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基于角膜上皮刮除联合角膜缝线建立大鼠重度角膜炎模型

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DOI：

10.3791/67305

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2024年11月22日

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1Department of Ophthalmology, the Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, 2School of Clinical Medicine, Guizhou Medical University, 3The Second People's Hospital of Guiyang City, 4Department of Biomedical Sciences, School of Infection, Inflammation and Immunology, College of Medicine and Health, University of Birmingham

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们通过角膜上皮刮除联合角膜缝线的方法建立了一种大鼠严重角膜炎症模型。该研究评估了角膜炎症模式、上皮细胞增殖以及炎症条件下角膜缘干细胞的变化。

摘要

角膜炎症，尤其是重度角膜炎症，在角膜缘干细胞功能障碍的发生发展中起着重要作用。构建适当的动物模型有助于我们聚焦重度炎症对角膜缘干细胞的影响。一种2 mm除锈剂 是 用于去除Sprague Dawley（SD）大鼠角膜中央上皮以造成损伤，随后使用尼龙缝线缝合角膜中央基质以诱导持续性炎症。由此构建了一种伴有角膜中央上皮擦伤和角膜中央基质缝合的角膜炎症模型，可诱发严重的角膜炎症。观察造模后1、3和7天角膜炎症的变化以及角膜缘干细胞的状态。在第3天rd 造模后第1天，大鼠角膜缘出现严重水肿，伴有明显新生血管形成及局部增生，均为角膜缘干细胞缺乏的典型表现。至第7天th 第几天时，角膜水肿逐渐加重，新生血管化持续增加。通过定量反转录聚合酶链反应（RT-qPCR）和免疫荧光染色检测发现，角膜上皮炎症因子显著上调，角膜上皮分化异常，角膜上皮干细胞数量明显减少，细胞增殖能力及干性亦下降。因此，该模型表明，严重炎症可在不直接损伤角膜缘干细胞的情况下诱导其损害。该模型有利于观察严重炎症对干细胞生物学机制的影响，为研究炎症诱导的角膜上皮干细胞功能障碍机制提供了理想的平台。

引言

角膜缘干细胞功能障碍（LSCD）的特征包括持续性上皮缺损、角膜新生血管化、慢性炎症、瘢痕形成以及结膜组织向角膜表面移行1,2。该病症可由严重的眼表疾病导致角膜缘干细胞耗竭或功能异常所引发，例如化学烧伤、热烧伤、斯蒂文斯-约翰逊综合征以及因眼科手术引起的医源性损伤2,3,4。LSCD 的致病机制主要涉及干细胞本身的改变及其微环境的紊乱5,6，从而影响角膜上皮的稳态维持2,7。在 LSCD 中，角膜缘干细胞的命运改变主要有两种类型：1）角膜上皮干细胞的定向分化潜能发生异常，导致其分化为皮肤型上皮细胞。这一现象表现为角膜上皮细胞特异性转录因子 Pax6 以及角膜特异性角蛋白 Krt12 和 Krt3 的表达下降，同时皮肤相关鳞状上皮化生标志物 Krt10、Krt1 和 Sprr1b 的表达显著升高8；2）眼表损伤直接破坏角膜缘干细胞，引起细胞坏死或凋亡，继而导致结膜组织增生并覆盖角膜表面9。已有报道指出，在 LSCD 发展过程中，角膜上皮干细胞微环境中巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞等炎症细胞显著增多，相应地，干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）以及巨噬细胞炎症蛋白（MIP）-1α/β 等细胞因子水平也显著升高10。

已建立多种LSCD模型，包括缝线诱导、化学损伤以及苯扎氯铵点染所建立的模型11。这些模型各有优缺点。化学损伤可损害整个眼表，并直接破坏角膜缘干细胞12。苯扎氯铵的作用机制与化学损伤类似，但其效应相对较慢13。角膜缝线模型可诱导稳定且长期的炎症反应，但炎症反应相对较轻，不足以导致LSCD。

为了研究炎症在角膜缘干细胞缺乏症（LSCD）发生发展中的作用及其机制，建立了一种结合中央角膜上皮刮除与角膜缝线的动物模型。该模型可在不直接损伤角膜缘干细胞的情况下，诱导角膜上皮持续性炎症。

方案

所有操作均遵循ARVO关于在眼科和视觉研究中使用动物的指南，并经贵州医科大学动物伦理委员会批准（批准号：2305192）。大鼠饲养于贵州医科大学动物中心，严格遵守相关动物管理规定。

1. 动物选择

  1. 使用7-8周龄的雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠。通过裂隙灯检查确保无眼表病变。
  2. 使用快速灭菌器对器械进行灭菌。所需器械包括角膜锈环去除器、2 mm皮肤取样标记器、持针器、板层刀、眼科手术剪和镊子。
  3. 用1.25%三溴乙醇按每100 g体重0.3 mL的剂量进行腹腔注射麻醉大鼠。通过夹趾反应评估麻醉深度。滴入一滴托吡卡胺滴眼液以散大瞳孔。在眼部使用盐酸布比卡因滴眼液。对侧眼使用眼用润滑软膏以保持湿润。
  4. 用碘伏对眼周皮肤和毛发进行消毒。
  5. 建立炎症模型。
    1. 将大鼠置于侧卧位。在手术显微镜下暴露眼球。
    2. 中央角膜 使用2 mm尺寸的皮肤取样标记器进行标记， 标记的中央角膜上皮 使用角膜锈环去除器刮除。
    3. 在距角膜缘约3 mm处，使用10-0尼龙线、持针器、眼科手术剪和镊子，放置三个相隔120°的角膜缝线，注意勿穿透角膜14,15.
  6. 在操作结束时涂抹氧氟沙星眼膏以预防感染。
  7. 观察并拍摄角膜在第1天的情况st, 3rd，和 7th 术后第1天使用10倍放大裂隙灯观察并记录角膜上皮愈合、结膜充血、角膜水肿、角膜缘充血及角膜新生血管等体征。

2. 炎症指数的计算

  1. 建立动物模型后，计算眼表炎症指数。
    1. 睫状体充血评分标准如下：无充血（0 分）；充血范围小于 1 mm（1 分）；充血范围在 1 mm 至 2 mm 之间（2 分）；充血范围大于 2 mm（3 分）。
    2. 中央角膜水肿评分标准如下：无水肿（0 分）；水肿但虹膜纹理可见（1 分）；水肿导致虹膜纹理模糊（2 分）；水肿导致虹膜不可见（3 分）。
    3. 旁中央角膜水肿评分标准如下：无水肿（0 分）；水肿但虹膜纹理可见（1 分）；水肿导致虹膜纹理模糊（2 分）；水肿导致虹膜不可见（3 分）。
    4. 将各项评分相加后除以 9，计算炎症指数。

3. 角膜新生血管化的评估

  1. 使用裂隙灯观察角膜新生血管。
    1. 使用裂隙灯图像处理软件分析和处理图像16。
    2. 在每次观察时间点记录角膜新生血管的生长情况，测量朝向角膜中央、弯曲度最小的最长新生血管长度。
    3. 按以下标准进行分级：0级：无血管；1级：轻微软（<1 mm）；2级：轻度（1 mm 至 1.5 mm）；3级：中度（>1.5 mm 至 2 mm）；4级：重度（>2 mm）。

4. 分析模型的生物学特性

  1. 准备冷冻眼组织标本。
    1. 使用 4-5% 异氟烷麻醉大鼠，并通过颈椎脱位法处死。
    2. 将大鼠置于侧卧位，用显微镊子将眼球向外提起，用眼科剪沿上下巩膜穹窿部剪开结膜。
    3. 剪断视神经，注意保持角膜上皮的完整性。
    4. 用滤纸吸干眼球表面的血迹和水分，将其放入含有最佳切割温度（OCT）包埋介质的包埋盒中。
    5. 用 200 µL 移液器去除包埋盒中的气泡，使用液氮速冻后，将包埋好的标本保存于超低温冰箱中。
  2. 制备眼球冷冻切片。
    1. 在制备冷冻切片前，将冷冻切片机预冷至约 -28 °C，将样本夹持器预冷至 -26 °C。
    2. 从低温冰箱中取出冷冻标本，放入冷冻切片机中约 1 小时。
    3. 将冷冻标本在冷冻切片机中预冷 10 分钟。用铅笔标记标本，用 OCT 将其固定在样本垫上，冷却后一同固定于切片架上。
    4. 调整冷冻标本的位置和方向并固定。先切去 20 µm 厚的组织，直至出现中央角膜，然后连续切取 6 µm 厚的切片，将切片收集到预先准备好的防脱载玻片上。
    5. 在载玻片上标记组织的名称、材料、切片时间、操作者姓名及编号。室温（RT）放置约 30 分钟。
    6. 切片干燥后，将其放入盒中，保存于超低温冰箱中备用。
  3. 进行苏木精-伊红染色。
    1. 从超低温冰箱中取出预先准备好的冷冻切片，置于通风橱中室温下干燥。
    2. 在室温下用 4% 多聚甲醛固定切片 15 分钟，然后用 1x PBS 缓冲液冲洗 5 分钟。
    3. 将带有切片的载玻片置于载玻片架上，浸入盛有苏木精染液的染缸中，在室温下染色 5 分钟。
    4. 用自来水缓慢冲洗载玻片上的切片以去除浮色，随后将其浸入 0.1% 盐酸酒精溶液中，1-2 秒后迅速取出。
    5. 用自来水缓慢冲洗切片 15 分钟。
    6. 将切片从水中取出，浸入伊红染液缸中，在室温下染色 3 分钟。
    7. 用自来水缓慢冲洗切片，洗去多余染液，然后依次使用 75% 酒精、80% 酒精、95% 酒精、100% 酒精（一）和 100% 酒精（二）进行梯度酒精脱水，每种浓度浸泡 2 分钟。
    8. 分别在二甲苯（1）和二甲苯（2）中各透明 2 分钟。
    9. 在通风橱中干燥切片，用封片剂封片，注意避免产生气泡。
    10. 将载玻片放入载玻片盒中，室温保存。使用显微镜观察并成像。
  4. 进行免疫荧光染色。
    1. 取出冷冻切片，置于通风橱中室温下干燥。
    2. 在冷冻标本的载玻片空白处标记待染抗体的名称。
    3. 在室温下用 4% 多聚甲醛固定标本 15 分钟。在盒中加入少量自来水，防止标本干燥。
    4. 去除多聚甲醛固定液，用 1x PBS 缓冲液洗涤标本三次，每次 5 分钟。注意不要冲掉标本。
    5. 吸干组织切片周围的液体，覆盖细胞膜通透液（0.2% TritonX-100），室温孵育 20 分钟。
    6. 去除细胞膜通透液，用 1x PBS 缓冲液洗涤切片三次，每次 5 分钟。
    7. 吸干组织切片，覆盖免疫荧光封闭液（2% BSA），室温孵育 1 小时。
    8. 在孵育期间，根据制造商说明书配制一抗及其稀释液（1% BSA）。
    9. 去除封闭液，用移液泵吸干标本，加入已配制的一抗，盖上盒子，避光于 4 °C 冰箱中孵育过夜（约 12-16 小时）。
    10. 弃去一抗，用 PBS 缓冲液洗涤标本四次，每次 10 分钟。
    11. 在洗涤过程中，根据制造商说明书配制二抗稀释液。
    12. 去除 PBS，吸干标本，加入已配制的二抗，盖上盖子，室温避光孵育 1 小时。
    13. 去除二抗，用 1x PBS 缓冲液洗涤标本四次，每次 10 分钟，然后用 1x PBS 缓冲液覆盖整个载玻片。
    14. 去除 PBS，吸干标本，用含 DAPI 的封片剂封片，确保无气泡。用锡箔纸包裹载玻片，4 °C 避光保存。
    15. 使用激光共聚焦显微镜系统或直立荧光显微镜相机系统拍照（扫描速度：4 µs/像素，扫描分辨率：1024 x 1024）。
  5. 大鼠角膜上皮单细胞悬液制备
    1. 处死后，用浸有 75% 酒精的镊子取出眼球，放入预先配制的含 10% 胎牛血清（FBS）和 10% 青霉素-链霉素的 1x Hanks 平衡盐溶液（HBSS）中。
    2. 清洗眼球，用含 10% FBS 和 10% 青霉素-链霉素的 1x HBSS 溶液洗涤两次，每次 5 分钟。
    3. 沿巩膜缘剪除结膜，保留约 1 mm 的巩膜缘。再次用含 10% FBS 和 10% 青霉素-链霉素的 1x HBSS 溶液洗涤角膜组织两次。
    4. 将清洁的角膜组织转移至含有 2U/mL Dispase II 的补充激素表皮培养基（SHEM）中。密封后置于 4°C 孵育 14-16 小时。
    5. 准备好一对镊子、无齿镊、虹膜复位器和外科灭菌器。
    6. 在手术显微镜下，沿角膜边缘轻轻分离角膜上皮。
    7. 用含 10% 青霉素-链霉素的 1x HBSS 溶液洗涤角膜上皮 5 分钟。
    8. 将角膜上皮组织转移至含有 200 µL 胰蛋白酶的 1.5 mL 离心管中，在 5% CO2、37 °C 培养箱中孵育。每 5 分钟轻轻摇晃离心管三次，以将角膜上皮片消化为单细胞悬液。
    9. 加入等体积的 SHEM 培养基以终止胰蛋白酶消化作用，室温放置。
  6. 角膜上皮细胞克隆培养
    1. 制备滋养层细胞。
      1. 当 NIH 3T3 小鼠细胞生长密度达到 80-90% 时，弃去细胞培养基。加入预先配制的 10 mg/mL NIH 3T3 丝裂霉素培养基，在 37 °C 孵育 2.5 小时。
      2. 去除培养基，用 1x HBSS 洗涤细胞，更换为新的 NIH 3T3 细胞培养基，继续在 CO2 培养箱（5% CO2，37 °C）中孵育。
    2. 根据所需比例制备角膜上皮细胞悬液并计数细胞。
    3. 在制备角膜上皮细胞悬液的同时，处理经丝裂霉素处理的 NIH 3T3 细胞。
      1. 弃去上清液，用 1x HBSS 洗涤细胞，加入 1 mL 胰蛋白酶-EDTA 溶液，在室温下孵育 2-3 分钟。
      2. 加入等体积的补充激素表皮培养基（SHEM 培养基：DMEM/F12，10 ng/mL 小鼠表皮生长因子 [EGF]，10 µg/mL 胰岛素-转铁蛋白-硒 [ITS]，5% FBS，1% 青霉素-链霉素，0.5% 二甲基亚砜 [DMSO]，0.5 mg/mL 氢化可的松），轻轻吹打制成细胞悬液，并进行细胞计数。
    4. 使用 12 孔板，每孔加入 0.5 mL SHEM 培养基。
    5. 按 500 个角膜上皮细胞/cm2 和 5 x 105 个 NIH 3T3 细胞/cm2 的密度混合角膜上皮细胞与 NIH 3T3 细胞，每孔加入 1 mL SHEM 培养基。
    6. 每孔加入 1 mL 细胞混合液，轻轻吹打使细胞均匀分布。
    7. 在培养箱（5% CO2，37 °C）中孵育，每 2-3 天更换一次培养基，培养 12-14 天。
  7. 结晶紫染色
    1. 约 12 天后，当角膜上皮克隆即将融合时，弃去培养基，每孔加入 1 mL 4% 多聚甲醛溶液，完全覆盖细胞，在室温下固定 15 分钟。
    2. 去除 4% 多聚甲醛，用 1x PBS 缓冲液洗涤三次，每次 5 分钟。
    3. 去除 1x PBS 缓冲液，每孔加入 0.4% 结晶紫染液，在室温下染色 30 分钟。
    4. 去除或回收结晶紫染液，用 1x PBS 缓冲液洗涤三次，每次 10 分钟。
    5. 室温下自然干燥各孔，直至完全干燥。
    6. 使用常规直立显微镜摄影系统（扫描速度：4 µs/像素，扫描分辨率：1024 x 1024）拍照。
  8. 角膜 mRNA 提取
    1. 准备眼科剪、角膜剪、有齿镊、电动角膜上皮刮匙、Trizol、无 RNase 的 1.5 mL 离心管和冰盒。
    2. 上皮获取
      1. 使用 4-5% 异氟烷麻醉大鼠，颈椎脱位后处死。将动物置于侧卧位。用眼科剪修剪大鼠胡须，避免遮挡视野。
      2. 将大鼠置于手术显微镜下，调整至适当高度以聚焦眼球。用有齿镊轻轻推挤并暴露眼球。提起大鼠结膜，使用洁净的电动角膜上皮刮匙刮取角膜上皮中央 2 mm 区域。
      3. 用喷洒过酒精的洁净有齿镊收集刮取的角膜上皮，将其放入含有 1 mL Trizol 的离心管中。
      4. 尽快操作，将收集的组织在含有双蒸水的 50 mL 离心管中冲洗。用滤纸吸去多余水分，喷洒 75% 酒精后进行下一步操作。
      5. 再次用有齿镊提起大鼠结膜。使用凹面朝上的角膜剪沿角膜缘剪开结膜，保留约 0.5 mm 白色结膜。
      6. 使用电动刮匙刮取角膜缘 2 mm 范围内的角膜上皮。按前述方法收集组织。分别收集三个眼球的中央角膜上皮和三个眼球的角膜缘上皮。
      7. 将收集的组织分别放入含有 1 mL Trizol RNA 提取试剂的离心管中。整个操作过程在冰上进行，以保持 RNA 完整性。立即进行后续步骤，或储存于 -80 °C 超低温冰箱中以备后续使用。
    3. 在冰上解冻标本，使用超声组织匀浆器裂解细胞。设置超声匀浆器功率为 25%，每次超声 2 秒，间隔 5 秒，总时间 2 分钟。冰上静置 10 分钟。
    4. 向每个样品中加入氯仿（总体积的 1/5，约 200 µL），颠倒混匀 30 秒，在 4 °C 条件下以 400 x g 离心 10 分钟。
    5. RNA 沉淀
      1. 离心后，离心管内液体分为三层：上层透明液体为 RNA，中间白色浑浊层为 DNA 和蛋白质，下层为 Trizol。小心吸取约 500 µL 上层透明液体至新的 1.5 mL 离心管中，注意不要吸入中间的白色沉淀。若不慎吸入，需重新离心后再次收集上清液。
      2. 向含有上清液的离心管中加入等体积预冷的异丙醇（约 500 µL），反复颠倒混匀数次，立即放入 -80 °C 超低温冰箱中 20-30 分钟，以加速 RNA 沉淀。
    6. 取出样品，立即在 4 °C 条件下以 400 x g 离心 10 分钟。离心管底部可见少量白色絮状沉淀，弃去上清液。
    7. 向每管中加入预先配制并冰浴冷却的 70% 乙醇。立即在 4 °C 冷冻离心机中以 400 x g 离心约 10 分钟；重复上述步骤一次，彻底洗涤沉淀。此步骤前，需用紫外灯对通风橱预灭菌 15 分钟。
    8. 取出离心管并弃去上清液后，再次在 4 °C 条件下以约 250 x g 离心 2 分钟。使用 200 µL 移液器吸头小心从沉淀对侧吸除多余乙醇，尽可能干燥。置于经紫外灭菌的通风橱中，室温晾干沉淀约 15 分钟。
    9. 将 1 mL RNase 抑制剂加入 40 mL 焦碳酸二乙酯（DEPC）水中配制溶液。加入适量 DEPC 水/RNase 抑制剂混合液（约 20-30 µL）溶解样品。若沉淀较多，可加入 30-50 µL。立即进行逆转录 PCR。
  9. 逆转录 PCR
    1. 确保以下物品齐全：PCR 仪、无 RNase 的 1.5 mL 离心管、0.2 mL PCR 管、冰浴或冰盒、移液器及无 RNase 的吸头。
    2. 使用微量分光光度计测定 RNA 浓度。每个样本确保加入 1 µg RNA 至反应体系中。
    3. 逆转录体系总体积为 20 µL。根据样本数量计算所需试剂总量，按说明书指定比例混合。
    4. 在冰上配制反应体系，涡旋混匀后短暂离心。在 42 °C 孵育 15 分钟，90 °C 孵育 30 秒。
    5. 将逆转录获得的 cDNA 直接用于实时定量 PCR 分析，或储存于 -80 °C 冰箱中。
  10. 实时定量 PCR 反应
    1. 使用实时定量 PCR 试剂盒17，反应体系为 10 µL。引物序列见表 1。
    2. 将上述反应体系加入专用于 RT-PCR 的 96 孔板或八联管中。确保样本充分混匀。在放入 PCR 仪前检查管内是否有气泡。
    3. 使用 PCR 循环程序（95 °C 预变性 5 分钟），进行 40 个循环（95 °C 变性 10 秒，60 °C 退火延伸 30 秒），完成数据采集并计算 2-ΔΔ Ct 值。使用适当的数据分析软件进行数据处理、分析和绘图。

结果

如图所示 图1A通过裂隙灯观察发现，角膜上皮的愈合受到阻碍。正常情况下，中央角膜上皮在去除后24–48小时内可完全愈合，但在角膜中央上皮切除联合缝线模型中，新生血管持续存在。造模后第3天，可见明显的角膜缘水肿及新生血管形成，局部出现典型的角膜缘干细胞缺乏体征。随着时间推移，至第7天th 天，愈合仍未完成。采用睫状充血、旁中央角膜水肿和中央角膜水肿来评估角膜炎症指数。角膜水肿逐渐加重，角膜炎症（图1A）继续恶化。此外，角膜新生血管是炎症的一个指标。随着炎症的进展，角膜新生血管（图1B）和炎症指数（图1C) 呈现出持续上升的趋势。

我们在模型建立后第7天对眼组织进行冷冻包埋。苏木精-伊红染色（图2A）显示角膜缘和中央角膜上皮增厚，上皮排列失去正常形态，提示非典型性增生。角膜基质呈现水肿，并有大量炎性细胞浸润。通过PMN和ED1免疫荧光染色（图2B）观察到中性粒细胞和巨噬细胞的浸润显著增加。研究采用IL-1β（图2C）和MIP-1α（图2D）检测炎症因子，发现IL-1β在第3天达到峰值，随后逐渐下降，而MIP-1α则随时间持续升高。

慢性炎症通常导致一系列角膜缘干细胞功能缺陷，例如 Pax6 表达下调、Krt12 表达减少以及角膜上皮的鳞状上皮化生。为了验证本研究建立的模型是否可诱导角膜上皮表型发生上述变化，对角膜上皮进行了 Krt12（图 3A）和 Pax6（图 3B）的免疫荧光染色。随着炎症持续时间延长，Krt12 表达逐渐减少，在第 7 天仅观察到单个 Krt12 阳性细胞，且角膜上皮中 Pax6 表达显著降低。在 mRNA 水平上，正常角膜上皮标志物 Krt12（图 3C）和 Pax6（图 3D）的表达水平在第 7 天均显著下降。然而，鳞状上皮化生标志物 Krt10（图 3E）和 Sprr1b（图 3F）的表达水平在第 7 天则显著升高。

我们使用增殖标志物Ki67对角膜上皮进行染色，结果显示，到第7天时，Ki67阳性角膜上皮细胞数量显著减少（图4A）。通过角膜缘干细胞特异性标志物ABCG2（图4B）和上皮祖细胞标志物P63（图4C）评估角膜上皮干细胞的状态，发现ABCG2和P63的表达水平显著低于正常组。此外，我们采用干细胞研究的金标准——克隆培养法，评估该过程中角膜缘干细胞的变化。观察发现，角膜缘干细胞的克隆形成率（图4D）在第3天已开始下降，到第7天显著降低，克隆平均面积变小，且第7天仅可见少数全克隆。通过计数培养皿显微镜视野中可见的细胞克隆，计算克隆形成效率（CFE）。CFE结果（图4E）表明，在炎症条件下，角膜缘干细胞的数量呈逐渐减少趋势。这提示，该模型中的严重炎症导致角膜缘上皮干细胞耗竭，且此过程并未诱导角膜缘干细胞发生表型转化，而是表现为分化或自我更新能力的障碍。

本研究采用的炎症模型导致了角膜出现具有角膜缘干细胞缺乏症（LSCD）特征的改变，包括大量炎性细胞浸润角膜、角膜上皮发育异常，以及角膜上皮正常表型中 Pax6 和 Krt12 的表达减弱或紊乱。此外，Krt10 mRNA 的表达显著升高。综上所述，该实验模型非常适合用于研究由炎症诱导的角膜上皮干细胞异常分化。

角膜愈合过程，图像和图表显示数天内的进展，定量分析结果。
图 1：炎症模型的建立。为研究严重炎症对角膜上皮干细胞的影响，建立了严重的炎症模型。（A）模型诱导后，采用裂隙灯摄影观察角膜。造模后第3天，大鼠角膜缘出现明显水肿，伴有显著的新生血管形成和局部增生，这些是角膜缘干细胞缺乏的典型表现。至第7天，角膜水肿逐渐加重，新生血管持续生长。随着炎症进展，（B）角膜新生血管形成和（C）炎症指数均持续升高。*p < 0.05，****P < 0.0001。 请点击此处查看此图的放大版本。

角膜组织的H&E染色与免疫荧光显微镜观察，IL-1β、MIP-1α的表达分析图。
图2：建模后的炎症反应。评估了模型在角膜中诱导的炎症反应。（A）眼球的苏木精-伊红染色显示，在炎症过程中，角膜缘和中央角膜上皮均增厚，角膜上皮排列失去正常形态，表现出非典型性增生的迹象。（B）巨噬细胞标志物ED1（绿色）和中性粒细胞标志物PMN（红色）显著增加。RT-qPCR结果显示角膜上皮炎症因子（C）IL-1β和（D）MIP-1α显著升高。蓝色代表DAPI核染色，比例尺 = 50 µm；***p < 0.001。 请点击此处查看此图的放大版本。

免疫荧光、qPCR分析、Krt12、Pax6、角膜组织、表达变化
图3：炎症条件下细胞表型的变化。 棘层上皮中（A，红色）KRT12 和（B）PAX6 的免疫染色结果。（C）KRT12 mRNA 表达水平随着炎症进展而显著降低。（D）在炎症条件下，PAX6 mRNA 表达在棘层上皮中呈现异常分布，并明显减少。相反地，（E）Krt10 和异常分化的角膜上皮标志物（F）Sprr1b 的 mRNA 表达在炎症期间显著升高。蓝色为DAPI核染色，比例尺 = 50 µm；**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001。 请点击此处查看此图的放大版本。

Ki67/DAPI 染色图像、mRNA 表达柱状图、克隆形成结果、CFE 分析。
图 4：炎症状态下角膜缘干细胞的变化。 免疫荧光图像（A，红色）Ki67 显示了炎症诱导后增殖细胞的变化情况。干细胞标志物（B）ABCG2 的 mRNA 表达显著降低。前体细胞标志物（C）p63 也有表达。在炎症条件下，（D）结晶紫染色图像和（E）CFE 结果显示角膜缘干细胞数量减少。蓝色表示 DAPI 染色的细胞核；比例尺为 50 µm；*p < 0.05，**p < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001。 请点击此处查看该图的放大版本。

引物名称引物序列
TNF-a正向引物5'-TCAGTTCCATGGCCCAGAC-3'
反向引物5'-GTTGTCTTTGAGATCCATGCCATT-3'
IL-1β正向引物5'-CCTCGTCCTAAGTCACTCGC-3'
反向引物5'-GGCTGGTTCCACTAGGCTTT-3'
Pax6正向引物5'-GTGTTCAGTGCAGAGCCTTC-3'
反向引物5'-TTCACCGTTGCTGTTCACTG-3'
Krt12正向引物5'-AGCTAACGCGGAACTGGAAA-3'
反向引物5'-CTCTCCGCTCTTGGTGAGGT-3'
Krt10正向引物5'-TCCGGGATCTGGAAGAGTCAA-3'
反向引物5'-TTGGGTAAGCTTTGCTAAGTGGAA-3'
Sprr1b正向引物5'-CCATCCCAAGGCACCTGAG-3'
反向引物5'-TGCTGGTATGGTGATGGAGT-3'
Actin正向引物5'-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3'
反向引物5'-CCCATACCCACCATCACACC-3'

表1：用于定量RT-PCR的引物序列。

讨论

炎症在角膜缘干细胞缺乏症的发生发展中起关键作用18，但其具体机制和影响仍需进一步探索。为解决这一问题，我们通过刮除中央角膜上皮并缝合中央角膜基质以诱发严重的角膜炎症，从而建立LSCD模型。我们在造模后第1、3、7天观察了角膜炎症的演变过程以及角膜缘干细胞的状态。造模后第3天，可见大鼠角膜缘明显水肿、显著新生血管形成及局部组织增生增加，这些均为角膜缘干细胞缺乏的典型特征。至第7天，角膜水肿进一步加重，新生血管数量持续增加。通过RT-qPCR和免疫荧光染色技术发现，造模后第7天，巨噬细胞标志物ED1、中性粒细胞标志物PMN以及中央角膜上皮炎症因子MIP-1α和IL-1β的表达水平显著升高。在炎症进展过程中，角膜上皮细胞特异性转录因子Pax6和角膜特异性角蛋白Krt12的免疫荧光成像信号及相关mRNA表达水平均显著降低。而皮肤相关鳞状上皮化生标志物Krt10和角膜上皮标志物Sprr1b的mRNA表达在炎症进展过程中升高，提示出现异常分化。干细胞标志物ABCG2的mRNA表达显著下降，前体细胞标志物p63仍有表达。结晶紫染色图像及CFE结果显示，在炎症条件下，角膜缘干细胞数量减少。综合分析表明，造模后7天，角膜上皮内炎症因子显著增加，角膜上皮分化异常，角膜上皮干细胞数量显著减少，细胞增殖能力及干细胞特性均下降。

该模型可在不直接损伤角膜缘上皮干细胞的情况下诱导角膜炎症，从而促进对角膜炎症对角膜缘上皮干细胞影响及其作用机制的研究。在包括角膜上皮在内的上皮组织中，干细胞重编程表现为上皮转分化。这一过程与炎症密切相关，其特征是在微环境中的多种细胞因子、生长因子及其他可溶性因子作用下发生的异常分化19,20,21,22。在炎症状态下，尤其是在干眼综合征及其他眼表疾病等长期持续性炎症状态中23,24,26，角膜上皮可被重编程为皮肤样上皮，这种现象称为鳞状上皮化生。该转变过程表现为角膜上皮特异性标志物Krt12的表达减弱或缺失，并被皮肤特异性标志物Krt10和Sprr1b所取代27,28。本实验方案所描述的模型表现出类似现象：初期角膜缘干细胞被激活，随后在持续炎症作用下发生角膜上皮鳞状上皮化生。我们在角膜上皮中观察到典型的鳞状上皮细胞，其特征为Krt12和Pax6表达降低，而Krt10和Sprr1b（鳞状上皮化生标志物）表达升高。早期炎症增强了角膜上皮的增殖能力，而后期增殖能力则下降。与我们在Stevens-Johnson综合征或先天性无虹膜症所致的角膜缘干细胞缺乏症（LSCD）研究中发现的结果一致，角膜缘干细胞标志物ABCG2以及评估干细胞功能的金标准——克隆形成效率均显著降低。然而，这些克隆细胞仍保留了向成熟角膜上皮细胞分化的潜能。在既往研究中，尽管在气-液界面培养体系中观察到角膜上皮发生鳞状上皮化生，但角膜上皮干细胞仍表现出分化为正常角膜上皮表型的潜力以及增殖能力增强的特性。这一点与我们目前的研究结果非常相似29。

因此，本方案中建立的研究模型证实，严重炎症可在不直接损伤角膜缘干细胞微环境的情况下，导致角膜缘干细胞的损害。该发现对于观察严重炎症对角膜缘干细胞生物学机制的影响具有重要意义，并为研究角膜炎症所致角膜缘干细胞缺乏症（LSCD）的发病机制提供了理想的实验平台。

然而，该模型存在一定的局限性。麻醉后的大鼠需接受角膜上皮的机械刮除，随后进行角膜缝合，这两种操作均为侵入性手术，术中及术后感染风险较高30。此外，由于大鼠角膜较薄，在缝合过程中容易发生穿孔，对手术操作者的熟练程度要求较高。

因此，我们在操作过程中必须注意以下几点：（i）清洁与消毒：所有器械在手术前必须灭菌。术前一日及手术当天应使用抗生素滴眼液，以降低感染风险。由于角膜缝线属于异物，可能引发炎症和感染，因此必须严格遵守无菌操作规范，术后还需继续使用抗生素滴眼液三天。（ii）大鼠角膜的操作：大鼠角膜相对较薄，在缝合过程中容易发生穿孔。建议使用有齿镊夹住缝合部位对侧的结膜，以固定眼球并便于操作。缝合位置应距离角膜缘约1.5–2 mm，此处角膜较厚，不易穿孔，同时可避免损伤角膜缘干细胞。（iii）角膜上皮的去除：角膜环钻和角膜上皮刮刀可快速去除角膜上皮，操作简便，但其刃口较锋利，可能损伤基质层或导致穿孔。去除过程中应控制施力强度，防止穿孔。为确保去除区域的一致性，可在去除角膜上皮前使用圆形标记笔预先标记区域。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究部分得到了贵州省科技项目（黔科合JC-ZK[2024]ZD043）、福建省杰出青年科学基金（2023J06053 [致S.O.]）、国家自然科学基金（编号82101084 [致S.O.]）以及国家留学基金管理委员会（CSC，202306310049 [致Y.W.]）的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
10-0 缝合线Alcon, Inc., USA8065698001
2 mm 角膜环钻苏州XVI Vision公司，中国http://www.66vision.com/
20 μ L、100 μ L、1 mL 移液枪头，细胞培养板，离心管广州吉特生物科技有限公司，中国https://www.jetbiofil.com/index.html
-20/-80 °C 冰箱青岛海尔公司，中国https://www.haier.com/cn/
10 mL 注射器 浙江康德莱医疗器械股份有限公司，中国https://en.kdlchina.com/zhejiang/25.html
载玻片粘附剂世泰公司188105
戊醇上海麦克林生化科技有限公司，中国http://www.macklin.cn/products/
抗细胞角蛋白抗体Abcam，英国ab76318
抗角蛋白12抗体 EPR17882Abcam，英国ab185627
抗PAX6抗体Abcam，英国ab195045
防脱载玻片、盖玻片江苏世泰实验器材有限公司，中国https://cn.citotest.com/
高压灭菌器Hirayama，日本https://hirayama.com.cn/about/
戊氨基脲（Avertin）上海阿拉丁生化科技股份有限公司，中国https://www.aladdin-e.com/zh_cn/A111225.html
氯仿上海生物工程有限公司，中国https://www.siobp.com/web
CO2 培养箱、超声破碎仪、离心机赛默飞世尔科技公司，美国https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html
共聚焦显微镜上海勤翔科学仪器有限公司，中国https://www.clinx.cn/about
角膜上皮镊苏州XVI Vision公司，中国53418D
DAPIVector. Inc.，美国H-1000
DEPC水 上海生物工程有限公司，中国https://www.siobp.com/web
Dicuro 眼膏（氧氟沙星眼膏）参天制药公司，日本https://www.santen.com/asia
D-KSFM 培养基、双抗、PBS赛默飞世尔科技公司，美国https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html
ED1AbD Serote c，英国 MCA341GA
电子天平上海奥豪斯生物科技有限公司，中国http://shbio.com/company
膜封闭材料Parafilm, Inc.，美国https://www.sigmaaldrich.cn
眼科用荧光素钠试纸条天津精明新技术开发有限公司，中国https://www.eworldtrade.com/c/jingmingtechnological/
荧光倒置相差显微成像系统TE-2000U，Nikon，日本https://www.microscopyu.com/museum/eclipse-te2000-inverted-microscope
冷冻台式离心机Eppendorf，德国https://www.eppendorf.sh.cn 
玻璃片框厦门天根生物科技有限公司，中国http://www.tagene.net/
H-1200 配DAPI封片剂厦门君科生物科技有限公司，中国https://www.bosonbio.com.cn/
HE染色试剂盒奥根，中国http://jushengwu.com/a048/
苏木精-伊红染色液试剂盒AURAGEN，美国P032IH
高精度与低精度电子天平Sdolis，德国https://www.solisinverters.com/global
异丙醇国药集团化学试剂有限公司，中国https://en.reagent.com.cn/
Ki-67 抗体Abcam，英国ab16667
液氮厦门亿东气体有限公司，中国https://www.china.tdk.com.cn/tdk_chn_en/tdk_xiamen/
显微持针器苏州XVI Vision公司，中国http://www.66vision.com/
多聚甲醛粉末Sigma，美国https://www.sigmaaldrich.cn
常温离心机 46Eppendorf，德国https://www.thermofisher.cn
OCT包埋剂上海懋康生物科技有限公司，中国4583
普通生物显微成像系统Eclipse 50i，Nikon，日本https://www.microscope.healthcare.nikon.com/zh_CN/products/upright-microscopes/eclipse-ni-series
PBS上海安金生物科技有限公司，中国SH30256.01
PCR仪及反应装置Biometra热循环仪，德国https://www.analytik-jena.com/products/life-science/pcr-qpcr-thermal-cycler/thermal-cycler-pcr/biometra-tone-series/
各种规格移液器Eppendorf公司，德国https://www.eppendorf.com/cn-zh/
RT-PCR引物上海生物工程技术有限公司
0.5% 盐酸丙美卡因滴眼液Alcon, Inc.，美国https://www.alcon.com/about-us
大鼠PMN抗体Fitzgerald，美国20R-PR020
实时荧光定量PCRApplied Biosystems， 美国https://www.thermofisher.cn
逆转录试剂盒TAKARA，日本https://www.takarabiomed.com.cn/
裂隙灯TOPCON，日本https://topconchina.cn/
平镊苏州XVI Vision公司，中国http://www.66vision.com/
标本盒兰博立德（福州）生物科技有限公司，中国http://chuangdianbio.com/
超净工作台新艺高技术有限公司，新加坡https://www.hi-p.com/
有齿镊苏州XVI Vision公司，中国http://www.66vision.com/
托吡卡胺滴眼液（美多丽）Alcon, Inc.，美国https://www.alcon.com/about-us
微量核酸蛋白浓度检测仪赛默飞世尔科技公司，美国https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html
TrizolInvitrogen，美国https://www.fishersci.com/us/en/brands/IIAM0WMR/invitrogen.html
蔡司手术显微镜卡尔·蔡司，德国https://www.zeiss.com/corporate/en/about-zeiss.html

参考文献

  1. Ang, L. P., Tan, D. T. Ocular surface stem cells and disease: Current concepts and clinical applications. Ann Acad Med Singap. 33 (5), 576-580 (2004).
  2. Mao, Y., et al. Downregulation of p38 MAPK signaling pathway ameliorates tissue-engineered corneal epithelium. Tissue Eng Part A. 28 (23-24), 977-989 (2022).
  3. Sprogyte, L., Park, M., Di Girolamo, N. Pathogenesis of alkali injury-induced limbal stem cell deficiency: A literature survey of animal models. Cells. 12 (9), 1294(2023).
  4. He, X., et al. Lacrimal gland microenvironment changes after obstruction of lacrimal gland ducts. Invest Ophthalmol Vis Sci. 63 (3), 15(2022).
  5. Le, Q., Chauhan, T., Deng, S. X. Diagnostic criteria for limbal stem cell deficiency before surgical intervention- A systematic literature review and analysis. Surv Ophthalmol. 65 (1), 32-40 (2020).
  6. Li, W., Hayashida, Y., Chen, Y. T., Tseng, S. C. Niche regulation of corneal epithelial stem cells at the limbus. Cell Res. 17 (1), 26-36 (2007).
  7. Ou, S. K., et al. The role of ectodysplasin a on the ocular surface homeostasis. Int J Mol Sci. 23 (24), 12(2022).
  8. Lin, S., et al. Limbal stem cell dysfunction induced by severe dry eye via activation of the p38 MAPK signaling pathway. Am J Pathol. 193 (11), 1863-1878 (2023).
  9. Jiang, G. J., Li, B. B., Fan, T. J. Timolol induces necroptosis, apoptosis and senescence concentration-dependently in rabbit limbal stem cells in vitro. Life Sci. 277, 119453(2021).
  10. Castro-Munozledo, F. Review: Corneal epithelial stem cells, their niche and wound healing. Mol Vis. 19, 1600-1613 (2013).
  11. Atalay, E., et al. Animal models for limbal stem cell deficiency: A critical narrative literature review. Ophthalmol Ther. 13 (3), 671-696 (2024).
  12. Delic, N. C., Cai, J. R., Watson, S. L., Downie, L. E., Di Girolamo, N. Evaluating the clinical translational relevance of animal models for limbal stem cell deficiency: A systematic review. Ocul Surf. 23, 169-183 (2022).
  13. Lin, Z., et al. A mouse model of limbal stem cell deficiency induced by topical medication with the preservative benzalkonium chloride. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (9), 6314-6325 (2013).
  14. Ye, J., et al. Biomimetic nanocomplex based corneal neovascularization theranostics. J Control Release. 374, 50-60 (2024).
  15. Zhu, H. M., et al. A synergistic therapy with antioxidant and anti-VEGF: Toward its safe and effective elimination for corneal neovascularization. Adv Healthc Mater. 13 (5), 10(2024).
  16. Yu, J. W., et al. In vivo assembly drug delivery strategy based on ultra-small nanoparticles: Toward high drug permeation and accumulation for CNV treatment. Chem Eng J. 450, 137968(2022).
  17. Wu, H., et al. A SU6668 pure nanoparticle-based eyedrops: Toward its high drug accumulation and long-time treatment for corneal neovascularization. J Nanobiotechnol. 22 (1), 290(2024).
  18. Long, Q., et al. A novel tissue-engineered corneal epithelium based on ultra-thin amniotic membrane and mesenchymal stem cells. Sci Rep. 14 (1), 17407(2024).
  19. Giroux, V., Rustgi, A. K. Metaplasia: Tissue injury adaptation and a precursor to the dysplasia-cancer sequence. Nat Rev Cancer. 17 (10), 594-604 (2017).
  20. Herfs, M., Hubert, P., Delvenne, P. Epithelial metaplasia: Adult stem cell reprogramming and (pre)neoplastic transformation mediated by inflammation. Trends Mol Med. 15 (6), 245-253 (2009).
  21. Slack, J. M. Metaplasia and transdifferentiation: From pure biology to the clinic. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (5), 369-378 (2007).
  22. Slack, J. M., Tosh, D. Transdifferentiation and metaplasia--switching cell types. Curr Opin Genet Dev. 11 (5), 581-586 (2001).
  23. Wang, S., et al. Impact of chronic smoking on meibomian gland dysfunction. PLoS One. 11 (12), e0168763(2016).
  24. Wu, Y., et al. Evolution of therapeutic strategy based on oxidant-antioxidant balance for fuchs endothelial corneal dystrophy. Ocul Surf. 34, 247-261 (2024).
  25. Li, Y., et al. Meibomian gland alteration in patients with systemic lupus erythematosus. Lupus. 31 (4), 407-414 (2022).
  26. Zhang, Y., et al. Histopathology-based diagnosis of Mooren's ulcer concealed beneath the pterygium on eye. J Histotechnol. 45 (4), 195-201 (2022).
  27. Tseng, S. C., Hatchell, D., Tierney, N., Huang, A. J., Sun, T. T. Expression of specific keratin markers by rabbit corneal, conjunctival, and esophageal epithelia during vitamin A deficiency. J Cell Biol. 99 (6), 2279-2286 (1984).
  28. Espana, E. M., et al. Characterization of corneal pannus removed from patients with total limbal stem cell deficiency. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (9), 2961-2966 (2004).
  29. Li, W., et al. Air exposure induced squamous metaplasia of human limbal epithelium. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49 (1), 154-162 (2008).
  30. Marino, G. K., et al. Epithelial basement membrane injury and regeneration modulates corneal fibrosis after pseudomonas corneal ulcers in rabbits. Exp Eye Res. 161, 101-105 (2017).

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基于角膜上皮刮除联合角膜缝线建立大鼠重度角膜炎模型
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