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方法文章

基于核磁共振的代谢组学在危重患者中异常代谢物的鉴定与定量

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DOI：

10.3791/67319

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2024年11月29日

 ,  ,  , 
1Centre of Biomedical Research, SGPGIMS Campus, 2Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR), 3Department of Critical Care Medicine, Sanjay Gandhi Postgraduate Institute of Medical Sciences

本文内容

摘要

核磁共振（NMR）波谱法用于识别多种疾病患者中代谢物的异常调节。该技术可对异常代谢物进行定量分析，揭示其病理生理学机制。本文详细描述了基于核磁共振的患者代谢特征分析的逐步操作流程。

摘要

代谢组学正逐渐成为反映个体对病理生理状态应答的重要方法。核磁共振（NMR）波谱技术已发展为识别重症患者代谢紊乱的工具，适用于急性呼吸窘迫综合征（ARDS）、重症急性胰腺炎（SAP）、急性肾损伤（AKI）和脓毒症等疾病。通过800 MHz核磁共振波谱仪采集研究组与对照组血清样本的谱图数据，并利用核磁共振数据处理与分析工具进行处理。此外，采用严格的统计分析方法（如单变量和多变量检验）以确定具有显著差异的代谢物，随后使用核磁共振代谢物定量软件对其进行准确鉴定与定量。同时，通路分析可揭示导致疾病严重程度的异常生化循环。通过这一综合方法，研究人员旨在深入理解这些危重疾病相关的代谢改变，有望为疾病机制的进一步阐明以及诊断和治疗策略的优化提供支持。

引言

尽管全球范围内持续努力以提供高效的疾病诊断，靶向治疗仍未充分发挥其真正潜力。转录组学、蛋白质组学等多种方法已鉴定出若干生物标志物，但由于缺乏足够的灵敏度和特异性，这些标志物在临床上的应用价值有限1,2。在某些多因素疾病中，靶向治疗仍面临巨大挑战，最终导致较高的死亡率。对于具有广泛异质性的复杂疾病，亟需更深入地理解其潜在机制和病理生理过程。在此背景下，代谢组学的发展已彻底改变了治疗策略的研发，未来有望为急性呼吸窘迫综合征（ARDS）、脓毒症和重症急性胰腺炎（SAP）等各类危重疾病提供个体化的治疗方案。

代谢组学是一种综合性方法，旨在鉴定和定量各种生物流体、细胞或组织提取物中的小分子量物质（如氨基酸、脂质、肽类、有机酸和维生素等代谢物）。这些分子量通常小于1500 Da的代谢物在生物化学过程中发挥着积极作用，反映了生物体生物学状态的动态变化。它们包括关键酶促反应的底物、生物通路中的中间产物以及细胞代谢的副产物。因此，代谢组学能够捕捉到饮食影响、药物相互作用和疾病状态的详细特征。代谢物的变化是代谢活动和生物通路的高度敏感指标，可用于关联表型表达及由此产生的病理生理异常3,4。代谢物的初始变化可作为疾病严重程度的早期指标，而随时间推移的变化则有助于监测治疗效果、疾病进展和临床结局5,6,7。因此，代谢组学通过临床、生理和生化终点重新定义疾病，从而增强了临床检测及其他多种组学方法的应用价值8,9,10,11,12,13。代谢组学的分析能力被用于通过检测代谢物浓度的改变来监测和确定疾病易感性14,15。

在此背景下，质谱法（MS）和核磁共振（NMR）波谱法已成为生物样本中代谢物分析的主要技术平台。这些方法可用于靶向和非靶向的代谢物鉴定与定量16,17,18。每种技术平台均有其优势与局限性，但NMR具有非破坏性特点，因此在多种活体（in vivo）研究以及未知化合物结构表征中更具优势，尤其适用于代谢组学研究的初期阶段。质谱分析前所需的样品分馏、衍生化和电离过程可能引入偏差，且常导致样品损失，从而影响对代谢物动态特征的准确捕捉；而NMR波谱法通常无需或仅需极少的样品前处理即可实现此类检测。NMR的主要局限在于其灵敏度低于MS，检测限较高，因而难以检测丰度较低的代谢物19。然而，随着高分辨率超导磁体、低温冷却NMR探头以及多种提升灵敏度技术的发展，这一局限已得到显著改善20,21,22。作为基因组学和蛋白质组学的补充手段，基于NMR波谱法的代谢谱分析正日益成为一种备受青睐的技术23,24,25。尽管存在灵敏度方面的挑战，NMR因其样品前处理简便、结果可重复性高，仍是一种有效捕捉代谢物内在动态特征的重要工具26。

多个研究团队已成功开展了代谢组学研究，确定了多种疾病患者的代谢失调特征27，例如急性呼吸窘迫综合征（ARDS）28,29,30,31,32,33、肺炎34、脓毒症7、胆结石35和胰腺炎36。基于核磁共振（NMR）的代谢组学研究在危重患者中发挥了重要作用，可用于追踪从全身炎症反应综合征（SIRS）进展至多器官功能障碍综合征（MODS）的过程，后者是重症监护病房（ICU）患者死亡和发病的主要原因37。在Stringer等人的一项研究中，利用血浆样本分析了脓毒症所致急性肺损伤（ALI）患者与对照组患者之间的代谢变化38。该初步研究中发现的关键代谢物水平升高反映了所涉及的代谢通路及其与临床评分的关联。该研究进一步扩展至血清代谢组学，以区分脓毒症与ARDS中肺损伤机制的早期阶段32。此外，另一项针对ARDS的研究鉴定出强有力的血清生物标志物，可明确区分急性肺损伤/ARDS患者与健康对照者，揭示了与急性肺损伤发作相对应的全身性代谢改变39,40。

核磁共振（NMR）波谱法是一种高通量、自动化的分析技术，能够提供关于代谢指纹的可靠且无偏倚的信息，揭示潜在的病理生理机制38。NMR数据的临床应用和生物学解释依赖于获取富含信息的高质量谱图。因此，确保数据采集、处理和分析的准确性、一致性和规范性至关重要。本研究旨在利用基于NMR的代谢组学关键步骤，实现对代谢物的鉴定与定量。本研究强调了开展临床代谢组学研究所需的关键实验步骤（图1），包括合适样本的选择、样本的采集与储存、样本处理与制备、数据获取与分析、目标代谢物的鉴定与定量，以及最终在临床背景下对结果进行解释以获得相关科学见解。上述每一步骤对于利用NMR波谱技术在代谢组学中揭示重要的生物学和临床信息均至关重要。

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方案

本研究已获得卢克诺桑贾伊·甘地医学研究生院（SGPGIMS）机构伦理委员会（IEC 代码：2022-71-PhD-126）的伦理批准。已获取患者或其亲属签署的书面知情同意书，以开展本研究并出于科研目的发表相关数据。此外，本研究遵循了机构制定的相关指南。

1. 研究设计与伦理审批

  1. 确定每组的样本量。仔细审查并建立受试者的选择标准。此外，若研究设计需要纳入人类或动物样本，则在开始样本采集前，须从相应的机构伦理委员会（IEC）获得伦理审批。
  2. 根据2012年柏林定义中基于动脉血氧分压（PaO₂）与吸入氧浓度（FiO₂）比值（P/F比值）的诊断标准，选择被分类为轻度、中度和重度的急性呼吸窘迫综合征（ARDS）患者。其中，P/F比值在300-200之间的ARDS患者视为轻度，100-200之间为中度，低于100为重度。38. 此处，我们重点关注了两组患者：轻度和中度急性呼吸窘迫综合征患者（见 表1).
    注意：本研究使用从血液样本中获得的血清进行基于核磁共振（NMR）的代谢组学分析。本研究纳入的参考参与者平均年龄为42岁（±10.9岁），性别分布为2名男性和6名女性。

分类P/F 比值
轻度300-200
中度200-100
重度100-0

表1：急性呼吸窘迫综合征（ARDS）患者的分类。

2. 样本选择、采集与处理

  1. 按照以下步骤进行血清分离。
    1. 实验时，使用无菌针头从动脉采集2 mL血液样本至无添加剂的无菌试管中。将样本在室温下静置30分钟使其凝固。本研究中选取了4名诊断为轻度急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的患者和4名中度ARDS患者。
    2. 以3100 × g 离心15分钟，分离血清25。将血清转移至无菌微量离心管中，分装成较小体积（即400–500 µL），并做好适当标记（患者姓名、CR编号、采样时间点等），随后于-80 °C保存，以备后续分析。
      注意：此时实验可暂停，并在合适时间继续进行。
  2. 在进行核磁共振（NMR）实验前，按以下步骤处理血清样本。
    1. 在进行NMR实验前将样本解冻。取250 µL血清分装样本与250 µL磷酸盐缓冲生理盐水溶液（含100% D2O、0.9% NaCl、50 mM磷酸钠缓冲液，pH 7.4）混合，以尽量减少pH变化。
    2. 涡旋振荡混合物数秒（约15秒），确保均匀混合。最后将制备好的样本转移至洁净的NMR管中，NMR管内含同轴插入件，其中含有浓度为0.05 mM的三甲基硅丙酸（TSP），作为校准和定量的外标41。
      注意：作为参考，应使用一种惰性且不具反应性的化合物，不与待测物发生相互作用。其他常用参考化合物包括四甲基硅烷（TMS）和三甲基硅丙磺酸钠（DSS）。

3. 核磁共振实验

注意：本研究重点在于鉴定血清样品中的小分子，因此采用了抑制大分子信号的 Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）脉冲序列。本研究中所有血清样品均使用配备低温冷却三共振TCI 5 mm宽带反向探头及屏蔽z梯度的800 MHz核磁共振波谱仪进行检测。

  1. 将样品放入磁体中。输入命令 wrpa（注明实验编号），然后按回车键，以 cpmg 脉冲程序设置质子实验。通过点击 标题 选项，注明患者姓名及其他必要信息。
  2. 通过输入命令Lock并按回车键锁定磁场，随后选择90% H2O 和 10% D2O选项。通过ATMM手动调节和匹配探头，以优化射频脉冲效率并最大化灵敏度。通过点击topshim执行一维梯度匀场。
  3. 设置以下采集参数：弛豫延迟为 5 s，谱宽为 12 ppm，回波时间为 300 µs。所有这些参数均可通过上方面板中的采集参数选项轻松修改。
  4. 使用指数窗函数施加 0.3 Hz 的线宽展宽，共采集 128 次扫描，数据点数为 64,000。这些参数同样可通过上方面板中的采集参数选项进行修改。点击采集参数后，将显示参数列表，可在优化过程中修改所述属性及其他参数。
  5. 使用核磁共振处理与分析工具采集 NMR 谱图。获得最终谱图后，输入命令apk和absn，并分别按回车键进行相位校正和基线校正。点击上方面板中的校准坐标轴选项，然后自动或手动将 TSP 峰校准至 0 ppm。
  6. 将采集的数据从系统传输至工作站，以进行后续处理与分析。
    注意：实验阶段现已完成，可暂停操作。数据预处理、分析与解释可随后方便地进行。

4. 数据预处理

  1. 使用核磁共振（NMR）处理与分析工具以及NMR代谢物定量软件进行数据预处理。
    1. 有时仅靠自动校正并不足够，此时还需进行手动校正。要手动进行相位校正，请点击NMR处理与分析工具顶部菜单栏中的Process选项，然后点击Adjust Phase，拖动鼠标并观察，直至谱图完成相位校正。完成后，点击同一菜单栏中以图标形式呈现的Save and Return选项。
    2. 要进行手动基线校正（Whittaker方法），请在NMR代谢物定量软件的处理器模块中打开谱图文件。选择Baseline Correction选项，然后选择Whittaker Method。接着在整个谱图范围内（通常血清样本为0.0至10 ppm，或根据谱图中代谢物的实际情况）在峰的基部放置若干点，以调整基线。所有谱图文件完成基线校正后，将其保存至同一文件夹中。后续处理可使用该软件的处理器或分析模块，基于保存为特定格式的同一文件进行。
    3. 使用该软件的分析模块进行分段处理（binning）。选择Tools，然后选择Batch Process，再选择Spectral Binning。
  2. 点击Spectral binning后，选择包含所有已完成基线校正的谱图文件的文件夹，以生成用于统计分析的最终分段表格。
  3. 将谱图划分为若干个等宽的区间，每个区间的谱宽设定为0.01至0.04 ppm（可根据具体研究优化）。该过程可简化并整理谱图数据，便于更一致的分析。需指定分段大小（bucket size）以及起始和终止的ppm值，并指定输出分段表格的保存文件夹。
  4. 排除对应于水和溶剂TSP的化学位移区域（4.8–5.2 ppm和0.0–0.7 ppm），以避免谱图干扰42,43,44。
  5. 该电子表格中，一行包含样本名称，其余行包含不同分段的数值及其对应的ppm值。在用于统计分析前，需对该表格进行修改：将样本按分析组别进行归类，并仅以逗号分隔（CSV）格式保存。
    注意：例如，在比较急性呼吸窘迫综合征（ARDS）患者轻度组与中度组时，我们将数据按“轻度”和“中度”标签排列，添加序列号，并将文件保存为CSV格式。

5. 统计学分析

注意：上一步获得的分箱表格将作为统计分析的输入文件。本研究中使用了代谢组学统计分析软件中的单因素统计分析模块。

  1. 在进行统计分析之前，使用总和、对数和帕累托方法进行归一化处理，但不同研究之间可能有所差异45.
  2. 进行单变量和多变量分析，以区分不同组别并确定所鉴定代谢物的准确性。
    1. 进行主成分分析（PCA）、偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），以观察组间差异，并获得每个对代谢谱差异有贡献的代谢物的投影变量重要性（VIP）得分。
    2. 采用单变量方法，例如学生 t 检验和方差分析（ANOVA），根据 p 值小于 0.05 的标准筛选显著性代谢物。这两种检验均可生成箱须图，展示代谢物相对浓度的差异。
    3. 进行生物标志物分析，得到受试者工作特征曲线（AUROC）下的面积。曲线下面积（AUC）值 > 0.8 被认为具有显著性46.
    4. 使用 VIP 评分标准筛选出显著性代谢物的最终列表>1，经Bonferroni校正的p值<0.0544，以及 AUC > 0.846.
  3. 按照下述方法鉴定代谢物。
    1. 分箱以 ppm 值的形式提供显著代谢物，而非代谢物名称。利用生物磁共振数据库（Biological Magnetic Resonance Bank, BMRB）等数据库，鉴定对应于特定 ppm 值的代谢物。47以及人类代谢组数据库（HMDB）。
    2. 除上述内容外，使用已发表的文献42,44 用于鉴定与验证。
    3. 使用核磁共振代谢物定量软件中的分析模块，根据化学位移（ppm）值确认所鉴定的代谢物。

6. 使用核磁共振代谢物定量软件对代谢物进行定量

注意：该软件的分析模块被广泛用于对已鉴定的代谢物进行定量分析。

  1. 开始定量分析之前，使用处理器模块对所选的参考化合物（本研究中使用的是 tsp）进行校准。点击 校准 CSI（化学形状指示剂） 选项，输入参考化合物的浓度（本研究为 0.05 mM）。然后将软件中的峰拖动至谱图中的参考峰位置，并适当调整其高度和宽度。当谱图中的参考峰与软件峰完全匹配后，点击 确定。
  2. 在分析模块中打开目标谱图，并选择适用于本研究的化合物谱库。
  3. 屏幕底部将显示代谢物列表。从该列表中选择感兴趣的代谢物。选定后，该代谢物可能的 ppm 值将显示在谱图的右上角。
  4. 点击右上角的 ppm 值，并对谱图进行放大，以查看该代谢物特定的 ppm 范围。
  5. 此时屏幕上将出现两个峰：一个代表实际记录的数据，另一个以虚线显示，代表软件生成的峰。对齐这两个峰，通过拖动软件峰并调整其高度和位置，使其与样品中的峰完全匹配。
  6. 完成准确对齐后，可在该代谢物对应的“浓度”（单位：mM）标题下显示的数值中读取其浓度（图 1）。
  7. 对所有代谢物和样品重复上述步骤，并将定量结果导出为电子表格文件。为生成输出文件，请点击 工具 菜单下的 批量操作 选项，并指定用于保存输出文件的目标文件夹。

7. 通路分析

注意：分析后鉴定出的显著代谢物可用于确定直接影响疾病组结果的主要通路。通常使用代谢组学统计分析软件的通路分析模块以及KEGG数据库来实现此目的。

  1. 将获得的显著代谢物列表输入该模块，将生成包含通路名称的列表。
  2. 根据影响因子大于 0.1 的标准筛选最终通路。显著的影响值表明与疾病相关的通路30。
  3. 深入分析所得通路，以阐明与疾病严重程度相关的失调机制。该方法的一个缺点是，当显著代谢物少于 3 个时，难以有效识别失调通路。
  4. 为应对这一问题，还可通过查阅已发表的文献来确定所鉴定代谢物及其与疾病严重程度的相关性。进行系统的文献调研，并观察所鉴定的代谢物是否与您关注的趋势一致。

核磁共振波谱工作流程图：从样品到重要代谢物的鉴定与相关性分析。
图 1：基于核磁共振的代谢组学基本步骤。 该图展示了基于核磁共振（NMR）的代谢组学中的关键步骤：样品采集与制备、核磁共振波谱检测、数据预处理、统计分析、代谢物的鉴定与定量，以及生物学意义的解读。请点击此处查看该图的放大版本。

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结果

进行代谢组学研究时，必须确定样本量以及将要分析的特定组别。选择合适的样本量对于获得与疾病严重程度准确相关的显著结果至关重要48。然而，在本项研究中，我们采用了较小的样本量，旨在演示基于核磁共振（NMR）代谢组学进行代谢物鉴定与定量所涉及的步骤，主要供参考之用。本研究分析了急性呼吸窘迫综合征（ARDS）患者在入住重症监护室（ICU）第1天时轻度与中度阶段之间的代谢差异，共纳入8名受试者。按照实验方案，采集并处理了所有样本的NMR谱图，最终生成了包含分箱结果的电子表格。

随后我们进行了严格的统计分析，将分箱表作为输入文件，使用总和、对数和帕累托方法对数据进行标准化。我们进行了主成分分析（PCA，图2A）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA，图2B），前者显示了样本的聚类趋势，而后者则揭示了组间明显的分离，并突出了代谢差异。置换检验（20次）得到的统计值为 R2Y=0.99 和 Q2=0.47。随后，我们进行了学生t检...

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讨论

代谢组学能够高效地鉴定和定量代谢物，针对疾病过程中发生紊乱的代谢循环。结果的质量取决于代谢组学方法中每一步操作的严谨性。从样本选择与采集到通路鉴定的每一个阶段，对于准确识别导致疾病的主因都至关重要。在开展代谢组学研究之前，必须全面回顾相关文献，并在每个阶段都给予仔细关注。

在设计代谢组学研究时，样本的选择对于提取有意义的信息以及确保理想的样本制备至关重要，无论研究目的是针对特定代谢物还是对所关注的临床状况进行非靶向代谢指纹分析。正确的初始样本处理非常关键，整个研究过程中应对所有样本始终如一地遵循标准操作流程49。处理临床样本时需格外谨慎。基于核磁共振（NMR）的代谢组学研究中常用的样本包括生物流体、细胞提取物和组织提取物50,51。脑脊液（CSF）和尿液通常需要极少的预处理，常被用于肾脏相关疾病、神经退行性疾病及药物毒性等研究场景。全血、血浆和血清能够为多种重大疾病提供全面的信息，且因其采集方便而被广泛采用。其他多种生...

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披露

作者声明不存在竞争性财务利益。

致谢

AS 感谢科学与创新研究学院（AcSIR）提供的注册支持（注册号：10BB22A71002）。AS 还感谢国防研究与发展组织（DRDO）提供的奖学金。我们感谢生物医学研究中心（CBMR）提供 800 MHz 核磁共振波谱仪设施，并通过院内项目（CBMR/IMR/0008/2021）提供资金支持。我们还感谢 SGPGIMS 重症监护医学科（CCM）的持续支持。我们感谢许多护士的帮助，以及最重要的是参与本研究的患者。本研究由生物医学研究中心（CBMR）的院内项目（CBMR/IMR/0008/2021）和国防研究与发展组织（DRDO）的院外项目（编号：LSRB/01/15001/LSRB-404/PEE&BS/2023）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
离心机Sigma aldrich3-18KS
Chenomx NMR suite NMR Suite, v9, Chenomx Inc., Edmonton, CanadaNMR代谢物定量分析软件
同轴插入管Sigma aldrichZ278513
重水Sigma aldrich151882
Eppendorf管Tarsons500020
MetaboanalystWishart Research Group代谢组学统计分析软件
NMR管WilmadZ412007直径5 mm
移液器Eppendorf research plus31230000390–100 μl
样品收集瓶Tarsons cryo chill vials523194
叠氮化钠Sigma aldrichS2002
氯化钠晶体Sigma aldrichS9625
磷酸氢二钠Sigma aldrich567550
磷酸二氢钠Sigma aldrichS0751
Topspin 3.6.4BrukerNMR数据处理与分析工具
Tsp盐Sigma aldrich269913

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