低成本聚对苯二甲酸乙二醇酯层压微流控设计用于多重斑马鱼成像

摘要

一种利用聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）层压技术制备微流控器件的创新方法，显著降低了对多个活体斑马鱼胚胎进行捕获和成像的成本与复杂性。

摘要

斑马鱼胚胎具有透明特性，因此特别适用于对伤口愈合和免疫细胞迁移等基本生命过程进行无创活体成像。微流控装置可用于固定多细胞生物体（包括斑马鱼），以支持长期成像。然而，采用软光刻技术制备此类装置需要专业的设备以及3D打印技术能力，而这些条件并非所有实验室都能具备。我们对先前开发的一种低成本聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）层压法进行了改进，用于构建微流控装置，该方法显著降低了技术门槛，使更多实验室能够实现装置的设计、制作与迭代优化。我们利用该方法制造了一种名为“用于斑马鱼后续愈合成像的旋转辅助装置”（RADISH）的设备，可同时对四个胚胎进行药物处理、人工造伤以及长期共聚焦成像，且所有胚胎均位于同一视野范围内。借助这一新设计，我们成功记录了多个胚胎在激光消融和人工横切损伤后2小时内伤口周围钙离子 信号的整体形态学特征，并实现了对中性粒细胞向伤口边缘募集过程长达24小时的动态观察。

引言

从单个细胞到多种组织，每个生物体在各个尺度上能否对损伤做出充分反应，对其生存至关重要。因此，创伤及其相关反应（例如吞噬细胞向受损区域的募集¹）是细胞与组织生物学中的重要研究课题。组织屏障一旦被破坏，创伤即被立即感知，并引发涉及伤口收缩^2,3的组织梯度反应，从而协调伤口愈合及后续再生⁴。由于这种收缩具有力学性质，实验过程中所使用的工具不得物理阻碍损伤部位附近细胞的运动。

斑马鱼胚胎是研究发育和疾病（包括脊椎动物伤口反应）的优良模型，这得益于其易于饲养、遗传操作简便以及光学透明性^5,6。然而，若要研究损伤部位附近细胞的长期行为，则需要对整个生物体进行长时间固定。将胚胎包埋于低熔点琼脂糖中虽足以实现未损伤组织的短期成像，但周围的凝胶基质会限制伤口的收缩与舒张，并随时间推移阻碍胚胎的正常发育^7,8,9。

微流控装置可在斑马鱼胚胎的不同发育阶段将其固定^{10,11,12,13,14,15,16}，以及一些如 zWEDGI⁷，可适应手动划痕。然而，现有装置设计存在若干缺点。例如，许多直接打印在塑料上的装置由于光学透明度差，无法与倒置显微镜系统的成像兼容。此外，平行通道虽可实现多位置成像^10,11，但显微镜载物台的物理移动会引入图像采集的延迟。反复迭代和优化以解决这些问题的是 考虑到每次新设计所需的财务和技术投入，尤其是当前使用聚二甲基硅氧烷（PDMS）软光刻技术进行器件制备的金标准方法，这一过程尤为困难。第一步——制作母模，通常就需要掌握3D建模软件知识、能够使用专用加工设备，并且（取决于所用材料）在模具投入使用前还需进行额外的防粘处理，例如硅烷化。PDMS浇注后固化至少需要在高温下进行一小时，且通常需在真空环境或使用夹具以获得最佳效果，整个过程一般还需在洁净室中完成。^7,17,18与发育生物学中类似，对于需要在多个模型中创建大量独特微流控环境的实验而言，这些成本可能迅速变得难以承受。

在现有的替代建筑材料中，聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）具有耐用、无毒且易于加工的优点。PET片材是一种广泛可得的塑料覆膜袋，大多数办公用品商店均有销售，其表面已预先涂布热活化胶粘剂（通常为乙烯-醋酸乙烯酯共聚物）。通过市售的手工切割仪（即为家庭手工爱好者设计的计算机控制切割绘图仪）对PET 片材进行塑形，并使用标准的热压覆膜设备将各层粘合在一起，可快速生成并迭代多种设计。因此，我们改进了一种先前报道的基于堆叠PET¹⁸的设计与构建方法，开发出用于斑马鱼伤口愈合成像的旋转辅助装置（Rotational Assistant for Danio Imaging of Subsequent Healing, RADISH）（图1A，B）。该装置采用多个近似楔形的限制性通道呈旋转排列，可在保证胚胎紧密排列的同时，为手动截断尾鳍操作留出空间，从而实现在损伤后立即进行成像，并在同一视野内对多个受伤的斑马鱼胚胎进行同步长期成像。此外，这种构建方法 显著 降低 了设备制作的前期资本投入和所需时间，同时保持了装置的可重复使用性。

方案

本研究使用受精后3天（dpf）的胚胎，但也可设计为使用受精后2-14天（dpf）的胚胎。斑马鱼实验遵循国际公认的标准进行。动物护理与使用方案已获普渡大学动物护理与使用委员会（PACUC）批准，符合美国国立卫生研究院（NIH）内部研究计划中使用斑马鱼的指南（方案编号：1401001018）。

1. PET 微流控装置的组装

注意：本方案的任何步骤均可随时暂停，但步骤 1.8 和 1.9 除外，这两个步骤对氰基丙烯酸酯的干燥时间较为敏感。

1. 在所选软件中设计装置的图案（例如 Adobe Illustrator，图1A）。根据胚胎的发育阶段和大小，调整通道宽度以及中央成像室的尺寸，以获得最佳适配效果。
   1. 将每一层保存为具有相同尺寸的独立图像文件。为每个文件命名，以便明确所用板材的厚度及组装顺序。
2. 按照制造商说明启动切割机。
3. 将每个设计图案上传至切割设计软件。
   1. 在设计工作区中选择新上传的设计。将计划用于相同厚度 PET 板材的图案组合在一起进行同一次切割（图2A）。如有必要，在设计软件中重新调整图案尺寸至正确大小。
   2. 确认切割图案的数量和类型，然后选择 切割材料。
      注意：PET 板材可能未在设计软件中列为可选材料，包括“塑封膜”等名称 "。可选择任何厚度和质地相似的材料替代（例如透明胶片或非粘性乙烯基材料）"。
   3. 将 PET 板材贴附到切割垫上，用力按压以去除气泡，然后将垫子装入切割机。按照屏幕提示操作，启动切割程序。
   4. 从切割垫上取下已完成的切割件。如有需要，使用美工刀或手术刀片对切割图案进行微调。
      注意：用于创建 RADISH 设计的图像文件（图1A）可下载为矢量图和 PNG 格式文件（补充文件1）。如果切割机出现抬升、撕裂或未能完全切透 PET 板材的情况，建议更换切割垫。 
4. 将各层在盖玻片上对齐，可借助预切割的定位标记或无需辅助直接对齐。若多个层可在层压前同时固定，则应同时对齐。 
5. 使用办公胶带固定各层，防止层压过程中发生移位（图2B）。根据装置尺寸和覆膜机容量，可将小型设计用更多胶带固定在较大背板上，以避免堵塞或卡住覆膜机进料口（图2C）。
   注意：层压过程中使用的背板与切割垫不同，其主要作用是为覆膜机提供摩擦力。任何厚度可忽略且耐热的材料均可作为背板使用（包括但不限于卡纸、折叠的打印纸或更大的 PET 板材）。
6. 打开覆膜机，并按照制造商说明进行覆膜。在对齐下一层之前，移除办公胶带（图2D）。
7. 重复步骤 1.4 至 1.6，直至所有层均已粘合完成。
8. 使用氰基丙烯酸酯胶水将装置固定在已钻有 ¾" 孔的 35 mm 培养皿上（图2E、F）。根据实验需求调整培养皿的形状和类型（例如任何足以容纳该装置的容器——24 孔板中的单个孔或更大的培养皿）。使用足量胶水将装置完全密封于培养皿上，但避免胶水溢出淹没装置。
   注意：将装置固定于承载皿并非其功能所必需。警告：氰基丙烯酸酯可在数秒内粘合皮肤和眼睛，并对呼吸系统、眼睛和皮肤产生刺激。操作时应佩戴手部和眼部防护装备，并在通风良好的环境中进行。
9. 通过在装置外边缘充分涂覆氰基丙烯酸酯胶水，对 PET 层压材料进行防水处理（图2F）。使用足量胶水完全覆盖外边缘。使用前至少静置 2 小时使其充分固化。
   注意：确保氰基丙烯酸酯挥发物有足够的空间排出。 挥发物积聚可能导致胶水沉积在装置表面，遮蔽光学透明材料。

2. 将胚胎置于 RADISH 装置中的位置确定及成像前准备

1. 在标准的胚胎培养液 E3 中培养斑马鱼胚胎¹⁹。如有需要，应在成像前至少 1 小时去除胚胎的绒毛膜，以使其展平。本实验使用 3 dpf 的胚胎，但胚胎可长达 14 dpf（图 1E）。
2. 根据实验需求对胚胎进行染色或处理。
   注意：在本实验中，相关样本的外上皮层细胞膜通过孵育 100 nM MemGlow 560 进行染色。
3. 使用 164 mg/L 的 MS-222 对胚胎进行麻醉²⁰。
   注意：所用麻醉剂的具体浓度可根据实验者的偏好进行调整。在长时间成像过程中，可降低麻醉剂浓度以保证胚胎的正常发育（见步骤 4.1）。
4. 向装有固定装置的培养皿中加入 5 mL 含 164 mg/L MS-222 的 E3 溶液。
5. 使用移液器将一只麻醉后的胚胎转移至装置的每个固定腔室中。确保在整个成像过程中胚胎始终浸没在液体中。
   注意：RADISH 装置可固定 1–4 只胚胎。
6. 使用毛发环调整胚胎方向，使胚胎的尾部伸入中央成像腔室，而卵黄则牢固地固定在楔形通道内（图 1C）。
   注意：为便于操作，可在体视显微镜下进行胚胎的定向。
7. 如需要，可使用微量移液器向固定腔室中加入 1.5% 低熔点琼脂糖，以固定胚胎头部。
8. 将装有胚胎的装置转移至所选的成像系统，开始成像。

3. 损伤后钙瞬变的成像

注意：本节和第4节为可选内容，仅作为潜在的示例实验提供。

1. 选择合适的成像系统和物镜。
   注意：此处使用的倒置激光扫描共聚焦显微镜配备有20倍物镜。
2. 调整样本焦距和成像参数（例如， 激光功率：5, 增益：90, 针孔大小：2 AU，曝光时间[扫描速度：1 帧/秒以获得最佳的信噪比和采集速度。
   注意：建议对样本进行预聚焦，并调整所选成像系统各通道的参数 在造伤前 缩短伤口形成与图像采集之间的时间间隔。
3. 伤口 Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) × (cdh1-dTomato)^xt1821,22 胚胎
   1. 在体视显微镜下，用手术刀片在脊索末端的尾鳍组织处施加压力，通过手动横切法对胚胎进行损伤视频 1），然后将设备放回载物台。
      注意：使用手术刀片时压力过大可能导致下方玻璃破裂。若玻璃破裂，请丢弃该装置并从步骤1.2重新开始。
   2. 通过激光刺激对胚胎进行损伤时，在尾鳍褶边缘附近定义一个感兴趣区域（ROI），并根据可用的激光功率进行刺激。
      注意：此处， 激光功率 的 2.4 W 用于 30 s 在 800 nm 足以诱导全层伤口形成。
4. 室温下成像 GFP （激发波长488 nm，发射波长510 nm）和 RFP （激发561 nm，发射610 nm）通道，使用 帧间隔 的 1 分钟 共计 1 小时。
5. （可选）：如有必要，可使用移液管在胚胎头部附近轻轻抽吸，或轻轻晃动培养皿，以释放胚胎便于成像后回收。

4. 损伤后中性粒细胞募集的成像

1. 成像前至少 1 小时，将胚胎转移至含有半标准浓度麻醉剂的 E3 溶液中，此处为 82 mg/L MS-222。
2. 选择合适的成像物镜（本实验使用配备 10 倍物镜的倒置激光扫描共聚焦显微镜）。
3. 调整样本焦距和成像参数（例如，激光功率：5，增益：90，针孔大小：2 AU， 曝光时间 [扫描速度：0.5 帧/秒]），以获得最佳信噪比和采集速度。
   注意：建议在造伤前预先对样本进行调焦，并调整所选成像系统各通道的参数，以减少损伤形成与图像采集之间的延迟。
4. 在体视显微镜下，通过手术刀片对尾鳍组织施加压力进行手动横切，对四个 Tol2(mpx:Dendra2)²³ 胚胎实施损伤，然后将装置放回载物台。
5. 在室温下，使用5 分钟帧间隔，持续24 小时，在GFP （激发波长 488 nm，发射波长 510 nm）通道上采集图像。
6. 如有必要，成像后可通过移液管在胚胎头部附近施加轻微吸力，或轻轻旋转培养皿，释放胚胎以便回收。

结果

为了比较使用与不使用RADISH装置时激光扫描共聚焦显微镜所获得的图像质量，对在外层上皮细胞中表达强度型钙离子生物传感器GCaMP6f^22,24的胚胎用MemGlow 560进行染色，并采用倒置激光扫描共聚焦显微镜对尾鳍褶全层进行成像，每帧图像的时间间隔为1分钟（视频2）。在未使用该装置的情况下（图3A），样品发生显著漂移，并出现条带状伪影；这是由于为了满足指定的时间分辨率，Z轴堆栈被限制为仅25层，而使用该装置时则无此限制（图3B）。进一步利用RADISH装置对表达Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) x (cdh1-dTomato)^xt1821的胚胎在损伤后立即发生的钙瞬变进行观察，其中内源性E-钙黏蛋白以红色标记，上皮顶端细胞质中的钙信号以绿色显示。通过手术刀片沿中央腔室两侧平行划伤（图4A和视频3），或使用红外激光直接进行激光消融（图4B）对胚胎造成损伤，随后对尾鳍褶的完整厚度进行成像。

为了验证RADISH在长期成像中的有效性，我们研究了伤口边缘在损伤后24小时内免疫细胞的募集情况。选取4只在3 dpf时表达Tol2(mpx:Dendra2)以将中性粒细胞标记为绿色²³的斑马鱼胚胎，通过尾部横切造成损伤，并连续成像24小时（图5）。通常在3 dpf晚期至4 dpf胚胎中出现的成像伪影（如倾斜和漂浮）在此实验中明显不存在（视频4），且组织再生在整个实验过程中持续顺利进行。中性粒细胞向伤口边缘的募集在整个成像期间持续存在（图5B），大多数迁移细胞在损伤后24小时离开伤口区域（图5C），这与预期的炎症消退过程一致^25,26。

图1：PET层压微流控装置（RADISH）的设计与使用。（A）示意图，展示各PET层的排列与厚度、装置的组装方式以及安装和使用方法。（B）最终产品，安装在35 mm培养皿中¾"的切口内。（C）3 dpf胚胎，（D）5 dpf胚胎，（E）装置内培养的14 dpf胚胎。比例尺 = 1,000 µm（C、D、E）。缩写：PET = polyethylene terephthalate；RADISH = Rotational Assistant for Danio Imaging of Subsequent Healing；dpf = days post fertilization。请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：PET 装置组装的分步图示。（A）层压前的单个 PET 层。（B）使用办公胶带将 PET 层固定在 25 mm 盖玻片上。（C）正在制作中的装置固定在塑料背板上以进行层压。（D）完成的 PET 层压装置。（E）安装装置前经过改装的 35 mm 培养皿。（F）完成的装置。缩写：PET = polyethylene terephthalate。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：在RADISH设计中，3 dpf胚胎激光扫描共聚焦图像质量的提升。（A）未使用RADISH的3 dpf Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) 胚胎经MemGlow 560染色的代表性图像。（B）使用RADISH固定并经MemGlow 560染色的Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) 胚胎代表性图像。比例尺 = 100 µm。缩写：RADISH = Rotational Assistant for Danio Imaging of Subsequent Healing；dpf = 受精后天数。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4：RADISH 设计与多种损伤技术的兼容性。（A）通过手动尾鳍横切法对 3 dpf Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) x (cdh1-dTomato)^xt18 胚胎进行损伤。（B）通过激光消融法对胚胎进行损伤。（C、D）相同胚胎在损伤后 4 分钟的图像，显示损伤后钙瞬变的进展过程。比例尺 = 100 µm。缩写：RADISH = 斑马鱼后续愈合成像旋转辅助装置（Rotational Assistant for Danio Imaging of Subsequent Healing）；dpf = 受精后天数。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5：胚胎长期固定用于成像吞噬细胞迁移过程。（A）Tol2(mpx:Dendra2) 胚胎在损伤后立即成像，以及同一胚胎在（B）25分钟、（C）12小时和（D）24小时后的成像结果。比例尺 = 100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

补充文件1：如图1A所示的RADISH装置设计的矢量图和PNG文件。 请点击此处下载该文件。

视频 1：使用 RADISH 装置设计进行手动尾鳍截断的明场视频。 缩写：RADISH = 斑马鱼后续愈合成像旋转辅助装置。 请点击此处下载该视频。

视频 2：未封片与封片的 3 dpf Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) 胚胎比较，来自图 3，采集速率为每分钟 1 帧。 请点击此处下载该视频。

视频3：通过手术刀横切或激光消融造成损伤的 Tg(krt4:Gal4, UAS:GCaMP6f) x (cdh1-dTomato)^xt18 胚胎中钙瞬变现象，数据来自图4，采集速率为每分钟1帧。 请点击此处下载该视频。

视频 4：在 Tol2(mpx:Dendra2) 胚胎中对白细胞募集和尾鳍再生进行长期成像。 缩写：RADISH = 斑马鱼后续愈合成像旋转辅助装置；hpw = 伤口后小时数。请点击此处下载该视频

讨论

PET 层压法的核心理念在于，与传统的微流控器件制备方法（如软光刻或 PDMS 模具成型）相比，显著降低制作成本并减少技术门槛。因此，本方案中唯一关键的步骤是在层压过程中精确对齐 PET 层，以及在器件构建完成后对边缘进行防水密封处理。方法中的其余所有步骤均可根据实验需求进行调整（例如，若需固定更年轻或更年长的胚胎，可相应调整 PET 层的厚度以缩小或扩大通道尺寸）。只要基底材料耐热且足够薄以通过覆膜机，设计可为任意形状并覆膜于任何基底材料上^18,27。由于 PET 薄膜使用市售的裁切机进行切割，而这些裁切机读取的是二维而非三维图像文件，因此任意器件的设计与迭代仅需具备在图像编辑软件中处理黑白图形的能力，从而极大降低了设计难度。这种软件选择的灵活性以及所用材料的广泛可获得性，显著提升了微流控器件的可及性，使得在撰写本文时，任何实验室或教室均可在初始投入成本低于 500 美元 的情况下使用该技术，而相比之下，PDMS 模具制备的起始设备成本则超过 2000 美元¹⁷。

此外，与传统的软光刻技术相比，使用该方法制造单个可用器件所需的时间显著缩短。假设已熟悉所需的软件，一个独特的PET层压微流控器件可在约3小时内完成设计、制造并立即投入使用，包括氰基丙烯酸酯的固化时间。若进行迭代优化，所需时间更短，具体取决于原始设计文件修改的程度，且可并行制造多个变体器件，仅需投入极少的额外时间，无需额外设备。尽管由于多种原因（包括粘合失效以及多层结构和高长宽比形状内部应力问题），该方法制造的器件在耐用性上不如PDMS器件，但其低成本和可扩展的制造方式意味着它们更容易被替换。由于商用裁切机具备反复精确重复相同切割的能力，且PET材料无 有效期限制，因此已完成设计的各个单独层可批量预先制备，随时可用于后续的组装与使用，从而进一步减少总体所需的时间投入。

然而，速度和可变性是以牺牲精度为代价的。与传统的PDMS molding相比，PET层压技术的主要局限在于空间分辨率。商用裁切机在处理尺寸小于约500 µm的图形时，往往难以精确切割锐角，且PET层压片材的厚度无法低于33 µm（不包括胶粘剂本身的厚度，该厚度未包含在包装上的标称厚度中），这显著限制了该技术可应用的尺度范围。此外，层压机的尺寸也限制了可叠加的最大层数，而不同制造商的设备尺寸可能存在差异。

最终的实验方案版本，包括注册与配准技术、材料供应商及软件的差异，将主要取决于用户的偏好。然而， 该方法的可及性与 整体灵活性降低了适应成本。鼓励个体用户根据自身独特需求进行充分迭代，以调整该方法。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
25 mm直径圆形盖玻片，1号厚度	Chemglass Life Sciences	CLS-1760-025	基底固定材料。厚度根据显微镜物镜的规格选定。
Adobe Illustrator v28.5	Adobe	N/A	用于设计装置图案的矢量图形编辑软件。
二水氯化钙	Fisher	C79	用于配制E3培养基。
设计用PNG文件（在线镜像）	N/A	N/A	https://i.ibb.co/QPYj7BL/multipositionalv7-1.png https://i.ibb.co/FDpQYXc/multipositionalv7-2.png https://i.ibb.co/5TG4SB6/multipositionalv7-3.png
Design Space for Desktop v8.39	Cricut	N/A	驱动手工切割机的专有软件。
Fusion Plus 7000L	GBC	1703098	热压覆膜机。选择此特定型号是因其具备提升使用体验的功能，例如支持更大的最大叠层尺寸。
德国碳化钨精密切割刀片	Cricut	10396595	手工切割机的替换刀片。
基础灰色工具套装	Cricut	10307854	用于剔除切割废料、清洁垫板和安装PET片材的工具组。可选。
六水氯化镁	Acros Organic	223211000	用于配制E3培养基。
Maker 3	Cricut	10669040	手工切割机。相较于Silhouette Cameo 4，选择Cricut Maker 3是因为其软件更易于使用，但任何能够读取黑白图像的切割机均可适用。
MemGlow 560	Cytoskeleton	MG02-10	细胞膜红色活细胞染料。无需洗涤。图3中使用。
22号碳钢手术刀片	Surgical Design	22-079-697	用于手动调整切割的刀片。任何类似的工艺刀（例如X-acto 2号刀）也可使用。
氯化钾	Fisher	BP366	用于配制E3培养基。
氯化钠	Fisher	BP358	用于配制E3培养基。
标准粘性切割垫	Cricut	10138842	手工切割机用固定垫板。轻粘性切割垫也可使用，但应避免使用强粘性或织物专用切割垫，因其粘性过强可能导致剔除和取下时切割成品发生翘曲。垫板上的粘性会随着持续使用而逐渐损耗；请根据需要更换垫板。
12 mm办公胶带	Deli	30014	普通办公胶带。经测试选择Deli品牌，因其在覆膜后易于移除。
液体万能胶	Loctite	1364076	氰基丙烯酸酯胶水。必须使用液体形态的胶水。 凝胶配方无法充分密封或防水装置边缘。
3密耳PET热覆膜袋	Scotch	TP3854	带热熔胶的PET片材。片材以成对夹层形式送达，使用前应分开。切割时应使粘合面朝下。
5密耳PET热覆膜袋	Scotch	TP5854	带热熔胶的PET片材。片材以成对夹层形式送达，使用前应分开。切割时应使粘合面朝下。
三卡因（MS-222）	Syndel	IC10310680	鱼类麻醉剂。