小鼠固定头部虚拟现实的行为训练流程

摘要

本文描述了在小鼠中常用线性轨道虚拟现实（VR）范式的实验操作流程，并通过测试Y形信号辨别任务，验证了执行复杂VR任务的可行性。

摘要

虚拟现实（VR）结合头部固定技术正越来越多地应用于行为神经科学研究中，因为它能够在头部固定的条件下对小鼠进行复杂的行为检测。这种方法可以在精确记录行为的同时，整合多种需要头部固定以减少神经记录过程中运动相关信号噪声的神经生理学技术。然而，尽管VR的使用日益广泛，关于如何实施该技术的详细方法学报道却十分有限。本研究建立了一种训练方案，通过该方案训练雄性和雌性C57BL/6J小鼠在虚拟线性通道中奔跑，通道长度在多次训练过程中从1-3米逐步增加。在此基础上，本研究进一步探索了小鼠在VR环境中执行复杂行为的可行性，采用Y型迷宫范式进行实验。任务要求小鼠从Y型迷宫的选择点出发，导航至具有黑色墙壁的臂。当小鼠连续两天正确率达到或超过70%时，即进入难度逐渐增加的感觉辨别任务阶段。研究结果提供了有关成功训练小鼠进行VR实验的方法学细节，并证明小鼠具备在Y型迷宫中学习导航的能力。所提出的方法不仅为基于VR的行为检测中的训练时长提供了参考依据，也凸显了在小鼠中探究复杂行为的潜力，为更深入的神经科学研究开辟了新的途径。

引言

由于头部固定技术的出现，虚拟现实任务已成为小鼠行为评估的一种强大方法，这种固定方式提供了机械稳定性，而在自由活动的小鼠中这种稳定性将受到破坏¹。该方法可减少电生理记录^2,3和光学成像^4,5,6,7中的运动伪影，同时有助于实现可重复的行为实验⁸和精确的眼动追踪⁹。在实验装置中，小鼠被固定于一个由气流支撑的球形跑步机上方。该设备支持在虚拟现实环境中对视觉引导行为进行精细探究。当小鼠在跑步机上移动时，其运动与虚拟环境中的导航实现无缝同步，虚拟场景则通过环绕小鼠的屏幕进行视觉呈现。

本研究具有双重目的：解决实验行为神经科学领域内的关键挑战，并推动该领域方法学的进步。首先，尽管虚拟现实（VR）在学术研究中的应用日益广泛^10,11,12，但目前仍缺乏系统性的方法和培训方案，这阻碍了新技术研究者的采用。本研究的主要目标是通过详细描述线性轨道范式中的训练方案来填补这一空白，该范式已在先前的研究中有所展示^13,14,15。本文采用一套 commercially available system 来描述这些操作流程。需要声明的是，这些操作指南包含针对该系统的特定组成部分；然而，关于本方案的普适性讨论，请参见“讨论”部分。本研究旨在阐明行为操作流程、执行这些操作的典型时间线，以及训练小鼠在简单线性轨道上奔跑的成功率。

其次，目前仍缺乏关于在此范式中实施小鼠复杂迷宫任务的详细记录。尽管已有研究开发了大鼠的复杂虚拟检测方法¹¹，但小鼠的视觉敏锐度相对较低¹⁶，在复杂任务中的表现通常较差¹⁷。虽然部分研究已聚焦于特定任务，如证据累积或空间新颖性识别¹⁸，但本研究的重点在于阐明小鼠在虚拟现实环境中参与决策范式所需的训练方法。为应对这一挑战，设计了一项信号辨别任务，要求小鼠仅需学习将奖励臂的颜色/亮度（黑色与白色）与奖励关联起来，具体操作为在Y形迷宫的选择点选择黑色臂，且每次试验中正确臂的位置随机化。该任务旨在促使小鼠与虚拟线索进行交互，并揭示其感知辨别能力。

总之，本研究通过提供在小鼠中使用虚拟现实范式的全面训练方案，并阐明在此框架内进行复杂决策任务的方法学，填补了实验行为神经科学领域的关键空白。通过借鉴以往研究的成果和创新的实验设计，本研究旨在简化研究流程，并推动对行为背后神经机制的理解。下文将深入探讨实验步骤与结果，并对研究发现进行讨论。

方案

所有涉及动物的实验程序均严格遵循国家环境健康科学研究所（NIEHS）动物护理与使用委员会制定的规程，确保符合伦理标准和动物福利指南。本研究采用约8周龄的C57BL/6Tac小鼠。

1. 头部植入杆手术

1. 手术准备
   1. 获取所需数量的小鼠作为研究队列，理想情况下应单独饲养以尽量减少对头杆植入物的干扰，尽管此做法为可选¹⁹。本研究使用了三只雄性和三只雌性小鼠（最初性别平衡，但一只雄性在训练早期因无法在球上奔跑而被排除）
   2. 获取材料表中列出的材料，并根据实验设计的具体要求进行调整。
   3. 获得小鼠后，为其分配个体标识符，并采用尾部纹身或耳部打孔方式以确保明确识别。建立完整的记录日志，系统性记录其体重，以满足限水程序的要求。
2. 麻醉给药
   1. 确保所有手术器械均已备齐，包括合适的注射器、加热垫、金属器械（如镊子、显微剪刀和止血钳）、碘溶液、眼用润滑剂，以及用于盛放生理盐水和过氧化氢的烧杯。为确保无菌条件，需对所有手术设备进行消毒，并使用高压灭菌器对所有手术工具进行灭菌。
   2. 在开始手术前，精确测量小鼠体重，并将加热垫调至34 °C。将所有必要信息记录于所在机构的实验室/手术记录本中。确认氧气和异氟烷气罐储量充足，并核实所有关键材料均已备齐，以保障手术过程不受中断。
   3. 抓握小鼠颈部皮肤，将其放入连接于专为小型动物设计的麻醉蒸发器的鼻罩中，给予4%异氟烷和3 L/min的氧气流速以诱导麻醉。建议使用废气清除装置捕获任何可能有害的废气。
   4. 在小鼠处于鼻罩下时，向其眼部涂抹凡士林眼用兽医软膏，以防止角膜干燥。初始时每只眼睛滴一滴，必要时可重复涂抹。通过定期检查，确保始终维持一层润滑剂覆盖，持续保护眼睛。
   5. 准备手术区域（图1A），剃除小鼠头部将用于固定头杆的颅骨区域毛发。
   6. 将小鼠的门齿固定于立体定位仪鼻罩下方，将氧气流速调整为1 L/min，并通过蒸发器给予1%–2%异氟烷。通过调节阀门，正确切换诱导鼻罩与立体定位仪之间的麻醉气路，确保麻醉气体流通顺畅。伸展小鼠后肢并用力按压脚趾，若足部无反射性回缩反应，则表明麻醉已生效。每15分钟重复一次该测试，并同时检查呼吸情况。
   7. 将手术稳定杆插入小鼠耳道，固定其头部，以最大限度减少手术过程中可能发生的头部移动。
   8. 在进行切口或注射前，使用浸有碘类消毒剂的棉签擦拭已剃毛的头部手术区域，进行灭菌处理。自此阶段起，应佩戴无菌手套以维持无菌环境。
3. 注射给药
   1. 使用25G针头，在头皮手术切口部位皮下注射布比卡因（局部镇痛）10 mg/kg（约每只小鼠0.05 mL ，来自5 mg/mL 溶液）。
   2. 使用25G针头，在肩胛间区一侧皮下注射生理盐水1 mL（用于补水）。
   3. 使用25G针头，在肩胛间区对侧皮下注射布雷诺啡（全身镇痛）1 mg/kg（约每只小鼠0.05 mL，来自0.5 mg/mL溶液）。
4. 暴露颅骨
   1. 使用显微剪刀或手术刀，在颅骨的额缝和鼻间缝上方皮肤做切口，起始于眉脊稍上方，延伸至枕骨切迹后方（图1A）。
   2. 使用止血钳固定左右两侧皮瓣，暴露颅骨。
   3. 使用干燥棉签清除被固定皮瓣之间的头皮结缔组织。
   4. 使用蘸湿（但未饱和）过氧化氢的棉签擦拭头皮，确保缝线清晰可见，同时注意避免过氧化氢接触周围组织。
   5. 重复步骤1.4.3和1.4.4，2至3次，直至前囟（bregma）和后囟（lambda）均清晰可见，且头皮彻底清洁。
5. 手术螺钉植入
   1. 将两枚螺钉固定于颅骨上，一枚置于前囟后方，另一枚置于后囟前方（图1B），以最大化牙科粘合剂的接触面积并增强头杆的稳定性。螺钉位置应设定在距前囟特定距离的目标点上。确保一枚螺钉位于左侧，另一枚位于右侧（即前后方向（AP）+1.00，内外侧方向（ML）-1.00；AP -3.00，ML +3.00），保证两枚螺钉之间留有足够空间以容纳头杆的放置，并根据需要调整坐标。
   2. 钻孔至目标位置，确保钻孔仅限于颅骨骨质，不得穿透脑组织。
   3. 使用螺丝刀将螺钉约一半长度旋入到位，对第二枚螺钉重复相同操作。
6. 安装头杆植入物
   1. 混合牙科水泥，并将其涂抹于头杆底面，重点覆盖凹面区域，同时沿颅骨额缝涂抹。
   2. 将头杆置于额缝上方，以促进头杆上的牙科水泥与缝线处水泥之间的结合。用手在所需角度固定约5分钟，直至固化。根据需要可追加涂抹牙科水泥。（图1C-E）
7. 将皮肤重新覆盖于头杆上
   1. 松开止血钳，使用镊子将两个皮瓣重新覆盖于已固化的牙科水泥固定的头杆上。使用局部组织粘合剂，从切口前部开始至后部结束，缓慢地将头皮左右部分精细粘合在一起。
   2. 等待局部组织粘合剂完全硬化，确认手术区域已重新封闭后，再将小鼠从手术稳定杆和鼻罩中释放。
   3. 将小鼠转移至单独饲养的笼具中，并置于37.5 °C加热垫上。
   4. 密切监测小鼠是否出现不适或呼吸异常迹象，直至其完全恢复意识。在小鼠恢复胸卧位、表现出警觉性并能自主活动前，不得无人看护。
   5. 手术后，让小鼠休息1周。每日监测其体重，及时发现并处理任何显著波动。术后3天内为小鼠提供软食以促进恢复。为防止干扰头杆，应将这些小鼠单独饲养。尽管群养在某些情况下可能可行，并有可能提升动物福利。

2. 限制液体摄入

注意：限水会使小鼠产生渴觉，从而增强其对液体奖励的动机。然而，必须谨慎实施该操作，以确保小鼠的福利得到保障²⁰。

1. 术后1周，测定小鼠的基线体重。
2. 将一个小型培养皿（60 mm × 15 mm）的弧面向下，用胶带固定在笼底；再将一个更小的培养皿（35 mm × 10 mm）弧面向下，用胶带固定在已贴于笼底的培养皿的平坦表面上；最后将另一个小型培养皿（60 mm × 15 mm）弧面向上，用胶带固定在中间培养皿的平坦表面上，作为储水装置图2).
3. 确保上层饲养盒的高度既能防止垫料污染，又能让小鼠方便地接触到水源。使用移液器将每日所需水量加入储水槽中。
4. 第1天，按每100克体重给予15毫升水的剂量提供给小鼠。
5. 第2天，按每100克体重给予10 mL水的剂量为小鼠提供饮水。
6. 第3天，按每100克体重给予5 mL水的剂量提供给小鼠。在整个研究期间，无论体重如何，小鼠每日摄水量应至少达到1 mL。
   注意：研究者可选择对所有受试者施用相同的最小体积，但此类调整应审慎进行。
7. 在整个研究期间保持一致的给水量，即每100克体重给予5毫升水（或根据需要统一给予1毫升水）
   注意：应为小鼠提供 随意摄取 每周让小鼠有 1 至 2 天的饮水时间，尤其是在未进行 VR 实验期间（例如周末），以促进其自然水合水平的恢复。当小鼠体重低于其记录基线体重的 90% 时，应将其转为 随意摄取 在体重降至基线体重的80%以下时，应实施人道安乐死；在体重恢复至基线体重的90%之前，持续提供饮水。
8. 在行为学评估后至少延迟30分钟再给予每日的饮水剂量，以避免干扰动物自然的渴饮行为，确保实验的准确性。
   注意：提供每日的水量配给 训练结束后立即给予饮水可能会无意中影响小鼠的表现，因为它们可能预期无论表现如何都会获得水，从而可能降低对任务的投入程度。 

3. 系统设置

1. 设备熟悉：有关VR行为系统的硬件组件及其他注意事项，请参见以下步骤。
   关于本方案在类似系统设置中的普适性讨论，请参见讨论部分。
   1. 完全沉浸式虚拟显示或穹顶：该虚拟显示系统可为动物提供完全沉浸于可自定义虚拟环境中的体验。虚拟环境中的运动与球形跑步机上的动物运动同步。
   2. 液体奖励系统：液体奖励系统通过蠕动泵输送液体强化物（水或蔗糖水），将奖励溶液经由一根包覆塑料的金属管输送至小鼠口部，当任务成功执行时触发奖励。系统包含传感器，用于监测小鼠在单次试验中获得的奖励量。
      1. 每周使用乙醇或替代清洁剂清洁一次奖励管。操作方法为：像输送液体奖励一样，将2–5 mL清洁剂冲洗通过管道，随后用等体积的水进行同样冲洗。
      2. 实验开始前，通过激活奖励管一段设定时间并测量所释放液体的体积，确定其液体释放速率。此操作可确定蠕动泵的液体输送速率。本研究中采用的释放速率约为0.0083 mL/s。
         注：大多数系统允许编程设定行为执行与奖励释放之间的时间间隔，从而可根据每轮试验预期的奖励体积精确规划实验方案。所用体积被确定为足够有效，因其为小鼠提供了充足的摄取时间，且其体积具有足够的激励作用。
      3. 某些实验方案可能要求小鼠舔舐奖励喷口以启动奖励输送。但在本研究所采用的任务类型中，未启用此功能，奖励仅在成功执行目标行为（例如在Y迷宫中选择正确臂）后自动释放。这有助于避免训练初期因舔舐行为尚未充分建立而导致的失败，提高初始成功率。此外，该设置还可用于测量奖励预期，该指标在某些条件下可与导航表现分离评估¹¹。
      4. 尽管部分采用液体限制的实验选择通过奖励管输送普通水，但本研究在操作性范式中使用蔗糖水（10% 蔗糖 v/v）作为额外的动机刺激。值得注意的是，引入蔗糖水后，在多个实验队列中均观察到表现增强。
   3. 泡沫塑料球：该球体作为球形跑步机使用。通过下方气流支撑，训练小鼠在其表面舒适地奔跑或行走。将其置于配备运动追踪传感器的球托上，以采集行进距离和速度数据。
   4. 头部固定装置：将该装置置于小鼠后方，确保在将头杆固定于装置时，小鼠视线与VR显示系统对齐。该装置对于维持小鼠头部固定至关重要，尤其在与光学成像或电生理技术联用时，可有效减少运动伪影。
   5. 气流硬件：配置压缩空气源向球体输送气流，以形成利于小鼠在球上奔跑的近似失重环境。该系统需配备流量调节器，以精确控制施加于球体的气压。球体在低气流条件下即可高效运行。因此，在系统设置过程中，应确定使球体在支架内实现平稳无阻运动所需的最小气流量。推荐气流范围为10–20 L/min。
2. 软件设置：有关系统操作的具体细节，请参见以下内容。
   ​注：与电子游戏设计类似²¹，虚拟世界架构整合了若干关键要素，包括外部控制器、可编程的可导航环境，以及包含状态图以定义动态功能的计划文件。这些组件协同作用，为参与研究的受试对象提供连贯的交互体验。软件的运行效能依赖于在指定文件夹内精确的文件组织结构。本文将概述填充预设模板所需的主要步骤，以便轻松调整现有文件并另存为新版本，这些新版本将作为研究的基础。
   1. 使用以下三个文件共同配置一个可运行的虚拟环境。
      1. XML文件：该文件格式允许用户调整天空、地面和墙壁等元素的图像纹理。用于图像的文件应放置在VR文件夹的Data子文件夹中。通过这些文件可设定迷宫的尺寸，并确定小鼠在迷宫中的初始位置。还可利用这些文件在迷宫特定节点定义三维物体（视觉线索）。可通过文本编辑器修改这些文件。
      2. XLSX文件：此类文件作为命令文件，将三种文件类型（XML、XLSX和XAML）整合，形成一个连贯且可交互的虚拟呈现系统。通过这些文件可定义控制VR及其附属设备运行的实验程序，例如增益灵敏度、数据提取内容，以及为实验组合哪些文件。
      3. XAML文件：该软件应用程序提供图形界面，通过流程图方式创建实验计划。它支持定义试验的时间参数、试验结束后传送控制，以及在试验框架内数字输出的激活时机。
   2. 在系统运行期间，使用以下应用程序进行数据采集和用户控制。
      1. [application] VR：与显示代表性景观的.XML文件关联，打开该文件可在显示器上以静态模式预览虚拟景观。如需动态交互，请在控制应用程序中打开配对的.XLSX配置文件。
      2. [application] control：与.XLSX文件关联，打开此应用程序可查看系统关联的附属设备。用户可在此手动伸缩奖励管、释放液体奖励，并查看实时数据采集情况。
      3. [application] schedule designer：该应用程序可用于调整XAML文件，以建立实验中事件触发的时间计划。例如，设计可自定义的触发器以确定奖励释放的持续时间，并定义小鼠在试验之间的休息时长。
3. 示例启动流程：首先根据步骤3.2.1.1–3.2.1.3中的可调组件确定研究方案的设计。在明确定义操作性协议后，按照以下步骤打开VR系统预设的模板实验之一。
   1. 打开VR应用程序，程序默认进入Data子文件夹。将创建的虚拟景观保存为XML文件。打开该文件后，虚拟景观应显示在VR显示器上。
   2. 打开Control应用程序，点击屏幕右上角的“打开文件夹”图标。点击图标，将显示Configs文件夹，其中存放有对应的.XLSX实验配置文件。打开与VR应用程序中所打开的.XML文件同名的.XLSX文件。此时，系统附属设备（如可伸缩奖励装置的泵和电机）将在应用程序的控制标签页下可见。
   3. 启动实验试验，这两个应用程序的协同工作将生成一个交互式虚拟环境。最终，该集成系统可实现对关键数据的监控，包括XY平面内的位移数据以及带时间戳的奖励获取记录。
4. 数据采集：从系统中提取最有价值的行为数据，即带时间戳的位置数据和奖励数据。这些数据将分别保存为日志文件。
   1. 位置数据：按以下步骤获取。
      1. 为获取带时间戳的XY位置数据，首先打开目标数据采集迷宫的电子表格文件。在表1中，于A列其他命令下方的任一单元格中输入命令WriteVRAndCamInfoToFile。此后，每次试验结束后，位置数据将自动保存为带日期的CSV文件（文件名为Log files-MM.DD.YYYY_VRandPathPos.csv），并存入configs文件夹。
      2. 试验结束后，关闭Control应用程序，数据将被保存为带日期的CSV文件。该文件将包含当天所有具体数据，因此需手动记录每位受试动物上球和离球的时间。打开文件后，使用Unicode UTF-8字符集导入。A列标记为DateTime，右键点击A标签，选择设置单元格格式，进入“时间”类别，选择MM/DD/YYYY HH:MM:SS格式。此后，所有系统事件将按时间顺序排列，便于进一步数据分析。
   2. 奖励数据：按以下步骤获取。
      1. 泵激活（奖励释放）的数据由系统自动保存为带日期的日志文件，因此无需像位置数据那样输入特定命令。要访问这些数据，请进入configs文件夹中的Log Files子文件夹。
      2. 对奖励数据重复步骤3.4.1中的操作以导出为电子表格文件。打开configs文件夹，选择对应日期的奖励文件（文件名为Corridor-MM.DD.YYYY 或 Corridor_Linear_Run-MM.DD.YYYY）。该文件将提供小鼠获得奖励的具体日期和时间，可用于后续数据分析，具体取决于所采用的实验范式。

4. 行为学任务

注意：根据行为神经科学领域的既定方法，所设计的任务采用基于奖励的关联学习技术。通过即时奖励强化特定行为，利用虚拟现实（VR）的传送功能，可有效训练动物执行重复性任务。在虚拟行为框架中，传送功能使小鼠能够参与任务而无需承受物理操作带来的应激，同时减少了与真实世界类似任务相比所需的准备时间。在训练过程中，实验环境中应使用微弱的红色顶灯照明。由于小鼠对红光的视觉感知敏感性较低，采用红光可减少对小鼠感知虚拟现实（VR）屏幕的潜在干扰，相比之下白光则可能产生更大干扰²²。

1. 习惯化
   1. 在开始液体调控习惯化的同时，也启动对球形跑步机的习惯化，以通过正确时机的生理动机将舔管与奖励关联起来。建议在开始线性轨道训练前进行为期三天的习惯化期。
   2. 第1天^st 当天称重后，对小鼠进行5分钟的抓取操作。在此互动过程中，建议将小鼠置于笼内，轻柔地抓握其头杆植入装置，以使其熟悉此类操作。同时在当天将小鼠带至虚拟现实（VR）设备所在区域，使其提前适应后续实验操作的空间环境。此次初步适应过程与液体调控的起始时间一致，即按每100 mg体重15 mL的剂量进行液体控制。
   3. 第2天^nd 每天，在过渡到按每100 mg体重10 mL液体调节的步骤时，再次对小鼠进行5分钟的操作。在笼内期间持续轻柔抓握头杆数次。将头杆固定于支架上，使小鼠在球形跑步机上适应5–20分钟，可选择在无限循环轨道上进行，或不启动软件程序。此步骤有助于小鼠适应头部固定状态。需预期小鼠在此期间可能出现排泄物，但该现象通常在后续训练中逐渐减少。
   4. 第3天^rd 第1天，即液体调控范式的最后一天（每100 mg体重给予5 mL液体），对小鼠进行5分钟的抓握操作。随后，将其牢固地固定在气垫式球形跑步机上，并通过奖励管引入液体奖励。
      1. 向初次接触舔水嘴的实验小鼠引入该装置时，小鼠起初可能会感到困惑，因此需确保小鼠意识到应从管中饮水。
   5. 在不施加过大外力的情况下，参考下方的小鼠定位指南，根据小鼠与饮水管的相对位置，调整其在球体上的姿势，以确保其能够舒适地获得奖励。开始时，需确认小鼠正在从饮水管中饮水；在限水条件下，当提供可饮用液体时，大多数小鼠会自然地开始饮水。
2. 小鼠的定位
   1. 预定位：在将小鼠放置于球体之前，先将居中的奖励管向前伸出，使其尖端带有一小滴奖励液。在固定小鼠头部前完成奖励管的伸出，以避免小鼠头部固定后因误操作将奖励管过度前伸而造成潜在伤害。将奖励管抬高至球形跑步机上方5–15 mm处，使小鼠需保持自然向前的头部姿势才能舔舐饮水口。
   2. 头部固定：将小鼠置于球形跑步机上，位于操作者惯用手的一侧。然后用操作者的惯用手抓住小鼠的头杆，将其拉向头部固定平台。将头杆放入用于固定的卡槽中，再用操作者的非惯用手将头杆扣紧到位。
   3. 球上的位置： 为每只小鼠在球形跑步机上的位置进行个性化调整，但需确保满足以下要求，以保证其有动机品尝奖励并尽量降低整体应激水平。
      1. 将小鼠的正中矢状面与球形跑步机的中心对齐。当头杆不处于直线状态时，应确保小鼠的正中矢状面（而非头杆）与放置位置的中心对齐。为便于直观理解，参见 图3C.
      2. 确保小鼠的后肢距球形跑步机顶点不超过11 cm，头部位于顶点后方。确保四只脚掌均接触跑步机表面，且小鼠静止时腹部可触及跑步机；这将有助于在球面上形成正常的步态和稳定奔跑。
      3. 当小鼠不进行跑动时，称为球体拒绝。如果小鼠持续处于僵直状态且未尝试跑动，可能表明其存在过度焦虑，研究者可选择将其排除出实验。本研究采用连续5天球体拒绝作为数据排除的定量阈值。
   4. 侧向偏好：小鼠在刚开始适应训练程序时，往往会偏好一侧而非另一侧。这种偏好可能干扰任务表现，因此需注意确保任何侧向偏好并非源于小鼠在球体上的固定方式存在不对称性。本实验所采用的Y迷宫任务要求动物必须同时做出向右和向左的选择，以优化奖励的给予，从而有助于克服侧向偏好。
   5. 奖励吸管：该方法采用一种被称为“轻触法”的轻柔操作，将小鼠引导至伸出的舔管处，使其口腔几乎接触到吸管尖端，从而确保奖励物的准确递送。当小鼠获得奖励时，设定奖励管伸出的持续时间为1秒，以提供充足时间让小鼠完全摄取液滴。应根据每只小鼠个体化调整舔管位置，因为不同小鼠的体型和偏好位置可能存在差异。在所有试验过程中，需确保奖励管位置始终保持居中，以实现舔舐行为的标准化；无论虚拟迷宫设计如何，小鼠始终应在相同的物理位置预期获得奖励。
      ​注意：尽管该持续时间的确定由研究者自行决定，但这些结果表明，此时间范围能够有效促进小鼠在移除管子前完成对奖励物的摄取。 图 3B 展示了一个推荐的放置位置示例。
   6. 线性轨道：与先前采用类似方法的研究一致，使用线性轨道任务来探究两个关键问题：训练小鼠穿越直线通道所需的时间，以及小鼠获取奖励的预期成功率。
      1. 确保小鼠已适应液体限制范式及实验设备。
      2. 每天进行一次30分钟的训练，让小鼠在一条线性虚拟走廊中移动，起始长度为1 m。当小鼠到达走廊末端并获得糖滴奖励后，立即将其传送回起点。
      3. 根据预设标准逐步增加迷宫长度（例如1 m、2 m、3 m）。当小鼠连续2天平均每天每分钟获得2次奖励时，将其推进至下一长度的迷宫图 4A).
      4. 记录小鼠在球形跑步机上运动的距离以及与奖励获取相关的带时间戳数据，每日进行，以供后续分析图4B- D).
      5. 对于在3米线性轨道上平均每分钟获得2次奖励的小鼠，可将其标记为在线性轨道范式中表现熟练。建议在进入需要决策的更复杂行为任务之前，小鼠应达到此阶段。
   7. 需要决策的复杂行为任务（Y迷宫）：本阶段旨在探索从简单行为任务过渡到需要决策的更复杂行为任务的可行性。为实现这一目标，设计一种信号辨别Y迷宫任务。
      1. 在此Y迷宫范式中^23,24确保小鼠行进至一个分叉点，在该点处两条臂以Y形分别向左右两侧各延伸45°。从小鼠出发位置至分叉点之间，关闭旋转功能；当进入决策区域，即两条不同颜色臂的起始区域时，启动旋转功能，使小鼠能够转向其选择的方向。
      2. 进入通向奖励区域的臂后，再次关闭旋转装置。黑色臂代表正确路径，白色臂代表错误路径。使用黑色臂和白色臂作为视觉线索，以适应小鼠视觉敏锐度的潜在局限，因其对比明显、易于区分，有助于以最简单形式考察小鼠对视觉信息的利用。
      3. 训练小鼠朝向黑色臂移动以获取糖水奖励，每次试验结束后将小鼠传送回起始位置。在实验设计中加入奖励位置在左侧与右侧之间的随机化洗牌，确保小鼠将奖励与视觉线索相关联，而非特定的一侧。
      4. 使用与线性通道相同的步骤设置Y迷宫。将Y迷宫实验范式中的进展标准与线性通道保持一致：每次试验持续30分钟，小鼠需连续两天达到预设的奖励阈值。根据以往Y迷宫预实验群体的平均表现，建议将正确获取奖励的比例阈值设定为70%；该数值高于随机水平（50%），且代表了小鼠理解任务难度后可合理达到的水平。图5A).
      5. 到达选择点后，确保小鼠选择正确或错误的臂。在臂的末端，将其传送回起点，以便在30分钟时间范围内重复迷宫实验。
      6. 该方法采用了一种受视觉心理物理学启发的设计，其中迷宫的辨别难度逐步增加。请根据以下描述了解Y迷宫范式的递进过程。
         1. 在初始的Y迷宫中，在迷宫的选择点处呈现纯黑色和纯白色的臂。如果小鼠在连续两天内有70%的试验中正确选择了黑色臂，则将其推进到下一阶段，进行难度逐渐增加的辨别任务。为实现这一目标，每提升一个阶段，就在每个臂中逐步增加10%的对比色。例如，将白色臂变为由90%白色和10%黑色组成，黑色臂 likewise 变为90%黑色和10%白色，从而使每次进阶后的辨别任务更具挑战性。
            注意：增加对比度的设想是，如果能达到50%的黑白比例，则可作为有效对照，因为此时小鼠的两条臂将无法区分。然而，小鼠在视觉上能够分辨的最接近比例为80%:20%（图5B).

结果

本初步研究旨在概述小鼠在两种不同任务中进行高效训练的方法：简单通道任务和复杂决策任务（Y迷宫视觉辨别任务）。这些数据为建立虚拟现实环境中行为训练的时间指导方案提供了基础。

操作步骤从图1中所示的头杆手术植入开始。该植入物用于在行为学评估期间稳定小鼠颅骨，从而提高神经记录的精确性，尤其是在与电生理学或成像技术联合使用时。

图2 和 图3 展示了实验系统的硬件组件及装置布局。图2 详细描述了采用培养皿喷泉法的供水系统。该方法包括将一个60 mm × 15 mm的培养皿凹面朝下固定在笼底，在较大培养皿中心位置将一个较小的35 mm × 10 mm培养皿凹面朝下固定，并在小培养皿上方放置另一个60 mm × 15 mm培养皿，凹面朝上，作为储水装置。上层培养皿的高度经过精确调整，以防止垫料污染，同时确保小鼠能够方便地获取饮水。

图3展示了系统硬件及小鼠定位指南。图3A为虚拟现实（VR）装置示意图，包含一个六屏阵列，中央放置球形跑步机。图3B显示小鼠在跑步机上的最佳放置位置，头部保持自然姿态，四肢均与表面接触。图3C比较了相对于头夹的正确与错误的小鼠放置方式，强调应使小鼠的正中矢状面居中，而非与头夹本身对齐。

图4以折线图形式展示了奖励获取曲线，说明了在虚拟现实环境中，根据预设的进展参数，小鼠在1米、2米和3米狭窄走廊中预期的学习周期。该图显示了小鼠在不同轨道长度下的平均速度，随着任务难度增加，速度逐步提升，表明小鼠在任务学习和表现上持续进步。此外，还展示了柱状图，分别呈现小鼠达到线性轨道任务标准所需的平均天数，以及各轨道长度对应的平均速度。随后，展示了小鼠学习线性轨道任务的各个渐进阶段。这些任务的设计旨在复现学术文献中已建立的方法，同时确保学习曲线对小鼠而言切实可行，从而促进其顺利通过各个阶段。

最后，图5提供了与Y型迷宫任务相关的数据。该图展示了任务的渐进性质，最初阶段为对纯黑色和纯白色臂进行简单辨别。这一初始阶段作为基础步骤，用于确立小鼠区分对比性视觉线索的能力。任务的后续阶段通过在每个臂中逐步增加对比色的百分比，引入更高的复杂性，从而进一步挑战小鼠的辨别能力。任务难度的逐步提升体现在从纯黑和纯白臂过渡到由90%一种颜色和10%另一种颜色组成的臂。值得注意的是，图5所示数据表明，尽管辨别准确率随着任务层级的推进而提高，但部分小鼠始终表现出视觉辨别能力的阈值，最高仅能达到80%/20%的白/黑辨别水平。这一观察结果凸显了小鼠在Y型迷宫任务中视觉辨别能力的内在局限性，为评估该任务的可行性以及受试动物的认知能力提供了有价值的见解。随后，详细描述了Y型迷宫轨道任务的渐进阶段，这些阶段的设计与文献中既定的方法学保持一致。这些阶段确保了小鼠具有可行的学习曲线，支持其逐步完成各层级任务。

图 1：头杆植入手术操作说明。 （A）在小鼠颅骨上标记切口位置。（B）螺钉应植入冠状缝左侧1 mm处，略低于前囟；另一枚螺钉植入冠状缝右侧3 mm处，略高于人字缝。（C）头杆应沿冠状缝放置。（D）在头杆植入物上涂抹牙科水泥。（E）涂抹牙科水泥后头杆的实际外观。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：使用培养皿喷泉法的供水系统。将一个 60 mm × 15 mm 的培养皿凹面朝下固定在笼底。在一个较大的培养皿中央放置一个较小的 35 mm × 10 mm 培养皿，并在上方再倒置一个凹面朝上的 60 mm × 15 mm 培养皿作为储水槽。该装置可确保水不被垫料污染，同时便于小鼠接触饮水。请点击此处查看该图的放大版本。

图 3：系统硬件及小鼠放置位置示意图。（A）显示所使用的虚拟现实（VR）装置。采用六屏幕设置，球形跑步机置于中央。（B）小鼠在球形跑步机上理想位置的侧视图。小鼠头部处于自然位置，四肢均位于球形跑步机上。（C）从头顶方向观察小鼠相对于头夹的正确与错误放置方式。正确放置时，应以小鼠的正中矢状面为中心，而非头夹本身。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：线性轨迹数据。（A）所示数据表示在每次30分钟试验期间每天获得的奖励数量。当小鼠连续两天平均每分钟获得2次奖励（总计60次奖励，达到阈值）后，即进入更长的轨迹长度。（B）随着小鼠在任务中熟练度的提高，其移动速度逐渐增加，表明奖励强化具有显著效果。该图展示了每只小鼠在轨迹上每日平均速度（单位：cm/s），反映出学习行为的线性进展。（C）该柱状图显示了每只小鼠在不同轨迹长度上达到熟练所需的时间，并标出了各轨迹长度对应的均值及标准误差。（D）该柱状图展示了每只小鼠在不同轨迹长度下每日平均速度的均值与标准误差。近乎线性的增长趋势表明奔跑速度通过学习得到了提升。（E）此图说明线性轨迹任务的递进过程：在进入更长版本的迷宫前，需连续两个试验日达到60次奖励。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 5：Y迷宫实验数据。（A）显示小鼠在Y迷宫训练不同阶段获得奖励的分布情况。本分析仅针对完成线性轨道所有阶段的四只小鼠的子集进行，从而确保雄性和雌性参与者均得到公平代表。（B）此图示展示了Y迷宫任务的各个阶段，小鼠在连续两天正确选择率达到70%时进入下一阶段。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本研究采用综合方法探究小鼠在虚拟现实（VR）环境中的行为反应，重点介绍手术操作、液体限制方案、系统设置以及行为任务的实施。这些发现通过提供详细的实验步骤、训练时间框架和成功率，为该领域做出贡献。这将有助于更有效地在小鼠中应用VR实验流程，并为有意在研究中采用该技术的实验室提供规划与实施支持。

头部固定条的手术植入对于在虚拟现实环境中开展头部固定行为学实验至关重要。通过严格遵循既定操作规程并提供适当的术后护理，可确保头部固定条成功整合，同时将对动物健康和行为的不利影响降至最低。此外，实施液体限制方案以调控小鼠的饮水量，维持其水分水平和渴觉状态。逐步适应过程以及定期提供饮水对于保障动物福利并顺利开展行为学任务至关重要。

VR行为系统的搭建涉及硬件与软件组件的整合，以构建供小鼠使用的沉浸式虚拟环境。通过采用完全沉浸式虚拟显示、液体奖励系统、泡沫聚苯乙烯球作为球形跑步机，以及头部固定装置，实现了对实验条件和数据采集的精确控制。行为学任务包括线性轨道和Y迷宫范式，经过精心设计，用于研究小鼠行为的关键方面，如运动、决策和奖赏处理。

尽管已尽最大努力优化实验流程，研究过程中仍遇到了若干挑战。个体小鼠反应的差异性以及与硬件和软件集成相关的技术问题，给数据采集与分析带来了困难。此外，实验依赖于液体限制方案，因此必须仔细监测动物的水合状态，并相应调整实验程序。有时，小鼠在被放置于球体上时会出现挣扎、不从奖励出口饮水、或僵直不动且无法在球上奔跑的情况。尽管其中一些问题可能是暂时的，但仍必须密切监测小鼠，以确保其未遭遇影响进展的障碍。对于相较于同龄小鼠未能表现出进步的小鼠，应将其从研究中剔除。一项类似实验中，55只小鼠中有4只因无法学会实验范式而被移除²⁵。对于连续5天在球上表现出持续不动的小鼠，在对其体重、饮水时接触奖励出口的能力以及在球上的体位进行了全面评估以确认无潜在健康问题后，将其排除出研究。在此类情况下，研究人员需自行判断采取何种策略以高效恢复实验进程。

这些训练方案旨在逐步增加小鼠的认知挑战，同时确保其能够熟练执行行为学任务。从小鼠在直线轨道训练过渡到Y迷宫范式的标准，取决于其是否达到预定的绩效阈值，例如连续多天成功完成试验并获取奖励。通过实施严格的训练方案，我们能够评估小鼠的行为能力及其对日益复杂任务的适应性。这些经过精心设计的训练流程为行为神经科学研究领域的研究人员提供了坚实的框架，系统性地指导实验动物的训练与评估。通过明确设定进阶标准，研究人员可高效地衡量实验对象的学习曲线，并据此优化训练范式。此外，该方法学策略有助于提升实验间的可重复性与标准化水平，促进跨研究的比较分析，推动对动物模型中认知过程与学习机制的深入理解。

在为小鼠设计虚拟现实（VR）实验范式时，必须认识到在任务复杂性和训练进程方面存在多种可选方法。本方案提供了一个构建实验设计的广泛框架，但具体细节（如奖励传递、偏差控制、刺激类型、任务进程和系统参数）仍需研究者根据研究需求进行定制。例如，某些研究采用更为简化的策略，专注于让动物立即参与任务。Krumin 等人的研究即为一例，他们实施了一种单一且一致的T型迷宫任务，而非在不同任务之间采用渐进式学习方案。相比之下，其他研究则提供了更多样化的试验设计要素，例如刺激强化策略和听觉提示。该研究将听觉反馈作为错误试验的惩罚，并仅以水作为正确试验的奖励²⁶。相反，Zhao 等人则使用10%蔗糖溶液作为正确试验的奖励，且未对错误试验施加任何形式的惩罚²⁷。他们转而通过反偏差训练等方法来减少错误反应，例如增加线索方向相对于动物先前选择发生切换的概率，并调整每日供水量以增强动物动机。实验设计上的差异（例如任务全程是否存在空间线索）可能导致对神经编码的不同解释。Zhao 等人发现后顶叶皮层细胞的选择性可由运动轨迹和空间偏好解释，而 Harvey 等人观察到的是与选择相关的激活序列，两者形成对比^27,28。需要指出的是，所使用的特定硬件包括六块LCD显示器、可伸缩舔管和气垫式泡沫塑料球跑步机。不同实验室之间的虚拟现实系统存在多种差异，包括使用投影仪²⁹还是计算机显示器、非球形跑步机³⁰，以及固定式¹⁰还是可伸缩舔管。

综上所述，本研究为小鼠在虚拟现实环境中的行为反应提供了有价值的见解，并证明了利用沉浸式技术研究复杂行为的可行性。未来的研究工作可聚焦于优化实验方案、探索决策过程背后的神经机制，以及将研究成果转化为临床应用。通过持续深入理解小鼠行为，科学家可进一步阐明健康与疾病状态下复杂行为背后的神经环路和认知过程。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
2.4 mm 螺钉 (00-96 X 3/32)	Protech International	8L0X3905202F	用于增强头杆稳定性
布比卡因	Hospira	NDC:0409-1162-19	局部麻醉剂
丁丙诺啡	Wedgewood Pharmaceuticals	SKU: BUPREN-INJ010VC	镇痛
剃毛推剪	Wahl	1565q	用于剃除手术区域毛发
钻孔与微注射机器人	Neurostar	17129-IDA	立体定向系统
GLUture	Zoetis	32046	外科粘合剂
头杆植入物	Luigs-Neumann	130060	小鼠头颅植入物
加热垫 (Lectro-Kennel)	K&H Manufacturing	100212933	术后保温
止血钳	World Precision Instruments	501291	外科工具
过氧化氢	Swam	L0003648FB	清洁剂
异氟烷	Dechra	B230008	外科吸入性麻醉剂
异氟烷/氧气输送装置（带鼻罩）	Eagle Eye Anesthesia Inc.	Model 50 Anesthesia	外科设备
Metabond	Parkell	CB-S380	粘接水泥
显微剪刀	Fine Science Tools	15000-08	外科工具
氧气	Praxair	UN1072	外科用氧
聚维酮碘棉签棒	Dynarex	g172095-05	外科工具
生理盐水	Hospira	NDC:0409-1966-02	水合剂
无菌棉签（Q-tips）	Puritan	25-806 2WC	外科工具
蔗糖	Fisher Chemical	CAS 57-50-1	主要强化物/动机/奖励物
镊子	World Precision Instruments	504505	外科工具
虚拟现实系统	PhenoSys	JetBall-TFT	JetBall 是一种气垫式球形跑步机，可使动物在投影于周围六个显示器上的虚拟世界中自由移动。
白色石油脂润滑眼膏	AACE Pharmaceuticals	NDC:71406-124-35	眼用润滑膏