使用基于 NMR 的代谢组学鉴定和定量危重患者紊乱的代谢物

Summary

核磁共振 （NMR） 波谱用于识别各种疾病患者代谢物的失调。该技术允许量化紊乱的代谢物，揭示病理生理学的见解。在这里，我们描述了基于 NMR 的方法用于患者代谢表征的分步程序。

Abstract

代谢组学正在成为反映个体对病理生理状况反应的重要方法。核磁共振 （NMR） 波谱已发展成为一种工具，用于识别患有急性呼吸窘迫综合征 （ARDS）、严重急性胰腺炎 （SAP）、急性肾损伤 （AKI） 和败血症等疾病的危重患者的代谢失调。研究组和对照组血清样本的波谱数据使用 800 MHz NMR 波谱仪记录，并使用 NMR 处理和分析工具进行处理。此外，还进行了严格的统计分析，例如单变量和多变量测试，以查明重要的代谢物，然后使用 NMR 代谢物定量软件准确识别和量化这些代谢物。此外，通路分析突出了导致疾病严重程度的紊乱生化循环。通过这种全面的方法，研究人员旨在更深入地了解与这些危重疾病相关的代谢改变，从而可能为更好地了解疾病和改进诊断和治疗策略铺平道路。

Introduction

尽管在全球范围内不断努力提供有效的疾病诊断，但靶向治疗仍未发挥其真正的潜力。转录组学、蛋白质组学等各种方法已经鉴定出几种生物标志物，但由于缺乏敏感性和特异性，这些生物标志物没有具有足够的临床效用 ^1,2。靶向治疗是一些多因素疾病的一大挑战，最终会导致更高的死亡率。需要更好地了解存在广泛异质性的复杂疾病的潜在机制和病理生理学。因此，在这方面，代谢组学的发展彻底改变了治疗的发展，最终可能有助于为各种危重疾病量身定制治疗方案，例如急性呼吸窘迫综合征 （ARDS）、败血症和严重急性胰腺炎 （SAP）。

代谢组学是一种全面的方法，旨在识别和定量各种生物流体、细胞或组织提取物中的小分子量分子（代谢物，如氨基酸、脂质、肽、有机酸和维生素）。这些代谢物的重量通常小于 1500 Da，在生化过程中发挥着积极作用，反映了生物体生物状态的逐步轮廓。它们包括关键酶促过程的底物、生物途径中的中间体和细胞代谢的副产物。因此，代谢组学可以捕获饮食影响、药物相互作用和疾病状态的详细指纹。代谢物变化是代谢和生物途径的高度敏感指标，允许与表型表达和由此产生的病理生理学异常相关 ^3,4。代谢物的初始变化可以作为疾病严重程度的早期指标，而时间变化可能有助于监测治疗效果、疾病进展和临床结果^5,6,7。因此，代谢组学通过临床、生理和生化终点重新定义疾病来增强临床测定和各种其他组学方法 8,9,10,11,12,13。代谢组学的分析能力用于通过改变代谢物浓度来监测和确定疾病易感性^14,15。

在此背景下，质谱 （MS） 和核磁共振 （NMR） 波谱已成为生物样品中代谢物分析的主要分析平台。这些方法用于代谢物的靶向和非靶向鉴定和定量 16,17,18。每个平台都有其优点和局限性，但 NMR 的非破坏性使其更适合用于各种体内研究和未知化合物结构的表征，尤其是在代谢组学研究的初始阶段。MS 之前所需的样品分馏、衍生化和电离可能会引入偏倚，并经常导致样品损失，从而影响 NMR 波谱在最少或无需样品制备的情况下可以捕获的动态特征。与 MS 相比，NMR 的主要局限性是其灵敏度较低，而 MS 的检测限较低，因此难以检测丰度较低的代谢物¹⁹。然而，高分辨率超导磁体、低温冷却 NMR 探针和提高灵敏度的技术等进步缓解了这一限制 20,21,22。作为基因组学和蛋白质组学的补充方法，使用 NMR 波谱的代谢分析作为一种首选技术越来越受欢迎 23,24,25。尽管存在灵敏度挑战，但 NMR 的最小样品制备、重现性和可重复性使其成为捕获代谢物固有动态特征的宝贵工具²⁶。

几个研究小组已经成功地进行了代谢组学研究，确定了各种疾病²⁷ 患者的代谢失调特征，例如 ARDS^{28、29、30、31、32、33}、肺炎³⁴、败血症⁷、胆结石³⁵ 和胰腺炎³⁶.基于 NMR 的危重患者代谢组学研究有助于追踪从全身炎症反应综合征 （SIRS） 到多器官功能障碍综合征 （MODS） 的进展，这是重症监护病房 （ICU） 死亡率和发病率的主要原因³⁷。在 Stringer 等人的一项研究中，与对照组患者相比，血浆样本用于检查败血症诱导的急性肺损伤 （ALI） 患者的代谢改变³⁸。在这项初步研究中发现升高的关键代谢物反映了所涉及的代谢途径及其与临床评分的关联。这项研究扩展到血清代谢组学，以区分脓毒症与 ARDS³² 中肺损伤机制的早期阶段。此外，ARDS 的另一项研究确定了有效的血清生物标志物，这些标志物可以明确区分急性肺损伤/ARDS 和健康对照，从而深入了解与肺损伤急性发作相对应的全身代谢变化^39,40。

NMR 波谱是一种高通量和自动化分析技术，可提供有关代谢指纹图谱的可靠且无偏差的信息，揭示潜在的病理生理学³⁸。NMR 数据的临床应用和生物学解释取决于获得包含丰富信息的高质量波谱。因此，确保准确、一致和完善的数据收集、处理和分析至关重要。因此，本研究的目的是利用基于 NMR 的代谢组学的基本步骤来鉴定和定量代谢物。本研究强调了临床代谢组学研究所需的方案的关键步骤（图 1），例如选择合适的样本、收集和储存、样本处理和制备、数据采集和分析、识别和量化感兴趣的代谢物，并最终在临床环境中解释结果以获得相关见解。这些步骤中的每一个对于在代谢组学中利用 NMR 波谱来揭示重要的生物学和临床见解都是必不可少的。

Protocol

伦理批准（IEC 代码:2022-71-PhD-126）已获得勒克瑙桑贾伊甘地医学科学研究生院 （SGPGIMS） 的 IEC。从患者或其亲属那里获得书面知情同意书，以执行研究并发布数据用于研究目的。此外，该研究是按照机构指南进行的。

1. 研究设计和伦理审查

1. 确定每个组的样本数量。仔细审查并建立参与者的选择标准。此外，如果研究设计要求包含人类或动物样本，则在开始样本采集之前从适当的机构伦理委员会 （IEC） 获得伦理许可。
2. 根据 2012 年柏林定义的诊断标准，根据动脉血氧分压 （PaO2） 与吸入氧分数 （FiO2） （P/F） 的比率，选择分为轻度、中度和重度的 ARDS 患者。P/F 范围为 300-200 的 ARDS 患者被认为是轻度的，200-100 是中度的，低于 100 的被认为是严重的³⁸。在这里，我们关注两组:轻度和中度 ARDS 患者（见 表 1）。
   注:该研究涉及使用从血液样本中获得的血清进行基于 NMR 的代谢组学。在本研究中，纳入参考的参与者平均年龄为 42 岁 （± 10.9 岁），性别分布为 2 名男性和 6 名女性。

类别	P/F 比率
轻微	300-200
温和	200-100
严重	100-0

表 1:ARDS 患者的分类。

2. 样品选择、采集和处理

1. 按照下述步骤进行血清分离。
   1. 对于实验，使用无菌针头在普通（无添加剂）和无菌小瓶中从动脉中收集 2 mL 血样。将样品在室温下凝固 30 分钟。在本研究中，选择了 4 例诊断为轻度 ARDS 的患者和 4 例中度 ARDS 患者。
   2. 将样品以 3100 x g 离心 15 分钟以分离血清²⁵。将血清转移到无菌微量离心管中，制成较小体积的等分试样（即 400-500 μL），适当标记它们（患者姓名、CR 编号、日期等），并将它们储存在 -80 °C 以备将来分析。
      注意:此时，可以在方便的时间暂停和恢复实验。
2. 在NMR实验之前，使用以下步骤处理血清样品。
   1. 在进行 NMR 实验之前解冻样品。将 250 μL 等分试样的血清与 250 μL 磷酸盐水缓冲溶液（含有 100% D₂O、0.9% NaCl、50 mM 磷酸钠缓冲液，pH 7.4）混合，以尽量减少 pH 值变化。
   2. 涡旋混合物几秒钟 （~15 s），以确保其均匀混合。最后，将制备好的样品转移到带有浓度为 0.05 mM 的丙酸三甲硅烷酯 （TSP） 的同轴插件的干净 NMR 管中，该插件用作校准和定量的外部标准品⁴¹。
      注:作为参考，使用不与分析物相互作用的惰性和非反应性化合物。其他常用的参比化合物包括四甲基硅烷 （TMS） 和三甲基硅烷基丙磺酸钠 （DSS）。

3. 核磁共振实验

注:重点是鉴定血清样品中的小分子，因此，我们使用了抑制大分子信号的 Carr-Purcell-Meiboom-Gill （CPMG） 脉冲序列。本研究中的所有血清样品均使用 800 MHz NMR 波谱仪记录，该波谱仪配备低温冷却三共振 TCI 5 mm 宽带反向探头头和屏蔽 z 梯度。

1. 将样品放入磁力架中。编写命令 wrpa （提及实验编号） 并按 Enter 键，以使用 cpmg 脉冲程序设置质子实验。通过单击选项提及患者的姓名和其他必要的详细信息 标题.
2. 通过编写命令锁定来锁定磁场，按 Enter，然后进一步选择选项 90% H₂O 和 10% D₂O。通过 ATMM 手动调谐和匹配探头，以优化射频脉冲的效率并最大限度地提高灵敏度。通过单击 topshim 执行 1D 梯度填充。
3. 设置以下采集参数，包括 5 s 的弛豫延迟、12 ppm 的频谱扫描宽度和 300 μs 的回波时间。所有这些参数都可以通过选择上部面板中的 Acquisition Parameters 选项轻松修改。
4. 使用指数窗口函数应用 0.3 Hz 的线展宽，在 128 次扫描中将数据收集到 64,000 个点中。这些参数可以通过选择上部面板中的 Acquisition Parameters 选项进行类似修改。通过单击 Acquisition Parameters，将出现一个规格列表，并且可以在优化期间修改上述属性以及其他参数。
5. 使用 NMR 处理和分析工具获取 NMR 波谱。获得最终光谱后，编写命令 apk 和 absn ，然后按 enter 键分别执行相位校正和基线校正。单击上面板上的 "校准轴" 选项，然后自动或手动将 TSP 峰校准为 0 ppm。
6. 将采集的数据从系统传输到工作站，在那里进行进一步的处理和分析。
   注意:实验阶段现已完成，可以暂停。可以方便地进行数据预处理、分析和解释。

4. 数据预处理

1. 使用 NMR 处理和分析工具以及 NMR 代谢物定量软件进行数据预处理。
   1. 有时，只有自动校正是不够的，在这种情况下，手动校正也是必要的。要手动执行相位校正，请单击 NMR 处理和分析工具顶部菜单栏上的 "处理 "选项。然后单击 Adjust Phase（调整相位），拖动鼠标，并观察直到光谱经过相位校正。完成后，单击同一菜单栏中的 Save and Return 选项（以图标形式显示）。
   2. 要执行手动基线（Whittaker 方法）校正，请在 NMR 代谢物定量软件的处理器模块中打开光谱文件。选择选项 Baseline Correction。然后选择选项 Whittaker 方法。现在将点放在整个光谱中峰的底部（通常在血清的情况下为 0.0 至 10 ppm，或者根据光谱中代谢物的可用性）以调整碱基。校正基线后，所有光谱文件都已校正，请将它们保存在一个文件夹中。使用处理器或 NMR 代谢物定量软件的轮廓模块，可以使用以特定格式保存的相同文件进行进一步处理。
   3. 使用同一软件的 profiler 模块执行分箱。选择选项 工具 ，然后选择 Batch Process，然后选择 Spectral Binning 。
2. 要生成用于统计分析的最终分箱表，请在单击光谱分箱后选择包含所有基线校正光谱文件的文件夹。
3. 将光谱分成一定数量的等大小分箱，具有定义的光谱宽度，范围为 0.01 至 0.04 ppm（可根据研究进行优化）。此过程可简化和组织光谱数据，从而促进更一致的分析。指定存储段大小以及开始和结束 ppm 值，并指定将保存输出分箱表的文件夹。
4. 排除与水和溶剂 TSP（4.8-5.2 和 0.0-0.7 ppm）相对应的化学位移区域，以防止光谱干扰 42,43,44。
5. 此电子表格在一行中包含样品名称，在其他行中包含不同的分箱值以及 ppm。在使用此工作表进行统计分析之前，请对其进行修改，方法是将样本分组进行分析，并仅以逗号分隔 （CSV） 格式保存。
   注意:例如，在比较轻度组和中度 ARDS 患者组时，我们使用轻度和中度标签排列数据，添加序列号，并将文件保存为 CSV 格式。

5. 统计分析

注意:从上一步获取的分箱表用作统计分析的输入文件。本研究采用代谢组学统计分析软件的统计分析（单因素）模块。

1. 在统计分析之前，使用 sum、log 和 Pareto 执行标准化步骤，但它可能因不同的研究而异⁴⁵。
2. 执行单变量和多变量分析以区分不同的组并确定鉴定代谢物的准确性。
   1. 执行主成分分析 （PCA）、部分最小二乘判别分析 （PLS-DA） 和正交部分最小二乘判别分析 （OPLS-DA），以观察组间产生可变投影重要性 （VIP） 分数的组间差异导致代谢谱差异的每种代谢物。
   2. 执行单变量方法（如学生 t 检验和方差分析），以根据 p 值小于 0.05 的标准鉴定显著性代谢物。两种测试均产生箱须图，显示代谢物相对浓度的差异。
   3. 进行生物标志物分析，生成受试者工作特征曲线下面积 （AUROC） 图。AUC（曲线下面积）值> 0.8 被认为是显著的⁴⁶。
   4. 使用标准 VIP 评分 >1、Bonferroni 校正的 p 值 <0.05⁴⁴ 和 AUC > 0.8⁴⁶ 选择显著代谢物的最终列表。
3. 如下所述鉴定代谢物。
   1. 分箱以 ppm 值而不是名称的形式提供重要的代谢物。使用生物磁共振组 （BMRB） ⁴⁷和人类代谢组数据库 （HMDB） 等数据库识别与特定 ppm 值相对应的代谢物。
   2. 除此之外，使用以前发表的文献^42,44 进行鉴定和验证。
   3. 使用 NMR 代谢物定量软件的 Profiler 模块确认鉴定的代谢物及其 ppm 值。

6. 使用 NMR 代谢物定量软件定量代谢物

注意:该软件的 Profiler 模块广泛用于量化已鉴定的代谢物。

1. 在开始定量之前，使用处理器模块校准为研究选择的参比化合物（本研究中使用的 tsp）。单击选项 校准 CSI （化学形状指示剂）。提及参比化合物的浓度（本研究为 0.05 mM）。然后，将软件峰拖动到光谱参考峰上，并适当调整其高度和宽度。一旦光谱参考峰与软件的峰拟合，请单击 Accept（接受）。
2. 在分析器模块中打开所需的谱图，并选择合适的化合物库进行研究。
3. 在屏幕底部，将显示代谢物列表。从此列表中选择感兴趣的代谢物。选择后，所选代谢物的可能 ppm 将出现在光谱的顶角。
4. 选择右上角的 Ppm 值 ，然后将光谱放大到代谢物的特定 ppm 刻度。
5. 此时，屏幕上会出现两个峰值:一个代表记录的数据，另一个显示为虚线，代表软件峰值。对齐两个峰。拖动软件峰并调整其高度和位置以匹配样品中存在的峰。
6. 正确对齐后，可以从该代谢物的浓度（以 mM 为单位）标题下显示的值获得代谢物的浓度（图 1）。
7. 对所有代谢物和样品遵循相同的程序，并将定量值导出到电子表格中。要生成输出文件，请单击 批量作 选项下 工具 菜单。指定用于保存输出文件的所需文件夹。

7. 通路分析

注意:分析后鉴定的重要代谢物用于确定直接影响疾病组结果的主要途径。为此，通常采用代谢组学统计分析软件和 KEGG 数据库的途径分析模块。

1. 将获得的重要代谢物列表输入到模块中。将生成一个包含路径名称的列表。
2. 根据影响因子大于 0.1 的标准选择最终通路。显著影响值表明疾病相关途径³⁰.
3. 彻底分析产生的途径，以阐明与疾病严重程度相关的失调。这种方法的缺点之一是当重要代谢物小于 3 时，它在识别失调途径方面效率低下。
4. 为了应对相同的情况，也可以使用先前发表的文献来确定已鉴定的代谢物及其与疾病严重程度的相关性。进行彻底的文献调查，并观察已鉴定的代谢物是否也遵循与您的兴趣相同的趋势。

图 1:基于 NMR 的代谢组学的基本步骤。 该图介绍了基于 NMR 的代谢组学的关键步骤:收集和制备样品、进行 NMR 波谱分析、预处理数据、进行统计分析、识别和量化代谢物以及解释生物学意义。 请单击此处查看此图的较大版本。

Results

要进行代谢组学研究，必须确定样本量和将要分析的特定群体。选择适当的样本量对于获得与疾病严重程度准确相关的显着结果至关重要⁴⁸。然而，在这项特定的工作中，我们使用了小样本量来演示使用基于 NMR 的代谢组学鉴定和定量代谢物所涉及的步骤，这主要是为了参考。在这项研究中，我们检查了 ARDS 轻中度患者在入住 ICU 第 1 天的代谢差异，共包括 8 名受试者。按照协议，采集和处理所有样品的 NMR 波谱，最后，使用分档结果创建一个电子表格。

然后，我们进行了严格的统计分析，其中分箱表用作输入文件，使用 sum、log 和 Pareto 对数据进行归一化。我们进行了 PCA （图 2A） 和 OPLS-DA （图 2B），其中前者显示聚类，但后者显示组间有明显的区分并突出了代谢差异。排列检验统计分析 （20x） 得出 R2Y=0.99 和 Q2=0.47 的值。随后，我们进行了学生 t 检验（图 2C）和生物标志物分析（图 2D）以识别失调的代谢物。按照方案部分中概述的标准，我们将结果过滤为重要的代谢物（表 2）。

图 2:多变量和单变量分析。 （A） 轻度 ARDS 患者（以红色表示）和中度 ARDS 患者（以绿色表示）的主成分分析 （PCA） 和 （B） 正交偏最小二乘判别分析 （OPLS-DA）。（C） 箱须图突出了通过质子核磁共振波谱在血清样本中检测到的轻度和中度 ARDS 患者之间代谢物相对浓度的差异。x 轴代表研究组，y 轴表示在入住 ICU 第 1 天比较轻度 ARDS 患者（用红色表示）和中度 ARDS 患者（用绿色表示）时的相对浓度。（D） 在比较 ICU 入住第 1 天的轻度和中度 ARDS 患者进行生物标志物分析后获得的预测严重程度的重要代谢物的曲线下面积 （AUC） 图。 请单击此处查看此图的较大版本。

S.No。	名字	光谱位置 （ppm）	p 值	贵宾	AUC 值
1	授乳	1.34	0.04	1.99	1
2	异亮氨酸	1.42	0.03	2.01	0.875

表 2:比较 ICU 入院第 1 天的轻度和中度 ARDS 患者后获得的重要代谢物列表。

由于结果是以 ppm 值获得的，因此我们使用以前的文献分配了代谢物，并通过分析器对其进行了验证。分配后，乳酸和异亮氨酸作为重要的代谢物获得，这在以前的一些 ARDS 研究中也有报道 ^30,40。我们确保选择分辨良好、不重叠的峰。鉴定后，我们使用方案中提到的标准过滤了重要代谢物的列表。然后，我们使用分析器模块通过打开谱图，搜索感兴趣的代谢物，并将软件峰与谱图中获得的峰拟合，从而定量目标代谢物。这提供了以 mM 为单位的代谢物的定量值。生成了一份包含样品名称、代谢物名称和浓度的电子表格以供参考。使用软件进行定量后，可以通过其他方法（如蛋白质组学）进行验证。

此外，对鉴定的代谢物进行彻底分析，以确定它们与疾病严重程度的相关性，并确定这些代谢物积极参与的生化途径。由于在使用材料和方法部分中提到的标准后仅鉴定出两种重要的代谢物，因此无法使用该软件进行通路分析。因此，进行了全面的文献调查以突出紊乱的代谢周期。本研究中鉴定的两种代谢物成功地与 ARDS 的严重程度相关。乳酸增加表示肺部炎症和无氧呼吸，而异亮氨酸增加表示与肺损伤、感染和能量代谢相关的蛋白质分解代谢⁴⁰。了解这些代谢途径具有双重目的。首先，它揭示了疾病的复杂性，提供了对其生物学机制的见解。其次，它通过指导临床医生为患者量身定制治疗方法，最终改善临床结果，从而促进治疗进步。

Discussion

代谢组学可有效识别和量化代谢物，靶向疾病期间变得紊乱的代谢周期。结果的质量取决于代谢组学方法中每个步骤的细致执行。从样本选择和收集到通路鉴定，每个阶段对于准确识别导致疾病的主要因素都至关重要。在进行代谢组学之前，对文献进行彻底回顾是必不可少的，并且必须在每个阶段都仔细注意。

在设计代谢组学研究时，样品的选择对于提取重要信息和确保理想的样品制备至关重要，无论是考虑临床状况的靶向还是非靶向代谢指纹图谱。适当的初始样品处理至关重要，在整个研究过程中，所有样品都应始终遵循方案⁴⁹。处理临床样本时需要格外小心。基于 NMR 的代谢组学常用样品包括生物流体、细胞提取物和组织提取物^50,51。脑脊液 （CSF） 和尿液通常需要最少的预处理，并且经常在肾脏相关疾病、神经退行性疾病和药物毒性等情况下进行研究。全血、血浆和血清为广泛的危重疾病提供了全面的信息，并且由于易于采集而成为首选。广泛的其他生物流体，如、唾液、胆汁、透析液、羊水、呼出气冷凝物、肺抽吸物、滑液和小支气管肺泡灌洗液 （mBALF），因其特异性和准确性而被广泛使用 NMR 52,53,54。每种生物流体在收集、可用性和信息内容方面都有其优势和挑战，具体取决于研究或实验设计⁵⁵。在这项研究中，我们重点关注 ARDS 患者的血清样本，因为血液样本通常提供全身水平的信息，并且不会受到极端日常变化的显着影响。另一方面，尿液样本会受到各种波动的影响，并可能受到饮食、生活方式、药物和环境因素的影响²⁷。适当的样品储存对于避免酶活性或微生物降解也很重要。样品通常在 -80 °C 下冻存，冻融循环次数最少，以防止代谢分解并保持样品的稳定性。样品可以在 -80 °C 下长时间储存，从而方便地进行 NMR 实验。但是，建议尽快计划和执行实验以获得最佳结果。

在本研究中，我们采用了 800 MHz NMR 波谱仪进行数据采集，可提供高分辨率的波谱数据。对于这个实验，我们遵循了上面提到的相同的采集参数。然而，重要的是要注意，本协议中概述的相同采集参数可以使用在其他磁场强度下运行的 NMR 波谱仪来应用。在较低磁场下运行时，可以增加扫描次数以提高分辨率。虽然更高的场强可能会提供更高的分辨率，但采集过程的核心方面（如脉冲序列、弛豫延迟和温度控制）在不同仪器之间保持一致，从而确保结果的可重复性和可靠性。

遵循标准化程序对于保持可重复性和公正性至关重要，因为偏差会阻碍后续的数据分析和评估。NMR 实验的每一步都必须一丝不苟地进行，因为波谱的质量取决于它们。应特别注意匀场，因为它定义了峰形，并且应根据样品和研究设计优化采集参数。对于样品中代谢浓度低的样品，可以增加扫描次数。NMR 中的数据采集涉及 1D 和 2D 实验的标准优化，根据样品的选择和所需的特定信息量身定制。各种 NMR 实验已经过优化，可从生物流体中获得高质量的波谱，从而最大限度地减少不需要的大分子的影响。CPMG 脉冲序列⁵⁶ 是血清、血浆或脑脊液等样品的首选。该技术抑制了来自大分子（如脂质和蛋白质）的广泛信号，这些信号具有较长的横向弛豫时间，并且可能掩盖低分子量代谢物的共振。

数据预处理包括用于确保统一和同质数据分析及其解释的中间方法。此过程包括避免不需要的信号或容易出现不一致的频谱区域，并校正峰移。在生物流体中，排除不需要的区域通常意味着去除在 4.6 ppm 至 5 ppm 范围内占主导地位的信号，例如来自水的信号。由 pH 值、温度、盐浓度、稀释因子和离子组成的变化引起的峰漂移可以通过在稳态 pH 值下使用缓冲液来最大限度地减少。此外，使用标准参比化合物、峰对齐和分档有助于减少峰漂移。峰对齐对于在相同条件下采集的不同谱图的模式相关联至关重要。

必须正确进行光谱处理，以确保在分析后期进行准确分档。所有光谱都应校准并均匀对齐，并且可以手动或自动进行基校正和相位校正。正确的相位和基极校正以及校准至关重要。进行基线校正对于避免可能影响代谢物鉴定和定量的扭曲至关重要⁵⁷。相位校正是必要的，以确保没有失真或倒置的峰会影响结果的解释。仔细确定选择重要代谢物的标准，并相应地筛选结果。由于分档以 ppm 值的形式提供结果，因此请使用方案中提到的各种来源准确识别代谢物的名称。如果以相同的 ppm 值存在多种代谢物，则通过峰形来识别它们。

在进行统计分析之前，进行归一化以减少数据集中由于量级差异和代谢物浓度波动而引起的变化，无论是诱导的还是诱导的。此过程涉及各种居中、缩放和转换方法，这些方法根据数据的分布和可变性进行选择。目标是最大限度地减少不需要的系统偏差，同时保留感兴趣的生物学因素。多变量方法，包括 PCA、PLS-DA 和 OPLS-DA，用于建立 VIP 值大于 1 的差异代谢物。模型可预测性和交叉验证是使用 R2（拟合优度）和 Q2（预测优度）值确定的，而排列检验统计量则验证模型。基于 Pearson 相关性的热图通过列举亚表型和所得内型中上调和下调的代谢物来评估模型的稳健性。

单变量方法，例如学生 t 检验和方差分析，例如 Bonferroni 校正或 FDR（错误发现率）和 Benjamini-Hochberg 的最小化，用于降低假阳性的可能性。这些方法提供了潜在重要特征的粗略测量，而与它们在分子内部或分子与其他混杂因素之间的相关性无关。根据小于 0.05 的 p 值鉴定重要的代谢物，然后将其用于证实结果亚组⁴⁵ 中的代谢内型。

采用单个箱须图和 AUROC 来评估结果亚组中内型的特异性和敏感性。将临床评分与 AUROC 中的模型相结合，以验证模型的准确性。AUC 值> 0.8 被认为是显著的⁴⁶。网上有各种其他测试来测试鉴别的准确性和所鉴定代谢物的功效。其中一些是随机森林分类、热图、相关性等⁴⁵。

采用各种方法来定量重要代谢物，包括峰积分，由于其高级性质，这对初学者来说可能具有挑战性。通过参考单个化学变化来识别代谢物的特征峰，以便精确鉴定。确定这些特征峰相对于参比峰 TSP 面积的面积。要计算代谢物的绝对浓度 （Cm），请使用以下公式:

厘米 = Im.nr.Cr/Ir.nm

其中 Cr 是溶液中参比化合物 （TSP） 的浓度，Im 和 Ir 分别是代谢物和参比物 （TSP） 的积分峰面积（可以使用 NMR 处理和分析工具获得），nm 和 nr 分别是代表代谢物和参比峰的质子数²⁴。

或者，使用自动 NMR 代谢物定量软件根据参考标准品 TSP 的浓度获得单谱或多谱图的代谢物浓度。与其他方法相比，使用软件进行定量可简化过程并降低出错的可能性。虽然本研究论文强调了使用软件进行代谢物定量，但如果软件库中不存在感兴趣的代谢物，则可能会出现问题。此外，该软件是付费的，因此只有拥有授权许可证的研究人员才能使用它。

代谢组学已被证明有助于通过识别导致疾病严重程度的失调代谢周期来揭示各种疾病的复杂性。然而，将这些发现转化为临床实践一直具有挑战性。医学界现在强调个性化医疗方法以提高疾病结果。虽然以前鉴定失调的代谢物就足够了，但目前的工作重点是精确定量以确定疾病特异性范围。这些信息对于临床医生定制治疗策略非常宝贵。定量技术的进步促进了研究工作，全球众多研究小组使用专业软件成功采用了这些方法。

这一进展强调了代谢组学在显著影响个性化医疗和改善临床结果方面的潜力。此外，代谢组学数据与其他组学数据（如基因组学和蛋白质组学）的整合有望提供更全面的疾病机制理解，并进一步完善治疗干预。随着技术的不断发展，代谢组学在临床环境中的精度和实用性有望提高，为更有效和个性化的医疗保健解决方案铺平道路。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centirfuge	Sigma aldrich	3-18KS
Chenomx NMR 套件	NMR Suite， v9， Chenomx Inc.， Edmonton， Canada		核磁共振代谢物定量软件
同轴插入物	Sigma aldrich	Z278513
氧化氘	Sigma aldrich	151882
Eppendorf 管	Tarsons	500020
代谢分析学家	Wishart Research Group		代谢组学统计分析软件
NMR 管	Wilmad	Z412007	直径 5mm
移液器	Eppendorf research plus	3123000039	0-100 μl
样品采集瓶	Tarsons 冷冻冷却瓶	523194
氮化钠	Sigma aldrich	S2002
氯化钠晶体	Sigma aldrich	S9625
磷酸氢二钠	Sigma aldrich	567550
磷酸二钠	Sigma aldrich	S0751
Topspin3.6.4	布鲁克		核磁共振处理和分析工具
Tsp 盐	Sigma aldrich	269913