异养酵母与光合产糖蓝细菌共培养体系的构建与定量分析

摘要

本方案为共培养体系的建立和定量监测提供了全面的指导，包括光能自养型分泌糖类的蓝细菌与异养型酵母的共培养。

摘要

随着对可持续生物技术需求的不断增长，包含光合微生物与异养伙伴物种的混合菌群正被探索作为太阳能驱动生物生产的手段。其中一种方法是利用能够固定CO₂并分泌有机碳的蓝细菌，以支持共培养异养微生物的代谢活动，后者进而将碳源转化为更高价值的产品或服务。本实验方案提供了一套技术性描述，旨在协助研究人员建立一种将分泌蔗糖的蓝细菌菌株与真菌伙伴（以模式酵母物种为代表）进行共培养的体系。该方案阐述了建立共培养体系的关键前提条件：确定培养基组成、监测各伙伴物种单独生长的特性，以及对在同一培养容器中组合的多物种混合培养物进行分析。文中总结了用于共培养监测的基本实验技术，包括显微镜观察、细胞计数器和单细胞流式细胞术，并提供了符合FAIR（可发现、可访问、可互操作、可重复使用）原则的非专有软件示例，用于分析原始流式细胞术标准（FCS）文件数据。最后，还对在尝试建立分泌糖类的蓝细菌与新型异养伙伴共培养体系时经常遇到的瓶颈和潜在问题进行了评述。本方案为研究人员提供了一份资源指南，适用于构建包含蓝细菌与异养微生物的新共培养微生物组合。

引言

近年来，随着基因组工具和DNA技术的迅速发展，生物工程研究 increasingly 能够将微生物混合群落视为可行的生物生产策略，而不再局限于单一纯培养体系。相较于单一种类的微生物培养，微生物群落具有多种潜在优势，包括功能特化与分工协作、环境适应性与稳定性，以及底物利用效率的提升¹。然而，由于物种间相互作用所引发的高阶行为具有不确定性，多物种群落的可预测性工程设计面临复杂挑战²。种间信号传递与代谢物交换是实现分工协作原则的核心机制，但同时也可能导致群落成员之间出现意料之外的协同或拮抗效应³。要充分挖掘混合微生物群落的潜力，该领域仍需取得显著进展，其中包括开发灵活的双菌和三菌共培养平台，以自下而上（"bottom up"）的方式更深入地表征和理解微生物之间的相互作用。

目前，该领域内正在使用的共培养平台主要有几种主导类型，包括互补的营养缺陷型伙伴，以及能够分泌对多种微生物普遍有益的代谢物的微生物。在后一类中，蓝细菌已被改造为通过引入特定代谢途径而成为高效的初级生产者，这些途径可促进其分泌易于代谢的碳水化合物，并已在多种理性设计的微生物群落中得到研究。简而言之，在此类工程化微生物群落中，蓝细菌伙伴能够利用光和CO₂作为主要输入物质，通过产氧光合作用过程，这些菌株可分泌中心碳糖作为公共产物。其中一类工程化蓝细菌菌株已被改造为能够分泌二糖蔗糖⁴。这类菌株之所以可能取得成功，是因为蔗糖是一种接近多种生物中心碳代谢的代谢物，且常作为所谓的"相容性溶质"大量积累，以适应多种非生物环境胁迫⁵。在多种蓝细菌模式生物中，仅需少量的遗传干预即可实现高效的蔗糖分泌⁴。

能够分泌蔗糖的蓝细菌是研究理性设计微生物群落的有用平台，因为多种异养微生物可以将蔗糖作为其主要的碳源和能源进行代谢。事实上，已有许多实验室利用少数几种具备蔗糖分泌能力的模式蓝细菌，理性设计出包含一种或多种异养微生物的多物种共培养体系或群落，这些体系最终仅依赖光和CO₂作为初始输入，无需额外补充有机碳源⁴。异养菌株可单纯依赖蓝细菌提供的碳水化合物生存，也可被用于将蔗糖原料转化为更高价值的生物产品（例如燃料、聚合物、色素等）。除了作为一种可持续生物生产的潜在策略外，此类简单的共培养体系还可作为研究非相关微生物物种之间涌现性相互作用的平台。

本文视频重点介绍利用产糖蓝细菌作为灵活平台的设计方法和先决条件，用于构建仅需补充光照和无机碳输入即可保持稳定的简单微生物群落。虽然含有单一已知微生物的培养体系的建立与监测通常较为直接，可通过光密度（OD）或背向散射法轻松实现，但当两种或多种生物共存于同一容器中时，这些方法便不再适用。其主要原因是这些检测手段无法区分不同的微生物，因此只能提供培养物的整体信息，而无法解析各个生物个体的生长情况。此外，蓝细菌在400–750 nm范围内具有广泛的吸收光谱，若试图测定异养菌在OD₆₀₀ 处的光密度，会因藻蓝蛋白（在620 nm处有吸收峰）的存在而导致结果失真。因此，本文提供了在实验室中构建蓝细菌与异养菌混合群落的具体实验方案，以及可用于长期分析此类群落性能的通用检测方法。尽管这些方案主要针对一种模式蓝细菌（可分泌蔗糖）与一种或多种模式异养微生物的配对组合，但本研究的目的是为希望设计新型物种组合的研究人员提供参考资源，以加速此类共培养体系的优化过程。因此，除物种特异性操作步骤外，还包含了相关信息与策略，以便读者根据自身需求对这些方案进行调整和推广，从而建立个性化的微生物群落体系。

由于本文所述共培养平台具有灵活性，因此介绍了多种先前已报道可与分泌糖类的蓝细菌进行共培养的异养物种的实验方案。例如，提供了集胞藻Synechococcus elongatus PCC 7942 与常用实验室酵母酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae共培养的逐步操作方案。此外，本文还包含适用于评估其他模式物种共培养体系性能的实验方案，其中包括玉米黑粉菌Ustilago maydis的酵母形态形式。

本文重点介绍建立蓝细菌/异养生物共培养体系并随时间对这些混合群落的性能进行基本表征所需的一系列核心实验方案。具体而言，重点介绍了适用于准确统计不同物种的单细胞流式细胞术和颗粒计数方法，以及用于评估细胞形态的显微镜技术。这些实验方案旨在根据实际研究需求和可用设备进行调整和优化。重要的是，文中提供了在实验室中建立和监测共培养体系时所需的技术说明及其他注意事项。最后，还包含了使用 Python 软件包对原始 FCS⁶ 文件进行非专有化数据分析的示例。总之，本研究的目标是使基于蓝细菌的共培养技术更广泛地为科学界所用。

方案

注意：本方案包含有关如何建立并定量分析分泌糖类的集胞藻（S. elongatus）与可进行遗传操作的异养型模式酵母物种共培养体系的详细说明。总体而言，该方案适用于任何可通过遗传操作的酵母物种。

1. 建立光合蓝细菌与异养酵母的共培养体系

1. 共培养前的准备工作：培养基与预培养
   注意：所有培养基和储备液均需使用超纯过滤水配制。所有玻璃器皿（量杯、量筒、储存瓶和培养瓶）应清洗并高压灭菌。无菌培养基可于室温（RT）保存。需配备符合光能自养培养要求的设备。
   1. 至少在共培养开始前3至4天配制共培养培养基。大多数共培养培养基配方均为常见的BG-11培养基的变体。⁷ 用于多种蓝藻模式物种的常规培养。本实验方案以先前报道的CoYBG-11培养基为例（⁸；参见 表1）。根据需要，对制备好的培养基进行高压灭菌（121 °C，20 分钟）或过滤除菌（0.22 µm 孔径）。
      注意：有关为其他物种组合选择合适培养基的建议，请参见讨论部分。
   2. 准备分子试剂：用于诱导 cscB 表达与蔗糖输出^9,10,11，配制 1 M 的异丙基-β-硫代半乳糖苷（IPTG）储备液。
      注意：共培养期间使用抗生素并非最佳选择，但如果所有菌株均带有抗性盒，则可以使用。在此情况下，应根据所用菌株的需求配制抗生素储备液。
   3. 制备蓝细菌预培养物：在共培养开始前至少3天，将处于BG-11培养基中生长的糖分泌型蓝细菌预培养物中的细胞转移至含有CoY培养基的新型挡板锥形瓶中^BG-11 培养基（表1).
      注意：目前已对多种蓝细菌物种和菌株进行改造以分泌糖类。有关本文撰写时可用菌株的全面综述，参见⁴该参考文献还列出了已报道过与蓝细菌共培养的异养物种（见1.1.4）。
      1. 测量OD₇₅₀ 预培养物的所需体积，以达到目标OD值₇₅₀ 0.3（C₁）使用公式 V₁ = C₂ x V₂/ C₁ 其中 C₂ 目标OD值，V₂ = 目标体积，以及 V₁ = 预培养所需体积。例如，在接种30 mL培养液（V₂) 使用的液体培养物的量 x 为 V₁ （mL）= （0.3 × 30）/（测得的OD）₇₅₀).
         注意：光密度是细胞密度的近似值，受培养条件和细胞形态的影响；因此，研究人员有必要采用方法将光密度与绝对细胞数量相关联（参见第2.1、2.2和2.3节），以准确评估共培养性能。对于蓝细菌，不应使用光合有效光谱范围内的波长（即400–700 nm）测定光密度，因为这些波长会被叶绿素及其他色素吸收；因此，通常使用远红光波长（如750 nm）。
      2. 将稀释后的培养物置于合适的光培养箱中孵育。典型的孵育条件
         模式蓝藻的培养条件如下：30 °C，150 rpm（25 mm 振幅），2% CO₂₂ 顶空，约 200 µmol 光子 m^-2·s^-1 LED照明，75%湿度。
         注意：补充 CO₂ 强烈建议优化释放的蔗糖量。
      3. 在建立共培养体系前至少3天内，每天重复此稀释操作，以确保蓝细菌处于指数生长期。这有助于提高不同日期实验之间共培养表现的一致性。
   4. 至少在共培养开始前2天，制备异养生物预培养物。如前所述，已有多种酵母物种及其亚株曾与蓝细菌进行过共培养。^8,12,13.
      1. 将异养型物种在丰富培养液中培养的液体培养物按1:100比例稀释（250 µL），转移细胞 表1) 加入 50 mL CoY^BG-11 添加20 g/L蔗糖的培养基，置于250 mL带挡板的锥形瓶中。
      2. 在与蓝藻共生体培养条件相同的温度下过夜孵育。
   5. 检测 OD₆₀₀ 在计划进行共培养接种前至少24小时，确保异养菌株已充分生长以满足实验需求（见1.2）：必要时用新鲜培养基稀释以维持指数生长期。
2. 共培养接种与维持
   注意：有关光养与异养微生物之间接种比例的考量，请参见讨论部分。
   1. 共培养接种时，通过离心富集两份预培养物。
      1. 根据标准 C 计算浓缩细胞悬液的体积，以达到两种物种所需的起始密度₁ x V₁ = C₂ x V₂ 方程，其中 C₁ = 富集培养物的OD值。例如，要制备25 mL培养物 S. elongatus 起始OD₇₅₀ 0.5（来自1.5 OD的无菌培养物）并 S. cerevisiae 起始OD₆₀₀ 0.05（来自OD值为0.7的无菌培养物），根据上述公式，需取8.33 mL S. elongatus 起始培养物，需要1.79 mL的富集异养培养物，以及14.88 mL的CoY^BG-11 培养基
      2. 使用13,000 x g 室温下静置10分钟。在无菌条件下，倾去并弃除上清液。
         注意：可使用较低的相对离心力（RCF；×g）进行沉淀 S. cerevisiae 因为它们的细胞体积更大（是其他细胞的2到3倍） S. elongatus， 但需注意上清液应变为透明。收集蓝细菌生物量时，离心力应低于13,000 x g 也可使用，但需要更长的离心时间（例如，4,000 x g 可使用20分钟。
      3. 将蓝细菌沉淀重悬于25 mL无菌CoY培养基中^BG-11 培养基。采用与之前相同的离心条件，随后弃去上清液。
      4. 重复此过程两次 S. elongatus 以及再重复4次 S. cerevisiae.
         注意：必须洗涤蓝细菌和异养生物的沉淀物S. cerevisiae) 以去除残留的培养基成分。如 S. cerevisiae 如果先前是在蔗糖存在下培养的，增加洗涤步骤的次数将确保去除可能残留的糖分。
      5. 在确认 OD 后，合并体积 S. elongatus 和 S. cerevisiae 在无菌条件下，将 CoY 加入 250 mL 带挡板的锥形瓶中^BG-11 定容至50 mL。用预先配制的1 M IPTG母液稀释至终浓度1 mM（用于诱导集胞藻向培养基中分泌蔗糖）。对于50 mL培养液，加入50 µL的1 M IPTG母液。
         注意：通常建议使用带挡板的锥形瓶，因为其可为蓝细菌提供更好的通气和混合效果。
      6. 将上一步的烧瓶置于200 µmol photons·m⁻²·s⁻¹的光照条件下^-2·s^-1 LED 照明补充 2% CO₂ 在30 °C、150 rpm（25 mm振幅）和75%湿度条件下进行圆周振荡培养。
         注意：上述条件可能有所不同，需根据实验结果进行优化。
      7. 通过无菌取样（1 mL）每12小时或24小时监测培养物的生长情况（见第2部分）。可选择利用样品进行标准的活细胞显微镜观察，并测定菌落形成单位（CFU）¹⁴在合适的培养基上接种酵母细胞，以追踪细胞形态、适应性，并监测活异养细胞数量以及污染情况。
         注意：不建议将菌落形成单位（CFUs）作为监测蓝藻物种精确细胞密度的方法，因为蓝藻在从液体培养基转移到固体培养基的过程中可能经历显著的应激反应。因此，应使用含有适合酵母共生物种生长的富集培养基的琼脂平板，例如酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YEPD）培养基¹⁵应选择。

化学化合物	BG-11（浓度 mg/L）	CoY BG-11（浓度 mg/L）
NaNO3	1500	1500
K2HPO4	40	40
MgSO4·7H2O	75	75
CaCl2 · 2H2O	36	36
柠檬酸	6	6
柠檬酸铁铵	6	6
EDTA（二钠盐）	1	1
Na2CO3	20	20
微量元素组成
H3BO3	2.86	2.86
ZnSO4·7H2O	0.222	0.222
Co(NO3)2 · 6H2O	0.0494	0.0494
MnCl2·4H2O	1.81	1.81
CuSO4 · 5H2O	0.079	0.079
NaMoO4·2H2O	0.39	0.39
额外添加物
HEPPSO	7160	7160
酵母氮源基础（YNB），不含氨基酸，不含硫酸铵	–	3608, 120013
pH 8.3 滴定剂	KOH	KOH
KPO3	–	118
蔗糖（仅用于异养生物）	–	13690

表1：BG-11与CoY^BG-11的培养基成分。 CoY^BG-11中酵母氮源基础成分的给定浓度来源于已发表的文献资料^8,12,13。

2. 监测共培养物生长的工具与方法

注意：本方案为共培养分析与监测的指导性流程，涵盖从显微镜观察和计数板计数等操作简单但工作量较大的技术，到颗粒计数器和单细胞流式细胞术等高通量应用。除实际的共培养体系外，建议同时设置单一微生物的无菌培养对照，以便进行全面分析。分析的一般起始步骤是测定培养物的光密度（OD）。本节详细介绍了多种方法，可用于将细胞密度的相对测量值（即OD）转换为每单位体积的绝对细胞数量。通常使用OD₇₅₀测定来评估蓝细菌培养物的细胞密度（因其在400–700 nm波长范围内存在光吸收），而异养型微生物则常用OD₆₀₀进行测定。这两种测量所得数值均为任意单位的近似参考值，需注意不同仪器之间的测定结果可能存在显著差异。

1. 使用计数室进行显微镜下定量
   注意：计数室（即改良型血细胞计数板/血球计数板）是一种简单且经济的方法，可用于确定在形态上易于区分的共培养细胞组成的细胞比例。 即，根据其细胞形态（图1A）。它由一块厚玻璃显微镜载玻片和一片盖玻片组成。若将盖玻片正确放置在载玻片上方，则可形成两个带有刻蚀网格的精密体积计数室（图1B-D）。通过计数网格的特定区域，可计算出悬液中的细胞浓度。计数室具有不同的深度，应根据细胞厚度选择合适的计数室深度。对于真菌细胞等 U. maydis 或 S. cerevisiae 0.1 mm 的深度效果良好。对于聚球藻等较小的细胞而言，此腔室深度过大，细胞会在腔室内漂浮。0.02 mm 深度的腔室则适用于聚球藻以及聚球藻与真菌的共培养体系。
   1. 确保计数室和盖玻片无灰尘和细胞残留。
      注意：建议在使用前直接用70%（v/v）乙醇和无绒布进行清洁。
   2. 为正确放置盖玻片，应稍施压力将其沿两条支撑条滑入到位，注意避免用力过猛导致破损。
      注意：本应用需要使用特定的厚盖玻片（请参考培养室说明书）。由于在组装过程中盖玻片有时会破裂，建议准备备用盖玻片。
   3. 当盖玻片位置正确时，观察所谓的牛顿环（图1B）在两片玻璃表面之间，且盖玻片不再滑动。
      注意：在组装前轻轻向盖玻片呼气通常可改善结果。
   4. 充分混匀细胞悬液，取少量悬液（约2-10 µL，具体体积取决于计数室深度），滴加至计数室边缘，使其依靠毛细作用完全充满计数室。应使用适当稀释的细胞悬液，以便获得可靠的计数结果，例如每个大方格内含有20至200个细胞为宜图1D，红色矩形）。
   5. 使用合适的物镜（例如10倍）在光学显微镜（明场或相差模式）下观察计数室的网格线。网格可提供定位参考。根据给定细胞大小，从适合的方格开始计数细胞。
      注意：使用技术辅助工具进行计数，例如手持计数器或合适的智能手机应用程序（如通用“计数器”应用或提供非常有用功能的专用血细胞计数板应用程序）。应制定细胞位于网格边界时的计数规则，以避免重复计数。例如，可计数位于每个方格上侧和左侧边界上的细胞，而忽略右侧和下侧边界上的细胞。亦可采用其他计数规则¹⁶如果使用荧光显微镜，还可以根据细胞的自发荧光或荧光标记物来区分细胞。
   6. 计数后，例如四个角的大方格，确定每种细胞类型的平均值。根据这些平均值、所用方格的面积以及计数室的深度（参考生产商提供的信息），计算细胞浓度（见 代表性结果).
      注意：根据细胞大小，可使用不同的计数方格。对于酵母和蓝细菌细胞，使用四个角上的大方格效果较好（图1D，红色矩形）。
   7. 使用后，应根据样本的要求清洁腔室（例如，妥善灭活转基因生物）。
2. 使用颗粒计数器进行定量分析
   注意：根据共培养体系中细胞的特性，可使用粒子计数器来确定各共培养组分的细胞数量。该方法适用的前提是细胞间大小差异显著；例如，可用于区分细菌和酵母细胞。需包含共生体系中各单一微生物的无菌培养样本，以便结果解读。对于细胞大小相近或包含两个以上组分的共培养体系，应采用2.1或2.3节所述的方法进行分析。
   1. 样品制备
      1. 将菌液的OD值调整至0.1，用等渗测量缓冲液（参见仪器说明书）稀释1,000倍，总体积为10 mL。所有样品均设技术重复三份。
      2. 为实验选择合适孔径的毛细管。
         注意：孔径大小应涵盖共培养体系中最小细胞的尺寸范围，同时也需包含较大的细胞。切勿选择过小的孔径，因为细胞聚集（可能由细胞分裂引起）会导致孔隙堵塞。可用的孔径规格各不相同。例如，直径为45 µm的毛细管可开始检测到直径0.7 µm的细胞。U. maydis 和 S. cerevisiae 3.5 µm-5.5 µm S. elongatus/集胞藻属 sp. 约1-2.5 µm。
   2. 颗粒计数器中的细胞定量
      1. 启动设备。随后，进行自检以进行质量控制（参阅特定设备的使用手册）。
      2. 将样品加入样品杯中，盖紧杯盖，通过轻微倾斜样品杯来混匀样品。
         注意：尽量避免产生泡沫和气泡。每次测量均应使用一个独立的量杯。量杯可清洗后重复使用多次；若量杯内有无法清除的残留物，则应丢弃。若样品在量杯中放置时间较长，测量前需重新混匀。
      3. 由于细胞聚集体可能大于单个细胞，记录范围应设为0-30 µm。
         注意：首先，使用共培养伙伴各自的无菌培养物，以了解细胞的大小，并判断是否可根据其大小进行区分。
      4. 评估后，以相同方法确定共培养体系的组成。
3. 使用单细胞流式细胞术进行共生物群定量
   注意：单细胞流式细胞术是一种高通量方法，可用于确定共培养体系中各共生伙伴的细胞数量，前提是这些共生伙伴可通过其细胞大小/光散射特性或/和荧光信号加以区分。重要的是，在方法建立过程中，需要共培养伙伴的无菌培养物，以分析它们在流式细胞仪中的特性，并相应调整细胞群门控参数。对于携带荧光报告基因的菌株，需使用不携带该荧光报告基因的菌株作为阴性对照。熟悉流式细胞仪的基本应用将有助于成功实施以下实验方案。^{17,18,19,20,21}. 在本示例中，分析了一种由3种微生物组成的人工混合物（参见 代表性结果): 集胞藻属 （表达一种胞质报告荧光蛋白 mVenus）以及两种酵母 S. cerevisiae 和 U. maydis. 为了精确区分 S. cerevisiae 和 U. maydis，荧光标记以细胞质绿色荧光蛋白（GFP）的形式引入（U. maydis 增强型绿色荧光蛋白（eGFP）和红色荧光蛋白（RFP）mKate2（S. cerevisiae 使用基础的分子克隆技术将报告基因（mKate2）进行克隆。如果可能，应优先选择报告基因通过基因组整合的菌株，以避免需要持续施加筛选压力。
   1. 样品制备
      1. 在待分析的特定生长阶段测定菌液的光密度（OD）。
      2. 将样品的OD值调整至适合测量的范围。使用近似的OD₇₅₀ 0.05–0.5（针对蓝藻）和一个OD₆₀₀ 使用新鲜培养基培养酵母，使其OD值达到0.2–1.5（终体积：至少500 µL）。对于共培养，目标OD值为₇₅₀ 介于约0.1至0.5之间，并记录稀释倍数。计算时，使用步骤1.1.3.1中提供的公式。这将确保在10 µL/min的流速下，细胞计数维持在每秒1,000至10,000个细胞的范围内（相当于6,000至60,000个细胞/µL）。
         注意：稀释时可使用无自发荧光和无颗粒的培养基或缓冲液（例如 BG-11）。对于含有复杂成分（如酵母提取物）的培养基需谨慎，因其可能在检测中产生颗粒信号。
      3. 将每种样品细胞悬液各300 µL转移至96孔板中的独立孔内（标准圆底、透明、平底孔）。
         注意：如果使用半自动样品模式而非酶标仪模式，可将0.5–2 mL转移至荧光激活细胞分选（FACS）管中。
   2. 流式细胞术检测
      1. 启动流式细胞仪，并根据制造商说明书运行开机程序和质控（QC）步骤。
      2. 加载（使用板式进样器或半自动取样）并运行样品。首先使用每种共培养组分的无菌培养物作为对照样品，根据各物种的特性进行鉴定，然后对共培养样品中的物种进行分离。
      3. 打开与样本相关的荧光及散射通道（例如前向散射 [FSC] 或侧向散射 [SSC] 高度 [-H] 或面积 [-A]）的点图和/或直方图。
      4. 寻找目标细胞群，并调整阈值以排除培养基中的技术噪声和微小颗粒。
         注意：建议在FSC-H对FSC-宽度或FSC-H对SSC-H散点图中寻找目标细胞群，并将尺度从线性调整为对数，以适用于细菌等小型细胞（通常为1–3 µm）。在FSC-H或SSC-H通道中设置阈值。对于直径小于1 µm的细胞，建议使用405 nm violet激光下的紫色侧向散射光（VSSC）以获得更佳分辨率。
      5. 手动调节每个目标通道的增益至25–2,500范围内。调节增益时，应使阴性对照（例如，未标记荧光标记物的样本）的信号处于1 × 10范围内。²-1 × 10³ 以及阳性对照（例如，使用荧光标记）的范围为 1 x 10⁵-1 × 10⁶ 以获得最佳分离效果并保持在 1 x 10 的范围内¹-1 × 10⁷.
         注意：质控（QC）的标准增益值也可作为良好的参考。
      6. 为确定样品中的细胞浓度，使用记录功能记录固定的样品体积（例如，以10 µL/min的流速记录10 µL）。随后，将针对该体积测得的各细胞群个体计数除以记录的体积，从而获得每微升的细胞数。
         注意：计算培养物/样品中的细胞浓度时，需考虑初始稀释倍数。
   3. 细胞群体的门控/筛选
      注意：无论使用何种设备进行检测，分析和设门均可在流式细胞仪操作软件或商业分析软件中完成，如下文所示。²²此外，使用非专有软件分析流式细胞术数据时，可通过多种开源工具（如FlowCytometryTools）高效完成。²³ 或使用 FlowUtils 的 FlowKit²⁴ Python 中的软件包。本着开放科学的精神，本方案分享了一个示例性的 Jupyter Notebook，展示了如何使用这些软件包进行基础的数据探索。当然，其他替代软件同样适用于执行流式细胞术生物信息学分析。²⁵.
      1. 通过在点图中围绕特定细胞群绘制门控，或在直方图中围绕峰设置分界线或线段来选择特定的细胞群图4).
         注意：程序的自动门控功能可作为参考。
      2. 根据光养生物在光谱红光区域的自发荧光（主要由叶绿素引起）来区分光养型与异养型生物的信号。示例：使用 APC-H 通道的直方图（激发波长（ex.）638 nm，发射波长（em.）660/10 nm），在右侧峰（光养型 = 叶绿素自发荧光阳性群体）与左侧峰/峰群（异养型 = 叶绿素自发荧光阴性群体）之间设置一条垂直分界线（图4A).
         注意：荧光标记也可用于区分同一培养物中的两种（或多种）光合共生伙伴（例如，mVenus用于 集胞藻属).
      3. 根据荧光标记或散射特性（FSC、SSC，若可行）分离两种异养生物。
         注意：基于散射特性的分离仅适用于细胞具有例如不同大小或形态、从而导致散射特性出现可见变化的情况（例如， 集胞藻属：直径约为1.5–3 µm的球形细胞 vs. U. maydis 长形细胞，长度为10 µm，直径约为1-2 µm²⁶).
      4. 示例：使用仅显示“异养”群体的FITC-H通道直方图（激发波长：488 nm，发射波长：525/40 nm），以区分含有GFP的异养细胞（例如， U. maydis eGFP）以及不含GFP的（例如， S. cerevisiae RFP/mKate2) (图4B）。或者，使用PC5.5-H通道（激发：561 nm，发射：710/50 nm）的直方图，仅显示“异养型”种群，以区分含有RFP的异养细胞（例如 S. cerevisiae RFP/mKate2）以及不含RFP的（例如， U. maydis GFP图4C).
         注意：在检测过程中，两种（或多种）不同类型的细胞可能会“粘连”在一起。这些“双细胞团”或“多细胞团”可通过两种荧光标记物的点图轻松识别（例如，利用 APC-H 对 FITC-H 点图识别光养细胞与表达 GFP 标记的异养伴侣细胞的双细胞团）。
      5. 在 Python 中进行基础数据分析，请遵循此 Jupyter 中的说明（https://git.rwth-aachen.de/computational-life-science/cytoflow）。
         注意：本笔记本支持三个数据分析步骤。i）导入数据：导入FCS文件。ii）执行质量控制：检查数据完整性及事件数量。iii）数据可视化：使用直方图、散点图和密度图等图表展示数据。此外，还包含如何通过设门（gating）分离目标细胞群的操作流程。 图4 显示。
         为了便于在长期项目中分析共培养体系，建议研究人员采用上述方法对细胞数量进行计数，并建立标准曲线，以将光密度（OD）值与绝对细胞数量进行比较。光密度是一种相对测量值，其数值可能因物种、菌株、生长条件及分光光度计的不同而有所变化。因此，建立实验室内部的标准曲线对于将OD值准确转换为细胞数量至关重要。

图1：形态可区分细胞的显微定量分析。（A）改进型Neubauer细胞计数室。（B）牛顿环表明专用盖玻片已正确放置。（C）计数室结构示意图，中央腔室具有明确定义的体积，用于细胞计数。（D）所示改进型Neubauer计数室的网格由九个面积为1 mm²的大方格（红色）组成。四个角上的大方格进一步划分为16个小方格（蓝色）。中央的大方格被划分为25个中等方格，每个面积为0.04 mm²（橙色）。每个中等方格又由16个最小的方格（绿色）组成。该图基于公开的制造商资料绘制。请点击此处查看此图的放大版本。

结果

建立光合型 S. elongatus 与异养酵母的共培养体系
我们此前已报道了 Synechococcus elongatus PCC 7942 与多种 S. cerevisiae 亚株共培养的详细结果。有关该蓝细菌-酵母组合共培养结果的全面描述，请参见⁸。为简洁和准确起见，此处不再重复这些结果。简而言之，先前的研究结果表明，建立长期蓝细菌-酵母共培养体系时需考虑若干关键因素。首要问题是酵母在仅由蓝细菌提供固定碳源的条件下存活能力，这在很大程度上取决于酵母菌株利用蔗糖的效率。S. cerevisiae 菌株若经过进化或基因工程改造以更高效地代谢蔗糖^27,28，则更有可能成功过渡到共培养生长模式，在共培养中达到更高的细胞密度，并在长期（数天至数周）共培养实验中表现出更强的稳健性⁸。共培养接种的初始阶段对酵母存活尤为关键，可能是因为培养物稀释、培养基成分转换和/或浓缩碳源撤除所造成的应激。因此，在共培养启动时采取措施缓解从富营养培养基向极低碳供应条件的过渡，可提高实验的性能与重复性（见步骤 1.2.1.1）。此外，当接种至高密度 S. elongatus 培养物时，S. cerevisiae 表现出与高氧应激一致的应激反应，这与产氧光合作用主要副产物 O₂ 的积累相符。因此，防止蓝细菌伙伴过度生长和/或采用交替的“光/暗”光照周期，可显著延长 S. elongatus 在长期共培养中的存活时间。有关共培养体系中相对于无菌对照样本常见的现象的进一步总结，请参见讨论部分。

使用不同方法监测共培养物的生长
下文描述了采用三种不同方法对人工混合的三方共培养体系（包括集胞藻Synechocystis以及两种酵母S. cerevisiae和U. maydis）进行定量分析的示例。在制备混合培养物时，首先测定各单菌培养物的OD₇₅₀（用于蓝细菌）和OD₆₀₀（用于异养生物），并调整至OD值为0.1。随后按照光密度比1:1:1混合单菌培养物（注意：此比例基于光密度，而非细胞计数，参见上文）。为了便于在流式细胞仪中区分两种酵母，实验中使用了基因工程改造的报告菌株：持续表达胞质mKate2荧光蛋白的S. cerevisiae FY1679-O1B²⁹（基因型：URA3Δ/pTDH3::mKate2；菌株：S. cerevisiae mKate2³⁰），以及持续表达eGFP的U. maydis AB33菌株³¹（基因型：pep4Δ/pRpl40::egfp；菌株：U. maydis eGFP³²）。值得注意的是，所用蓝细菌菌株携带一种复制型质粒，可驱动黄色荧光蛋白mVenus的组成型强表达（Synechocystis sp. PCC 6803 pSHDY-Pcpc560-mVenus，菌株Synechocystis mVenus，类似文献³³），此外，该菌株还因含有光合系统而表现出典型的强烈自发荧光。

使用计数板进行显微镜下定量： 所用三种微生物人工混合物中的所有细胞类型均可通过显微镜轻松区分（图2A）：Synechocystis 和 S. cerevisiae 均呈球形细胞，但直径差异显著（Synechocystis：直径约1.5–3 µm，S. cerevisiae：直径约3–6 µm），而 U. maydis 细胞则呈细长的雪茄状形态，长度至少为10 µm（图2A）。这些明确的形态特征使得混合物中每种组分的精确定量成为可能。以一个示例说明，在四个大方格中分别计数到 37、18、36 和 21 个 S. cerevisiae 细胞（图2B），其平均值为28个细胞。由于所用血球计数板的每个大方格面积为1 mm²，计数室深度为0.02 mm，因此相当于每0.02 µL中含有28个细胞。换算后即为1,400 个细胞/µL，相当于1.4 × 10⁶ 个细胞/mL。其他细胞类型也以相同方法进行计数，并计算相应浓度（图2C，表2）。

图 2：由 Synechocystis 以及酵母 S. cerevisiae 和 U. maydis 组成的三物种共培养体系的显微定量分析。（A）指示微生物人工混合后的显微镜相差图像（DIC）。所有物种均可通过其形态轻松区分。比例尺：10 µm。（B）基于OD值为0.1的纯培养物人工混合后菌株的代表性计数结果。分析了网格边缘的四个大方格（见图 1D中的红色标记）。（C）利用四个方格中不同细胞计数的平均值，通过以下公式计算悬浮液中的细胞浓度：平均值/（计数室深度 [0.02 mm] × 计数方格面积 [1 mm²] × 1,000)。请点击此处查看该图的放大版本。

使用颗粒计数器进行定量分析：颗粒计数器可根据颗粒的大小测定悬浮液中颗粒的数量。在本示例数据集中，使用了配备45 µm毛细管的颗粒计数器。S. cerevisiae 和 U. maydis 细胞的尺寸相似，因此在颗粒计数器中无法区分，而较小的 Synechocystis 细胞则可被明显分离。单一种类培养物的分析结果显示，两种酵母在3至6 µm范围内出现位置相同的峰（图3A）。测量过程中施加负压，促使细胞进入毛细管，导致电阻短暂变化，仪器据此变化判断颗粒大小。在混合培养物中可检测到两个明显不同的峰，一个对应较小的蓝细菌细胞，另一个代表两种酵母物种的共同组分（图3B）。值得注意的是，除了反映活细胞的峰外，还在约1 µm处检测到额外的峰（图3），对应细胞碎片和更小的颗粒。信号若出现在比预期更大的直径范围，可能是由细胞聚集所致。需注意，峰的形状反映了细胞的均一性：尖锐的峰表示细胞高度均一，这在共培养体系中不太可能出现。在共培养体系中，若共存的两种生物在尺寸上有明显差异，则预期会出现非常宽的峰，甚至两个独立的峰。对于异养真菌的纯培养物，峰形可能为中等宽度。

图3：使用颗粒计数器对包含Synechocystis mVenus以及酵母S. cerevisiae mKate2和U. maydis eGFP的三元共培养体系进行定量分析。（A）三种菌株各自纯培养物分析的可视化结果，如图所示（使用45 µm毛细管的细胞计数器）。（B）在相同条件下对人工构建的三元共培养体系进行分析的典型可视化输出文件。颗粒计数器无法区分两种酵母物种，二者均表现为第二个峰。请点击此处查看该图的放大版本。

使用单细胞流式细胞术进行定量分析：借助单细胞流式细胞仪，可根据细胞的（自发）荧光和光散射特性轻松区分不同的细胞群体。光合细胞（Synechocystis）与异养细胞（U. maydis 和 S. cerevisiae）可通过光合色素在 APC-H 通道中检测到的红色自发荧光加以区分（图 4A）。在初步区分光合细胞与异养细胞的基础上，可通过 FITC-H 通道中的 eGFP 荧光标记和 PC5.5 通道中的 mKate2 荧光标记进一步区分两种异养细胞群体（图 4B、C）。在显示三个细胞群体散射特性的散点图（FSC-H 与 FSC-Width）中，各群体也可被有效区分，仅存在少量重叠（图 4D）。

采用该方法，取10 µL稀释后的样品以10 µL/min的流速进行分析，可在1分钟内定量约70,000个细胞。其中约60%的细胞属于集胞藻属（Synechocystis）（4.23 × 10⁶ 个细胞/mL），其余40%的细胞则在玉米黑粉菌（U. maydis）（1.35 × 10⁶ 个细胞/mL）和酿酒酵母（S. cerevisiae）（1.36 × 10⁶ 个细胞/mL）之间均等分布（图4E，Table 2）。

图 4：利用单细胞流式细胞术对包含蓝细菌 Synechocystis mVenus 以及酵母 U. maydis eGFP 和 S. cerevisiae mKate2 的三元共培养体系进行定量分析。在流式细胞仪上检测 Synechocystis mVenus（深绿色）、U. maydis eGFP（浅绿色）和 S. cerevisiae mKate2（红色）以 ⅓ OD₇₅₀ / ⅓ OD₆₀₀ / ⅓ OD₆₀₀ 比例组成的混合培养物所获得的示例图：（A）显示所有细胞在 APC-H 通道（激发波长：638 nm，发射波长：660/10 nm）中的事件计数与荧光强度直方图，用于根据自发荧光区分光养细胞与异养细胞；（B）所有异养细胞在 FITC-H 通道（激发波长：488 nm，发射波长：525/40 nm）中的事件计数与荧光强度直方图，用于根据绿色荧光特性区分 U. maydis eGFP 与 S. cerevisiae mKate2 细胞；（C）所有异养细胞在 PC5.5-H 通道（激发波长：561 nm，发射波长：710/50 nm）中的事件计数与荧光强度直方图，用于根据红色荧光特性区分 U. maydis eGFP 与 S. cerevisiae mKate2 细胞；（D）FSC-Width 与 FSC-H 通道散射信号的点图，用于识别无荧光特性的细胞群体；（E）包含事件计数、百分比以及相关荧光通道的算术平均值和标准差（SD）的群体统计结果。细胞总数及其大小和荧光信号在 10 µL 样本体积、流速为 10 µL/min 的条件下测定。请点击此处查看该图的放大版本。

为了比较不同定量方法的结果，以下两个表格（表2 和 表3）列出了测定的细胞数量。使用前述三种方法测定的细胞最终浓度在所有方法中均处于相似范围。细胞计数仪提供的样本量最高，其次是颗粒计数器和显微镜定量，各方法之间大约相差一个数量级。

共培养 1:1:1		分光光度计	流式细胞仪		颗粒计数器		显微镜计数室
生物体		OD750/600	细胞计数	cells/mL	细胞计数	cells/mL	细胞计数	cells/mL
Saccharomyces cerevisiae mKate2		0.0333	13,618	1.36 x 106	1,546*	2.58 x 106*	112	1.40 x 106
Ustilago maydis eGFP		0.0333	13,541	1.35 x 106			89	1.11 x 106
Synechocystis sp. PCC 6803 mVenus		0.0333	42,330	4.23 x 106	3,094	5.16 x 106	271	3.39 x 106

表2：不同定量方法的比较：人工混合培养物。 注意，使用颗粒计数器无法区分U. maydis 和S. cerevisiae（*）。

单培养		分光光度计	流式细胞仪		颗粒计数器		显微镜计数室
生物体		OD750/600	细胞计数	cells/mL	细胞计数	cells/mL	细胞计数	cells/mL
Saccharomyces cerevisiae mKate2		0.1	38,936	3.89 x 106	1,928	3.21 x 106	403	4.03 x 106
Ustilago maydis eGFP		0.1	36,927	3.69 x 106	2,465	4.11 x 106	307	3.07 x 106
Synechocystis sp. PCC 6803 mVenus		0.1	127,864	1.28 x 107	8,186	1.36 x 107	428	1.07 x 107

表3：不同定量方法的比较：使用单一/纯培养物进行校准。

讨论

在实验室环境中，对多种微生物模型进行单一无菌培养的操作已有数十年的历史。然而，尽管自然界中生命的主要形式是微生物群落，但在同一培养容器中组合两种或多种微生物伙伴的技术仍不够成熟，且面临现有知识和方法学上的空白所带来的挑战。预测群落中细胞的行为也更加困难，因为细胞之间会产生 emergent 相互作用和代谢物交换，从而显著影响共培养体系的命运^34,35。因此，建立共培养体系并非易事，涉及培养基的确定、共同生长条件的筛选、种间微量代谢物/信号分子的交换，以及随时间变化的共培养组成等多个层面。近年来，在光合型、分泌糖类的蓝细菌与异养型伙伴的组合构建方面取得的进展，现已能够初步总结出一些规律和方法，为设计新型共培养组合提供有益的指导。基于这些知识，本实验方案的第一部分提供了构建包含蔗糖分泌型蓝细菌与一种或多种酵母的共培养体系的逐步操作指南。

在首次尝试建立非相关微生物共培养体系时，一个关键考虑因素是选择一种共同培养基，以满足两种或多种物种的全部营养需求。由于篇幅限制，此处无法提供该过程的完整详细方案（在某些情况下可能还需要高度定制化），但以下内容概述了需要重点考虑的几个方面。一种直接的初步方法是将典型的蓝细菌培养基（例如BG11；见表1）与目标异养微生物已建立的最小培养基进行比较。将异养型最小培养基中存在但标准蓝细菌培养基中缺失的组分添加至后者中，是初始测试的良好起点^8,36。需要注意的是，由于最小培养基通常添加了较高浓度的有机碳源以支持异养生长（例如1%–4%葡萄糖），其设计往往旨在支持较高的异养菌细胞密度，而这一密度在初期共培养实验中可能难以达到。同样，某些常见的培养基成分本身也可作为有机碳源，独立于蓝细菌伙伴提供的光合产物（例如柠檬酸盐），这可能会使后续对蓝细菌/异养菌共培养体系的分析变得复杂。因此，在设计共培养基时，可能无需以完整浓度补足蓝细菌最小培养基中缺失的所有成分。例如，许多生物对环境中不同形态氮源（如N₂、硝酸盐、亚硝酸盐、尿素）的利用效率各不相同，甚至可能完全无法利用某些高度氧化的氮源。类似地，许多微生物因缺乏合成某些化合物的完整生物合成途径，可能需要额外补充必需维生素（如维生素B₁₂）、辅因子或必需氨基酸。基于上述原因，最实用的策略可能是首先简单地"合并"蓝细菌伙伴的标准最小培养基（例如BG11）与异养菌的明确定义的最小培养基（例如合成定义培养基[SD]）。随后可通过多轮迭代去除或减少冗余成分，以优化培养基并降低可能抑制任一伙伴生长的化合物丰度。一个有效的起始点是将培养基缓冲至中性或微碱性pH，因为大多数模式蓝细菌通常偏好此类条件。

此时，当提供过量蔗糖时，通常有助于对新共培养体系中固定化的异养生物进行初步生长测试。当然，在选择潜在的异养生物时，重要的是挑选能够分解利用由蓝藻伙伴提供的主要有机碳源的菌种。需要指出的是，蔗糖作为许多工程化蓝藻/异养共培养体系中主要提供的碳水化合物⁴，其被异养微生物普遍利用的程度不如葡萄糖：异养物种必须编码特异性的蔗糖转运蛋白，或者可能需要胞外转化酶将蔗糖分解为果糖和葡萄糖，而后者通常可被高亲和力转运蛋白识别⁸。多个研究混合微生物群落的实验室普遍报道的一个重要现象是，光合伙伴与异养伙伴之间会出现高阶的协同或拮抗效应^4,8,13。例如，其他天然分泌的代谢物（如有机酸、还原态氮）或辅因子（如铁载体）可能会使共培养条件下一个或两个伙伴的生长速率高于无菌对照。相反，光合作用中水分解导致的培养基过度氧合等潜在有害代谢副产物，已被报道会引起一个或两个伙伴的种间生长抑制⁸。因此，无菌对照可提供有用的基准，但由于这些涌现性特征的存在，共培养的实际表现可能与预期有所不同。

根据异养伙伴以及 S. elongatus 分泌蔗糖的能力（取决于诱导水平和所用 IPTG 浓度），应测试两种生物的不同比例。共培养的成功主要取决于 S. elongatus 维持异养伙伴生长的能力（即是否能产生足够的碳源）。虽然异养菌株的过度生长通常受限于共培养基中提供的有机碳含量不足，但蓝细菌可能超过异养菌的生长速度，从而导致出现抑制性相互作用（例如过高的氧气条件^8,13）。 在初步确定蓝细菌与酵母之间合适的细胞密度比例时，一个合理的近似原则是：蓝细菌伙伴能够支持与其自身细胞体积相等的异养细胞体积。由于真核酵母的细胞体积通常显著大于模型蔗糖分泌型蓝细菌，这意味着在稳态下蓝细菌的细胞密度可能显著更高（例如，对于 S. cerevisiae 可能高出 50 至 100 倍）。因此，在特定实验室条件和物种背景下建立新的共培养体系时，一个良好的起点是根据文献数据（例如参见 B10NUMB3R5³⁷）计算蓝细菌和酵母的平均细胞体积，以估算其体积比。初始培养瓶可按此细胞比例接种。为了探索最优条件范围，研究人员可保持蓝细菌浓度恒定（例如 OD₇₅₀ = 0.3），同时根据可用的光合培养空间通量，以约一个数量级的幅度逐步调整酵母细胞浓度。当然，这一体积“经验法则”依赖于光合伙伴分泌可被异养伙伴利用的有机光合产物（如蔗糖）的速率。一旦建立了共培养条件，随时间仔细监测两个伙伴的生长表现将提供有关理想物种比例的宝贵数据，特别是当早期共培养体系能够维持数天至数周时，可使研究人员识别出共培养末期达到的稳态比例。这些信息可用于后续实验中选择每种伙伴物种的初始接种密度，从而帮助培养体系更快地达到自适应的理想物种比例。

在实验方案的第二部分，提供了共培养分析的详细说明。对共培养体系进行可靠的定量是其成功实施的关键：光合自养且分泌碳源的伙伴菌的生长（或至少代谢活性）对于维持异养菌的生存至关重要。尽管接种时所用的蓝细菌与异养菌的比例并不总是需要优化（因为长期共培养通常会趋向于稳定的组成比例），但整合一些方法来防止任一伙伴菌不受控地生长仍可能十分重要，例如通过培养物稀释或对一个或多个物种进行包封^36,38,39,40。如上所述，蓝细菌伙伴产生的副产物在高浓度下可能对异养菌具有抑制作用（例如 O₂），而异养代谢的某些产物也可能损害蓝细菌的健康。大多数已发表的共培养体系所采用的异养菌生长速率通常快于大多数模式蓝细菌物种；因此，异养菌的生长速率往往受限于蓝细菌所提供的有机碳供应量。尽管如此，确定随时间变化的物种丰度动态对于揭示稳定性失败的原因，并优化长期培养中稳健的共培养体系具有关键意义。

本文提供了使用计数板、颗粒计数器和单细胞流式细胞术进行定量的实验方案。所有这些技术都是共培养体系表征的有用工具，但各自具有不同的前提条件、优势和局限性。只要培养体系中的所有组分能够通过细胞形态或其他特性在显微镜下被清晰区分，计数板就具有非常广泛的适用性。其最大优势在于设备价格低廉，几乎每个实验室都能配备。除了可以获得共培养体系的组成及各组分比例信息外，还能同时观察细胞的形态特征和生长状态，并检测可能存在的污染物。然而，计数板的使用也非常耗时，工作量大，且通量较低。

颗粒计数器和单细胞流式细胞术均具有高通量以及操作便捷、节省时间的巨大优势。细胞计数依赖于共培养体系中各组分细胞在尺寸上的明显差异，而单细胞流式细胞术还可通过区分荧光标记，实现对包含两个以上相同大小成员的共培养体系，甚至基于不同荧光标记来区分同一生物体的两种不同突变体的定量分析。在所提供的Synechocystis与S. cerevisiae和U. maydis人工组装示例中，利用细胞内荧光报告蛋白mKate2和eGFP来区分两种酵母。相同的荧光报告蛋白也可用于区分同一生物体（例如S. cerevisiae）的两种基因修饰菌株，这些菌株仅依靠其光散射特性无法被区分。类似策略已被用于追踪合成细菌群落⁴¹。根据细胞类型、群落中组分的数量及其潜在的自发荧光范围，荧光标记的选择需格外谨慎，以避免光谱特性的重叠，尤其是考虑到蓝细菌具有自发荧光的特性⁴²。

本文阐述了如何在科学数据的存储、管理和共享方面遵循FAIR 指导原则。FAIR是“可发现（Findable）、可访问（Accessible）、可互操作（Interoperable）和可重用（Reusable）”的缩写⁴³。随着这些原则被越来越广泛地接受，它们有望改变生物研究的格局，推动数据管理与使用朝着更加开放、协作和高效的方向发展。尽管将数据存入注释性研究背景（Annotated Research Context, ARC）⁴⁴可确保可访问性的关键组成部分，但使用开源软件重现数据处理步骤同样至关重要。原始FCS文件存储了流式细胞术实验的数据和元数据（包括激光器和检测器的信息，如波长、滤光片等）⁴⁵。这些文件可在专有软件之外加载和读取，从而实现复杂的数据分析；例如，已有多个工具包支持在Python环境中处理原始数据。所介绍的工具包展示了如何利用Python中众多可用工具包之一，在不依赖专有软件的情况下加载、读取和可视化包含细胞计量数据的原始.fcs文件²³。使用上述开源软件可避免专有软件带来的高昂许可费用，提供对数据处理全过程（如转换、补偿、设门等）的完全控制，并可在同一平台集成多种工具。

将单细胞流式细胞术与细胞分选仪联合使用的一个重要附加优势是，还可通过FACS收集特定类型的细胞。这对于应用各种组学技术深入研究共培养体系中的物种相互作用（如RNA测序或代谢组学）具有极高价值。这类设备明显的缺点是价格昂贵，因此在某些实验室中，此类仪器的可负担性和可及性可能成为明显的限制因素。

有趣的是，对共培养体系中三种伙伴微生物的多种定量方法进行直接比较后发现，不同技术之间的结果具有很好的一致性，表明基于光密度（OD）测量构建的混合体系可通过所有描述的方法进行可靠定量。值得注意的是，蓝细菌的总数量约为两种酵母物种数量的3至4倍，这一现象可能源于蓝细菌细胞尺寸较小。该观察结果与普遍认知相符，即在未校准的情况下，光密度值无法提供实际细胞数量的信息⁴⁶。而两种酵母的计数结果则处于相近水平（表2 和 表3）。此外，与单一种类培养物的定量结果相比表明，这三种方法均为区分不同细胞类型的可靠工具，但颗粒计数器除外，因其未能区分两种酵母物种。

本质上，单细胞流式细胞术应用无疑是监测共培养体系组成的最强大工具，能够实现每秒计数 1,000 至 10,000 个细胞。当共培养的伙伴种类超过两种，或伙伴之间在形态和/或直径上相似时，这一优势尤为明显。值得注意的是，目前存在多种可用于监测共培养体系的替代方法。例如，可通过荧光测定法或微型生物反应器连续追踪荧光标记微生物在共培养中的生长情况⁴⁷。然而，这些方法通常仅限于两种伙伴的共培养，且需要严谨的实验设计，例如在荧光标记物的选择方面。扩增子测序（16S rRNA 测序）及其他与复杂生物信息学分析相结合的高通量测序技术，是表征合成微生物群落的另一种选择^48,49,50。这些技术适用于高通量研究，可用于分析长期培养中已建立的相互作用、进化相关问题，或追踪多种微生物伙伴之间的突变情况。

综上所述，经过合理设计的简化微生物共培养体系提供了一种强大的方法 "自下而上" 一种用于研究物种间动态关系的方法，而这种动态关系在自然界占主导地位的多物种群落中往往更难探究^51,52,53在此提供一种简化的实验方案，可供科学界 readily 采用，以建立和分析新的蓝细菌与异养伙伴的配对组合。显然，要充分利用人工微生物共培养体系可能带来的基础性研究洞见，并确定人工设计的微生物群落是否能够实现文献中常赋予它们的生物技术应用潜力，仍需开展大量研究。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
10x Ph1 物镜	Carl Zeiss AG	46 04 01-9904
525/40 nm 带通滤光片	Beckman Coulter, Inc.	A01-1-0051	FITC 滤光片（用于 488 nm 激光）
660/10 nm 带通滤光片	Beckman Coulter, Inc.	A01-1-0055	APC 通道（用于 638 nm 激光）
710/50 nm 带通滤光片	Beckman Coulter, Inc.	B71092	PC5.5 通道（用于 561 nm 激光）
Multisizer 4e 专用 Accuvettes	Beckman Coulter, Inc.	A35473	带盖样品杯
Multisizer 4e 专用 30 μM 孔径管	Beckman Coulter, Inc.	C92760	毛细管
高压灭菌器	Lab Associates	EQM-ARBP	用于材料灭菌
ROTILABO® 挡板烧瓶，直颈，250 ml	Carl Roth GmbH + Co. KG	LY95.1
BG11 / CoYBG11 组分	不同供应商		参见表 1
瓶顶式无菌过滤器	Sigmaaldrich	Z222593	用于培养基无菌过滤，避免使用高压灭菌
45 µm 毛细管	Omni Life Science	OLS 5651738
CASY 细胞计数仪 TTC 型	Schaerfe Systems
CASY 计数杯	Omni Life Science	OLS 5651794
CASYclean	Omni Life Science	OLS 5651786	清洗液
CASYton 溶液	Omni Life Science	OLS 5651808	等渗溶液
离心管（50 mL）	Sigmaaldrich	CLS430828
CO2	BOC	270182-L	用于供应无菌蓝藻培养物及共培养体系
CONTRAD® 70	Beckman Coulter, Inc.	81911	深度清洁液
盖玻片 20 × 26 × 0.4 mm	VWR International GmbH	631-1190	计数室用盖玻片
比色皿	Sarstedt	67.742
蓝藻 BG-11 淡水培养基溶液	Merck KGaA	C3061
CytExpert 软件 v. 2.6	Beckman Coulter, Inc.		流式细胞仪应用软件
CytoFLEX 鞘液	Beckman Coulter, Inc.	B51503	鞘液
CytoFLEX S 流式细胞仪	Beckman Coulter, Inc.	BE51180
Multisizer 4e 专用 DxH 清洁剂	Beckman Coulter, Inc.	628022	清洗液
Eppendorf 管小型离心机	Labstac	CEN16-15	用于离心少于 2 mL 的培养物
乙醇	Carl Roth GmbH + Co. KG	K928.1
FACS 管	Beckman Coulter, Inc.	2523749	半自动模式用管
FlowClean 清洁剂，500 ml	Beckman Coulter, Inc.	C48093	日常清洁液
量筒	Sigmaaldrich	Z131121	用于培养基配制
HEPPSO	Merck KGaA	R426725
Infors MultiTron 光照培养箱	Infors AG		白色 LED 光源
IPTG	Merck KGaA	I6758	分装保存于 -20°C，使用时融化并置于冰上
Multisizer 4e 专用 Isoton II	Beckman Coulter, Inc.	8448011	等渗溶液
Kaluza v. 2.2	Beckman Coulter, Inc.	B16406	流式细胞术数据分析软件
KimWipes	VWR International GmbH	115-2221	无尘擦拭纸
KOH	Merck KGaA	221473
KPO3	Noah Chemicals	7790-53-6
烧杯	VWR	213-3747
96 孔微量板，滑盖，平底，聚苯乙烯，透明	SARSTEDT AG & Co. KG	82.1581.001
显微镜底座	Carl Zeiss AG	47 09 18-9902/16
显微镜镜体	Carl Zeiss AG	47 30 14
Milli-Q 超纯水系统	Merck Millipore	C85358
Multisizer 4e 颗粒计数器	Beckman Coulter, Inc.	B23005	CASY 细胞计数仪的替代设备
改进型 Neubauer 计数板，深度 0.02 mm	Assistent Germany		计数室
改进型 Neubauer 计数板，深度 0.1 mm	Paul Marienfeld GmbH & Co. KG	640010	计数室
即用型日常质控荧光微球	Beckman Coulter, Inc.	C65719	质控参考标准
SCHOTT 瓶	Dutscher	90347	用于储存
Specord®200 Plus 分光光度计	Analytic Jena GmbH		OD600/750 测定
蔗糖	Merck KGaA	84100
台式大容量离心机	Labstac	CEN18-06R	收集培养物生物量
酵母氮源基础培养基（不含氨基酸，不含硫酸铵）	Thermo Fisher Scientific Inc.	11743014