本文介绍了一种详细的实验方案，利用共聚焦显微镜检测表达GCaMP钙指示剂的转基因斑马鱼脑区中神经活动的方法。
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摘要
摘要
斑马鱼幼虫是研究行为神经机制的一种有前景的脊椎动物模型系统。其透明的身体和相对简单的神经回路有利于在行为的细胞分析中使用光遗传学技术。行为研究中的荧光指示剂 体内 神经活动，例如使用GCaMP6s，已被广泛用于研究与幼年斑马鱼简单行为相关的神经活动。本文介绍了一种利用转基因品系Tg(elav3:GCaMP6s)在半固定斑马鱼幼体中检测感觉诱导活动的实验方案。具体而言，我们使用化学物质烯丙基异硫氰酸酯诱导在后脑与脊髓交界区域产生强烈且可重复的荧光反应。我们讨论了GCaMP6s在多种行为范式中用于光学监测神经活动的潜在应用及其技术局限性。本方案提供了一种易于实施的方法，用于监测与行为相关的动态神经活动 体内 幼年斑马鱼大脑中的神经活动。
引言
斑马鱼是一种适用于深入进行细胞与分子神经生物学研究的脊椎动物模型。受精后5天（dpf）的斑马鱼幼体约有10万个神经元，显著少于哺乳动物大脑中的神经元数量。此外，斑马鱼具有相对透明的特性，这一性质有利于对神经结构和功能进行光学研究1,2,3,4,5。目前已开发出多种适用于斑马鱼的光遗传学工具，包括高保真钙离子指示剂6、电压传感器7,8，以及依赖神经活动的神经活动标记物9,10,11,12,13。这些工具进一步增强了该模型已有的其他优势，例如易于进行遗传修饰14,15,16,17，以及斑马鱼幼体能够快速吸收浸泡溶液中所含化学物质的特性18,19,20,21。
斑马鱼光学生理学研究可采用多种方法，尤其是双光子显微镜、光片显微镜和共聚焦显微镜。这些技术均需在两种相关的分辨率问题之间取得平衡：一是光学通透性，包括周围组织对光的散射；二是采样速度，特别是在亚毫秒尺度上捕捉动作电位动力学时尤为关键。22。在 体内 使用双光子显微镜进行钙成像，但该方法通常受限于视场范围 <1 mm2，通常只能获取单一深度平面的图像，从而限制了对大范围神经环路活动的记录22对于光片显微镜而言，其能够记录大脑中几乎所有神经元活动的潜力，解决了双光子显微镜视野受限的问题，但目前相机速度在物理上限制了成像通量，仅能在幼年斑马鱼中以每脑体积40个成像平面的分辨率，每秒获取约三个脑体积的数据。1,23共聚焦显微镜在深度分辨率和成像速度方面均逊于双光子显微镜和光片显微镜。然而，共聚焦显微镜的优势在于其在全球范围内的实验室中广泛可及，并且能够利用神经活动报告分子（如 cFos 和 p-ERK）实现全脑神经活动的重建9此外，若以较小的脑区为靶区，共聚焦显微镜可提供足够的神经活动时间分辨率。
本文介绍了一种利用共聚焦显微镜记录在中枢神经系统中广泛表达GCaMP6s的转基因斑马鱼神经元活动的方法。已有多种类似的利用斑马鱼幼体的实验方案被开发出来，用于研究神经通路的功能24,25,26,27,28,29。本研究整合了其中若干方案的关键特征，例如延时成像、钙动态的荧光指示剂以及活体成像技术，以检测斑马鱼中枢神经系统中一小群神经元在接触异硫氰酸烯丙酯（AITC）——一种令人厌恶的化学刺激物——时的神经活动11,26,27,29,30,31。AITC可引发全脑范围的神经反应，主要集中于后脑区域11。位于后脑稍尾侧的一簇神经元参与运动调控，并对AITC产生持续性反应，该反应在有害刺激移除后仍持续存在30。通过限制成像视野，我们成功检测到该神经元簇的活动，表现为表达GCaMP6s的神经元荧光信号的变化。本文提供了实现足够时空分辨率的共聚焦显微成像技术、操作指南及最佳实践，并讨论了本光学记录方法的局限性。尽管存在这些限制，该方法仍可用于研究多种神经生物学现象，包括记忆和感觉运动处理。
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方案
所有使用动物的实验程序均经加州州立大学富勒顿分校机构动物照护与使用委员会批准（方案编号 # 2023-1310）。
1. 使用低熔点琼脂糖对幼年斑马鱼进行固定
- 根据机构动物护理指南，将泛神经元表达 Tg(elav3:GCaMP6s)6 的成年转基因动物以两雌配两雄的方式进行繁殖。将成年鱼置于特制的繁殖盒中，使产下的卵落入带有假底的下层腔室，成鱼无法接触该腔室。在光照开始时或移除隔离板后，雌鱼释放卵子，雄鱼对滞留在假底中的卵子进行受精。
- 移除成鱼，使用滤卵筛收集受精卵，并将其置于胚胎培养液（E3 液）中（5 mM NaCl、0.33 mM MgSO₄、0.33 mM CaCl₂、0.17 mM KCl、1 mM HEPES、0.00001% 亚甲蓝，pH 7.0）30，在培养箱内以 28.5 °C、14 小时光照/10 小时黑暗的条件下培养。
注意：所用 E3 液中亚甲蓝浓度较低，不会影响荧光信号或产生显著的自发荧光。由于 GCaMP6s 转基因品系本身具有天然的通透性，在本方案指定的发育阶段无需使用 1-苯基-2-硫脲（PTU）。 - 将受精后 2 至 7 天（dpf）的幼鱼用溶解于 E3 液中的 3% 低熔点琼脂糖进行固定。加热琼脂糖至适宜温度，确保操作过程中不会损伤斑马鱼。在低熔点琼脂糖冷却凝固前（<1 分钟内），将幼鱼背侧朝上置于玻璃底培养皿中，使待观察的脑区尽可能靠近物镜，如图 1所示。根据实验需求，通常每个实验组使用 8 至 10 条斑马鱼即可满足要求。
注意：本方案中未对动物使用麻醉剂。 - 待琼脂糖完全凝固并固定幼鱼（约 2 至 3 分钟）后，加入 5 mL E3 溶液。随后根据实验方案要求，用手术刀切割琼脂糖。
注意：应根据实验需要释放斑马鱼的特定部位或施加不同刺激，选择性地切除相应区域的琼脂糖。 - 将含有斑马鱼的培养皿转移至共聚焦显微镜载物台上，让鱼适应环境 20 分钟。
2. 在施加刺激条件下进行共聚焦显微镜的设置与成像
- 驯化期结束后，在室温下使用明场照明（光源波长约 475 nm），将斑马鱼置于 40 倍（数值孔径 1.0）水浸物镜的视野中心。
- 共聚焦显微镜的采集参数设置取决于荧光分子的特性及其表达水平、组织的深度和光学性质、视野大小以及记录速度。使用范围指示器确定合适的设置，以根据实验需求优化发射光的捕获效果。
- 正确调节激光功率和主增益，以在最佳范围内捕获荧光信号，从而避免不必要的 GCaMP6s 依赖性荧光信号损失。参考以下列出的关键共聚焦设置及影响因素，确定适当的参数。
- 针孔尺寸：根据所用物镜确定，并设置为仅接收单一焦平面的光信号，同时限制其他焦平面的光进入。本方案中使用 32 µm 的针孔。
- 激光功率与波长：根据荧光分子的表达水平以及组织的深度和光学特性调整激光功率。使用范围指示器确保激光信号不超过光电探测器的检测范围。激发波长应设置为能够最有效激发荧光分子的波长。本实验中，由于斑马鱼为 GCaMP6s 转基因杂合子且表达水平较低，使用 488 nm 波长、5% 激光功率和 650 主增益。当转基因表达较强时，通常 1.5% 至 3% 的激光功率已足够。
注意：若激光功率设置过低，将导致信息丢失（光电倍增管检测到的光信号减少）；若激光功率过高，则发射光可能超出探测器范围或对样品造成损伤（光漂白）。 - 主增益：主增益决定光电探测器的灵敏度。使用范围指示器确保主增益不过高，以免超出光电探测器的检测范围。本实验中主增益设为 650。
- 视野：确保视野足够大，以涵盖目标组织。这通常是共聚焦显微镜的主要限制之一，因为视野大小会影响采集速度，如图 2所示。在涉及 AITC 的实验中，将视野设为 79.86 µm2。
- 采集速度：随着采集速度的提高，光电探测器捕获的光量会减少，导致图像质量下降。应确保采集速度在图像质量和记录生理事件所需时间分辨率之间取得平衡。本实验中采集速度设为 1.20 帧/秒（f/s）。
- 将视野中心对准脊髓前部、位于 Haller 联合下方尾侧的一个神经元簇。该神经元簇在约 2.5 天后受精（dpf）时较小，但在发育后期（7 dpf）明显增大。30
注意：若第 1 步中琼脂糖固定效果不佳（例如动物体位倾斜或埋入过深），将严重影响图像质量。在图 3中展示了固定良好的斑马鱼脊髓图像，以及固定不佳个体的对比图像。 - 使用 79.86 µm2 的视野，以每秒 1.20 帧（fps）的速度、空间分辨率为每像素 0.119 µm2 进行时间序列扫描。可根据具体应用需求调整视野大小和图像采集速度。
- 成像开始 2 分钟后，用移液器向培养皿中加入 41.67 µL 的 AITC 储备液（终浓度 10 µM）或 E3 溶液。继续记录约 30 秒，通过延时成像观察感兴趣区域内 GCaMP6s 活性的动态变化。记录完成后，将动物从琼脂糖中取出，并按照机构动物护理指南实施安乐死。
注意：在记录 GCaMP6s 活性期间，共聚焦激光本身可能成为刺激因素，分析成像结果时必须考虑此影响。记录时长由帧数和每帧采集速率决定，可根据所需时间灵活调整。
使用 FIJI 分析 GCaMP 信号
- 记录完成后，如果输出文件格式不是下游 FIJI 分析所需的 .tif 格式，请从显微镜软件套件中将图像文件导出为 .tif 格式。
- 下载 FIJI 以分析神经信号轨迹。打开 FIJI，将 .czi 文件导入程序中，当系统提示时，使用 BioFormats 插件的默认设置。
- 使用“圆形”或“自由手绘”工具，通过点击 其对应图标 来圈定感兴趣的区域/神经元。（将鼠标悬停在图标上时，程序会显示工具名称。）
注意：由于感兴趣区域的大小各不相同，无法使用固定面积或固定圆。允许以体素形式随时间注册荧光变化的软件（例如 Thunder 软件包32）可能实现单个神经元的检测；但对于本实验中约 20 个神经元而言，由盲法观察者识别细胞膜边界的方法可能优于自动化检测系统。 - 选定感兴趣区域（ROI）后，在 FIJI 工具栏中点击 分析 > 工具 > ROI 管理器。随后点击 添加 [t]，所选 ROI 将被添加至 ROI 管理器窗口。
- 在 ROI 管理器中，点击 更多 > 多重测量。保持设置为默认值，点击 确定。FIJI 将生成原始数据，可通过 Python 作为 CSV 文件处理，或直接在电子表格中作为原始数据使用。
- 为对原始数据进行归一化并将其表示为特定感兴趣区域的神经信号轨迹，取刺激前 2 分钟时间窗内最后约 30 秒的平均值，并将所有刺激后数值相对于该平均基线值进行归一化：
归一化荧光强度 = （刺激后某一特定感兴趣区域的瞬时荧光强度）/（刺激前 2 分钟时间窗中约 30 秒的平均荧光强度） - 将数据绘制成神经信号轨迹图，如 图 4 所示。
注意：在某些类型的显微镜技术中（例如光片显微镜），由于记录的是脑组织的三维体积，运动伪影可通过后期处理的空间配准至参考脑体积来校正1,11。然而，由于我们仅记录单个成像平面，无法对运动伪影进行任何校正。因此，本文展示的结果中未剔除任何帧。但如果运动伪影显著影响结果，可采用自动化系统识别并校正含有运动伪影的帧1,11，或由盲法观察者手动剔除这些帧。
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结果
给予烯丙基异硫氰酸酯可引起幼年斑马鱼中与钙相关的神经信号
给予AITC（步骤2.6）会导致幼年斑马鱼大脑中GCaMP6s相关的神经活动广泛增强11,30。我们观察到在施加AITC后，大脑的一个小区域荧光信号增强，如图4所示。
平衡钙相关神经信号的分辨率、采集速度与采集范围
提高采集速度会降低分辨率，这在实验设计中必须予以权衡。我们在图5中展示了使用约2.5天龄斑马鱼胚胎时不同采集速度及其对应的分辨率。在记录神经活动时，采集速度必须足够快，以捕捉到神经活动信号。尽管动作电位引起的电压变化相对较快（1–2毫秒），但钙离子与GCaMP的相互作用会延长动作电位信号的持续时间。本研究使用的GCaMP6s分子具有特别缓慢的动力学特性。在细胞培养中，使用GCaMP分子可检测并关联...
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讨论
我们已经证明，可以利用GCaMP6s结合共聚焦显微镜记录斑马鱼幼鱼大脑中的神经活动；由于GCaMP的反应动力学较慢，所需的成像速度较低，可通过缩小观察的脑区范围来补偿6。目前已有时间动力学更快的报告分子（例如GCaMP6f），但更高的时间分辨率通常以降低荧光信号强度为代价6。共聚焦显微镜的成像速度相对有限22，因此在选择报告分子时，应充分考虑共聚焦显微镜在时间分辨率上的局限性。
该方案受限于两个关键因素：1）记录过程中需要将动物置于琼脂糖中；2）共聚焦显微镜的成像速度相对较慢。在特定应用中，平衡视野范围与成像速度对于以足够分辨率捕获神经活动至关重要。如果AITC诱导的神经活动被截断或减弱，这可能表明幼年斑马鱼无法感知刺激，或AITC的效价不足。在后一种情况下，更新储备液并将其在-20 °C冷冻保存，可延长其有效性。如果鱼类无法感知刺激，可能是由于其在琼脂糖中埋置过深。在方案第1步中对斑马鱼进行准确定位是一个关键步骤，这对于药物施加过程中实现...
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披露
作者声明，本研究是在不存在任何可能被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。
致谢
本研究得到了美国国立卫生研究院向ACR提供的资助（SC2GM1304854）以及美国国家科学基金会向DLG提供的资助（2050850）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 低熔点琼脂糖 | Invitrogen | 16520-100 | 稀释至 3% |
| 异硫氰酸烯丙酯（AITC） | Sigma Aldrich | 377430 | 化学刺激物 |
| E3 | N/A | N/A | 斑马鱼幼鱼培养用水介质 |
| 玻璃底培养皿 | Thermo Fisher Scientific | 12-567-400 | 用于成像实验中固定斑马鱼 |
| 微量移液器（10–100 µL） | Cole-Parmer | 21600-14 | 用于配制 AITC 梯度稀释液的装置 |
| 显微镜载玻片 | Fisherbrand | 12-550-A3 | 用于表型筛选 |
| 镜面抛光镊子 | DUMONT | 11251-23 | 用于在琼脂糖中调整斑马鱼的方向 |
| myTEMP Mini 数字恒温培养箱 | Benchmark | H2200-HC | 斑马鱼饲养环境；设定为 28.5°C |
| 丁腈手套 | MedPRIDE | MPR-50504 | 基本个人防护装备 |
| 培养皿 | VWR | 89107-632 | 斑马鱼容器 |
| Posi-Click 离心管 | DENVILLE | C-2171 | 用于 AITC 稀释 |
| Samco 聚氨酯转移移液管 | Thermo Fisher Scientific | 225 | 用于挑选实验动物或施加稀释后的 AITC 溶液 |
| Stemi SV11 Apo 体视显微镜 | Zeiss | 1.25496E+11 | 用于斑马鱼发育阶段鉴定 |
| 转基因斑马鱼幼鱼（2 至 7 天后受精） | N/A | N/A | 动物实验对象；Tg(elav3:GCaMP6s) 品系 |
| 蔡司共聚焦显微镜（型号 LSM9） | Zeiss | 3523004097 | 用于鱼类成像 |
参考文献
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