由杨树茎干溃疡病原菌诱导的杨树不定根：研究根系生物学及光响应相关过程的实验系统

摘要

本文介绍了一种通过韧皮部或表皮环割结合真菌病原体接种途径诱导产生不定根（ARs）的实验方案，该方法适用于杨树根系生物学及光响应相关生理过程的研究。

摘要

Valsa sordida 和 Botryosphaeria dothidea 是两种重要的坏死营养型真菌病原体，可危害多种植物寄主，尤其是 Populus 属物种。这两种真菌病原体主要侵染杨树的枝条、茎干和小枝，引起典型的症状，如溃疡病斑、树冠枯死和萎蔫。病原接种是研究植物病害机制最有效的途径。除了在接种位点周围茎干上出现的溃疡病斑外，在杨树物种中进行茎干溃疡病原接种后，还观察到一种新的发育现象：大量呈鲜红色的不定根（ARs）。本研究描述了利用真菌病原体在杨树中诱导不定根的方法。该方法的关键步骤是在环割（韧皮部或表皮）处理后进行病原接种。第二个关键步骤是使用保湿材料。与使用Parafilm进行保湿处理相比，在环割-接种后用家用聚乙烯（PE）塑料薄膜包裹接种部位，可在20天内产生颜色鲜艳、数量多且健壮的不定根。最后，在遮光处理（用铝箔包裹茎干）后，杨树茎干接种环处会萌发出白色的不定根。该方法建立了一种研究根系发育和形态发生的新型实验体系，对于理解根系发育、形态发生及其在病害胁迫下的响应机制具有重要意义。此外，当结合遮光处理时，本研究还可为研究光响应相关过程提供便捷的实验系统，例如类黄酮、花青素或其他相关代谢物的生物合成，以及参与这些过程的基因或转录因子。

引言

由坏死性真菌病原体Valsa sordida和Botryosphaeria dothidea引起的杨树干溃疡病是中国北方两种重要的林木病害，严重阻碍了杨树生态林和经济林的发展。杨树溃疡病通常发生在树干和枝条的树皮上，溃疡病斑是其典型症状。病害发生后，不断扩展的溃疡病斑会逐步破坏寄主的韧皮部、形成层和木质部，进而影响光合产物和水分通过维管系统的运输。然而，溃疡病原菌如何阻碍韧皮部和木质部运输尚不清楚。

为了揭示受溃疡病原菌感染的杨树中碳水化合物和水分的运输机制，我们提出了韧皮部或表皮环割接种方法^1,2，该方法结合了经典的园艺环割操作与病原菌接种技术（菌丝块创伤接种法）。这些方法能够模拟溃疡病原菌引起的侵染过程以及水分和碳水化合物运输的阻断效应。

我们的研究揭示，真菌病原体通过首先引发碳饥饿，而非水分运输衰竭，导致杨树树冠枯萎^1,3,4,5。令人意外的是，我们观察到在接种茎干溃疡病原体后，杨树茎部出现一种特殊的生根现象：大量红色的不定根（ARs）从上部茎段的低端生长出来（位于韧皮部或表皮环割部位上缘的对侧）。此外，我们的实验表明，不定根的形成在杨树与溃疡病原体互作过程中具有普遍性。这种不定根可在不同种类的杨树物种或克隆材料中产生，植株年龄范围包括1年生、2年生甚至6年生，并可由不同的溃疡病原体（V. sordida 和 B. dothidea）或其分离株诱导产生。另外，我们研究了杨树不定根的颜色形成机制，结果表明其与类黄酮和花青素的生物合成有关，同时也涉及光照条件下光响应基因（或基因模块）的表达调控⁶。因此，由病原体诱导产生的这些杨树不定根可作为研究植物-病原体互作、根系生物学以及光响应基因功能与表达的稳定且理想的实验体系。

本研究将介绍并提供通过环割接种途径建立杨树不定根实验体系的操作方案；此外，我们还将指出影响不定根形成的关键因素，并阐述环割接种在杨树根系生物学及其他光响应相关生理过程研究中的潜在应用。

方案

1. 通过环割接种诱导杨树不定根

1. 真菌溃疡病原菌的培养
   1. 将6 g马铃薯提取物、20 g葡萄糖和20 g琼脂溶解于1000 mL水中，制备马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基。在121.1 °C下灭菌30分钟，将培养基倒入直径为9 cm的培养皿中，每皿约含20 mL PDA培养基。
   2. 将活化的真菌菌丝块（约0.5 cm）接种至PDA培养皿中央。
   3. 将接种后的PDA平板置于28 °C黑暗条件下培养7–10天。
   4. 将培养后的带有真菌菌丝的PDA培养基切成条状（宽1.2 cm，长约3–6 cm）。
2. 杨树材料的准备
   1. 选取1–2年生、生长健壮的杨树幼苗。
   2. 从杨树幼苗上选取成熟茎/枝（直径1–2 cm，无病虫害）。
   3. 清洗杨树茎/枝的接种区域（距地面或枝条基部约30 cm处）；用75%酒精溶液对茎/枝进行表面消毒。
3. 通过韧皮部环割-接种诱导不定根（ARs）
   1. 小心环割已消毒的杨树茎/枝的表皮和韧皮部，去除环割下来的韧皮部环（宽1 cm，包含部分形成层），暴露出白色的内部形成层/木质部组织。
      注：步骤1.3.2–1.3.4详述了不同的接种方法。
   2. 用菌丝条（宽1.2 cm）完全覆盖环割区域，作为韧皮部环割接种处理（GP），使真菌菌丝面朝向暴露的木质部。
   3. 用灭菌刀片轻轻刮擦并损伤暴露的内部形成层组织，然后将PDA条（宽1.2 cm）接种于环割区域，作为环割形成层去除处理（GR）。
   4. 将未接种真菌的PDA培养基条（宽1.2 cm）直接接种于环割区域，作为环割对照（GC）。
   5. 用可拉伸、无色透明的嫁接膜（或PE塑料薄膜）包裹接种后的茎/枝，缠绕4层以保持湿度。
   6. 用（金属、塑料或木质）支撑杆（长度超过50 cm）固定接种后的茎/枝，防止风折。
   7. 实验期间对环割处理的杨树材料进行常规灌溉培养。
   8. 接种后14–30天，从外部观察并记录杨树不定根（ARs）的形成情况。
4. 通过表皮环割-接种诱导不定根（ARs）
   1. 按照步骤1.2所述选择并准备接种材料。
   2. 小心环割杨树茎/枝的表皮。
   3. 去除表皮环（宽1.0 cm），暴露出绿色的韧皮部组织。
   4. 沿垂直方向轻微刮擦韧皮部组织四次，暴露其内部结构。
   5. 在环割的表皮区域接种真菌菌丝（eGP）和PDA条（eGC），接种操作参照步骤1.3.2–1.3.4。
   6. 按照步骤1.3.5所述，用嫁接膜（或PE塑料薄膜）包裹接种后的茎。
   7. 按照步骤1.3.6–1.3.8所述管理杨树并观察不定根（ARs）的形成。

2. 通过环割接种法建立光相关基因研究的实验体系

1. 采用韧皮部环割接种法诱导杨树不定根（步骤1.3.2–1.3.4）。
2. 或者，采用第1.4.5步所述的表皮环割接种法诱导杨树不定根。
3. 用铝箔包裹杨树茎/枝接种病原体的区域（高度15 cm）进行遮光处理（S），或不包裹铝箔进行光照处理（L）。
4. 将茎/枝条绑好 >使用50厘米长的木棍固定以防止风折。按照步骤1.3.6-1.3.7所述，定期对杨树进行栽培管理，并在实验期间保持充分灌溉。
5. 接种后约20天，去除茎部的铝箔。
6. 立即观察并拍摄铝箔遮光处理的（S）和未遮光的（L）杨树不定根。
7. 在阳光或其他人工光源/条件下培养遮荫的杨树不定根。
8. 在光照处理后1-5天，去除嫁接带（或聚乙烯塑料薄膜），收获杨树不定根。
9. 用铝箔包裹所有不定根（AR）样品。对于经过遮光处理的杨树不定根，在暗处采收样品。
10. 将AR样品浸入液氮中，随后于-80 °C保存，以备进一步分析。
11. 用铝箔包裹后，在光照或黑暗条件下（在暗处进行）采集杨树不定根（ARs），并于 4 °C 保存，用于形态学及其他分析 原位 检测方法

结果

通过环割接种诱导茎干溃疡病病原菌产生不定根的工作流程如图1所示。本研究中的实验表明，两种茎干溃疡病病原菌V. sordida和B. dothidea，以及来自不同寄主、地区或具有不同致病性的分离株，均能在杨树物种中诱导不定根（ARs）的形成。在本实验方案中，我们使用V. sordida分离株CZC（CGMCC 40575）、CFCC86775，以及B. dothidea分离株SD50和SD81，在P. alba var. pyramidalis中诱导产生不定根。其中，V. sordida CZC为典型病原菌，已保藏于中国普通微生物菌种保藏中心（CGMCC 40575）；V. sordida分离株CFCC86775购自中国林业微生物菌种保藏中心；两个SD分离株则采自中国山东省患有溃疡病的杨树植株，并保藏于本实验室。如图2所示，在环割区域形成愈伤组织（图2A，第1栏）；而在仅进行环割并去除形成层的处理中，不定根形成较少（图2A，第2栏）；而在韧皮部环割接种处理后，则产生大量红色须状根（图2A，第3–6栏）。我们还观察到，该方法可在不同杨树物种或克隆系中诱导不定根，例如P. alba var. pyramidalis、Populus × beijingensis、P. alba × P. tremula var. glandulosa克隆84K、P. euramericana cv. 'Bofeng 3'或其他杂交杨树。然而，在本实验方案中，不定根仅在1年生P. alba var. pyramidalis的茎干上产生。最后，如图2第7栏所示，在6年生P. alba var. pyramidalis树干上通过V. sordida病原菌进行韧皮部环割接种后，也可诱导形成不定根结构。杨树树干直径约为6–7 cm，最长须状根长度超过7.0 cm。

如图2所示，在暴露于光照条件后，遮荫的杨树不定根（ARs）中产生了红色区段，从铝箔包裹的杨树上产生的乳白色或浅红色不定根（图2B，第1幅）转变为3天后的红色不定根（图2B，第4幅）。此外，我们还注意到，光照后短时间内即有红色色素生成，基因表达分析表明，色素（主要是矢车菊素-3-O-葡萄糖苷）的生物合成是直接由其花青素前体转化而来，并非从苯丙烷代谢途径起始的从头生物合成⁶。

在本实验方案中，两种环割方法（韧皮部环割和表皮环割）均可在病原菌接种后诱导杨树茎部不定根（ARs）的形成。表皮环割接种的杨树植株中，风折现象较少，且对生理过程（如水分和碳水化合物的运输）影响较小；然而，韧皮部环割在不定根的产生速度和效率上似乎略高。因此，在杨树不定根的研究中，推荐采用韧皮部环割接种法。

图1：通过茎部环割接种方法诱导杨树产生茎源根（ARs）的示意图流程，该过程由茎干溃疡病原体引发。 首先，将茎干溃疡病原体（在黑暗条件下28 °C培养7–10天）切成宽度为1.2 cm的菌丝条。对一年生杨树幼苗或一年生枝条进行茎部环割处理（位置位于地面以上约30 cm处或枝条基部，由蓝色箭头指示），采用两种方法：韧皮部环割（环割并移除包含表皮、韧皮部及部分形成层组织的环状组织）或表皮环割（环割并移除仅包含茎表皮的环状组织）。环割的韧皮部或韧皮部环宽度为1.0 cm。随后，立即用菌丝条完全覆盖环割区域，并用聚乙烯（PE）塑料胶带包裹，确保菌丝面朝向环割区域。针对根系生物学研究，如根形成（rhizogenesis）和根发育，接种后的杨树幼苗/枝条在常规管理条件下培养14–30天（路径I，以黄色箭头标示）。对于次生代谢物合成、光形态建成或光响应基因表达调控的研究，则额外采用铝箔包裹处理，接种后的幼苗/枝条继续培养约20天以诱导茎源根生成。当茎源根形成后，去除茎/枝条上的铝箔，使杨树茎源根暴露于阳光或其他光照条件（光谱、光强、光照周期或其组合可变）下（路径II，以红色箭头标示）。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2：茎干溃疡病原菌在光照条件下诱导杨树不定根（ARs）的形成及不定根上节段的生物合成。（A）不同茎干溃疡病原菌诱导杨树茎部不定根的形成。A1：环割对照；A2：环割并去除形成层（GR）；A3–6：不同茎干溃疡病原菌（V. sordida 和 B. dothidea）在1年生P. alba var. pyramidalis 幼苗茎部诱导不定根形成；A7：6年生P. alba var. pyramidalis 枝条上形成的不定根。（B）光照诱导杨树不定根上节段的生物合成。B1–B4 分别表示杨树不定根在光照处理后0、1、2和3天的形态变化。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

杨树物种易于从茎插条中产生不定根（ARs）或侧根（LRs），这有助于其繁殖，并作为木本植物根系生物学研究的模型^7,8。此外，研究表明，接种特定微生物，如有益细菌（Agrobacterium rhizogenes^9,10；植物根际促生菌 [PGPR]¹¹）、内生细菌^12,13、丛枝菌根真菌（AMF）^14,15 或外生菌根真菌（EMF）^16,17，可促进植物根系的生长或发育。然而，目前尚未见有关病原菌（无论是细菌还是真菌病原体）诱导或促进寄主植物形成不定根结构的报道。

本实验表明，不同的杨树溃疡病病原菌（例如 V. sordida, B. dothidea）可诱导杨树茎/枝中形成不定根（ARs）图2A，图3-6）。此外，实验表明，不同杨树物种/克隆均可诱导产生不定根，例如1-2年生的幼苗 P. alba var. pyramidalis, Populus × beijingensis, P. alba × P. tremula var. glandulosa 克隆 84K, P. euramericana 品种‘博丰3号’，甚至6年生 杨树 分支（图2A，第7组）。然而，在1年生的幼苗/枝条上未形成ARs结构 苹果属 sp.（复数：spp.） 李属 sp.， Cedrus deodara，以及 马尾松然后，本方案提供了一种新的杨树不定根（ARs）生产途径：通过树木真菌性溃疡病原菌环割接种来诱导不定根的形成。V. sordida 和 B. dothidea在杨树茎/枝条上。

实验还表明，韧皮部环割和表皮环割方法均可在病原菌接种后诱导杨树茎段上不定根（ARs）的形成；然而，经过韧皮部环割接种的杨树茎段由于环割及去皮（韧皮部）操作导致茎秆韧性显著下降，并受到病原菌侵染，环割部位极易因风力而折断。因此，在诱导不定根形成时，应对杨树茎段或枝条用木棍进行良好固定，以防止其折断，尤其是在采用韧皮部环割方法时更需如此。

植物自身主要决定了不定根（ARs）的形成，但这一过程也受到一些环境因素的影响。例如，在部分双子叶植物物种中，淹水或积水条件可诱导不定根的产生^18,19。保持湿度是地上茎/枝条上诱导不定根形成的关键步骤。在本实验方案中，曾使用Parafilm和家用聚乙烯（PE）薄膜进行保水处理。然而，Parafilm可被新形成的不定根穿透，导致水分流失、生长迟缓、褐变以及杨树不定根的木质化。相反，在包裹PE薄膜的杨树茎段上则获得了大量幼嫩且富含水分的不定根。因此，本方案推荐使用家用PE薄膜，而非Parafilm薄膜。

根是植物的重要器官，在植物的繁殖、生长、养分和水分吸收中发挥着关键作用。因此，应采用相关方法研究杨树物种的根发生²⁰、形态与发育以及根系构型（RSA）²¹。此外，研究表明，根系与根际细菌之间的相互作用可增强寄主植物的抗病能力²²；因此，对杨树不定根（ARs）进行环割溃疡病原菌接种，可能诱导其发生分子和表观遗传学变化，这在抗病苗木培育中具有潜在应用价值。

光是一种影响植物生长、发育和繁殖的关键环境因素。遮荫-光照实验（图2B）表明，病原体诱导的杨树不定根（ARs）是研究植物次生代谢产物（如黄酮类、花青素²³等）生物合成的理想实验体系。先前的研究也表明，光照条件（包括强度、光质、持续时间以及母本植株接受的光照量）会影响根的形成或生根过程，以及不定根和侧根的发育^24,25,26。因此，通过精细调控光照条件，本实验方案中的病原体诱导杨树不定根体系可用于杨树根系生物学及其他光响应相关过程的研究。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂	Solarbio	A8190	为真菌生长提供营养
铝箔	biosharp	BS-QT-027B	为感染区域提供遮光
环割刀	MoGong Hardware tool firms		环割杨树茎/枝的表皮
嫁接膜	CAPI	5cm	固定植物上的真菌
PD培养基（马铃薯提取物，葡萄糖）	Solarbio	P7360	为真菌生长提供营养
聚乙烯塑料薄膜	MiaoJie	413703	固定植物上的真菌
培养皿	Bkman biological Co.,Ltd	90mm	制备PDA培养基
恒温培养箱	上海坤天实验室仪器有限公司	KTD-6000	为真菌生长提供环境