从成年小鼠海马体中分离小胶质细胞并进行全细胞膜片钳记录

摘要

本方案描述了如何从成年小鼠中分离和纯化原代海马区小胶质细胞，并进一步介绍了对这些急性分离的细胞进行全细胞膜片钳记录的操作步骤。

摘要

小胶质细胞是大脑中的常驻免疫细胞，通过与神经元相互作用来维持中枢神经系统（CNS）的稳态。研究表明，小胶质细胞表面表达钾离子通道，这些通道可调控小胶质细胞的活化状态，而这些钾通道的异常可能导致神经系统疾病。目前，对小胶质细胞进行全细胞膜片钳记录主要是在来自胎鼠或新生小鼠的原代培养小胶质细胞上进行，因为在急性分离的小胶质细胞上开展电生理评估存在较大困难。本研究介绍了一种易于操作的实验方案，用于从成年小鼠中分离海马区小胶质细胞，并对分离后的细胞进行全细胞膜片钳记录。简而言之，小鼠断头后取出脑组织，双侧解剖分离海马，使用成年小鼠脑组织解离试剂盒分离小胶质细胞。随后采用磁珠激活细胞分选（MACS）方法纯化小胶质细胞，并将其接种于盖玻片上。通过抗CD11和抗Iba1抗体的免疫荧光染色验证小胶质细胞分离的成功。将盖玻片置于记录浴槽中，在电压钳制条件下记录急性分离小胶质细胞的全细胞钾电流。

引言

小胶质细胞来源于原始卵黄囊中的髓系前体细胞，是中枢神经系统中的常驻细胞，约占全部神经细胞的10%至15%^1,2。在功能上，小胶质细胞除了监测局部微环境、执行免疫防御功能以及为神经元提供营养和支持^3,4外，还可通过直接接触神经元来调控神经元表面受体及其相应配体的结合，并通过分泌细胞因子间接与神经元相互作用⁵。体外（in vitro）和体内（in vivo）研究表明，小胶质细胞表达多种类型的钾离子通道，这些通道有助于维持负的膜电位⁶，并调控小胶质细胞的活化状态。鉴于在多种脑部疾病中已观察到小胶质细胞钾离子通道的异常⁷，因此，研究人员亟需鉴定靶向这些钾离子通道的潜在药物，并开发调控小胶质细胞功能的策略。

传统的微胶质细胞消化和纯化方法通常使用全脑组织，忽略了不同脑区微胶质细胞的异质性⁸。体外解离及在含血清培养基中的长期培养会使微胶质细胞处于活化状态⁹，这可能无法准确反映其生理特性和真实状态。

此外，尽管已在原代培养的新生小胶质细胞和细胞系中记录到外向整流性钾电流¹⁰，但来自胎鼠或新生小鼠脑组织长期培养的数据可能与成熟小胶质细胞存在差异。本方案旨在利用成年小鼠脑组织急性分离小胶质细胞，并立即进行全细胞膜片钳记录以检测小胶质细胞的钾电流。

采用一种适用于从小型组织中分离和纯化小胶质细胞的方法，检测了小胶质细胞的生物化学特性及钾离子通道特性^{11,12,13,14,15}。因此，本实验方案为研究人员阐明小胶质细胞在生理和疾病状态下的生物化学与功能特性提供了指导。尽管本方案以海马组织和钾离子通道为例进行说明，但该方法同样适用于其他脑区以及通道或细胞电生理特性的研究。

方案

所有实验均经华南师范大学生命科学动物护理与使用委员会批准，并遵循适当的动物福利标准（伦理批准号：SCNU-SLS-2023-048）。本研究使用3至5月龄的C57BL/6J小鼠，性别不限。所用试剂和设备的详细信息见材料表。

1. 溶液的配制

1. 配制 50 mL 胞内液，其中含 160 mM KF、10 mM HEPES、10 mM EGTA 和 2 mM MgCl₂。用 1 M KOH 溶液调节 pH 至 7.2，并用 D-蔗糖将渗透压调节至 300 mOsm^13,16。于 -20 °C 保存。
2. 配制 50 mL 磁珠激活细胞分选（MACS）缓冲液，其中含 0.5% 牛血清白蛋白（BSA）和 2 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）的 PBS 溶液。
3. 将多聚-L-赖氨酸（PLL）按 1:1000 比例溶于水中。
   注意：盖玻片应在实验前一天用 PLL 包被。将包被后的盖玻片于 37 °C 过夜孵育。第二天回收 PLL，并将包被的盖玻片在 37 °C 下烘干。

2. 脑组织单细胞悬液的制备

1. 按照机构批准的方案，使用2.5%水合氯醛（0.15 mL/10 g， i.p.）对小鼠进行麻醉。通过观察角膜反射消失以及轻捏脚趾或皮肤无痛觉反应，确认小鼠已进入深麻醉状态。将动物仰卧固定于解剖板上，并用针固定四肢。
   1. 暴露胸部，用预冷的无菌PBS经心脏灌注¹⁷，以清除血管内循环的血细胞。固定头部，用剪刀沿脑中线剪开皮肤，暴露颅骨。
   2. 用小剪刀在颅骨后部两侧及眼眶之间剪开，再沿矢状缝剪开颅骨，用镊子移除颅骨，迅速用镊子取出脑组织¹⁷。
2. 将脑组织置于含有预冷PBS的10 cm培养皿中。用镊子分离双侧大脑皮层，暴露并分离海马组织，将其剪成小块，转移至15 mL离心管中。
   注：双侧解剖大脑皮层可暴露出大脑两半球中的新月形海马组织。
3. 将海马组织小块重悬于2 mL预冷的Hank's平衡盐溶液（HBSS）中，在室温下以300 × g离心3分钟，弃去HBSS。
4. 向含有海马组织小块的15 mL离心管中加入1950 µL酶混合液1。将离心管置于37 °C水浴中持续振荡5分钟。
   注：酶混合液1由50 µL酶P与1900 µL缓冲液Y混合而成，预热至37 °C（为市售试剂盒的一部分，参见材料表）。
5. 从水浴中取出离心管，向其中加入30 µL新鲜配制的酶混合液2。用1 mL移液枪头反复吹打组织碎片20次，随后在37 °C水浴中持续振荡孵育5分钟。
   注：酶混合液2由20 µL缓冲液Y与10 µL酶A混合而成。上述两个消化步骤将脑组织转化为单细胞悬液。总消化时间不应超过15分钟。
6. 取出离心管，用1 mL移液枪头反复吹打悬液多次，直至无明显大块组织残留。
7. 将细胞悬液通过70 µm细胞筛滤器过滤，滤液收集至洁净的50 mL离心管中。
   注：此步骤可去除未完全消化的大块组织。
8. 将滤液转移至新的15 mL离心管中，在4 °C下以300 × g离心10分钟。用1 mL移液枪吸弃上清液。
9. 用15 mL HBSS将细胞悬液反复吹打20次进行洗涤，在4 °C下以300 × g离心10分钟。弃去上清液，
   将细胞沉淀重悬于1 mL MACS 缓冲液中。
   注：此步骤获得用于后续实验的单细胞悬液。

3. 小胶质细胞的急性分离

1. 取1 mL单细胞悬液转入2 mL微量离心管中，在4 °C、300 × g 条件下离心3 min，弃上清液。
2. 用90 µL MACS缓冲液重悬单细胞沉淀，加入10 µL CD11b/c微珠，在4 °C下于水平摇床上孵育15 min。
3. 将分选柱置于合适的MACS分选器的磁场中，并用500 µL MACS缓冲液润洗柱子两次。
4. 向管中直接加入1 mL MACS缓冲液洗涤单细胞悬液，在4 °C、300 × g 条件下离心3 min，彻底吸除上清液。
5. 用500 µL MACS缓冲液重悬细胞沉淀。
6. 用1 mL移液器将重悬的细胞悬液转移至处于磁场中的分选柱中，弃穿流液。在保持分选柱处于磁场中的同时，用500 µL MACS缓冲液洗涤柱子三次。
   注意：穿流液中含有未标记的细胞。洗涤过程中不得将分选柱移出磁场。
7. 将分选柱从磁场中取出，向柱中加入1 mL MACS缓冲液，用活塞缓慢推动液体通过柱子，收集穿流液。
   注意：穿流液中含有标记的细胞（即小胶质细胞）。为提高小胶质细胞纯度，可选用新的分选柱重复该过程（可选）。
8. 将分选得到的细胞接种至含有PLL包被盖玻片的24孔板中，每孔加入200 µL培养基，在37 °C、95% O₂、5% CO₂、60%–80%湿度的培养箱中孵育20 min。此步骤可使小胶质细胞贴附于盖玻片，以便后续进行全细胞膜片钳和免疫荧光实验。

4. 免疫荧光

1. 从培养板孔中吸除培养基，并在摇床上用 0.1 M PBS 洗涤细胞三次。
2. 弃去 PBS，加入 4% 多聚甲醛（PFA）在室温（RT）固定盖玻片上的小胶质细胞 20 分钟。
3. 移除固定液，并用 0.1 M PBS 将盖玻片洗涤三次。
4. 弃去 PBS，加入含 0.2% Triton X-100 和 5% BSA 的封闭缓冲液 200 µL，在摇床上室温孵育 1 小时以通透细胞。
5. 加入含抗 Iba1 和抗 CD11b 一抗的封闭缓冲液，4 °C 过夜孵育¹⁸。
6. 次日，移除一抗，并在摇床上用 PBS 室温洗涤盖玻片三次。
7. 加入含荧光标记二抗的封闭缓冲液，室温孵育 2 小时；在孵育最后 15 分钟加入 DAPI 染料。
8. 移除二抗，用 PBS 洗涤盖玻片三次，将盖玻片封片于显微镜载玻片上用于成像。

5. 小胶质细胞中钾电流的全细胞膜片钳记录

1. 将细胞内液解冻并置于冰上保存。
2. 使用垂直拉制仪从薄壁硼硅酸盐玻璃毛细管中拉制膜片钳电极¹⁷。
   注意：电极电阻应小于 10 MΩ。
3. 将盖玻片转移至记录室，并加入含有 160 mM NaCl、4.5 mM KCl、2 mM CaCl₂、1 mM MgCl₂ 和 10 mM HEPES 的细胞外液。使用 1 M NaOH 溶液将 pH 调至 7.2 后使用^13,16，并用 D-蔗糖将渗透压调节至 300 mOsm。
4. 使用水镜和 40 倍物镜定位球形的小胶质细胞。
5. 用细胞内液填充电极，将其连接至电生理装置的放大器头架，并施加正压。切换至 4 倍物镜并定位电极。
   1. 将电极浸入浴液中，将放大器设为电压钳模式，以浴液模式进行膜测试。切换回 40 倍物镜，并将电极尖端移近小胶质细胞。
      注意：当电极尖端非常接近小胶质细胞时，电阻应略有上升。
   2. 施加微弱的负压以固定细胞。当电阻达到 100 MΩ 时，在膜测试中从浴液模式切换至膜片模式。当电阻达到 300 MΩ 时，释放负压。
   3. 当电阻显示电极与小胶质细胞膜之间已形成吉欧姆密封（即>1 GΩ）时，在膜测试中从膜片模式切换至细胞模式。
6. 施加少量吸力并启动电击以破裂细胞膜。出现大的电容性瞬变表明细胞膜破裂成功。
7. 切换至电压钳模式并启动记录程序。记录 200 ms 的钾电流。为测试电位，以 1 Hz 频率施加从 -120 mV 到 +40 mV、每步 20 mV 的电压阶跃。
8. 使用适当的软件对获得的数据进行离线分析。

结果

简而言之，该过程包括从小鼠成年脑组织中分离海马区小胶质细胞，随后对这些细胞进行全细胞膜片钳记录（图1）。实验首先取3至5月龄C57BL/6J成年小鼠的海马组织。具体而言，在灌注后取出整个脑组织，并置于含有冰冻PBS的培养皿中（图2A）。为确保从小鼠海马区急性分离细胞，需去除大脑皮层，完整分离出新月形的海马组织（图2B）。

为了获得最佳的细胞质量和后续高质量的全细胞膜片钳记录，在制备单细胞悬液过程中严格控制消化时间至关重要。本研究始终手动震荡海马组织与酶混合液，并将消化时间严格限制在不超过15分钟内（图3）。随后采用MACS方法分离细胞，纯度达到86.20% ± 0.68%^19,20。为确认所分选的细胞为小胶质细胞，使用抗Iba1和抗CD11b抗体通过免疫荧光检测小胶质细胞表面标志物，这两种抗体被广泛用于小胶质细胞的鉴定¹⁸。结果表明，分离得到的细胞呈CD11b和Iba1阳性，证实成功分离出小胶质细胞（图4）。

最后，为了评估急性分离的小胶质细胞是否具有高质量以用于后续实验，我们介绍了如何进行全细胞膜片钳记录以检测小胶质细胞的钾电流。所记录的小胶质细胞的平均膜电容为 10.42 ± 2.05（图 5）。结果表明，可以成功记录到小胶质细胞的钾电流，说明急性分离的小胶质细胞适用于神经生物学研究。

图1：实验流程概览。 实验主要包括四个步骤：小心取出脑组织，并双侧解剖分离海马体；使用本方案中详细描述的酶混合物消化海马体组织，制备单细胞悬液；通过磁性激活细胞分选法分离目标细胞；最后，采用全细胞膜片钳记录技术检测急性分离细胞中的钾离子电流。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 2：海马体的解剖分离。（A）3 至 5 月龄小鼠的完整脑组织。（B）分离出的双侧海马体。比例尺：0.5 cm。请点击此处查看该图的放大版本。

图3：海马组织消化过程的示意图。 关键实验步骤示意图，显示通过在37 °C条件下持续振荡并加入酶混合液，将海马组织消化成单细胞悬液，消化时间最长可达15分钟。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：急性分离的海马区小胶质细胞的鉴定。 典型的共聚焦图像显示从海马区分离出的CD11b（绿色）和Iba1（红色）阳性细胞，证实所分离的细胞为小胶质细胞。比例尺：10 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5：全细胞小胶质细胞钾电流的记录。（A）记录电极置于分离的海马小胶质细胞表面。比例尺：20 µm。（B）急性分离的海马小胶质细胞在电压钳制条件下的典型钾电流。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

来自胎鼠或新生小鼠的培养小胶质细胞显然不适用于研究成年小胶质细胞。此外，鉴于小胶质细胞在不同脑区之间存在异质性²¹，从全脑分离的小胶质细胞可能无法准确代表特定脑结构中小胶质细胞的特性。本方案提供了一种特异性分离海马区小胶质细胞的方法，用于评估这些细胞的电生理特性，并包括记录小胶质细胞钾离子通道所介导电流的技术方法。

众所周知，在制备单细胞悬液时，组织消化过程需要严格控制，以避免在原代细胞培养及后续实验中影响这些细胞的特性。通常，通过胰酶消化和物理匀浆的方法从全脑组织获得单细胞悬液。然而，在从特定脑区（如海马体）分离小胶质细胞时，仅使用物理匀浆无法获得足够数量的细胞以进行有意义的实验。此外，胰酶具有较强的消化活性，可能影响细胞活力。

为解决这些问题，本研究采用了一种相对温和的解离方法，并使用成年小鼠脑组织解离试剂盒，通过人工控制消化时间不超过15分钟。该方法能够保持小胶质细胞处于活性状态，这对于后续的全细胞膜片钳记录至关重要。这种温和的解离方法在操作速度和成本效益方面也具有优势。

原代小胶质细胞的纯化方法包括分层振荡法（SSM）²²、密度梯度离心法（DGCM）²³以及荧光激活细胞分选法（FACS）^11,24。其中，SSM被广泛用于神经元或胶质细胞的纯化。然而，SSM的主要局限性在于其难以实现高纯度²⁵。同样，DGCM获得的细胞纯度也较低。FACS方法需要对细胞染色15分钟至1小时，随后使用高速细胞分选仪进行分选，这一过程可能影响细胞活力。相比之下，本方案采用磁珠激活细胞分选法（MACS），该方法缩短了分离时间，并避免了仪器的重复使用以及耗时的染色步骤。因此，可获得高纯度的小胶质细胞，尽管其得率可能低于某些其他方法。

该技术存在一定的局限性。例如，磁珠激活细胞分选（MACS）方法所获得的小胶质细胞数量相对较少，且急性分离的小胶质细胞无法进行长期培养。然而，该方法仍具有重要价值，因为它能够用于研究从成年小鼠海马区 freshly prepared（新鲜制备）的小胶质细胞的电生理特性，而无需依赖长期培养的细胞。

全细胞膜片钳技术是研究细胞（尤其是神经元）电生理特性的关键且广泛应用的工具，广泛应用于神经科学、药理学和细胞生物学等领域²⁶。全细胞膜片钳记录已被大量研究用于探究急性分离脑片、原代培养细胞和细胞系的特性。然而，在我们开展研究之前，尚无对成年小鼠脑中急性分离的小胶质细胞进行全细胞膜片钳记录的报道。

本研究不仅提供了分离成年海马区小胶质细胞的实验方案，还成功记录了这些分离小胶质细胞中的钾离子电流。值得注意的是，该方案可能适用于海马体以外其他脑结构中小胶质细胞的研究。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100 mm 培养皿	Corning	353003
15 mL Falcon 离心管	BD	352096
24 孔板	BD	353047
35 mm 培养皿	Corning	353001	-
50 mL Falcon 离心管	BD	352070
70 μm 细胞筛	Miltenyi	130-095-823	细胞分选前去除细胞团块
成年小鼠脑组织解离试剂盒	Miltenyi	130-107-677
抗 CD11b 抗体	Bio-Rad	MCA74	也可使用山羊抗小鼠 IgG。用于阻断内源性免疫球蛋白。
抗 Iba1 抗体	SYSY	234308	也可使用山羊抗豚鼠 IgG。用于阻断内源性免疫球蛋白。
Axon Digidata 1440A	USA
Axon MultiClamp 700B 放大器	USA
BSA 白蛋白第 V 组分	BioFrox	4240GR500	血清
C57BL/6 小鼠	广东省医学实验动物中心
CD11b/c 微珠	Miltenyi	130-105-634
水合氯醛	Absin	abs47051394	在小鼠中广泛用作麻醉剂
Clampfit 10.6	USA
共聚焦显微镜	Zeiss	LSM 800
培养基	Fisher Scientific	C11995500BT	-
DAPI 染料	Beyotime	C1002
电极拉制仪	Narishige	PC-10
HBSS	Servicebio	G4203
水平摇床	SCILOGEX	SLK-O3000-S
图像分析软件	Fiji
MACS 柱	Miltenyi	130-042-201
MACS 分离器	Miltenyi	130-042-102
多聚甲醛	Fisher Scientific	T353-500	使用新鲜配制的 4% 溶液（溶于 1×PBS，pH 7.2–7.4）。
多聚-L-赖氨酸	Beyotime	C0313	盖玻片包被
Triton X-100	Sigma	X100