从成年小鼠海马体中分离小胶质细胞并进行全细胞膜片钳记录

摘要

本方案描述了如何从成年小鼠中分离和纯化原代海马区小胶质细胞，并进一步介绍了对这些急性分离的细胞进行全细胞膜片钳记录的操作步骤。

摘要

小胶质细胞是大脑中的常驻免疫细胞，通过与神经元相互作用来维持中枢神经系统（CNS）的稳态。研究表明，小胶质细胞表面表达钾离子通道，这些通道可调控小胶质细胞的活化状态，而这些钾通道的异常可能导致神经系统疾病。目前，对小胶质细胞进行全细胞膜片钳记录主要是在来自胎鼠或新生小鼠的原代培养小胶质细胞上进行，因为在急性分离的小胶质细胞上开展电生理评估存在较大困难。本研究介绍了一种易于操作的实验方案，用于从成年小鼠中分离海马区小胶质细胞，并对分离后的细胞进行全细胞膜片钳记录。简而言之，小鼠断头后取出脑组织，双侧解剖分离海马，使用成年小鼠脑组织解离试剂盒分离小胶质细胞。随后采用磁珠激活细胞分选（MACS）方法纯化小胶质细胞，并将其接种于盖玻片上。通过抗CD11和抗Iba1抗体的免疫荧光染色验证小胶质细胞分离的成功。将盖玻片置于记录浴槽中，在电压钳制条件下记录急性分离小胶质细胞的全细胞钾电流。

引言

小胶质细胞来源于原始卵黄囊中的髓系前体细胞，是中枢神经系统中的常驻细胞，约占全部神经细胞的10%至15%^1,2。在功能上，小胶质细胞除了监测局部微环境、执行免疫防御功能以及为神经元提供营养和支持^3,4外，还可通过直接接触神经元来调控神经元表面受体及其相应配体的结合，并通过分泌细胞因子间接与神经元相互作用⁵。体外（in vitro）和体内（in vivo）研究表明，小胶质细胞表达多种类型的钾离子通道，这些通道有助于维持负的膜电位⁶，并调控小胶质细胞的活化状态。鉴于在多种脑部疾病中已观察到小胶质细胞钾离子通道的异常⁷，因此，研究人员亟需鉴定靶向这些钾离子通道的潜在药物，并开发调控小胶质细胞功能的策略。

传统的微胶质细胞消化和纯化方法通常使用全脑组织，忽略了不同脑区微胶质细胞的异质性⁸。体外解离及在含血清培养基中的长期培养会使微胶质细胞处于活化状态⁹，这可能无法....

方案

所有实验均经华南师范大学生命科学动物护理与使用委员会批准，并遵循适当的动物福利标准（伦理批准号：SCNU-SLS-2023-048）。本研究使用3至5月龄的C57BL/6J小鼠，性别不限。所用试剂和设备的详细信息见材料表。

1. 溶液的配制

1. 配制 50 mL 胞内液，其中含 160 mM KF、10 mM HEPES、10 mM EGTA 和 2 mM MgCl₂。用 1 M KOH 溶液调节 pH 至 7.2，并用 D-蔗糖将渗透压调节至 300 mOsm^13,16。于 -20 °C 保存。
2. 配制 50 mL 磁珠激活细胞分选（MACS）缓冲液，其中含 0.5% 牛血清白蛋白（BSA）和 2 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）的 PBS 溶液。
3. 将多聚-L-赖氨酸（PLL）按 1:1000 比例溶于水中。
   注意：盖玻片应在实验前一天用 PLL 包被。将包被后的盖玻片于 37 °C 过夜孵育。第二天回收 PLL，并将包被的盖玻片在 37 °C 下烘干。

2. 脑组织单细胞悬液的制备

....

结果

简而言之，该过程包括从小鼠成年脑组织中分离海马区小胶质细胞，随后对这些细胞进行全细胞膜片钳记录（图1）。该操作首先取3至5月龄C57BL/6J成年小鼠的海马组织。具体而言，在灌注后取出整个脑组织，并置于含有冰冻PBS的培养皿中（图2A）。为确保从小鼠海马区急性分离细胞，需去除大脑皮层，完整分离出新月形的海马组织（图2B）。

为了获得最佳的细胞质量和后续高质量的全细胞膜片钳记录，在制备单细胞悬液过程中严格控制消化时间至关重要。本研究在酶混合液中对海马组织始终采用手动震荡方式，并将消化时间严格限制在不超过15分钟内（图3）。随后采用磁珠分选法（MACS）分离细胞，纯度达到86.20% ± 0.68%^19,20。为确认分选所得细胞为小胶.......

讨论

来自胎鼠或新生小鼠的培养小胶质细胞显然不适用于研究成年小胶质细胞。此外，鉴于小胶质细胞在不同脑区之间存在异质性²¹，从全脑分离的小胶质细胞可能无法准确代表特定脑结构中小胶质细胞的特性。本方案提供了一种特异性分离海马区小胶质细胞的方法，用于评估这些细胞的电生理特性，并包括记录小胶质细胞钾离子通道所介导电流的技术方法。

众所周知，在制备单细胞悬液时，组织消化过程需要严格控制，以避免在原代细胞培养及后续实验中影响这些细胞的特性。通常，通过胰酶消化和物理匀浆的方法从全脑组织获得单细胞悬液。然而，在从特定脑区（如海马体）分离小胶质细胞时，仅使用物理匀浆无法获得足够数量的细胞以进行有意义的实验。此外，胰酶具有较强的消化活性，可能影响细胞活力。

为解决这些问题，本研究采用了一种相对温和的解离方法，并使用成年小鼠脑组织解离试剂盒，通过人工控制消化时间不超过15分钟。该方法能够保持小胶质细胞处于活性状态，这对于后续的全细胞膜片钳记录至关重要。这种温和的解离方法在操作速度和成本效益方面也具有优势。<.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100 mm 培养皿	Corning	353003
15 mL Falcon 离心管	BD	352096
24 孔板	BD	353047
35 mm 培养皿	Corning	353001	-
50 mL Falcon 离心管	BD	352070
70 μm 细胞筛	Miltenyi	130-095-823	细胞分选前去除细胞团块
成年小鼠脑组织解离试剂盒	Miltenyi	130-107-677
抗 CD11b 抗体	Bio-Rad	MCA74	也可使用山羊抗小鼠 IgG。用于阻断内源性免疫球蛋白。
抗 Iba1 抗体	SYSY	234308	也可使用山羊抗豚鼠 IgG。用于阻断内源性免疫球蛋白。
Axon Digidata 1440A	USA
Axon MultiClamp 700B 放大器	USA
BSA 白蛋白第 V 组分	BioFrox	4240GR500	血清
C57BL/6 小鼠	广东省医学实验动物中心
CD11b/c 微珠	Miltenyi	130-105-634
水合氯醛	Absin	abs47051394	在小鼠中广泛用作麻醉剂
Clampfit 10.6	USA
共聚焦显微镜	Zeiss	LSM 800
培养基	Fisher Scientific	C11995500BT	-
DAPI 染料	Beyotime	C1002
电极拉制仪	Narishige	PC-10
HBSS	Servicebio	G4203
水平摇床	SCILOGEX	SLK-O3000-S
图像分析软件	Fiji
MACS 柱	Miltenyi	130-042-201
MACS 分离器	Miltenyi	130-042-102
多聚甲醛	Fisher Scientific	T353-500	使用新鲜配制的 4% 溶液（溶于 1×PBS，pH 7.2–7.4）。
多聚-L-赖氨酸	Beyotime	C0313	盖玻片包被
Triton X-100	Sigma	X100