一种用于评估环境污染物与核受体结合亲和力的高通量筛选方法

摘要

本方案描述了一种高通量筛选系统，该系统利用特定荧光探针与核受体结合后产生的荧光偏振信号，作为检测环境污染物的读数指标。

摘要

环境中化合物的含量不断升高，导致广泛的污染，并对人类健康构成威胁。然而，尽管这些化合物在环境中普遍存在，关于其毒理学效应的信息却极为有限。因此，迫切需要开发高通量筛选（HTS）方法，以指导毒理学研究。本研究建立了一种基于高通量筛选系统的受体-配体结合实验，用于测定环境污染物对核受体的结合活性。该检测利用微孔板读数仪（即含有多种化学物质的96孔板），通过测量特异性荧光探针的荧光偏振（FP）值来完成。该实验包括四个部分：重组载体的构建与转化、受体蛋白（配体结合结构域）的表达与纯化、受体与探针的结合，以及化学物质与受体的竞争性结合。为演示该实验流程，测定了两种环境污染物——全氟辛烷磺酸（PFOS）和三苯基磷酸酯（TPHP）与过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）的结合活性。最后，还讨论了该方法的优缺点及其潜在应用。

引言

大量化学物质已在环境和人体中被广泛检出，引发了人们对这些物质对生态环境和人类健康影响的严重关切^1,2,3。尽管这些化学物质在环境中普遍存在，但有关其毒理学效应的信息仍十分有限。因此，亟需开发高通量筛选（HTS）方法，以促进对化学物质毒性的评估。

已有多种高通量筛选（HTS）方法被报道用于化学物质毒性评估，例如Tox21和ToxCast项目中使用的HTS生物测定方法^4,5。这些方法能够快速识别潜在的有毒物质，并提供有关化学物质毒性机制的重要信息。然而，这些HTS生物测定主要依赖基于细胞的系统，可能较为复杂且成本较高。此外，高通量测序方法也已被用于化学物质毒性评估，但实现化学品的高通量评估仍然具有挑战性⁶。先前的研究已开发出基于荧光偏振（FP）的受体-配体竞争性结合测定法，用于测定多种环境污染物（包括全氟和多氟烷基物质（PFAS）^7,8,9、双酚A....

方案

试剂与仪器的详细信息见材料表。

1. 重组载体的构建与转化

注意：PPARγ 是一种配体依赖性转录因子，具有典型的核受体结构，包含一个调控靶基因的 DNA 结合域和一个由配体激活的配体结合域。在配体激活后，PPARγ 会与另一种核受体——视黄醇 X 受体（RXR）形成异源二聚体，并结合到 PPARγ 的反应元件上，从而调控下游靶基因的转录^9,16。

1. 设计PPARγ-LBD的引物（见表1），并扩增PPARγ-LBD DNA片段（见表2和表3）。
2. 使用限制性内切酶XhoI和BamHI消化，将带有His×6标签的pET28a载体线性化¹⁸。
3. 利用 commercially available 克隆试剂盒将PPARγ-LBD DNA片段克隆至带有His×6标签的pET28a载体中，获得重组质粒pET28a-PPARγ-LBD-6×His¹⁸。
4. 将重组表达质粒pET28a....

结果

PPARγ-LBD 蛋白的表达与纯化
PPARγ-LBD 在 BL21 (DE3) 中以组氨酸标签蛋白的形式进行异源表达。该蛋白存在于可溶性组分中，纯化后的 PPARγ-LBD 在 SDS-PAGE 上呈现单一蛋白条带，表观分子量约为 34.9 kDa（图 2），与该蛋白预测的分子量一致。

C₁-BODIPY-C₁₂ 探针与 PPARγ-LBD 的结合
在受体结合实验中，使用了 C1-BODIPY-C12（一种可与 PPARγ-LBD 结合的 BODIPY 标记脂肪酸）作为荧光探针，用于研究环境污染物与 hPPARγ-LBD 的结合能力。如图 3A所示，加入 PPARγ-LBD 后，荧光偏振（FP）值从 20 上升至 250，表明 C1-BODIPY-C12 与受体发生了结合。结合曲线在 PPARγ-LBD 浓度达到 800 nM.......

讨论

荧光偏振（FP）、表面等离子体共振（SPR）和核磁共振（NMR）是常用于评估蛋白质与化合物之间直接结合相互作用的技术^19,20。FP 已被广泛应用于药物发现和化学筛选中的分子相互作用研究^21,22,23。相比之下，SPR 和 NMR 检测成本较高且耗时较长，因此不太适用于高通量筛选（HTS）应用。本方案描述了一种基于 FP 并结合多孔板检测系统的受体-配体分析方法，可实现化学品的高通量筛选。

为受体结合实验选择合适的探针至关重要。探针应包含两个部分：一个针对核受体的特异性配体和一个荧光基团。通常，此类探针可从商业途径获得，例如本研究中使用的C1-BODIPY-C12探针。C1-BODIPY-C12是一种脂肪酸的荧光类似物，其BODIPY荧光基团连接在脂肪酸的C1位，是PPARγ的特.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
C1-BODIPY-C12 探针	Thermo Fisher Scientific, 中国	102209-82-3	与 PPARγ-LBD 结合并发出荧光。
考马斯亮蓝 R-250	Solarbio, 中国	6104-59-2	对蛋白质条带进行染色。
GraphPad Prism	Dotmatics		https://www.graphpad.com/features
咪唑	Solarbio, 中国	I8090	用于蛋白纯化过程中缓冲液的配制。
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷	Solarbio, 中国	367-93-1	诱导 PPARγ-LBD 的表达
酶标仪	Biotek , 美国	Synergy H1	检测荧光偏振值
NaCl	上海试剂	7647-15-5	用于蛋白纯化过程中缓冲液的配制。
NaH2PO4 · 2H2O	上海试剂	13472-35-0	用于蛋白纯化过程中缓冲液的配制。
Ni NTA Beads 6FF	Smart-Lifesciences, 中国	SA005005	蛋白纯化。
Origin 8.5	OriginLab, Northampton, MA, 美国
全氟辛烷磺酸 (PFOS)	J&K Scientific Ltd, 中国	1763-23-1	待检测的环境污染物
苯甲基磺酰氟 (PMSF)	Solarbio, 中国	P0100	抑制蛋白质降解。
PPARγ-竞争性检测试剂盒	Thermo Fisher Scientific	PV6136	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/PV6136
PPARγ-LBD 配体筛选检测试剂盒	Cayman	600616	https://www.caymanchem.com/product/600616
罗格列酮 (Rosi)	阿拉丁, 中国	122320-73-4	PPARγ 的激动剂
摇床	智城, 中国	ZWY-211C	用于细菌培养扩增及蛋白表达诱导
磷酸三苯酯 (TPHP)	麦克林, 中国	T819317	待检测的环境污染物
Tris	Solarbio, 中国	T8230	用于蛋白纯化过程中缓冲液的配制。
胰蛋白胨	OXOID Limited, 中国	LP0042B	用于配制溶菌肉汤 (LB) 培养基。
超声波清洗机	金佰利, 中国	LHO-1	裂解细菌以实现完全破碎
尿素	Solarbio, 中国	U8020	用于蛋白纯化过程中缓冲液的配制。
酵母提取物	OXOID Limited, 中国	LP0021B	用于配制溶菌肉汤 (LB) 培养基。