涡虫作为实验性急性癫痫的动物模型

摘要

癫痫发作对多种功能和生活质量产生负面影响。通过将涡虫暴露于不同浓度的化学致痫剂中，评估其癫痫表型及运动障碍情况。本研究提出将涡虫作为人类急性癫痫发作的模型，对癫痫治疗药物的开发具有重要意义。

摘要

癫痫是最常见的神经系统疾病之一，其特征是反复发作的自发性癫痫发作。癫痫发作是神经元活动失控且过度同步化的临床表现。癫痫发作对大脑造成的损伤程度取决于其持续时间和强度。遗憾的是，目前尚无治疗癫痫的有效方法。本研究旨在评估涡虫 Dugesia dorotocephala 是否可作为研究急性癫痫发作及其治疗药物开发的模型。目前，已有多种模型（如小鼠模型）被用于评估抗癫痫药物（ASM）。然而，这些模型成本高昂，且存在伦理问题。相比之下，无脊椎动物模型为抗癫痫药物的发现过程提供了经济高效的研究途径。涡虫属于扁形动物门，栖息于海洋、淡水及陆地环境中。Dugesia dorotocephala 是北美地区水生涡虫的主要物种。由于其成本低、具有类似脊椎动物的神经元以及可量化的多种行为特征，D. dorotocephala 成为癫痫研究中一种可行的无脊椎动物模型，优于其他无脊椎动物或更大型动物。该物种已被广泛应用于与衰老、记忆及再生相关的药理学和环境毒理学研究。在本研究中，将涡虫暴露于不同浓度的匹罗卡品（一种常用的化学致痫剂）中，观察其行为变化。观察结束后，将涡虫实施安乐死，并用甲醛或高尔基液固定，以进行神经组织学评估。实验中观察到六种不同的行为表型：背侧振荡、头部振荡、尾部背侧扩张、C形弯曲、头部抽动和尾部抽动。与对照组相比，实验组涡虫的背侧振荡频率显著增加，且呈剂量依赖性。此外，匹罗卡品还干扰了涡虫的运动能力。由匹罗卡品诱导的涡虫癫痫发作可作为评估急性癫痫发作及抗癫痫药物的有效模型，这对于开发针对癫痫患者治疗策略至关重要。

引言

癫痫的特征是在24小时内出现两次或以上无明显诱因的癫痫发作，全球约有5000万人受此影响¹。其中，据报告有1000万至1500万人患有药物难治性癫痫²。因此，抗癫痫药物的研究至关重要。该疾病表现为短暂的部分性或全面性不自主运动发作，症状从凝视发呆到身体强直和抽搐不等，并与大脑电活动的突然增强相关³。

从历史上看，由于啮齿类动物和其他哺乳动物在进化上与人类具有相似性，癫痫研究一直依赖这些动物模型。然而，这些方法可能耗时且成本高昂，因此需要一种替代方案^4,5。果蝇、水蛭、蝌蚪、斑马鱼和线虫等非哺乳动物已被用于相关研究，并取得了有前景的结果⁶。此外，已有研究表明，涡虫可作为无脊椎动物与人类基因组之间的比较基因组学研究模型，同时具备测试致惊厥剂、抗癫痫药物（ASM）以及行为模式的能力⁶。涡虫（扁形动物门 Platyhelminthes），又称扁虫，属于涡虫纲（Turbellaria），主要以其强大的再生能力而闻名；但本研究重点关注其对诱发癫痫物质的反应。

涡虫与人类具有相似的基....

方案

注意：整体实验设计见图1。

1. 行为表型检测

1. 用泉水配制 1 mM 和 2 mM 的毛果芸香碱溶液，并设置仅含泉水的对照组。
2. 将每种溶液各 3 mL 加入 4 × 3 孔板中，每一行代表不同浓度的毛果芸香碱。
3. 使用剪去尖端的移液管，将约 2 周龄的实验室培养 Dugesia dorotocephala 各一只放入 12 个孔中。
   注意：剪切移液管尖端，使其末端足够大，以便放入涡虫而不造成损伤。
4. 在正常室内光照条件下，将摄像设备置于 4 × 3 孔板上方，清晰记录涡虫行为 1 小时，确保视频图像可被肉眼清晰观察。
5. 重复步骤 1.1–1.4，使用用泉水配制的 3 mM、4 mM 和 6 mM 毛果芸香碱溶液。

2. 运动性分析

注意：涡虫行为在直径为 2.5 cm 的孔板中记录。将长达 1 小时的视频录像分割为 30 分钟片段，并使用商业软件进行剪裁，以单独分析每只涡虫。

1. 使用自动化行为分析软件开始新实验。打开增强型自动化行为追踪系统。在“新实验”下点击

结果

涡虫暴露于不同浓度的匹鲁卡品后观察到以下行为：
背侧波动：一种类似气泡的结构从涡虫身体的头部向尾部移动。
头部波动：涡虫头部出现类似气泡的结构，形成类似蝌蚪的外观。
C形：头部顺时针移动，尾部逆时针移动，形成C形。
头部抽动：涡虫头部突然向左或向右抽动。
尾部背侧波动：涡虫尾部出现类似气泡的结构，形成类似蝌蚪的外观。
尾部抽动：涡虫尾部突然向左或向右抽动。

我们观察到，随着毛果芸香碱浓度的增加，行为频率也随之上升。结果表示在整个记录过程中观察到的特定行为次数。与对照组（均值 = 0）相比，6 mM 毛果芸香碱（均值 = 16 ± 4.10，p < 0.0001）和 4 mM 毛果芸香碱（均值 = 11.25 ± 2.17，p < 0.0001）诱导的背侧振荡具有统计学显著性（图 2A）。该运动表现出剂量依赖性特征（R² = 0.87；图 2G）。此外，与其它浓度相比，涡虫在暴露于 6.......

讨论

本研究展示了不同浓度毛果芸香碱诱导的涡虫行为。其中最显著的行为是振荡性背侧扩张，因为此行为在其他关于涡虫惊厥样行为的研究中尚未见报道^9,10,11,12。毛果芸香碱诱导涡虫产生惊厥样行为的具体机制尚不清楚。然而，本研究表明，不同的行为可能对应不同程度的神经兴奋性。该效应被认为是由毒蕈碱受体激动作用所引起²²。

本实验方案的关键步骤包括制备用于剂量依赖性分析的毛果芸香碱溶液。遵循此处所述的操作流程可确保用于行为记录的涡虫处于一致的实验条件。将涡虫分别置于含有毛果芸香碱溶液或泉水的多孔板中，以便观察其关键行为，如背部振荡、C形运动和头部抽动。每孔板仅放置一条涡虫，也有助于减少在一小时记录过程中自动追踪软件可能产生的误差。此外，必须使用特定参数对视频资料进行校准与分析，以量化运动模式，包.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1.5 mL 离心管
4% 多聚甲醛溶液	Himedia	TCL119
水性封片介质	Clini Sciences	NB-47-02240-30ML
烧杯（每种测试浓度各一个）
Carolina 纯净水	carolina	132450
冷冻切片机
稀释后的一抗和二抗
乙醇（100%）	sigma Aldrich
EthosVision XT 16	noldus
Fiji 版本 2.9.0
明胶包被载玻片	sigma Aldrich	643203
高尔基体抗体 1H6	DSHB	AB_2619608
高尔基染色试剂盒_	Neuroscience Associate	PK 401/401A
过氧化氢
甲醇
封片介质	thermo fischer scientific
OCT 包埋剂
PBS 缓冲液	sigma Aldrich	P4417
脱脂奶粉
锡箔纸
移液管
二甲苯