙酮完全挥发。
- 将蛋白样品加入含 β-巯基乙醇的 20 µL 上样缓冲液中孵育，然后在水浴或干燥浴中 95 °C 加热 10 分钟。
注意：此处的蛋白样品代表含有胞质蛋白的水相（A）组分、含有外膜蛋白的去垢剂相（D）组分，以及含有内膜蛋白的沉淀相（P）组分。 - 将含有 A、D 和 P 组分的样品，连同预染蛋白 Marker（M）和总蛋白（T），分别上样至 10% SDS-PAGE 凝胶的各个加样孔中。
注意：总蛋白可通过将上述三种组分合并至同一管中，并加入 20 µL 上样缓冲液制备而成。 - 电泳装置中使用 1× 电极缓冲液（表 1）。设定电泳参数：浓缩胶阶段电流为 6 mA，分离胶阶段为 12 mA。在室温下进行电泳。
- 使用考马斯亮蓝 G 或实验室现有的其他蛋白染色剂对凝胶进行染色。
6. 免疫印迹
- 凝胶电泳分离后，将未染色的凝胶置于转移缓冲液（25 mM Tris 碱，190 mM 甘氨酸，20% 甲醇）中孵育 5 分钟。
- 将适当大小的印迹滤纸浸入免疫印迹转移缓冲液中孵育 5 分钟，然后将其组装为“三明治”结构的底层。
- 使用聚偏二氟乙烯（PVDF）膜或硝酸纤维素膜将蛋白质从未染色凝胶中转移。首先将 PVDF 膜浸入纯甲醇中 30 秒，随后在免疫印迹转移缓冲液中浸泡 5 分钟，接着将其整合到印迹“三明治”结构中。
- 将从转移缓冲液中取出的未染色凝胶放置于上述结构中，用于构建转移印迹“三明治”。
- 最后，用另一张印迹滤纸覆盖“三明治”顶部，使用印迹滚轮排除任何滞留的气泡，并采用半干转移法进行电转移。
注意：也可根据实验室条件选用干式转移或湿式转移等其他方法。 - 将膜浸入封闭缓冲液（含 8% 脱脂奶粉的 TBS-0.1% Tween 20 [TBS-T]）中封闭 2 小时，随后在 4 °C 下与针对 Leptospira 脂蛋白 LipL41（1:5000）或鞭毛丝状体 35 kDa 核心蛋白（FlaB）（1:4000）的单特异性抗血清*（定制抗体）孵育过夜。用 TBS-T 洗涤膜三次，每次洗涤持续 5 分钟。
注意：可使用任何感兴趣的抗体。抗体的稀释比例可能有所不同。 - 在室温下，将膜与辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔 IgG 二抗（1:20000 稀释）孵育 2 小时。
- 将膜与化学发光（ECL）试剂接触，以显影蛋白条带。
- 在暗室中将膜置于对蓝光敏感的 X 射线胶片下进行曝光。
注意：也可使用其他显影方法。
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结果
在本实验中，我们采用了螺旋体 钩端螺旋体 作为一种模式生物来分离亚细胞组分。我们采用了一种基于浊点和临界菌丝浓度（CMC）的策略性方法，利用非离子型去垢剂Triton X-114的高效性，图1）。在进一步操作之前，对单个生物学重复样本的各组分进行了蛋白质定量，以评估其浓度。我们观察到在水相（A）、去垢剂相（D）和沉淀相（P）组分中，蛋白质浓度比例为3:1:1.3，该比例在每批生物学重复实验中均保持一致。从各Triton X-114分相中提取的蛋白质样品经SDS-PAGE分析后进行免疫印迹检测，以评估其质量（图2）。我们采用了钩端螺旋体的 LipL41 和 FlaB 蛋白 钩端螺旋体 在免疫印迹分析中，以研究它们在不同亚细胞区室中的表达情况26LipL41，一种暴露于表面的外膜蛋白29在所有致病性物种中均保守 钩端螺旋体 并在去垢剂胶束中径向溶解，特别是Triton X11...
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讨论
亚细胞分级分离技术在分离特定细胞组分以进行后续分析方面发挥着关键作用。Triton X-114 是一种非离子型去污剂，常用于此类技术中，因其能够将样品分为不同的相，从而实现多种细胞组分的分离32。Triton X-114 特别适用于从多种来源中提取膜蛋白（以天然形式），包括尿液细胞外囊泡、高尔基体膜、细菌膜以及如 Borrelia burgdorferi 和 Leptospira interrogans 等病原体的外膜蛋白25,32,33,34,35,36,37。已有研究采用含有 EDTA、溶菌...
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披露
作者声明不存在利益冲突的财务关系。
致谢
作者衷心感谢印度医学研究委员会（印度新德里）通过资助编号 Leptos/22/2013-ECD-I-2012-2400 提供的财政支持，以及科学技术部科学与工程研究委员会（印度新德里）通过资助编号 SR/SO/HS/0108/2012 向 M.G.M. 提供的资金支持。此外，作者还感谢印度医学研究委员会（印度新德里）通过资助编号 ICMR-SRF 2020-0756/PROTEOMICS-BMS、Fellowship/131/2022-ECD-II-2021-8230 分别向 H.P. 和 AS 提供的高级研究奖学金，以及科学技术部科学与工程研究委员会（印度新德里）通过资助编号 PDF/2017/000343 向 S.A.D.C. 提供的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乙酸 | Sigma | 695092 | |
| 丙酮 | Sigma | 32201 | |
| 丙烯酰胺 | Sigma | A-3553 | |
| 过硫酸铵 | Sigma | A-3678 | |
| 天平 | SHIMADUZ | Z741079 | |
| 双丙烯酰胺 | Sigma | M7279 | |
| 牛血清白蛋白第五组分（BSA） | Sigma | A-8022 | |
| 溴酚蓝 | Sigma | B-8026 | |
| 离心管（50 mL） | Tarsons | 500020 | |
| 带盖锥形瓶（150 mL） | Tarsons | 431030 | |
| 冷冻离心机 | Eppendorf | 5355316200 | |
| 考马斯亮蓝 | Sigma | 1.12553 | |
| 暗场显微镜 | ZEISS | GmbH37081 | |
| 精密擦拭纸巾 | Kimtech Science | 34155 | |
| 干浴器 | Eppendorf | 535531620 | |
| Ellinghausen–McCullough–Johnson–Harris（EMJH）培养基，Difco | Difco | 279410 | |
| 凝胶托盘：凝胶托盘尺寸至少应宽2 cm，表面光滑平整，并配有盖子。 | Hoefer | 不适用 | |
| 玻璃烧杯（150 mL） | Tarsons | 421030 | |
| 甘氨酸 G8790 | Sigma | G-8898 | |
| Immobilon 转印滤纸 | Millipore | IBFP0813C | |
| 免疫印迹半干转装置 | ATTA | AE-6675 | |
| 培养箱 — 用于在37°C条件下孵育凝胶托盘18小时。 | EYELA | SLI-700 | |
| 层流洁净台 | 不适用 | 不适用 | |
| 鲁米诺 | Sigma | 09253 | |
| 氯化镁 M8266 | Sigma | M8266 | |
| 磁力搅拌器 | TARSONS | 6040 | |
| 甲醇 | Sigma | 17995-7 | |
| 移液器吸头（10 µL–10 mL） | Axygen | T-10, T-200-C,T-1000-C, T-10ML-C | |
| 移液器 | Eppendorf | EP2231300010 | |
| 微量离心管（1.5 mL 安全锁） | Eppendorf | EP022363212 | |
| 小型离心机 | Genaxy | GEN-MINI-6K | |
| 多功能酶标仪 | BMG LABTECH | S/N 413-3877 | |
| 脱脂奶粉（牛源） | Sigma-Aldrich | M7409 | |
| 对香豆酸 | Sigma | C9008 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Sigma | P4417 | |
| 冰箱 | LG | GC-B217BLJ2 | |
| 摇床 — 用于染色凝胶的低速摇床或旋转摇床。 | TARSONS | 4080 | |
| SDS-PAGE 装置 — 电泳仪 | Hoefer, Inc. | SE300-10A-1.0 | Hoefer 型号 ‘miniVE’，可制备尺寸为10 cm × 8 cm、厚度为1 mm的凝胶。 |
| 氯化钠 | Sigma | 5886 | |
| 十二烷基硫酸钠（SDS） | Sigma | L-4396 | |
| TEMED | Sigma | T-9281 | |
| Triton X-114 | Sigma | 648468 | |
| Trizma 基础缓冲液（TRIS）T6066 | Sigma | T6066 | |
| 涡旋振荡器 | TARSONS | 3020 |
参考文献
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