尽管原核生物缺乏细胞器系统，但其细胞内存在特定的亚细胞区域，这些区域含有定位的蛋白质。对亚细胞区域中酶和蛋白质进行定性与定量分析，对于开发药物和疫苗靶点具有重要意义。本文以Triton X-114为例，介绍钩端螺旋体蛋白的亚细胞分级分离及其分析方法。
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本文内容
摘要
摘要
原核生物缺乏精确的亚细胞器，但具有不同的区域，如细胞质、内膜、周质和外膜，大多数生物化学和生理功能在这些区域中有序进行。因此，要理解蛋白质的功能特性，必须阐明其亚细胞定位。然而，由于革兰氏阴性菌具有复杂的磷脂双分子层，从中提取亚细胞蛋白质面临挑战。尽管Triton X-114在提取外膜蛋白（OMP）方面已显示出潜力，但仍缺乏简明的实验方案。本方案以螺旋体属的Leptospira为模型，展示了一种逐步提取亚细胞蛋白质的工作流程。该技术结合了亚细胞分级分离和相分离，可获得分别富含细胞质蛋白、外膜蛋白和内膜蛋白的不同组分。去垢剂Triton X-114因其适宜的浊点温度（约22 °C）和较低的临界胶束浓度（CMC），非常适合用于相分离，能够在最小变性的条件下高效提取和纯化天然蛋白质。值得注意的是，分析结果表明该方法能够有效区分来自内膜和外膜的蛋白质与细胞质蛋白。
引言
亚细胞蛋白质组学（SCP）分析通过研究细菌细胞特定亚细胞区室内的蛋白质组，在阐明细菌致病机制方面发挥着关键作用。这种亚细胞蛋白质组学方法可对不同区室中的细菌蛋白质进行表征，通过排除高丰度蛋白质以降低复杂性，从而揭示其组织结构及相对丰度1,2。例如，通过采用亚细胞分级分离结合液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术，对Shewanella oneidensis开展的一项研究揭示了其蛋白质组的大量信息，提供了关于细胞区室结构和蛋白质丰度的关键细节。该研究为后续探索革兰氏阴性菌的亚细胞结构提供了基础框架3。在细菌致病性研究领域，明确细菌在in vivo感染过程中的蛋白质组对于理解致病机制至关重要4。通过对不同感染阶段上皮细胞内沙门氏菌（Salmonella）的蛋白质组进行研究，已成功揭示了细菌病原体在其胞内微环境中所采用的适应性策略4,5。SCP策略通过评估蛋白质在不同细胞区室中的丰度与转位情况，全面揭示细胞动态变化。该方法有助于广泛鉴定来自多种细菌区室的蛋白质，从而增强对细菌蛋白质组的深入分析6,....
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方案
注意：本实验方案使用问号钩端螺旋体（Leptospira interrogans）进行亚细胞蛋白质提取实验。尽管本方案可经调整后用于其他革兰氏阴性细菌，但可能需要根据具体的研究目标进行优化。材料表和表1分别列出了化学品与设备，以及缓冲液和试剂溶液的组成成分，而表2则概述了实验室设施。
1. Leptospira 菌株及培养条件
- 获取 L. interrogans 血清群Icterohaemorrhagiae血清型Copenhageni菌株Fiocruz L1-130
注：该菌株由位于印度布莱尔港的印度医学研究委员会—区域医学研究中心（WHO 合作中心）提供，该中心专注于钩端螺旋体病的诊断、参考、研究与培训。 - 培养 钩端螺旋体 （含有约 1 × 106 细胞/mL）置于50 mL添加了1%牛血清白蛋白（BSA）的Ellinghausen McCullough Johnson Harris（EMJH）培养基中。
- 在30 °C下培养，直至菌液达到对数生长中期（3.5 × 108 细胞/mL）。在营养琼脂平板上检测培养基的等分试样，以确保培养基未受污染。
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结果
在本实验中，我们采用了螺旋体 钩端螺旋体 作为一种模式生物来分离亚细胞组分。我们采用了一种基于浊点和临界菌丝浓度（CMC）的策略性方法，利用非离子型去垢剂Triton X-114的高效性，图1）。在进一步操作之前，对单个生物学重复样本的各组分进行了蛋白质定量，以评估其浓度。我们观察到在水相（A）、去垢剂相（D）和沉淀相（P）组分中，蛋白质浓度比例为3:1:1.3，该比例在每批生物学重复实验中均保持一致。从各Triton X-114分相中提取的蛋白质样品经SDS-PAGE分析后进行免疫印迹检测，以评估其质量（图2）。我们采用了钩端螺旋体的 LipL41 和 FlaB 蛋白 钩端螺旋体 在免疫印迹分析中，以研究它们在不同亚细胞区室中的表达情况26LipL41，一种暴露于表面的外膜蛋白29在所有致病性物种中均保守 钩端螺旋体 并在去垢剂胶束中径向溶解，特别是Triton X11.......
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讨论
亚细胞分级分离技术在分离特定细胞组分以进行后续分析方面发挥着关键作用。Triton X-114 是一种非离子型去污剂，常用于此类技术中，因其能够将样品分为不同的相，从而实现多种细胞组分的分离32。Triton X-114 特别适用于从多种来源中提取膜蛋白（以天然形式），包括尿液细胞外囊泡、高尔基体膜、细菌膜以及如 Borrelia burgdorferi 和 Leptospira interrogans 等病原体的外膜蛋白25,32,33,34,35,36,37。已有研究采用含有 EDTA、溶菌.......
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披露
作者声明不存在利益冲突的财务关系。
致谢
作者衷心感谢印度医学研究委员会（印度新德里）通过资助编号 Leptos/22/2013-ECD-I-2012-2400 提供的财政支持，以及科学技术部科学与工程研究委员会（印度新德里）通过资助编号 SR/SO/HS/0108/2012 向 M.G.M. 提供的资金支持。此外，作者还感谢印度医学研究委员会（印度新德里）通过资助编号 ICMR-SRF 2020-0756/PROTEOMICS-BMS、Fellowship/131/2022-ECD-II-2021-8230 分别向 H.P. 和 AS 提供的高级研究奖学金，以及科学技术部科学与工程研究委员会（印度新德里）通过资助编号 PDF/2017/000343 向 S.A.D.C. 提供的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乙酸 | Sigma | 695092 | |
| 丙酮 | Sigma | 32201 | |
| 丙烯酰胺 | Sigma | A-3553 | |
| 过硫酸铵 | Sigma | A-3678 | |
| 天平 | SHIMADUZ | Z741079 | |
| 双丙烯酰胺 | Sigma | M7279 | |
| 牛血清白蛋白第五组分（BSA） | Sigma | A-8022 | |
| 溴酚蓝 | Sigma | B-8026 | |
| 离心管（50 mL） | Tarsons | 500020 | |
| 带盖锥形瓶（150 mL） | Tarsons | 431030 | |
| 冷冻离心机 | Eppendorf | 5355316200 | |
| 考马斯亮蓝 | Sigma | 1.12553 | |
| 暗场显微镜 | ZEISS | GmbH37081 | |
| 精密擦拭纸巾 | Kimtech Science | 34155 | |
| 干浴器 | Eppendorf | 535531620 | |
| Ellinghausen–McCullough–Johnson–Harris（EMJH）培养基，Difco | Difco | 279410 | |
| 凝胶托盘：凝胶托盘尺寸至少应宽2 cm，表面光滑平整，并配有盖子。 | Hoefer | 不适用 | |
| 玻璃烧杯（150 mL） | Tarsons | 421030 | |
| 甘氨酸 G8790 | Sigma | G-8898 | |
| Immobilon 转印滤纸 | Millipore | IBFP0813C | |
| 免疫印迹半干转装置 | ATTA | AE-6675 | |
| 培养箱 — 用于在37°C条件下孵育凝胶托盘18小时。 | EYELA | SLI-700 | |
| 层流洁净台 | 不适用 | 不适用 | |
| 鲁米诺 | Sigma | 09253 | |
| 氯化镁 M8266 | Sigma | M8266 | |
| 磁力搅拌器 | TARSONS | 6040 | |
| 甲醇 | Sigma | 17995-7 | |
| 移液器吸头（10 µL–10 mL） | Axygen | T-10, T-200-C,T-1000-C, T-10ML-C | |
| 移液器 | Eppendorf | EP2231300010 | |
| 微量离心管（1.5 mL 安全锁） | Eppendorf | EP022363212 | |
| 小型离心机 | Genaxy | GEN-MINI-6K | |
| 多功能酶标仪 | BMG LABTECH | S/N 413-3877 | |
| 脱脂奶粉（牛源） | Sigma-Aldrich | M7409 | |
| 对香豆酸 | Sigma | C9008 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Sigma | P4417 | |
| 冰箱 | LG | GC-B217BLJ2 | |
| 摇床 — 用于染色凝胶的低速摇床或旋转摇床。 | TARSONS | 4080 | |
| SDS-PAGE 装置 — 电泳仪 | Hoefer, Inc. | SE300-10A-1.0 | Hoefer 型号 ‘miniVE’，可制备尺寸为10 cm × 8 cm、厚度为1 mm的凝胶。 |
| 氯化钠 | Sigma | 5886 | |
| 十二烷基硫酸钠（SDS） | Sigma | L-4396 | |
| TEMED | Sigma | T-9281 | |
| Triton X-114 | Sigma | 648468 | |
| Trizma 基础缓冲液（TRIS）T6066 | Sigma | T6066 | |
| 涡旋振荡器 | TARSONS | 3020 |
参考文献
- Curreem, S. O. T., Watt, R. M., Lau, S. K. P., Woo, P. C. Y. Two-dimensional gel electrophoresis in bacterial proteomics. Protein Cell. 3 (5), 346-363 (2012).
- King, B. R., Latham, L., Guda, C. Estimation of subcellular proteomes in bacterial species. Open Appl Informatics J.
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重印与许可
