本文介绍了一种详细的实验方案，利用共聚焦显微镜检测表达GCaMP钙指示剂的转基因斑马鱼脑区中神经活动的方法。
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本文内容
摘要
摘要
斑马鱼幼虫是研究行为神经机制的一种有前景的脊椎动物模型系统。其透明的身体和相对简单的神经回路有利于在行为的细胞分析中使用光遗传学技术。行为研究中的荧光指示剂 体内 神经活动，例如使用GCaMP6s，已被广泛用于研究与幼年斑马鱼简单行为相关的神经活动。本文介绍了一种利用转基因品系Tg(elav3:GCaMP6s)在半固定斑马鱼幼体中检测感觉诱导活动的实验方案。具体而言，我们使用化学物质烯丙基异硫氰酸酯诱导在后脑与脊髓交界区域产生强烈且可重复的荧光反应。我们讨论了GCaMP6s在多种行为范式中用于光学监测神经活动的潜在应用及其技术局限性。本方案提供了一种易于实施的方法，用于监测与行为相关的动态神经活动 体内 幼年斑马鱼大脑中的神经活动。
引言
斑马鱼是一种适用于深入进行细胞与分子神经生物学研究的脊椎动物模型。受精后5天（dpf）的斑马鱼幼体约有10万个神经元，显著少于哺乳动物大脑中的神经元数量。此外，斑马鱼具有相对透明的特性，这一性质有利于对神经结构和功能进行光学研究1,2,3,4,5。目前已开发出多种适用于斑马鱼的光遗传学工具，包括高保真钙离子指示剂6、电压传感器7,8，以及依赖神经活动的神经活动标记物9,10,11,12,13。这些工具进一步增强了该模型已有的其他优势，例如易于进行遗传修饰14,
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方案
所有使用动物的实验程序均经加州州立大学富勒顿分校机构动物照护与使用委员会批准（方案编号 # 2023-1310）。
1. 使用低熔点琼脂糖对幼年斑马鱼进行固定
- 根据机构动物护理指南，将泛神经元表达 Tg(elav3:GCaMP6s)6 的成年转基因动物以两雌配两雄的方式进行繁殖。将成年鱼置于特制的繁殖盒中，使产下的卵落入带有假底的下层腔室，成鱼无法接触该腔室。在光照开始时或移除隔离板后，雌鱼释放卵子，雄鱼对滞留在假底中的卵子进行受精。
- 移除成鱼，使用滤卵筛收集受精卵，并将其置于胚胎培养液（E3 液）中（5 mM NaCl、0.33 mM MgSO₄、0.33 mM CaCl₂、0.17 mM KCl、1 mM HEPES、0.00001% 亚甲蓝，pH 7.0）30，在培养箱内以 28.5 °C、14 小时光照/10 小时黑暗的条件下培养。
注意：所用 E3 液中亚甲蓝浓度较低，不会影响荧光信号或产生显著的自发荧光。由于 GCaMP6s 转基因品系本身具有天然的通透性，在本方案指定的发育阶段无需使用 1-苯基-2-硫脲（PTU）。 - 将受精后 2 至 7 天（dpf）的幼鱼用溶解于 E3 液中的 3% 低熔点琼脂糖进行固定。加热琼脂糖至适宜温度，确保操作过程中不会....
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结果
给予烯丙基异硫氰酸酯可引起幼年斑马鱼中与钙相关的神经信号
给予AITC（步骤2.6）会导致幼年斑马鱼大脑中GCaMP6s相关的神经活动广泛增强11,30。我们观察到在施加AITC后，大脑的一个小区域荧光信号增强，如图4所示。
平衡钙相关神经信号的分辨率、采集速度与采集范围
提高采集速度会降低分辨率，这在实验设计中必须予以权衡。我们在图5中展示了使用约2.5天龄斑马鱼胚胎时不同采集速度及其对应的分辨率。在记录神经活动时，采集速度必须足够快，以捕捉到神经活动信号。尽管动作电位引起的电压变化相对较快（1–2毫秒），但钙离子与GCaMP的相互作用会延长动作电位信号的持续时间。本研究使用的GCaMP6s分子具有特别缓慢的动力学特性。在细胞培养中，使用GCaMP分子可检测并关联.......
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讨论
我们已经证明，可以利用GCaMP6s结合共聚焦显微镜记录斑马鱼幼鱼大脑中的神经活动；由于GCaMP的反应动力学较慢，所需的成像速度较低，可通过缩小观察的脑区范围来补偿6。目前已有时间动力学更快的报告分子（例如GCaMP6f），但更高的时间分辨率通常以降低荧光信号强度为代价6。共聚焦显微镜的成像速度相对有限22，因此在选择报告分子时，应充分考虑共聚焦显微镜在时间分辨率上的局限性。
该方案受限于两个关键因素：1）记录过程中需要将动物置于琼脂糖中；2）共聚焦显微镜的成像速度相对较慢。在特定应用中，平衡视野范围与成像速度对于以足够分辨率捕获神经活动至关重要。如果AITC诱导的神经活动被截断或减弱，这可能表明幼年斑马鱼无法感知刺激，或AITC的效价不足。在后一种情况下，更新储备液并将其在-20 °C冷冻保存，可延长其有效性。如果鱼类无法感知刺激，可能是由于其在琼脂糖中埋置过深。在方案第1步中对斑马鱼进行准确定位是一个关键步骤，这对于药物施加过程中实现.......
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披露
作者声明，本研究是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。
致谢
本研究得到了美国国立卫生研究院向ACR提供的资助（SC2GM1304854）以及美国国家科学基金会向DLG提供的资助（2050850）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 低熔点琼脂糖 | Invitrogen | 16520-100 | 稀释至 3% |
| 异硫氰酸烯丙酯（AITC） | Sigma Aldrich | 377430 | 化学刺激物 |
| E3 | N/A | N/A | 斑马鱼幼鱼培养用水介质 |
| 玻璃底培养皿 | Thermo Fisher Scientific | 12-567-400 | 用于成像实验中固定斑马鱼 |
| 微量移液器（10–100 µL） | Cole-Parmer | 21600-14 | 用于配制 AITC 梯度稀释液的装置 |
| 显微镜载玻片 | Fisherbrand | 12-550-A3 | 用于表型筛选 |
| 镜面抛光镊子 | DUMONT | 11251-23 | 用于在琼脂糖中调整斑马鱼的方向 |
| myTEMP Mini 数字恒温培养箱 | Benchmark | H2200-HC | 斑马鱼饲养环境；设定为 28.5°C |
| 丁腈手套 | MedPRIDE | MPR-50504 | 基本个人防护装备 |
| 培养皿 | VWR | 89107-632 | 斑马鱼容器 |
| Posi-Click 离心管 | DENVILLE | C-2171 | 用于 AITC 稀释 |
| Samco 聚氨酯转移移液管 | Thermo Fisher Scientific | 225 | 用于挑选实验动物或施加稀释后的 AITC 溶液 |
| Stemi SV11 Apo 体视显微镜 | Zeiss | 1.25496E+11 | 用于斑马鱼发育阶段鉴定 |
| 转基因斑马鱼幼鱼（2 至 7 天后受精） | N/A | N/A | 动物实验对象；Tg(elav3:GCaMP6s) 品系 |
| 蔡司共聚焦显微镜（型号 LSM9） | Zeiss | 3523004097 | 用于鱼类成像 |
参考文献
- Ahrens, M. B., Orger, M. B., Robson, D. N., Li, J. M., Keller, P. J. Whole-brain functional imaging at cellular resolution using light-sheet microscopy. Nat Method. 10 (5), 413-420 (2013).
- Meyer, M. P., Smith, S. J.
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重印与许可
