癫痫发作对多种功能和生活质量产生负面影响。通过将涡虫暴露于不同浓度的化学致痫剂中，评估其癫痫表型及运动障碍情况。本研究提出将涡虫作为人类急性癫痫发作的模型，对癫痫治疗药物的开发具有重要意义。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
癫痫是最常见的神经系统疾病之一，其特征是反复发作的自发性癫痫发作。癫痫发作是神经元活动失控且过度同步化的临床表现。癫痫发作对大脑造成的损伤程度取决于其持续时间和强度。遗憾的是，目前尚无治疗癫痫的有效方法。本研究旨在评估涡虫 Dugesia dorotocephala 是否可作为研究急性癫痫发作及其治疗药物开发的模型。目前，已有多种模型（如小鼠模型）被用于评估抗癫痫药物（ASM）。然而，这些模型成本高昂，且存在伦理问题。相比之下，无脊椎动物模型为抗癫痫药物的发现过程提供了经济高效的研究途径。涡虫属于扁形动物门，栖息于海洋、淡水及陆地环境中。Dugesia dorotocephala 是北美地区水生涡虫的主要物种。由于其成本低、具有类似脊椎动物的神经元以及可量化的多种行为特征，D. dorotocephala 成为癫痫研究中一种可行的无脊椎动物模型，优于其他无脊椎动物或更大型动物。该物种已被广泛应用于与衰老、记忆及再生相关的药理学和环境毒理学研究。在本研究中，将涡虫暴露于不同浓度的匹罗卡品（一种常用的化学致痫剂）中，观察其行为变化。观察结束后，将涡虫实施安乐死，并用甲醛或高尔基液固定，以进行神经组织学评估。实验中观察到六种不同的行为表型：背侧振荡、头部振荡、尾部背侧扩张、C形弯曲、头部抽动和尾部抽动。与对照组相比，实验组涡虫的背侧振荡频率显著增加，且呈剂量依赖性。此外，匹罗卡品还干扰了涡虫的运动能力。由匹罗卡品诱导的涡虫癫痫发作可作为评估急性癫痫发作及抗癫痫药物的有效模型，这对于开发针对癫痫患者治疗策略至关重要。
引言
癫痫的特征是在24小时内出现两次或以上无明显诱因的癫痫发作，全球约有5000万人受此影响1。其中，据报告有1000万至1500万人患有药物难治性癫痫2。因此，抗癫痫药物的研究至关重要。该疾病表现为短暂的部分性或全面性不自主运动发作，症状从凝视发呆到身体强直和抽搐不等，并与大脑电活动的突然增强相关3。
从历史上看，由于啮齿类动物和其他哺乳动物在进化上与人类具有相似性，癫痫研究一直依赖这些动物模型。然而，这些方法可能耗时且成本高昂，因此需要一种替代方案4,5。果蝇、水蛭、蝌蚪、斑马鱼和线虫等非哺乳动物已被用于相关研究，并取得了有前景的结果6。此外，已有研究表明，涡虫可作为无脊椎动物与人类基因组之间的比较基因组学研究模型，同时具备测试致惊厥剂、抗癫痫药物（ASM）以及行为模式的能力6。涡虫（扁形动物门 Platyhelminthes），又称扁虫，属于涡虫纲（Turbellaria），主要以其强大的再生能力而闻名；但本研究重点关注其对诱发癫痫物质的反应。
涡虫与人类具有相似的基本神经机制，例如对5-羟色胺和多巴胺的反应性，其神经系统相关基因与哺乳动物大脑中的基因相似度达95%，并具有可辨识的脑结构7。此外，在实验室条件下，涡虫表现出可观测的运动行为，且相较于啮齿类或其他哺乳动物，具有成本低、耗时短和符合伦理优势。这些可观测的行为，如螺旋状、C形和核桃状运动，数十年来已被广泛记录，并与可卡因、尼古丁、多巴胺和匹鲁卡品等物质相关联7,8,9,10,11,12,13,14。因此，涡虫成为研究人类癫痫药物的一种可行模型。
本方法旨在利用高尔基染色法对暴露于匹鲁卡品的涡虫神经元进行表征。高尔基染色可用于在光学显微镜下观察神经元，并已被用于研究形态学变化是否与癫痫发作相关15,16,17。目前文献中尚无对涡虫脑组织进行高尔基染色的报道。尽管以往研究已通过观察行为表型记录了药物效应，但本文是首次采用高尔基染色法对暴露于匹鲁卡品的涡虫神经元进行表征的研究11,18。该技术在可视化和理解与癫痫发作相关的形态学变化方面具有重要价值。本研究发现，随着匹鲁卡品浓度的增加，涡虫背侧振荡行为的发生频率显著升高。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
注意：整体实验设计见图1。
1. 行为表型检测
- 用泉水配制 1 mM 和 2 mM 的毛果芸香碱溶液，并设置仅含泉水的对照组。
- 将每种溶液各 3 mL 加入 4 × 3 孔板中，每一行代表不同浓度的毛果芸香碱。
- 使用剪去尖端的移液管，将约 2 周龄的实验室培养 Dugesia dorotocephala 各一只放入 12 个孔中。
注意：剪切移液管尖端，使其末端足够大，以便放入涡虫而不造成损伤。 - 在正常室内光照条件下，将摄像设备置于 4 × 3 孔板上方，清晰记录涡虫行为 1 小时，确保视频图像可被肉眼清晰观察。
- 重复步骤 1.1–1.4，使用用泉水配制的 3 mM、4 mM 和 6 mM 毛果芸香碱溶液。
2. 运动性分析
注意：涡虫行为在直径为 2.5 cm 的孔板中记录。将长达 1 小时的视频录像分割为 30 分钟片段，并使用商业软件进行剪裁，以单独分析每只涡虫。
- 使用自动化行为分析软件开始新实验。打开增强型自动化行为追踪系统。在“新实验”下点击新建，并为实验命名。
- 按以下说明设置实验参数。
- 在菜单提示中点击实验设置。确保设置为默认值：视频源（来自视频文件）、 arenas 数量（1）、追踪特征（中心点检测）、身体点检测技术（基于轮廓）、分析选项（无）、单位（cm、s、deg）。
- 按以下说明设置 arena 参数。
- 在左上角“设置”面板中的arena 设置标签下点击arena 设置。当系统提示上传视频时，从存储位置选择涡虫的录制视频。选中视频后，点击抓取。
- 按照屏幕右上角面板的提示操作。点击1. 绘制标尺以校准。在孔位的视频图像上，从样本孔的一侧边缘拖动标尺线至另一侧边缘，并输入孔的实际距离（2.5 cm）。
- 点击2. 选择形状并绘制 arena。确保右侧面板中已选中 Arena 1。将鼠标光标移至屏幕顶部中央，点击圆形图标。
- 通过从 arena 边缘拖动至另一边缘，在上传的视频图像中创建一个圆形。确保 arena 位于橙色区域内。调整形状以贴合实际 arena 范围，并确保 Arena 1 标签位于 arena 范围内。
- 在右侧面板底部，将形状、大小和位置调整为所需数值（宽度：2.75，高度：2.75，X：0，Y：0）。
- 点击3. 选择形状并绘制区域（可选）。此时右侧面板中的 Zone Group 1 将被选中。将鼠标光标移至屏幕顶部中央，选择圆形图标。在 arena 图像内部拖动以创建一个较小的圆形。
- 在右下方面板中，将形状、大小和位置调整为所需数值（宽度：1.75，高度：1.75，X：0，Y：0）。
- 在与圆形图标相同的菜单栏中点击添加区域标签按钮，然后点击较小圆形的中心区域。右键点击右侧面板中的Zone 1标签，将其重命名为“中心”。
- 再次点击添加区域标签按钮，然后点击arena 的外围区域，即中心区域之外。右键点击右侧面板中的Zone 2，将其重命名为“外围”。
- 点击4. 验证设置，以确保 arena 设置有效。
- 按以下说明设置试验控制参数。
- 在左上角“设置”面板的“试验控制设置”标签下点击试验控制设置。将出现六个组件框。点击第四个标为“条件”的框内的设置，其中包含“时间（1）”和“无限时间（条件永不满足）”。
- 点击“在……之后”旁边的圆点，然后在右侧文本框中输入持续时间（30 min）。时间文本框右侧还有一个下拉菜单，可用于选择 h、min 或 s。
注意：录制视频的检测设置取决于视频质量。可根据具体视频调整以下方法，以获得最佳观察效果。
- 按以下说明设置检测参数。
- 在左上角“设置”面板的“检测设置”标签下点击检测设置。在右上方面板中点击选择视频按钮。上传用于设定检测参数的目标视频。
- 在右侧同一面板中点击高级标签。在“方法”标签下，确保设置为灰度化（Gray Scaling），并将范围调整为（0 - 100）。
- 在右侧面板的“平滑”标签下，确保“视频像素平滑”为“无”，“丢帧校正”为“关闭”，“轨迹噪声抑制”为“关闭”。
- 在右侧面板的“目标轮廓”标签下，调整序列设置，将“腐蚀”、“膨胀”和“腐蚀”分别设为 1、1 和 0。
- 在“目标大小”标签下，将“最小值”设为（0），“最大值”设为（125000）。点击右下角的保存。
- 按以下说明设置用于观察的视频试验序列。
- 在左上角“设置”面板中点击试验列表。通过点击“系统视频文件”列下的省略号按钮，按所需顺序上传样本视频。如需添加更多试验，可点击试验列表面板左上方附近的添加试验按钮。
- 设置采集参数。
- 在左上角“采集”标签下点击采集。在右侧面板的采集设置中，点击追踪所有计划试验。
- 开始采集时，点击屏幕下方中央“准备开始”旁边的红色按钮。视频采集将随即开始，所需时间取决于上传视频试验的数量和长度。
- 按以下说明设置分析参数。
- 在左侧面板的“分析”标签下点击分析配置文件。点击默认选中的因变量速度和移动距离，并将其删除。
- 在因变量面板的“位置”标签下，点击在区域内。勾选中心和外围区域对应的复选框。
- 在“在区域内”框内的试验统计标签下，取消勾选首次进入潜伏期，然后点击添加。
- 在“身体”标签下，点击旋转按钮。选择顺时针，并将阈值（50.00 度）和最小移动距离（2.00 cm）保持默认。点击添加。
- 再次点击旋转按钮，选择逆时针，然后点击添加。
- 按以下说明分析轨迹。
- 在“结果”标签下点击轨迹可视化。在右侧面板的“筛选”下取消勾选最后。屏幕底部中央的播放控制条将显示特定观察时间段内样本的轨迹可视化结果。
- 分析并导出结果。结果可在左下方面板其余标签页中查看。要导出数据，请在左侧面板的“导出”下点击原始数据或统计结果。
3. 安乐死
- 用蒸馏水配制22 mM的丁香酚溶液。使用剪切过的移液管将涡虫放入含有9 mL 22 mM丁香酚溶液的培养皿中，不同浓度应分别处理。麻醉3分钟，或直至所有运动完全停止。
- 将涡虫转移至新的含有9 mL蒸馏水的培养皿中，清洗1至2次，随后将其放入下述高尔基溶液（用于高尔基染色）或4%多聚甲醛溶液（用于免疫荧光染色）中。
4. 组织学分析
- 高尔基染色
- 在涡虫被处死后，将其放入盛有高尔基染色试剂盒中溶液A和溶液B按1:1比例混合的烧杯或培养皿中。次日更换溶液，将涡虫转移至另一装有新鲜A液和B液混合液的烧杯中。
- 让涡虫在溶液A和溶液B中静置1周。
- 将涡虫从溶液A和B中取出，转移至另一烧杯中的溶液C中。次日更换一次溶液C。让涡虫在溶液C中静置至少72小时，最长可达1周。
- 用移液管将涡虫从溶液C中取出，使用OCT包埋：先在样品头（chuck）上涂少量OCT包埋剂，放入涡虫，再用OCT完全包裹。在-24°C条件下，用冷冻切片机将样本横向切成5 µm厚的切片。
- 用移液管和溶液C将切片转移至明胶包被的载玻片上，置于室温避光处干燥，最多干燥3天。
- 使用染色液（1份溶液D、1份溶液E、2份泉水）进行染色，将载玻片依次浸入以下溶液中：染色液中10分钟，随后用泉水漂洗2次，每次4分钟；50%乙醇中4分钟；75%乙醇中4分钟；95%乙醇中4分钟；100%乙醇中4次，每次4分钟；最后在二甲苯中3次，每次4分钟。
- 用组织学封片介质封片，并在明场显微镜下观察组织。
- 免疫荧光染色
- 在涡虫被处死后，将其放入4%多聚甲醛中固定至少24小时。此步骤后可将样本存放在冰箱中保存。
- 将涡虫从4%多聚甲醛转移至20%蔗糖溶液中，浸泡1天。随后取出涡虫，放入PBS缓冲液中5分钟。
- 用PBS缓冲液洗涤3–4次，每次数分钟，然后转移至20%蔗糖溶液中储存，直至准备染色。
- 依次将样本置于70%、95%和100%乙醇溶液中，各1分钟。再放入二甲苯中1分钟。
- 再依次将样本置于95%和70%乙醇中，各1分钟。随后在PBS缓冲液中洗涤3次，每次5分钟。接着放入60:40的甲醇与过氧化氢溶液中10–15分钟。
- 在PBS中洗涤3次，每次5分钟。将此前步骤4.2.1中使用的4%多聚甲醛体积加入此PBS缓冲液中。
- 在PBS中洗涤3次，每次5分钟。用脱脂奶粉覆盖样本，室温封闭1小时。
- 用PBS将一抗（1H6）稀释至5 µg/mL，将载玻片在4°C抗体溶液中孵育过夜。次日，用PBS冲洗涡虫10分钟。
- 用PBS将二抗（山羊抗小鼠IgG）稀释至1 µg/mL，将载玻片在室温抗体溶液中孵育过夜。次日，用PBS冲洗涡虫15分钟。
注意：不同抗体具有不同的最佳浓度；实验开始前应预先确定。 - 将完整的涡虫样本封片于载玻片上，加盖盖玻片，使用水溶性封片剂封固，并在荧光显微镜下观察组织。
5. 图像分析
- 打开开源图像分析软件应用程序。通过将 colour_deconvolution2.jar 插件拖入该应用程序，将其安装到开源图像分析软件中。
- 选择待分析的图像，并将其拖入开源图像分析软件应用程序。进入 Image 选项卡，点击 color，然后点击 Colour Deconvolution2 v2.1。
- 在 vectors 选项中，点击 H DAB；在 output 选项中，点击 8bit_Transmittance。确保勾选 Simulated LUTs、Cross product for Colour 3、Show matrices 和 Hide legend。点击 OK。
- 选择 Image in Black and White，以确保开源图像分析软件能够有效分析图像。
- 进入 Image 选项卡，点击 Adjust，再点击 Threshold。调节阈值，使 DAB 染色区域或前景呈现红色，背景为白色。若需对多张图像进行定量分析，应确保每张图像的阈值保持一致。
- 点击 Analyze，然后点击 Set Measurements。勾选 Area, Min & max gray value, Limit to threshold, Display label, Median, 和 Mean gray value，点击 OK。再次点击 Analyze，然后点击 Measure，获取分析结果。
- 重复步骤 1.2 至 1.6，直至完成所有图像的定量分析。点击 Results Image，然后点击 File，选择 Save As，将文件保存为电子表格格式，并在电子表格软件中查看数据。
6. 统计学分析
- 使用方差分析（ANOVA）和学生t检验计算涡虫行为的均值及均值标准误（SEM），以确定统计学显著性（p < 0.05）。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
涡虫暴露于不同浓度的匹鲁卡品后观察到以下行为：
背侧波动：一种类似气泡的结构从涡虫身体的头部向尾部移动。
头部波动：涡虫头部出现类似气泡的结构，形成类似蝌蚪的外观。
C形：头部顺时针移动，尾部逆时针移动，形成C形。
头部抽动：涡虫头部突然向左或向右抽动。
尾部背侧波动：涡虫尾部出现类似气泡的结构，形成类似蝌蚪的外观。
尾部抽动：涡虫尾部突然向左或向右抽动。
我们观察到，随着毛果芸香碱浓度的增加，行为频率也随之上升。结果表示在整个记录过程中观察到的特定行为次数。与对照组（均值 = 0）相比，6 mM 毛果芸香碱（均值 = 16 ± 4.10，p < 0.0001）和 4 mM 毛果芸香碱（均值 = 11.25 ± 2.17，p < 0.0001）诱导的背侧振荡具有统计学显著性（图 2A）。该运动表现出剂量依赖性特征（R2 = 0.87；图 2G）。此外，与其它浓度相比，涡虫在暴露于 6...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本研究展示了不同浓度毛果芸香碱诱导的涡虫行为。其中最显著的行为是振荡性背侧扩张，因为此行为在其他关于涡虫惊厥样行为的研究中尚未见报道9,10,11,12。毛果芸香碱诱导涡虫产生惊厥样行为的具体机制尚不清楚。然而，本研究表明，不同的行为可能对应不同程度的神经兴奋性。该效应被认为是由毒蕈碱受体激动作用所引起22。
本实验方案的关键步骤包括制备用于剂量依赖性分析的毛果芸香碱溶液。遵循此处所述的操作流程可确保用于行为记录的涡虫处于一致的实验条件。将涡虫分别置于含有毛果芸香碱溶液或泉水的多孔板中，以便观察其关键行为，如背部振荡、C形运动和头部抽动。每孔板仅放置一条涡虫，也有助于减少在一小时记录过程中自动追踪软件可能产生的误差。此外，必须使用特定参数对视频资料进行校准与分析，以量化运动模式，包...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明无任何利益冲突。
致谢
我们感谢EVMS研究激励基金（项目负责人：A.E. Musto）以及Jorge Jacot博士在优化免疫荧光实验方案过程中提供的有益建议。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 离心管 | |||
| 4% 多聚甲醛溶液 | Himedia | TCL119 | |
| 水性封片介质 | Clini Sciences | NB-47-02240-30ML | |
| 烧杯（每种测试浓度各一个） | |||
| Carolina 纯净水 | carolina | 132450 | |
| 冷冻切片机 | |||
| 稀释后的一抗和二抗 | |||
| 乙醇（100%） | sigma Aldrich | ||
| EthosVision XT 16 | noldus | ||
| Fiji 版本 2.9.0 | |||
| 明胶包被载玻片 | sigma Aldrich | 643203 | |
| 高尔基体抗体 1H6 | DSHB | AB_2619608 | |
| 高尔基染色试剂盒_ | Neuroscience Associate | PK 401/401A | |
| 过氧化氢 | |||
| 甲醇 | |||
| 封片介质 | thermo fischer scientific | ||
| OCT 包埋剂 | |||
| PBS 缓冲液 | sigma Aldrich | P4417 | |
| 脱脂奶粉 | |||
| 锡箔纸 | |||
| 移液管 | |||
| 二甲苯 |
参考文献
- World Health Organization. Epilepsy. , (2024).
- Dalic, L., Cook, M. J. Managing drug-resistant epilepsy: challenges and solutions. Neuropsychiatr Dis Treat. 12, 2605-2616 (2016).
- Mayo Clinic. Seizures - Symptoms and causes. , (2023).
- Shomrat, T., Levin, M. An automated training paradigm reveals long-term memory in planarians and its persistence through head regeneration. J Exp Biol. 216 (20), 3799-3810 (2013).
- Moreira-Lobo, D. C., et al. Eugenol modifies the excitability of rat sciatic nerve and superior cervical ganglion neurons. Neurosci Lett. 472 (3), 220-224 (2010).
- Johan Arief, M. F., Choo, B. K. M., Yap, J. L., Kumari, Y., Shaikh, M. F. A systematic review on non-mammalian models in epilepsy research. Front Pharmacol. 9, 655(2018).
- Mineta, K., et al. Origin and evolutionary process of the CNS elucidated by comparative genomics analysis of planarian ESTs. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 7666-7671 (2003).
- Wu, J. P., Lee, H. L., Li, M. H. Cadmium neurotoxicity to a freshwater planarian. Arch Environ Contam Toxicol. 67 (4), 639-650 (2014).
- Kim, A., Rawls, S. M. Nicotine-induced C-shape movements in planarians are reduced by antinociceptive drugs: Implications for pain in planarian paroxysm etiology. Brain Res. 1778, 147770(2022).
- Reho, G., Lelièvre, V., Cadiou, H. Planarian nociception: Lessons from a scrunching flatworm. Front Mol Neurosci. 15, 935918(2022).
- Pagán, O. R., et al. Planarians require an intact brain to behaviorally react to cocaine, but not to react to nicotine. Neuroscience. 246, 265-270 (2013).
- Raffa, R. B., Holland, L. J., Schulingkamp, R. J. Quantitative assessment of dopamine D2 antagonist activity using invertebrate (Planaria) locomotion as a functional endpoint. J Pharmacol Toxicol Methods. 45 (3), 223-226 (2001).
- Bhatt, P., Reitz, A. B., Tallarida, C. Mephedrone ("bath salt") pharmacology: insights from invertebrates. Neuroscience. 208, 79-84 (2012).
- Neufeld, T., Carniello, T., Dotta, B. A single hypoxic event ameliorates pilocarpine-induced hyperkinetic movements in Planaria. Nat Sci. 14, 149-156 (2022).
- Rossini, L., et al. Dendritic pathology, spine loss, and synaptic reorganization in human cortex from epilepsy patients. Brain. 144 (1), 251-265 (2021).
- Owuor, K., et al. LGI1-associated epilepsy through altered ADAM23-dependent neuronal morphology. Mol Cell Neurosci. 42 (4), 448-457 (2009).
- Dubey, V., et al. Dendritic reorganization in the hippocampus, anterior temporal lobe, and frontal neocortex of lithium-pilocarpine induced Status Epilepticus (SE). J Chem Neuroanat. 133, 102329(2023).
- Löscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20 (5), 359-368 (2011).
- Musto, A. E., Walker, C. P., Petasis, N. A., Bazan, N. G. Hippocampal neuro-networks and dendritic spine perturbations in epileptogenesis are attenuated by neuroprotectin D1. PLoS One. 10 (1), e0116543(2015).
- Omuro, K. G., et al. Novel monoclonal antibodies to study tissue regeneration in planarians. BMC Dev Biol. 15 (2), (2015).
- Keenan, C. L., et al. Cytoarchitecture of primitive brains: Golgi studies in flatworms. J Comp Neurol. 195, 4(1981).
- Pronin, A. N., Wang, Q., Slepak, V. Z. Teaching an old drug new trick: Agonism, antagonism, and biased signaling of pilocarpine through M3 muscarinic acetylcholine receptor. Mol Pharmacol. 92 (5), 601-612 (2017).
- Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods Mol Biol. 1897, 299-311 (2019).
- Vogt, R. V., Phillips, D. L., Henderson, L. O., Whitfield, W., Spierto, F. W. Quantitative differences among various proteins as blocking agents for ELISA microtiter plates. J Immunol Meth. 101 (1), 43-50 (1987).
- Duhamel, R. C., Johnson, D. A. Use of nonfat dry milk to block nonspecific nuclear and membrane staining by avidin conjugates. J Histochem Cytochem. 33 (7), 711-714 (1985).
- Chen, T. S., Huang, T. H., Lai, M. C., Huang, C. W. The role of glutamate receptors in epilepsy. Biomedicines. 11 (3), 783(2023).
- Kreshchenko, N. Immunocytochemical identification of serotoninergic neurons in Planaria Girardia tigrina. Biochem. Moscow Suppl Ser A. 11, 68-76 (2017).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
