一种用于评估环境污染物与核受体结合亲和力的高通量筛选方法

Summary

该方案描述了一种高通量筛选系统，该系统使用与核受体结合的特异性荧光探针的荧光极化作为筛选环境污染物的读数。

Abstract

在环境中检测到的化合物含量不断增加，造成了广泛的污染，并对人类健康构成风险。然而，尽管它们在环境范围内的发生率很高，但关于其毒理学影响的信息非常有限。迫切需要开发高通量筛选 （HTS） 方法来指导毒理学研究。在这项研究中，开发了一种使用 HTS 系统的受体-配体结合测定法，以确定环境污染物对核受体的结合效力。该测试是使用酶标仪（即含有各种化学物质的 96 孔板）通过测量特定荧光探针的荧光偏振 （FP） 进行的。该检测包括四个部分:重组载体的构建和转化、受体蛋白（配体结合域）的表达和纯化、受体-探针结合以及化学物质与受体的竞争性结合。测定两种环境污染物全氟辛烷磺酸 （PFOS） 和磷酸三苯酯 （TPHP） 与过氧化物酶体增殖物激活受体 γ （PPARγ） 的结合效力，以说明测定程序。最后，还讨论了该方法的优缺点及其潜在应用。

Introduction

在环境和人体中广泛检测到大量化学物质，引起了人们对其对生态环境和人类健康影响的严重担忧 ^1,2,3。尽管它们在环境下的发生率很高，但有关其毒理学影响的信息却很少。因此，迫切需要开发高通量筛选 （HTS） 方法来促进化学毒性的评估。

已经报道了几种用于化学毒性评估的高通量筛选 （HTS） 方法，例如 Tox21 和 ToxCast 计划中使用的 HTS 生物测定 ^4,5。这些方法可以快速识别潜在的毒物，并提供有关化学毒性机制的宝贵信息。然而，这些 HTS 生物测定主要依赖于基于细胞的系统，这可能既复杂又昂贵。此外，高通量测序方法也已用于化学毒性评估，但实现化学品的高通量评估仍然具有挑战性⁶。以前的研究已经开发了基于荧光偏振 （FP） 的受体-配体竞争性结合测定法，以确定几种环境污染物的结合效力，包括全氟和多氟烷基物质 （PFAS）^7,8,9、双酚 A （BPA）^10,11 和颗粒物 （PM）¹²，以及过氧化物酶体增殖物激活受体 （PPAR^{） 等}核受体7^， 8,9,10,13，法尼醇 X 受体 （FXR）^11,12 和甲状腺受体 （TR）^14,15。这种方法高效、经济高效，并提供机制见解。

在本研究中，基于检测小荧光探针的荧光偏振 （FP） 描述了受体 - 配体结合测定的方案。基于 FP 的受体-配体结合测定的原理如图 1 所示。当一个小荧光分子被平面偏振光激发时，由于分子的快速旋转，发射的光会变得高度去偏振。然而，当示踪剂与较大的受体结合时，其旋转速度会减慢。当示踪剂与大受体结合时，检测到高 FP 值，而当示踪剂游离时，观察到低 FP 值。纯化过氧化物酶体增殖物激活受体 γ （PPARγ） 以使探针与受体结合。罗格列酮 （Rosi） 、全氟辛烷磺酸 （PFOS） 和磷酸三苯酯 （TPHP） 用于竞争探针与受体的结合。Rosi 是 PPARγ 的特异性激动剂，在受体竞争性结合试验中用作阳性对照。此外，PFOS 和 TPHP 先前在以前的研究中已被确定为 PPARγ 的弱激动剂 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17。此外，它们属于已知环境暴露的化合物的不同结构类别，并以其在人类群体中相对较高的检出率而著称。这些化合物用于进一步验证竞争结合测定的广泛适用性。该程序包括四个步骤:重组载体的构建和转化、受体蛋白（配体结合结构域）的表达和纯化、受体探针结合以及化学物质与受体的竞争性结合。

Protocol

试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 重组载体的构建和转化

注:PPARγ 是一种配体依赖性转录因子，具有经典的核受体结构，包括一个调节靶基因的 DNA 结合结构域和一个由配体激活的配体结合结构域。配体激活后，PPARγ 与另一个核受体类视黄醇 X 受体 （RXR） 形成异二聚体，并与 PPARγ 的反应元件结合，从而调节下游靶基因的转录 ^9,16。

1. 设计 PPARγ-LBD 的引物（见 表 1）并扩增 PPARγ-LBD DNA 片段（见 表 2 和 表 3）。
2. 通过用限制性核酸内切酶 XhoI 和 BamHI¹⁸ 消化 His ×6 标记的 pET28a 载体，将其线性化。
3. 使用市售克隆试剂盒将 PPARγ-LBD DNA 片段克隆到 His×6 标记的 pET28a 载体中，得到重组质粒 pET28a-PPARγ-LBD-6×His¹⁸。
4. 将重组表达质粒 pET28a-PPARγ-LBD-6×His 转染到 BL21 （DE3） 大肠杆菌 细胞中，用于蛋白表达¹⁸。
5. 将 5 μL 重组载体加入感受态 BL21 （DE3） 细胞中，在冰上孵育 30 分钟，在 42 °C 下进行热休克 45 秒，然后立即返回冰中。
6. 加入 900 μL LB 培养基，在 37 °C 下摇动 1 小时 （160-200 rpm），然后在室温下以 ~3000 x g 离心 5 分钟。
7. 弃去上清液，将细菌沉淀重悬于 100 μL LB 培养基中，然后铺展到固体培养基上。将板倒置并在 37 °C 下培养 12-16 小时。
8. 选择单个菌落进行测序鉴定以及随后的蛋白质表达和纯化。

2. 受体蛋白的表达和纯化

1. 将转化的 BL21 （DE3） 细胞在补充有 100 μg/mL 氨苄青霉素的 200 mL LB 培养基中，在轨道振荡器 （230 rpm） 上孵育 1-2 小时，温度为 37 °C。
2. 当OD₆₀₀ 达到0.4-0.6吸光度单位时，通过加入10μM异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导细胞，并在16°C下孵育16小时。
3. 收集细菌悬浮液并在 8000 × g、4 °C 下离心 10 分钟。
4. 在 20 mL 可溶性裂解缓冲液（50 mM NaH₂PO₄、300 mM NaCl、10 mM 咪唑，pH 8.0）中裂解细胞，加入 200 μL 苯甲基磺酰氟 （PMSF） 和 200 μL 溶菌酶。使用 5 mL 移液器重悬细菌沉淀，然后以 30% 的功率进行超声处理 20 分钟。
5. 加入等于柱体积 5 倍的裂解缓冲液以平衡镍柱。重复此过程两次，然后放在一边。
6. 将超声处理的细菌悬浮液在 4 °C 下以 8000 × g 离心 15 分钟，以获得细菌上清液裂解物 （CL）。
7. 将 CL 加载到镍柱上（用于蛋白质吸附）以获得流出率 （FT）。
8. 用 5 倍柱体积的洗涤缓冲液（50 mM NaH₂PO₄、300 mM NaCl、20 mM 咪唑，pH 8.0）洗涤色谱柱，以获得洗涤洗脱液 （W1-W6）。
9. 用 1 mL 洗脱缓冲液（50 mM NaH₂PO₄、300 mM NaCl、250 mM 咪唑，pH 8.0）洗涤色谱柱，洗脱目标蛋白质并获得蛋白质组分 （E1-E5）。
10. 取每个馏分（CL、FT、W1-W6 和 E1-E5）的 20 μL 等分试样，并使用 SDS-PAGE¹⁸ 和考马斯亮蓝染色进行分析。PPARγ-LBD 在变性凝胶上以 34.9 kDa 蛋白的形式电泳。

3. 受体结合测定

注:在该测定中，C1-BODIPY-C12 用作位点特异性荧光探针以建立受体-配体结合系统。C1-BODIPY-C12 是 PPARγ 的特异性配体，是脂肪酸的荧光类似物，在 C1 位点将 BODIPY 荧光基团掺入脂肪酸中。

1. 在 Tris-HCl 缓冲液（20 mM Tris，100 mM NaCl，pH 8.0）中将纯化的人 PPARγ-LBD 稀释至 1 nM 至 6400 nM 的浓度范围。此外，在 Tris-HCl 缓冲液中将 C1-BODIPY-C12 探针稀释至 50 nM 的浓度。
2. 将稀释的 PPARγ-LBD 溶液（每孔 55 μL）和 C1-BODIPY-C12 探针溶液（每孔 55 μL）混合在 96 孔黑色板中。在室温下孵育 5 分钟。
3. 使用酶标仪测量荧光偏振 （FP）。
4. 根据受体浓度绘制 FP 值，使用统计和绘图软件使用 Hill 斜率方程的特异性结合拟合曲线，并计算 K_d 值。

4. 竞争性结合测定

注:在该测定中，使用 800 nM 人 PPARγ-LBD 和 50 nM C1-BODIPY-C12 探针进行受体结合。使用罗格列酮 （Rosi）、磷酸三苯酯 （TPHP） 和全氟辛烷磺酸 （PFOS） 与探针与 PPARγ 的结合竞争。

1. 在 Tris-HCl 缓冲液中稀释三种化合物，浓度范围为 0-200 μM。
2. 用终浓度为 800 nM 的人 PPARγ-LBD 和 50 nM 的 C1-BODIPY-C12 探针制备受体-探针结合溶液。
3. 在 96 孔黑色板中混合受体探针结合溶液（每孔 55 μL）和化合物溶液（每孔 55 μL）。在室温下孵育 5 分钟。
4. 使用酶标仪测量荧光偏振 （FP）。
5. 将 FP 值绘制为配体浓度的函数。使用由绘图和分析软件处理的 S 形模型从竞争曲线中获得每个配体的半数最大抑制浓度 （IC₅₀）。

Results

PPARγ-LBD 的蛋白表达和纯化
PPARγ-LBD 在 BL21 （DE3） 中作为组氨酸标记蛋白异源表达。在可溶性组分中检测到蛋白质，纯化的 PPARγ-LBD 在 SDS-PAGE 上显示一条带，表观分子量约为 34.9 kDa（图 2），与蛋白质的预测分子量一致。

C 1-BODIPY-C₁₂ 探针与 PPARγ-LBD 的结合
在受体结合试验中，以 C1-BODIPY-C12（一种可与 PPARγ-LBD 结合的 BODIPY 标记脂肪酸）作为荧光探针，研究环境污染物与 hPPARγ-LBD 的结合效力。如图 3A 所示，添加 PPARγ-LBD 后，荧光偏振 （FP） 值从 20 增加到 250，表明 C1-BODIPY-C12 与受体结合。结合曲线在 800 nM PPARγ-LBD 时达到饱和，解离常数 （K_d） 为 253.5 nM ± 10.05 nM。因此，选择 800 nM PPARγ-LBD 进行后续的竞争性结合测定。

环境污染物与 PPARγ-LBD 的竞争性结合
罗格列酮 （Rosi） 是 PPARγ 的特异性激动剂，在竞争性配体结合测定中用作阳性对照以取代荧光探针。如图 3B 所示，Rosi 以剂量依赖性方式抑制 C1-BODIPY-C12 探针与 PPARγ-LBD 的结合，IC₅₀ 为 6.89 μM，证明了该测定的可行性。接下来，测定 TPHP 和 PFOS 与 PPARγ-LBD 的结合亲和力。如图 3C、D 所示，TPHP 和 PFOS 也以剂量依赖性方式抑制 C1-BODIPY-C12 探针与 PPARγ-LBD 的结合，IC₅₀ 值分别为 60.45 μM 和 37.27 μM。

图 1:基于荧光偏振 （FP） 的受体竞争性结合测定的示意图。请单击此处查看此图的较大版本。

图 2:纯化的 PPARγ-LBD 的 SDS-PAGE 分析。 M 是蛋白质分子量标记物。Cl 是细胞裂解物，FT 是流出组分，W1-W6 是洗涤液，E1 是洗脱液，E2-E4 是纯化的 PPARγ-LBD 蛋白。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 3:基于荧光偏振 （FP） 的受体结合曲线和竞争性结合曲线。 （A） C 1-BODIPY-C₁₂ 与人 PPARγ-LBD 的基于 FP 的结合曲线。（B - D）Rosi、TPHP 和 PFOS 与人 PPARγ-LBD 的基于 FP 的竞争性结合曲线。误差线表示三个独立实验的标准偏差 （SD）。请单击此处查看此图的较大版本。

身份证	序列
pET28a-人 PPARG-P1	CAAATGGGTCGCGGATCCATGATCGACCAGCTGAATCCAGAGTCC
pET28a-人 PPARG-P2	GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTCAGTACAAGTCCTTGTAGATCTC
PPARγ-LBD 核苷酸序列	AGACGACATTCCCTCTAGAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGAT ATACCATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCAGCAGCGGCCTG GTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAA TGGGTCGCGGATCCATGATCGACCAGCTGAATCCAGAGTCCGCTGAC CTCCGGGCCCTGGCAAAACATTTGTATGACTCATACATAAAGTCCTTCC CGCTGACCAAAGCAAAGGCGAGGGCGATCTTGACAGGAAAGACAACA GACAAATCACCATTCGTTATCTATGACATGAATTCCTTAATGATGGGAGA AGATAAAATCAAGTTCAAACACATCACCCCCCTGCAGGAGCAGAGCAA AGAGGTGGCCATCCGCATCTTTCAGGGCTGCCAGTTTCGCTCCGTGG AGGCTGTGCAGGAGATCACAGAGTATGCCAAAAGCATTCCTGGTTTTG TAAATCTTGACTTGAACGACCAAGTAACTCTCCTCAAATGGAGTCCA CGAGATCATTTACACAATGCTGGCCTCCTTGATGAATAAAGATGGGGT TCTCATATCCGAGGGCCAAGGCTTCATGAAGGGAGTTTCTAAAG AGCCTGCGAAAGCCTTTTGGTGACTTTATGGAGCCCAAGTTTGAGT TTGCTGTGAAGTTCAATGCACTGGAATTAGATGACAGCGACTTGGCAA TATTTATTGCTGTCATTATTCTCAGTGGAGACCGCCCAGGTTTGCTGAA TGTGAAGCCCATTGAAGACATTCAAGACAACCTGCTACAAGCCCTGG AGCTCCAGCTGAAGCTGAACCACCCTGAGTCCTCACAGCTGTTTG CCAAGCTGCTCCAGAAAATGACAGACCTCAGACAGATTGTCACGGA ACACGTGCAGCTACTGCAGGTGATCAAGAAGACGGAAACCGACATG AGTCTTCACCCGCTCCTGCAGGAGATCTACAAGGACTTGGACTGG CTCGAGGCCACCCACCC的

表 1:PPARγ 配体结合结构域的引物和核苷酸序列。

实验试剂名称	体积/剂量
pET28a-人 PPARG-P1	1 微升
pET28a-人 PPARG-P2	1 微升
2×phanta Max 预混液	12.5 微升
cDNA 抗体	2 μL
ddH2O	8.5 微升

表 2:PCR 实验试剂系统。

实验名称	温度	时间
预变性	95 摄氏度	3 分钟
变性	95 摄氏度	15 秒
退火	65 °摄氏度	15 秒
外延	72 摄氏度	6 分钟
商店	12 摄氏度	--

表 3:PCR 实验反应程序。

Discussion

荧光偏振 （FP）、表面等离子体共振 （SPR） 和核磁共振 （NMR） 是用于评估蛋白质和化合物之间直接结合相互作用的常用技术^19,20。FP 已广泛用于药物发现和化学筛选的分子相互作用研究 21,22,23。相比之下，SPR 和 NMR 分析既昂贵又耗时，因此不太适合高通量筛选 （HTS） 应用。该协议描述了一种基于 FP 的受体-配体分析方法，具有多孔板检测系统，可实现化学品的 HTS。

为受体结合测定选择合适的探针至关重要。探针应由两部分组成:核受体的特异性配体和荧光基团。通常，这种探针可以商业获得，如本研究中使用的 C1-BODIPY-C12 探针所示。C1-BODIPY-C12 是脂肪酸的荧光类似物，BODIPY 荧光基团掺入 C1 位点，是 PPARγ 的特异性配体。如果市售荧光探针不是一种选择，则应通过将荧光基团连接到已知的特异性配体上来化学合成。

核受体的经典结构包括一个负责调节靶基因表达的 DNA 结合结构域和一个配体结合结构域 （LBD），通常位于受体的 C 端²⁴。共调节因子结合位点通常位于核受体的转录激活功能结构域内，在那里它与核共调节因子相互作用²⁵。这些共调节因子可以增强或抑制受体的转录活性，从而调节基因表达。LBD 位于受体蛋白的特定区域，在配体结合时调节受体的构象变化，进而激活或抑制其转录活性。由于 LBD 是一个定义明确的结构域，对于识别和结合特异性小分子配体至关重要²⁴，因此在本研究中，仅将受体-LBD 用于受体竞争性结合测定。这种方法涉及表达和纯化 PPARγ 的配体结合结构域，降低了检测成本。

该方法中使用的试剂，包括用于蛋白质纯化的缓冲液、C1-BODIPY-C12 探针和 Tris-HCl，是市售且价格低廉的，这是该测定的显着优势。荧光偏振 （FP） 检测在多孔板（96 孔或 384 孔）中进行，每个板的快速读取时间为 3-5 分钟，从而提高了检测通量和效率。受体-配体结合方法非常灵活，只要受体蛋白可用，就可以很容易地适应各种受体。这种适应性拓宽了可以使用这种方法进行的研究范围。总体而言，这些优势的结合 - 易于使用、成本效益、高通量容量、快速加工和受体驯化的灵活性 - 使该方法成为筛选有毒环境污染物的有前途的选择。

目前的结果表明，PFOS 和 TPHP 可以与 PPARγ 结合，这与之前分子对接和报告基因测定的结果一致 ^9,26。此外，本手稿中描述的方法已被用于评估几种环境污染物与核受体的结合效力。例如，使用基于 FP 的受体-配体竞争性结合测定，19 种全氟和多氟烷基物质 （PFAS） 和 7 种双酚 A （BPA） 化合物与过氧化物酶体增殖物激活受体 β/δ （PPARβ/δ） ^7,10 的结合效力，¹² 种 PFAS 与 PPARγ ^9,13、7 种 BPA 化合物和 3 种颗粒物 （PM_2.5） 成分与法呢醇 X 受体 （FXR） 的结合效力^11，12 种和对甲状腺受体 （TR） ^14,15 的 8 种多溴联苯醚 （PBDE） 和 6 种多氯联苯 （PCB） 已确定。这些发现突出了这种方法在筛选环境污染物和核受体之间的结合相互作用方面的潜力。

以前的研究报道了 PPARγ 的荧光偏振 （FP） 测定方法，该方法涉及使用凝胶过滤来测量结合，这需要至少 1.5 小时才能检测单个化合物的结合²³。相比之下，该方法允许在 10 分钟内用 PPARγ 检测至少 12 种化合物的结合亲和力。此外，一些市售的检测试剂盒（参见 材料表）的 800 × 20 μL 规格的价格超过 3000 美元。这些方法非常昂贵且耗时。本研究提出了对这些现有方法的改进。

这种方法的一个潜在限制是荧光探针必须是受体的配体，并且荧光探针不直接与环境污染物相互作用。因此，确保探头和环境污染物在溶液中分开保存至关重要。此外，该测定反映了体外情况，不能完全捕获体内相互作用，因为受体在体内是异二聚体 ²⁷。因此，虽然这种方法是一种快速筛选工具，但有必要进一步研究体内受体激活和相关毒理学机制。

另一个缺点是在评估结合亲和力时在荧光偏振 （FP） 测定中观察到的"右移"现象，这可能导致系统性地低估了测得的亲和力。在以前的研究中，使用时间分辨荧光共振能量转移 （TR-FRET） 测定²⁸ 评估罗格列酮与 PPARγ 的结合亲和力，这是一种测量配体-受体结合亲和力的高灵敏度方法。然而，TR-FRET 测定相对耗时且繁琐，需要在检测前将反应溶液在室温下孵育 4 小时。尽管与 TR-FRET 检测相比，FP 检测的灵敏度较低，但它更适合高通量筛选与核受体结合的环境配体。然而，FP 检测可能会遗漏一些弱环境配体。此外，在以前的研究中，PFOS 与 PPARγ 的结合亲和力是使用平衡透析 （EqD） ²⁹ 确定的，这是另一种测量配体-受体结合亲和力的高灵敏度方法。然而，EqD 依赖于昂贵的分析设备 （LC-MS/MS），这限制了其应用并排除了高通量筛选能力。

尽管这种荧光偏振 （FP） 测定表现出"右移"现象，这可能导致计算的 IC₅₀ 值通常较高，但它不会影响相对亲和力排名或随后的风险评估预测。此外，FP 检测具有成本效益、时间效率高，并且能够筛选多种化合物对多种核受体的亲和力。总体而言，基于 FP 的环境配体高通量筛选有助于快速鉴定有毒环境污染物。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
C1-BODIPY-C12 探针	Thermo Fisher Scientific， China	102209-82-3	与 PPAR&γ;-LBD 结合并发出荧光。
考马斯亮蓝 R-250	Solarbio， 中国	6104-59-2	对蛋白质条带进行染色。
GraphPad prism	Dotmatics		https://www.graphpad.com/features
咪唑	Solarbio，中国	I8090	为蛋白质纯化过程准备缓冲液。
异丙基 &β;-D-1-硫代吡喃半乳糖苷	Solarbio， 中国	367-93-1	诱导 PPAR&γ;-LBD
酶标仪	Biotek， USA	Synergy H1	检测 FP 值
NaCl	Shanghai 试剂	7647-15-5	为蛋白质纯化过程准备缓冲液。
NaH2PO4 · 2H2O	上海试剂	13472-35-0	为蛋白质纯化过程准备缓冲液。
Ni NTA Beads 6FF	Smart-Lifesciences， China	SA005005	蛋白质纯化。
起源 8.5	OriginLab，美国马萨诸塞州北安普敦
全氟辛烷磺酸 （PFOS）	J&K Scientific Ltd， 中国	1763-23-1	检测到的环境污染物
苯甲基磺酰氟 （PMSF）	Solarbio， China	P0100	抑制蛋白质降解。
PPAR&γ;-竞争者检测试剂盒	Thermo Fisher Scientific	PV6136	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/PV6136
PPARγ-LBD 配体筛选检测试剂盒	开曼	600616	https://www.caymanchem.com/product/600616
罗格列酮 （Rosi）	aladdin， 中国	122320-73-4	PPAR&γ 的激动剂;
摇床	志成， 中国	ZWY-211C	细菌培养扩增和蛋白质表达的诱导
磷酸三苯酯 （TPHP）	Macklin， 中国	T819317	检测到的环境污染物
Tris	Solarbio， 中国	T8230	为蛋白质纯化过程准备缓冲液。
胰蛋白胨	OXOID Limited，中国	LP0042B	制备溶原肉汤 （LB） 培养基。
超声波清洗机	Kimberly， China	LHO-1	破坏细菌以实现完全裂解
Urea	Solarbio， China	U8020	为蛋白质纯化过程准备缓冲液。
酵母提取物	OXOID Limited，中国	LP0021B	制备溶原肉汤 （LB） 培养基。